QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage

Die Seite wird erstellt Melanie Mertens
 
WEITER LESEN
QuantiFERON®-TB Gold Plus (QFT®-Plus)
ELISA Packungsbeilage
                                                       2 x 96

Der IFN-γ-Test für Vollblut zur Messung der Reaktion
auf die Peptidantigene ESAT-6 und CFP-10

           In-vitro-Diagnostikum

           622120

       QIAGEN GmbH
       QIAGEN-Straße 1
       40724 Hilden
       DEUTSCHLAND
       Telefon: +49-2103-29-0

       1083163DE Rev. 02

     www.QuantiFERON.com

                                   www.QuantiFERON.com
Inhalt
Verwendungszweck                                                        4
Zusammenfassung und Erklärung des Tests                                 4
     Testprinzip                                                       6
     Zeitbedarf für den Test                                           7
Komponenten und Aufbewahrung                                            8
     Vom Anwender bereitzustellende Materialien                        9
     Lagerung und Handhabung                                           9
Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen                                    10
     In-vitro-Diagnostikum                                             10
     Warnhinweise                                                      10
     Vorsichtsmaßnahmen                                                11
Probennahme und -handhabung                                            14
Gebrauchsanweisung                                                     16
Berechnungen und Auswertung des Tests                                  21
     Erstellung der Standardkurve                                      21
     Qualitätskontrolle des Tests                                      22
     Interpretation der Ergebnisse                                     22
Grenzen des Verfahrens                                                 24
Leistungsmerkmale                                                      25
     Klinische Studien                                                 25
     Leistungsmerkmale des Tests                                       31
Technische Informationen                                               37
     Unschlüssige Ergebnisse                                           37
     Geronnene Plasmaproben                                            37
Hilfe zur Fehlerbehebung                                               38
Literatur                                                              40
Symbole                                                                47
Kontaktinformationen                                                   47
Kurzanleitung                                                          48

   QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015        3
Verwendungszweck
Der Test QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ist ein In-vitro-Diagnostikum zur
Stimulation von Zellen in heparinisiertem Vollblut. Hierzu wird ein Peptid-Cocktail
verwendet, der die Proteine ESAT-6 und CFP-10 simuliert. Die In-vitro-Reaktion auf
diese Peptid-Antigene, die in Zusammenhang mit einer Infektion durch Mycobacterium
tuberculosis steht, wird durch Nachweis von Interferon-γ (IFN-γ) mittels ELISA-Test
(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) festgestellt.
QFT-Plus ist ein indirekter Test auf Infektionen mit M. tuberculosis (einschließlich der
aktiven Erkrankung) und ist zur Verwendung in Zusammenhang mit der Risiko-
abschätzung, Röntgenuntersuchungen und anderen medizinischen und diagnostischen
Verfahren vorgesehen.

Zusammenfassung und Erklärung des Tests
Tuberkulose ist eine übertragbare Krankheit, die durch eine Infektion mit Organismen
des M.-tuberculosis-Komplexes (MTB-Komplex: M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum)
verursacht wird. Die Ansteckung erfolgt in der Regel über eine Tröpfcheninfektion durch
Personen, die an Tuberkulose der Atemwege leiden. Bei neu infizierten Personen kann
Wochen oder Monate später eine Tuberkulose-Erkrankung auftreten, bei den meisten
Infizierten treten jedoch keine Beschwerden auf. Bei einigen persistiert eine latente
Tuberkulose-Infektion (LTBI), eine nicht übertragbare, asymptomatische Erkrankung, die
erst Monate oder Jahre später zum Ausbruch kommen kann. Der Hauptzweck der
Erkennung der LTBI besteht darin, eine Behandlung zur Prävention des Ausbruchs der
Tuberkulose-Erkrankung in Betracht zu ziehen. Bis vor kurzem war der Tuberkulin-
Hauttest (THT) die einzige verfügbare Methode zur Diagnose der LTBI. Die kutane
Sensitivität für Tuberkulin entsteht 2 bis 10 Wochen nach der Infektion. Jedoch reagieren
einige Infizierte nicht auf Tuberkulin, darunter z. B. Patienten mit einer gestörten
Immunreaktion infolge anderer Erkrankungen, aber auch Patienten ohne solche
Erkrankungen. Umgekehrt weisen jedoch einige Personen, bei denen eine Infektion mit
M. tuberculosis unwahrscheinlich ist, eine Tuberkulin-Sensitivität auf und erzielen ein
positives Testergebnis im Tuberkulin-Hauttest, beispielsweise nach der BCG-Impfung,
nach Infektion mit anderen, nicht dem M.-tuberculosis-Komplex zugehörigen,
Mykobakterien oder aufgrund unbekannter anderer Faktoren.
Die LTBI muss von der meldepflichtigen Tuberkulose-Erkrankung abgegrenzt werden, bei
der in der Regel die Lunge und die unteren Atemwege betroffen sind, jedoch auch
andere Organsysteme betroffen sein können. Die Diagnose der Tuberkulose-Erkrankung
erfolgt aufgrund der Ergebnisse von Anamnese und ärztlicher Untersuchung sowie
aufgrund radiologischer, histologischer und mykobakteriologischer Untersuchungs-
ergebnisse.
Mit QFT-Plus wird die zellvermittelte Immunreaktion auf Peptidantigene, welche
Mykobakterienproteine simulieren, gemessen. Diese Proteine (ESAT-6 und CFP-10)
fehlen in allen BCG-Stämmen und den meisten nicht-tuberkulösen Mykobakterien mit

   4                   QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015
Ausnahme von M. kansasii, M. szulgai und M. marinum (1). Bei Personen, die mit
Organismen des MTB-Komplexes infiziert sind, liegen im Allgemeinen Lymphozyten im
Blut vor, die diese und andere mykobakterielle Antigene erkennen. Bei diesem
Erkennungsprozess wird das Zytokin IFN-γ von den Zellen produziert und sezerniert.
Der Nachweis und die anschließende Quantifizierung von IFN-γ bilden die Grundlage
dieses Tests.
Die im QFT-Plus-Test verwendeten Antigene sind ein Peptidcocktail, der die Proteine
ESAT-6 und CFP-10 simuliert. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass diese
Peptidantigene die IFN-γ-Reaktion in den T-Zellen von mit M. tuberculosis infizierten
Personen stimulieren, jedoch in der Regel nicht die T-Zellen von nicht infizierten
Personen und BCG-geimpften Personen ohne Tuberkulose-Erkrankung oder LTBI-Risiko
(1–32). Es besteht jedoch die Möglichkeit, dass die IFN-γ-Reaktion durch medizinische
Behandlungen oder Erkrankungen, die die Immunfunktion beeinträchtigen, verringert
wird. Patienten mit bestimmten anderen Mykobakterieninfektionen können ebenfalls auf
ESAT-6 und CFP-10 reagieren, da die Gene, die diese Proteine kodieren, auch bei M.
kansasii, M. szulgai und M. marinum vorhanden sind (1, 23). QFT-Plus ist zum einen
zum Nachweis einer LTBI geeignet und zum anderen eine wertvolle Hilfe bei der
Diagnose einer Infektion mit dem M.-tuberculosis-Komplex bei erkrankten Patienten. Ein
positives Testergebnis unterstützt die Diagnose einer Tuberkulose-Erkrankung; jedoch
kann es auch durch Infektionen mit anderen Mykobakterien (z. B. M. kansasii)
hervorgerufen werden. Für die Bestätigung bzw. den Ausschluss einer Tuberkulose-
Erkrankung sind weitere medizinische und diagnostische Untersuchungen erforderlich.
Bei QFT-Plus-Test kommen zwei verschiedene TB-Antigen-Röhrchen zum Einsatz: TB-
Antigen-Röhrchen 1 (TB1) und TB-Antigen-Röhrchen 2 (TB2). Beide Röhrchen enthalten
Peptidantigene der mit dem MTB-Komplex assoziierten Antigene ESAT-6 und CFP-10.
Das TB1-Röhrchen enthält Peptide von ESAT-6 und CFP-10, welche zellvermittelte
Immunreaktionen von CD4+ T-Helfer-Lymphozyten auslösen sollen, während das TB2-
Röhrchen eine zusätzliche Kombination von Peptiden enthält, welche der Induktion von
zellvermittelten Immunreaktionen von zytotoxischen CD8+ T-Lymphozyten dienen. Die
Ausschüttung von IFN-γ durch CD4+ T-Zellen spielt eine entscheidende Rolle bei der
natürlichen Kontrolle einer MTB-Infektion durch das Immunsystem. Neue Forschungs-
ergebnisse weisen darauf hin, dass auch CD8+ T-Zellen eine Rolle bei der Wirtsabwehr
von MTB spielen, indem sie IFN-γ und andere lösliche Faktoren produzieren. Diese
Faktoren aktivieren Makrophagen, welche die Vermehrung der MTB unterdrücken, töten
infizierte Zellen oder lysieren direkt intrazelluläre MTB (33–35). MTB-spezifische CD8+-
Zellen wurden bei Patienten mit LTBI und mit aktiver TB gefunden, wo häufig IFN-γ-
produzierende CD8+-Zellen vorhanden sind (36–38). Zudem wurde berichtet, dass
CD8+ T-Zellen, die für ESAT-6 und CFP-10 spezifisch sind, häufiger bei Patienten mit
aktiver TB-Erkrankung als bei Patienten mit LTBI nachgewiesen werden und mit einer
kürzlich erfolgten MTB-Exposition in Zusammenhang stehen könnten (39–41). MTB-
spezifische CD8+ T-Zellen, die IFN-γ produzieren, wurden auch bei Probanden mit
aktiver TB und Koinfektion mit HIV (42, 43) sowie bei kleinen Kindern mit TB-
Erkrankung (44) nachgewiesen.

   QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015                       5
Testprinzip
Der QFT-Plus-Test beinhaltet spezielle Blutentnahmeröhrchen, in die die Vollblutproben
entnommen werden. Die anschließende Inkubation der Blutproben im Röhrchen dauert
16 bis 24 Stunden. Danach wird das Plasma entnommen und auf das Vorliegen von
IFN-γ untersucht, das gegebenenfalls in Reaktion auf die Peptidantigene gebildet
wurde.
Der QFT-Plus-Test wird in zwei Teilen durchgeführt. Zunächst wird Vollblut in jedes der
QFT-Plus-Blutentnahmeröhrchen abgenommen. Dabei handelt es sich um ein
Negativkontrolle-Röhrchen (Nil), ein TB1-Röhrchen, ein TB2-Röhrchen und ein Mitogen-
Röhrchen. Alternativ kann das Blut mit einem einzigen normalen Blutentnahme-
röhrchen, welches Lithium-Heparin als Antikoagulans enthält, entnommen und
anschließend in die QFT-Plus-Röhrchen überführt werden.
Das Mitogen-Röhrchen wird im QFT-Plus-Test als Positivkontrolle verwendet. Dies kann
in Fällen wichtig sein, in denen der Immunstatus des Patienten fraglich ist. Das
Mitogen-Röhrchen dient auch als Kontrolle für den korrekten Umgang mit der
Blutprobe und die korrekte Inkubation.
Die QFT-Plus-Röhrchen sollten so schnell wie möglich, jedoch spätestens 16 Stunden
nach der Blutentnahme, bei 37 °C inkubiert werden. Nach einer Inkubationszeit von
16 bis 24 Stunden werden die Röhrchen dann zentrifugiert, das Plasma wird
abgenommen und die Menge an IFN-γ (IU/ml) wird mittels ELISA gemessen.
Ein QFT-Plus-Test gilt als positiv für die IFN-γ-Reaktion, wenn der Messwert eines der
beiden TB-Antigen-Röhrchen (IFN-γ in IU/ml) signifikant über dem Wert der Negativ-
kontrolle (Nil) liegt. Die Plasmaprobe aus dem Mitogen-Röhrchen dient bei jeder Probe
als IFN-γ-Positivkontrolle. Wenn eine Blutprobe eine negative Reaktion auf die TB-
Antigene zeigt, weist eine ebenfalls nur geringe Reaktion auf das Mitogen (< 0,5 IU/ml)
auf ein unschlüssiges Ergebnis hin. Ein solches Muster kann auftreten bei ungenügender
Lymphozytenzahl, verringerter Lymphozytenaktivität infolge unsachgemäßer Proben-
behandlung, unsachgemäßem Befüllen oder Mischen des Mitogen-Röhrchens oder
dann, wenn die Lymphozyten des Patienten nicht in der Lage sind, IFN-γ zu
produzieren. Das Negativkontrolle-Röhrchen dient der Hintergrundkorrektur (z. B. bei
übermäßiger IFN-γ-Konzentration in der Blutbahn oder heterophilen Antikörpern). Der
IFN-γ-Wert des Negativkontrolle-Röhrchens wird vom IFN-γ-Wert der TB-Antigen-
Röhrchen und des Mitogen-Röhrchens abgezogen.

   6                   QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015
Zeitbedarf für den Test
Nachstehend finden Sie Angaben zur geschätzten Dauer des QFT-Plus-ELISA sowie zur
erforderlichen Zeit bei der gleichzeitigen Durchführung mehrerer Tests.
Inkubation der Blutröhrchen bei 37 °C: 16 bis 24 Stunden
ELISA:                                 Etwa 3 Stunden für eine ELISA-Platte
                                       (22 Patienten)
                                       < 1 Stunde Arbeitszeit
                                       Plus 10 bis 15 Minuten pro zusätzliche Platte

   QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015                   7
Komponenten und Aufbewahrung
    Blood Collection Tubes*                                              200            Single Patient Pack
                                                                       Röhrchen     (Einzelpatientenpackung)
    Katalog-Nr.                                                         622526               622222
    Anzahl an Tests/Packung                                                 50                  10
    QuantiFERON Nil Tube (Negativkontrolle-                     Nil   50 Röhrchen         10 Röhrchen
    Röhrchen, grauer Deckel, weißer Ring)

    QuantiFERON TB1 Tube (TB1-Röhrchen, grüner                  TB1   50 Röhrchen         10 Röhrchen
    Deckel, weißer Ring)

    QuantiFERON TB2 Tube (TB2-Röhrchen, gelber                  TB2   50 Röhrchen         10 Röhrchen
    Deckel, weißer Ring)

    QuantiFERON Mitogen Tube (Mitogen-Röhrchen,             Mitogen 50 Röhrchen           10 Röhrchen
    lila Deckel, weißer Ring)

    Packungsbeilage für QFT-Plus-                                           1                   1
    Blutentnahmeröhrchen

    Komponenten des ELISA†                                                           Kit mit 2 ELISA-Platten
    Katalog-Nr.                                                                              622120
    Microplate Strips (Mikrotiterstreifen [12 x 8 Wells], beschichtet mit            2 Sätze von je 12 8-
    murinen monoklonalen Antikörpern gegen humanes IFN-γ)                            Well-Mikrotiterstreifen
    IFN-γ Standard, lyophilized (IFN-γ-Standard, lyophilisiert, enthält              1 Fläschchen (8 IU/ml
    rekombinant hergestelltes humanes IFN-γ, Rindercasein, 0,01 % w/v                 nach Rekonstitution)
    Thimerosal)

    Green Diluent (grüne Verdünnungslösung, enthält Rindercasein,                           1 x 30 ml
    normales Mausserum, 0,01 % w/v Thimerosal)

    Conjugate 100x Concentrate, lyophilized (Konjugatkonzentrat,                        1 x 0,3 ml (nach
    100-fach konzentriert, lyophilisiert, murines Antikörper-HRP-Konjugat                Rekonstitution)
    gegen humanes IFN-γ, enthält 0,01 % w/v Thimerosal)

    Wash Buffer 20x Concentrate (Waschpufferkonzentrat, 20-fach                            1 x 100 ml
    konzentriert, pH 7,2, enthält 0,05 % v/v ProClin® 300)
    Enzyme Substrate Solution (Enzymsubstratlösung, enthält H2O2,                           1 x 30 ml
    3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidin)
    Enzyme Stopping Solution (Enzymstopplösung, enthält 0,5 M H2SO4)                        1 x 15 ml
    Packungsbeilage für QFT-Plus-ELISA                                                          1
* Nicht alle Produktkonfigurationen sind in allen Ländern erhältlich. Wenden Sie sich bitte an unseren
  Kundenservice QIAGEN Customer Care (Details im Internet unter www.qiagen.com), um zu erfahren,
  welche Konfigurationen für Sie bestellbar sind.
†
    Siehe die Sicherheits- und Gefahrenhinweise auf Seite 11.

      8                      QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015
Vom Anwender bereitzustellende Materialien
     Inkubator mit einer Temperatur von 37 °C ± 1 °C*. CO2 nicht erforderlich
     Kalibrierte Pipetten* mit variablem Volumen für Volumina von 10 µl bis 1000 µl,
      mit Einwegspitzen
     Kalibrierte Mehrkanalpipette* zur Abgabe von 50 µl und 100 µl, mit
      Einwegspitzen
     Schüttler für Mikrotiterplatten*
     Entionisiertes oder destilliertes Wasser, 2 Liter
     Waschgerät für Mikrotiterplatten (vorzugsweise automatisiert)
     Mikrotiterplatten-Photometer* mit 450-nm-Filter und Referenzfilter bei 620 bis
      650 nm

Lagerung und Handhabung

Blutentnahmeröhrchen
     Blutentnahmeröhrchen bei 4 °C bis 25 °C lagern.

Reagenzien des Kits
     Reagenzien des Kits bei 2 °C bis 8 °C lagern.
     Die Enzymsubstratlösung stets vor direkter Sonneneinstrahlung schützen.

Rekonstituierte und nicht verbrauchte Reagenzien
Anweisungen zur Rekonstitution der Reagenzien finden Sie auf Seite 17.
     Der rekonstituierte Kitstandard ist bei Lagerung bei 2 °C bis 8 °C 3 Monate lang
      haltbar.
       Notieren Sie das Datum der Rekonstitution des Kitstandards.
     Das 100x Konjugatkonzentrat muss nach Rekonstitution bei 2 °C bis 8 °C gelagert
      und innerhalb von drei Monaten aufgebraucht werden.
       Notieren Sie das Datum der Rekonstitution des Konjugats.
     Gebrauchsfertig verdünntes Konjugat muss innerhalb von 6 Stunden nach
      Zubereitung verwendet werden.
     Gebrauchsfertig verdünnter Waschpuffer ist bei Raumtemperatur bis zu 2 Wochen
      lang haltbar.

* Stellen Sie sicher, dass die Geräte gemäß den Herstellerempfehlungen geprüft und kalibriert wurden.

    QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015                                   9
Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen

In-vitro-Diagnostikum

Warnhinweise
    Ein negatives Ergebnis im QFT-Plus-Test schließt die Möglichkeit einer
     Infektion mit M. tuberculosis und einer Tuberkulose-Erkrankung nicht aus;
     falsch-negative Ergebnisse können bedingt sein durch die Infektions-
     phase (z. B. wenn die Blutprobe vor der Entwicklung der zellulären
     Immunreaktion entnommen wurde), Störungen der Immunfunktion durch
     andere Erkrankungen, unsachgemäße Handhabung der Röhrchen nach
     der Blutentnahme, unrichtige Testdurchführung oder andere
     immunologische Variablen.
    Ein positives Ergebnis im QFT-Plus-Test sollte nicht als alleinige
     Grundlage für die Diagnose einer Infektion mit M. tuberculosis dienen;
     durch unrichtige Testdurchführung kann es zu falsch-positiven
     Ergebnissen kommen.
    Ein positives Ergebnis im QFT-Plus-Test sollte durch weitere medizinische
     und diagnostische Untersuchungen abgeklärt werden, um zu bestimmen,
     ob eine aktive Tuberkulose-Erkrankung vorliegt (z. B. durch Abstrich und
     Kultur, Röntgen-Thorax).
    Zwar kommen ESAT-6 und CFP-10 in den BCG-Stämmen und in den
     meisten bekannten nicht-tuberkulösen Mykobakterien nicht vor, ein
     positives Ergebnis im QFT-Plus-Test kann jedoch auch auf eine Infektion
     mit M. kansasii, M. szulgai oder M. marinum zurückzuführen sein.
     Werden solche Infektionen vermutet, sind alternative Testmethoden
     einzusetzen.

  10                QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015
Vorsichtsmaßnahmen
Nur zum diagnostischen Gebrauch in vitro.
Tragen Sie beim Umgang mit Chemikalien immer einen Laborkittel, Einmal-
Laborhandschuhe und eine Schutzbrille. Weitere Informationen können Sie den
entsprechenden Sicherheitsdatenblättern entnehmen (safety data sheets, SDS).
In unserer Online-Sammlung der Sicherheitsdatenblätter unter
www.qiagen.com/safety finden Sie zu jedem QIAGEN-Kit und zu jeder Kit-
Komponente das jeweilige SDS als PDF-Datei, die Sie einsehen und ausdrucken
können.

                   VORSICHT: Behandeln Sie Humanblut- und -plasmaproben
                   stets als potenziell infektiös. Beachten Sie die einschlägigen
                   Richtlinien zum Umgang mit Blut. Proben und Materialien,
                   die mit Blut oder Blutprodukten in Kontakt waren, sind
                   gemäß den örtlichen und nationalen Vorschriften zu
                   entsorgen.

Die folgenden Gefahren- und Sicherheitshinweise gelten für einzelne
Komponenten des QuantiFERON-TB Gold Plus ELISA:

Gefahrenhinweise
          QuantiFERON Conjugate (Konjugat)
          Enthält: Borsäure. Gefahr! Kann die Fruchtbarkeit beeinträchtigen oder das Kind
          im Mutterleib schädigen. Inhalt/Behälter einer anerkannten Abfallentsorgungs-
          anlage zuführen. BEI EXPOSITION ODER FALLS BETROFFEN: Ärztlichen Rat
          einholen / ärztliche Hilfe hinzuziehen. Vor Gebrauch besondere Anweisungen
          einholen. Unter Verschluss aufbewahren. Schutzhandschuhe / Schutzkleidung /
          Augenschutz / Gesichtsschutz tragen.
          QuantiFERON Enzyme Stopping Solution (Enzymstopplösung)
          Enthält: Schwefelsäure. Gefahr! Verursacht schwere Verätzungen der Haut und
          schwere Augenschäden. Kann gegenüber Metallen korrosiv sein. Inhalt/Behälter
          einer anerkannten Abfallentsorgungsanlage zuführen. BEI KONTAKT MIT
          DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser ausspülen. Eventuell
          vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter ausspülen.
          BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT (oder dem Haar): Alle kontaminierten
          Kleidungsstücke sofort ausziehen. Haut mit Wasser abwaschen / duschen.
          Sofort GIFTINFORMATIONSZENTRUM oder Arzt anrufen. Unter Verschluss
          aufbewahren. Schutzhandschuhe / Schutzkleidung / Augenschutz /
          Gesichtsschutz tragen.

   QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015                  11
QuantiFERON Enzyme Substrate Solution (Enzymsubstratlösung)
         Achtung! Verursacht leichte Hautreizungen. Bei Hautreizung: ärztlichen Rat
         einholen / ärztliche Hilfe hinzuziehen.
         QuantiFERON Green Diluent (Grüne Verdünnungslösung)
         Enthält: Trinatrium-5-hydroxy-1-(4-sulphophenyl)-4-(4-sulphophenylazo)pyrazol-3-
         carboxylat. Achtung! Kann allergische Hautreaktionen verursachen.
         Inhalt/Behälter einer anerkannten Abfallentsorgungsanlage zuführen.
         Kontaminierte Kleidung ausziehen und vor erneutem Tragen waschen. Bei
         Hautreizung oder -ausschlag: Ärztlichen Rat einholen / ärztliche Hilfe
         hinzuziehen. Schutzhandschuhe / Schutzkleidung / Augenschutz /
         Gesichtsschutz tragen.
         QuantiFERON IFN-γ Standard (IFN-γ-Standard)
         Enthält: Borsäure. Gefahr! Kann die Fruchtbarkeit beeinträchtigen oder das Kind
         im Mutterleib schädigen. Inhalt/Behälter einer anerkannten
         Abfallentsorgungsanlage zuführen. BEI EXPOSITION ODER FALLS BETROFFEN:
         Ärztlichen Rat einholen / ärztliche Hilfe hinzuziehen. Vor Gebrauch besondere
         Anweisungen einholen. Unter Verschluss aufbewahren. Schutzhandschuhe /
         Schutzkleidung / Augenschutz / Gesichtsschutz tragen.
         QuantiFERON Wash Buffer 20x Concentrate (Waschpufferkonzentrat, 20-fach
         konzentriert)
         Enthält: Gemisch aus 5-Chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-on und 2-Methyl-2H-
         isothiazol-3-on (3:1). Achtung! Kann allergische Hautreaktionen verursachen.
         Schutzhandschuhe / Schutzkleidung / Augenschutz / Gesichtsschutz tragen.

Sicherheitshinweise
Vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen. Schutzhandschuhe /
Schutzkleidung / Augenschutz / Gesichtsschutz tragen. BEI BERÜHRUNG MIT
DER HAUT (oder dem Haar): Alle kontaminierten Kleidungsstücke sofort
ausziehen. Haut mit Wasser abwaschen / duschen. BEI KONTAKT MIT DEN
AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser ausspülen. Eventuell
vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter ausspülen. Bei
Exposition oder falls betroffen: Ärztlichen Rat einholen / ärztliche Hilfe
hinzuziehen. Sofort GIFTINFORMATIONSZENTRUM oder Arzt anrufen. Bei
Hautreizung oder -ausschlag: Ärztlichen Rat einholen / ärztliche Hilfe
hinzuziehen. Kontaminierte Kleidung ausziehen und vor erneutem Tragen
waschen. Unter Verschluss aufbewahren. Inhalt/Behälter einer anerkannten
Abfallentsorgungsanlage zuführen.

   12                 QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015
Weitere Informationen
Sicherheitsdatenblätter: www.qiagen.com/safety
    Abweichungen von den Instruktionen der QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-
     Plus) ELISA Packungsbeilage können zu fehlerhaften Ergebnissen führen.
     Bitte lesen Sie die Anweisungen vor Gebrauch sorgfältig durch.
    Verwenden Sie den Kit nicht, wenn Reagenzienflaschen vor Gebrauch
     beschädigt oder undicht erscheinen.
    Die folgenden Reagenzien und Komponenten dürfen nicht aus
     unterschiedlichen Chargen des QFT-Plus-Kits verwendet oder gemischt
     werden: Mikrotiterstreifen, IFN-γ-Standard, grüne Verdünnungslösung und
     100x Konjugatkonzentrat. Die anderen Reagenzien (20x Waschpuffer-
     konzentrat, Enzymsubstratlösung und Enzymstopplösung) können zwischen
     verschiedenen Kits ausgetauscht werden, solange das Verfallsdatum der
     einzelnen Reagenzien nicht abgelaufen ist und die Angaben zu den
     jeweiligen Chargen dokumentiert werden. Nicht benötigte Reagenzien und
     biologische Proben sind gemäß den örtlichen und nationalen Vorschriften
     zu entsorgen.
    Nach Ablauf des Verfallsdatums dürfen die QFT-Plus-Blutentnahmeröhrchen
     und der ELISA-Kit nicht mehr verwendet werden.
    Stellen Sie vor Gebrauch sicher, dass die Laborgeräte kalibriert/validiert
     wurden.

    QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015             13
Probennahme und -handhabung
Im QFT-Plus-Test werden die folgenden Blutentnahmeröhrchen verwendet:
1. QuantiFERON Nil (Negativkontrolle-Röhrchen, grauer Deckel mit weißem Ring)
2. QuantiFERON TB1 (TB1-Röhrchen, grüner Deckel mit weißem Ring)
3. QuantiFERON TB2 (TB2-Röhrchen, gelber Deckel mit weißem Ring)
4. QuantiFERON Mitogen (Mitogen-Röhrchen, lila Deckel mit weißem Ring)
Die Anweisungen zur Verwendung von Lithium-Heparin-Röhrchen finden Sie weiter
unten.
Die Innenwand der Blutentnahmeröhrchen ist mit getrockneten Antigenen beschichtet.
Daher müssen die Blutproben sorgfältig mit dem Inhalt des Röhrchens vermischt
werden. Die QFT-Plus-Röhrchen müssen so schnell wie möglich, jedoch spätestens
16 Stunden nach der Blutentnahme, in einen 37 °C-Inkubator überführt werden.

Für optimale Ergebnisse sollte das folgende Verfahren befolgt werden:
1.   Beschriften Sie die Röhrchen in geeigneter Weise.
     Stellen Sie sicher, dass jedes Röhrchen (Negativkontrolle, TB1, TB2 und Mitogen)
     nach dem Entfernen des Deckels anhand des Etiketts oder auf andere Weise
     identifiziert werden kann.
2.   Nehmen Sie von jedem Patienten per Venenpunktion je 1 ml Blut direkt in jedes
     der QFT-Plus-Blutentnahmeröhrchen ab. Diese Prozedur darf nur von einer
     entsprechend ausgebildeten Fachkraft durchgeführt werden.
     Wichtiger Hinweis: Die Röhrchen sollten bei der Befüllung mit Blut eine Temperatur
     zwischen 17 °C und 25 °C aufweisen.
     Die QFT-Plus-Blutentnahmeröhrchen können bis zu einer Höhenlage von 810 m
     benutzt werden.
     Da die 1-ml-Röhrchen das Blut relativ langsam aufnehmen, belassen Sie das
     Röhrchen nach dem scheinbaren Erreichen des endgültigen Füllstands bitte noch
     2–3 Sekunden auf der Nadel. Dies gewährleistet, dass das korrekte Volumen
     entnommen wurde.
     Die schwarze Markierung seitlich am Röhrchen zeigt den validierten Füllbereich
     von 0,8 bis 1,2 ml an. Falls sich der Füllspiegel des Bluts außerhalb des Bereichs
     der Indikatorlinie befindet, sollte eine neue Blutprobe entnommen werden.
     Bei Verwendung einer Butterfly-Nadel zur Blutentnahme ist mit Hilfe eines
     Leerröhrchens sicherzustellen, dass die Schlauchverbindung mit Blut gefüllt ist,
     bevor die QFT-Plus-Röhrchen verwendet werden.
     Bei Verwendung der QFT-Plus-Blutentnahmeröhrchen in Höhenlagen oberhalb von
     810 m oder falls zu wenig Blut in ein Röhrchen aufgenommen wird, kann das Blut

     14                 QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015
beim Patienten mit einer Spritze abgenommen und sofort anschließend je 1 ml in
     jedes der 4 Röhrchen überführt werden. Aus Sicherheitsgründen nimmt man
     hierzu am besten unter Beachtung der einschlägigen Vorsichtsmaßnahmen die
     Nadel von der Spritze, nimmt dann die Deckel von den 4 QFT-Plus-Röhrchen ab
     und gibt in jedes Röhrchen 1 ml Blut (bis zur Mitte der seitlichen schwarzen
     Markierung auf dem Röhrchenetikett). Anschließend werden die Röhrchen wieder
     sorgfältig mit den Deckeln verschlossen und wie nachstehend beschrieben
     gemischt.
     Alternativ kann das Blut mit einem einzigen normalen Blutentnahmeröhrchen, das
     Lithium-Heparin als Antikoagulans enthält, entnommen und anschließend in die
     QFT-Plus-Röhrchen überführt werden. Verwenden Sie ausschließlich Lithium-
     Heparin als Blut-Antikoagulans, da andere Antikoagulantien den Test
     beeinträchtigen. Füllen Sie ein Blutentnahmeröhrchen (Mindestvolumen 5 ml) und
     durchmischen Sie den Inhalt behutsam, indem Sie das Röhrchen mehrere Male
     über Kopf schwenken, um das Heparin zu lösen. Das Blut sollte bei Raumtemperatur
     gelagert werden (22 °C ± 5 °C), bis es zur Inkubation in die QFT-Plus-Röhrchen
     überführt wird. Das Überführen in die QFT-Plus- Röhrchen zur Inkubation muss
     innerhalb von 16 Stunden nach der Blutentnahme erfolgen. Wurde das Blut mit
     Lithium-Heparin-Röhrchen entnommen, müssen die Proben vor dem Übertragen in
     die QFT-Plus-Röhrchen durch behutsames Über-Kopf-Schwenken gleichmäßig
     gemischt werden. Beim Übertragen in die QFT-Plus-Röhrchen sind aseptische
     Techniken und die einschlägigen Vorsichtsmaßnahmen anzuwenden. Man nimmt
     die Deckel von den 4 QFT-Plus-Röhrchen ab und gibt in jedes Röhrchen 1 ml Blut
     (bis zur Mitte der seitlichen schwarzen Markierung auf dem Röhrchenetikett).
     Anschließend werden die Röhrchen wieder sorgfältig mit den Deckeln
     verschlossen und wie nachstehend beschrieben gemischt.
3.   Schütteln Sie die Röhrchen unmittelbar nach der Befüllung zehnmal (10x) gerade
     so stark, dass die gesamte Innenwand des Röhrchens mit Blut bedeckt ist. Dies löst
     die Antigene an der Röhrchenwand.
     Wichtiger Hinweis: Die Röhrchen sollten beim Schütteln eine Temperatur
     zwischen 17 °C und 25 °C aufweisen. Zu heftiges Schütteln kann das Gel
     zerstören und so zu falschen Ergebnissen führen.
4.   Nach dem Beschriften, Befüllen und Schütteln müssen die Röhrchen so schnell wie
     möglich, und spätestens 16 Stunden nach der Blutentnahme, in einen Inkubator
     mit einer Temperatur von 37 °C ± 1 °C überführt werden. Lagern Sie die Röhrchen
     bis zur Inkubation bei Raumtemperatur (22 °C ± 5 °C).

     QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015                    15
Gebrauchsanweisung

Teil 1 — Inkubation der Blutproben und Entnahme des Plasmas
Im Lieferumfang enthaltene Materialien
     QFT-Plus-Blutentnahmeröhrchen (siehe Kapitel 3)

Vom Anwender bereitzustellende Materialien
     Siehe Kapitel 3

Durchführung
1.   Wenn die Inkubation der Blutproben nicht sofort anschließend an die Blut-
     entnahme durchgeführt wird, müssen die Röhrchen unmittelbar vor der Inkubation
     erneut durch 10-maliges Über-Kopf-Schwenken gemischt werden.
2.   Röhrchen STEHEND 16 bis 24 Stunden bei 37 °C ± 1 °C inkubieren. CO2 und
     Befeuchtung sind im Inkubator nicht erforderlich.
3.   Nach der Inkubation bei 37 °C können die Blutentnahmeröhrchen bis zur
     Zentrifugation bis zu 3 Tage lang bei 4 °C bis 27 °C aufbewahrt werden.
4.   Nach der Inkubation der Röhrchen bei 37 °C werden diese zur leichteren
     Entnahme des Plasmas für 15 Minuten bei 2000 bis 3000 x g (RZB, engl. RCF)
     zentrifugiert. Die Gelbarriere trennt dabei die Zellen vom Plasma. Geschieht dies
     nicht, sollten die Röhrchen erneut zentrifugiert werden.
     Das Plasma kann auch ohne Zentrifugieren entnommen werden, jedoch muss
     hierbei sehr vorsichtig vorgegangen werden, um keine Zellen aufzuwirbeln.
5.   Die Plasmaproben sollten nur mit einer Pipette entnommen werden.
     Wichtiger Hinweis: Vermeiden Sie nach der Zentrifugation jegliches Auf- und Abpipettieren
     oder Mischen vor Abnahme des Plasmas. Achten Sie stets darauf, dass das Material an der
     Oberfläche des Gels nicht aufgewirbelt wird.
     Die Plasmaproben können direkt aus den zentrifugierten Blutentnahmeröhrchen in
     die QFT-Plus-ELISA-Platte pipettiert werden, auch bei Verwendung eines ELISA-
     Automaten.

     Die Plasmaproben können bei 2 °C bis 8 °C bis zu 28 Tage lang gelagert
     werden. Nach Entnahme des Plasmas kann dieses bei unter –20 °C auch für
     längere Zeit gelagert werden.

     Für eine einwandfreie Testdurchführung sollten mindestens 150 µl Plasma
     entnommen werden.

     16                 QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015
Teil 2 — IFN-γγ-ELISA
Im Lieferumfang enthaltene Materialien
     QFT-Plus-ELISA-Kit (siehe Kapitel 3).

Vom Anwender bereitzustellende Materialien
     Siehe Kapitel 3.

Durchführung
1.   Alle Plasmaproben und Reagenzien, mit Ausnahme des 100x Konjugatkonzentrats,
     müssen vor Gebrauch auf Raumtemperatur (22 °C ± 5 °C) gebracht werden.
     Planen Sie für die Temperaturäquilibrierung mindestens 60 Minuten ein.
2.   Nehmen Sie nicht benötigte Streifen aus dem Rahmen, geben Sie sie in die
     Folienverpackung zurück und lagern Sie sie bis zum Gebrauch im Kühlschrank.
     Sehen Sie mindestens einen Streifen für die QFT-Plus-Standards und eine
     ausreichende Anzahl von Streifen für die zu testenden Patienten vor (siehe
     Abbildung 2). Bewahren Sie nach Gebrauch den Rahmen und den Deckel für die
     verbleibenden Streifen auf.
3.   Rekonstituieren Sie den IFN-γ-Standard mit der auf dem Etikett des Fläschchens
     angegebenen Menge an entionisiertem oder destilliertem Wasser. Mischen Sie
     vorsichtig, um die Schaumbildung zu minimieren, und vergewissern Sie sich, dass
     der Inhalt vollständig aufgelöst wurde. Durch Rekonstitution des Standards auf
     das angegebene Volumen erhält man eine Lösung mit einer Konzentration von
     8,0 IU/ml.
     Wichtiger Hinweis: Das Rekonstitutionsvolumen des Kitstandards ist je nach
     Charge unterschiedlich.
     Verwenden Sie den rekonstituierten Kitstandard zur Herstellung einer 1:2-
     Verdünnung von IFN-γ in grüner Verdünnungslösung (Green Diluent, GD), gefolgt
     von einer 1:4-Verdünnungsreihe (siehe Abbildung 1). S1 (Standard 1) enthält
     4,0 IU/ml, S2 (Standard 2) enthält 1,0 IU/ml, S3 (Standard 3) enthält 0,25 IU/ml
     und S4 (Standard 4) enthält 0 IU/ml (nur GD). Die Standards müssen mindestens
     als Doppelbestimmung getestet werden. Stellen Sie die Verdünnungen des
     Kitstandards für jeden ELISA-Durchgang frisch her.

     QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015                  17
Empfohlenes Verfahren für Doppelbestimmung der Standards
  a. 4 Röhrchen mit „S1“, „S2“, „S3“ bzw. „S4“ beschriften.

  b. Je 150 µl GD in S1, S2, S3 und S4 geben.

  c. 150 µl des Kitstandards in S1 geben und gründlich mischen.

  d. 50 µl von S1 in S2 überführen und gründlich mischen.

  e. 50 µl von S2 in S3 überführen und gründlich mischen.

  f.    GD allein dient als Nullstandard (S4).

                     Standard 1     Standard 2   Standard 3    Standard 4
  Rekonstituierter       4,0            1,0          0,25           0
   Kitstandard          IU/ml          IU/ml        IU/ml     IU/ml (Grüne
                                                              Verdünnungs-
                                                                 lösung)

Abbildung 1. Herstellung der Standardkurve.

4.     Rekonstituieren Sie das lyophilisierte 100x Konjugatkonzentrat mit 0,3 ml
       entionisiertem oder destilliertem Wasser. Mischen Sie vorsichtig, um die
       Schaumbildung zu minimieren, und vergewissern Sie sich, dass das Konjugat
       vollständig gelöst wurde.
       Das gebrauchsfertig verdünnte Konjugat wird hergestellt, indem Sie die
       erforderliche Menge des rekonstituierten 100x Konjugatkonzentrats in grüner
       Verdünnungslösung verdünnen (Tabelle 1. Vorbereitung des Konjugats). Nicht
       verbrauchtes 100x Konjugatkonzentrat sofort nach Gebrauch wieder bei 2 °C
       bis 8 °C lagern. Nur die grüne Verdünnungslösung verwenden.

       18                         QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015
Tabelle 1. Vorbereitung des Konjugats

 Anzahl der                    Menge an 100x                   Menge an grüner
 Streifen                     Konjugatkonzentrat              Verdünnungslösung
 2                                   10 µl                          1,0 ml

 3                                   15 µl                          1,5 ml

 4                                   20 µl                          2,0 ml

 5                                   25 µl                          2,5 ml

 6                                   30 µl                          3,0 ml

 7                                   35 µl                          3,5 ml

 8                                   40 µl                          4,0 ml

 9                                   45 µl                          4,5 ml

 10                                  50 µl                          5,0 ml

 11                                  55 µl                          5,5 ml

 12                                  60 µl                          6,0 ml

5.    Plasmaproben, die den Blutentnahmeröhrchen entnommen und vor dem Test
      gelagert oder tiefgekühlt wurden, müssen vor dem Einbringen in die ELISA-Wells
      sorgfältig gemischt werden.
     Wichtiger Hinweis: Wenn die Plasmaproben direkt aus den zentrifugierten QFT-
     Plus-Röhrchen zugegeben werden, ist jedes Mischen des Plasmas zu vermeiden.
     Achten Sie stets darauf, dass das Material an der Oberfläche des Gels nicht
     aufgewirbelt wird.
6.    Geben Sie mit Hilfe einer Mehrkanalpipette je 50 µl des frisch zubereiteten
      gebrauchsfertig verdünnten Konjugats in alle benötigten Wells der ELISA-Platte.
7.    Geben Sie je 50 µl der Plasmaproben mit einer Mehrkanalpipette in die
      entsprechenden Wells (siehe empfohlenen Plattenbelegungsplan in Abbildung 2).
      Geben Sie schließlich je 50 µl der Standards 1 bis 4 in die entsprechenden Wells.

     QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015                    19
1      2     3     4      5       6        7        8        9        10       11       12
A 1N        3N    5N    7N     9N      S1       S1       13 N     15 N     17 N     19 N     21 N
B    1 TB1 3 TB1 5 TB1 7 TB1 9 TB1     S2       S2       13 TB1   15 TB1   17 TB1   19 TB1   21 TB1
C    1 TB2 3 TB2 5 TB2 7 TB2 9 TB2     S3       S3       13 TB2   15 TB2   17 TB2   19 TB2   21 TB2
D    1M     3M    5M    7M     9M      S4       S4       13 M     15 M     17 M     19 M     21 M
E    2N     4N    6N    8N     10 N    11 N     12 N     14 N     16 N     18 N     20 N     22 N
F    2 TB2 4 TB1 6 TB1 8 TB1 10 TB1 11 TB1      12 TB1   14 TB1   16 TB1   18 TB1   20 TB1   22 TB1
G 2 TB2 4 TB2 6 TB2 8 TB2 10 TB2 11 TB2         12 TB2   14 TB2   16 TB2   18 TB2   20 TB2   22 TB2
H 2M        4M    6M    8M     10 M    11 M     12 M     14 M     16 M     18 M     20 M     22 M

Abbildung 2. Empfohlene Plattenbelegung (22 Tests pro Platte).
           S1 (Standard 1), S2 (Standard 2), S3 (Standard 3), S4 (Standard 4)
           1 N (Probe 1, Negativkontrolle-Plasma), 1 TB1 (Probe 1, TB1-Plasma), 1
            TB2 (Probe 1, TB2-Plasma), 1 M (Probe 1, Mitogen-Plasma)

8.   Decken Sie jede Platte mit einem Deckel ab und mischen Sie Konjugat und
     Plasmaproben/Standards 1 Minute lang gründlich, aber unter Vermeidung von
     Spritzern, auf einem Schüttler für Mikrotiterplatten.
9.   Decken Sie jede Platte mit einem Deckel ab und inkubieren Sie die Platten
     120 ± 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (22 °C ± 5 °C).
     Die Platten sollten während der Inkubation keinem direkten Sonnenlicht ausgesetzt
     sein.
10. Verdünnen Sie während der Inkubationszeit 1 Teil 20x Waschpufferkonzentrat
    mit 19 Teilen entionisiertem oder destilliertem Wasser und mischen Sie sorgfältig.
    Im Lieferumfang ist ausreichend 20x Waschpufferkonzentrat zur Herstellung von
    2 Litern gebrauchsfertig verdünntem Waschpuffer vorhanden.
     Waschen Sie die Wells mindestens 6-mal mit je 400 µl gebrauchsfertig
     verdünntem Waschpuffer. Wir empfehlen die Verwendung eines Wasch-
     automaten für Mikrotiterplatten.
     Sorgfältiges Waschen ist für die Leistung des Tests sehr wichtig. Achten Sie bei
     jedem Waschzyklus darauf, dass alle Wells vollständig bis oben mit Waschpuffer
     gefüllt sind. Es empfiehlt sich, den Waschpuffer bei jedem Zyklus mindestens 5
     Sekunden einwirken zu lassen.
     In den Auffangbehälter für Abfallflüssigkeit sollte ein laborübliches Desinfektions-
     mittel gegeben werden. Befolgen Sie zudem die in Ihrem Labor geltenden
     Anweisungen zur Dekontamination potenziell infektiösen Materials.
11. Klopfen Sie die Platten umgekehrt auf einem fusselarmen Papierhandtuch aus,
    um noch vorhandenen Waschpuffer zu entfernen. Geben Sie 100 µl der Enzym-
    substratlösung in jedes Well, decken Sie jede Platte mit einem Deckel ab und
    mischen Sie gründlich auf einem Schüttler für Mikrotiterplatten.

     20                 QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015
12. Decken Sie jede Platte mit einem Deckel ab und inkubieren Sie die Platten
    30 Minuten lang bei Raumtemperatur (22 °C ± 5 °C).
    Die Platten sollten während der Inkubation keinem direkten Sonnenlicht ausgesetzt
    sein.
13. Geben Sie nach der 30-minütigen Inkubation 50 µl Enzymstopplösung in jedes
    Well und mischen Sie anschließend.
    Die Enzymstopplösung sollte in der gleichen Reihenfolge und etwa im gleichen
    Tempo in die Wells gegeben werden wie das Substrat in Schritt 11.
14. Messen Sie innerhalb von 5 Minuten nach Stoppen der Reaktion die optische
    Dichte (OD) jedes Wells mit einem Mikrotiterplatten-Photometer unter Verwendung
    eines 450-nm-Filters und eines Referenzfilters zwischen 620 und 650 nm. Die OD-
    Werte werden für die Berechnung der Ergebnisse benötigt.

Berechnungen und Auswertung des Tests
Für die Analyse der Rohdaten und die Berechnung der Ergebnisse kann die QFT-Plus-
Analysesoftware verwendet werden, die im Internet unter www.QuantiFERON.com
heruntergeladen werden kann. Bitte achten Sie darauf, immer mit der neuesten
Version der QFT-Plus-Analysesoftware zu arbeiten.
Die Software führt eine Qualitätskontrolle des Tests durch, erstellt eine Standardkurve
und liefert für jeden Patienten ein Testergebnis nach der im Abschnitt „Interpretation
der Ergebnisse“ beschriebenen Methode.
Alternativ zur Verwendung der QFT-Plus-Analysesoftware können die Ergebnisse auch
wie im Folgenden beschrieben ermittelt werden.

Erstellung der Standardkurve

(Bei Nichtverwendung der QFT-Plus-Analysesoftware)
Ermitteln Sie für jede Platte die Mittelwerte der OD-Werte der Kitstandard-
Doppelbestimmungen.
Erstellen Sie eine log(e)-log(e)-Standardkurve durch Auftragen des log(e) des OD-
Mittelwerts (y-Achse) gegen den log(e) der IFN-γ-Konzentration der Standards in IU/ml
(x-Achse), unter Nichtberücksichtigung des Nullstandards. Berechnen Sie dann die
Regressionsgerade für diese Punkte.
Ermitteln Sie anhand der Standardkurve die IFN-γ-Konzentration (IU/ml) der einzelnen
Plasmaproben anhand ihrer OD-Werte.
Für diese Berechnungen können Software-Pakete für Mikrotiterplatten-Photometer
verwendet werden oder gängige Tabellenkalkulations- und Statistik-Programme (wie
beispielsweise Microsoft® Excel®). Wir empfehlen die Verwendung solcher Software-

   QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015                      21
Pakete zur Durchführung der Regressionsanalyse und zur Berechnung des
Variationskoeffizienten (%CV) der Standards sowie des Korrelationskoeffizienten (r)
der Standardkurve.

Qualitätskontrolle des Tests
Die Genauigkeit der Testergebnisse hängt von der Erstellung einer korrekten
Standardkurve ab. Daher müssen vor Auswertung der Testergebnisse die Ergebnisse
der Standards geprüft werden.
Der ELISA liefert gültige Ergebnisse, wenn alle nachstehenden Kriterien erfüllt sind:
    Der Mittelwert der OD von Standard 1 muss ≥ 0,600 sein.
    Der prozentuale Variationskoeffizient (%CV) der OD-Werte der
     Mehrfachbestimmungen von Standard 1 und Standard 2 muss ≤ 15 % sein.
    Die OD-Werte der Mehrfachbestimmungen von Standard 3 und Standard 4
     dürfen höchstens um 0,040 OD-Einheiten vom jeweiligen Mittelwert abweichen.
    Der aus den mittleren Absorptionswerten der Standards berechnete
     Korrelationskoeffizient (r) muss ≥ 0,98 sein.
Diese Qualitätskontrollparameter werden von der QFT-Plus-Analysesoftware berechnet
und ausgegeben.
Werden die obigen Kriterien nicht erfüllt, ist der Test ungültig und muss wiederholt
werden.
Der Mittelwert der OD des Nullstandards (grüne Verdünnungslösung) sollte ≤ 0,150
sein. Wenn der Mittelwert der OD > 0,150 ist, sollte das Verfahren zum Waschen
der Platten überprüft werden.

Interpretation der Ergebnisse
Die Ergebnisse des QFT-Plus-Tests werden gemäß den folgenden Kriterien interpretiert:
Wichtiger Hinweis: Die Diagnose bzw. der Ausschluss einer Tuberkulose-Erkrankung
sowie die Beurteilung der Wahrscheinlichkeit einer LTBI erfordern eine Kombination
von epidemiologischen, anamnestischen, medizinischen und diagnostischen
Ergebnissen; diese müssen bei der Interpretation der QFT-Plus-Testergebnisse
(Tabelle 2) in Betracht gezogen werden.

    22                 QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015
Tabelle 2. Interpretation QFT-Plus-Testergebnisse
    Negativ-     TB1 minus      TB2 minus       Mitogen          QFT-Plus           Bericht/Interpretation
    kontrolle    Negativ-       Negativ-        minus            Testergebnis
    (IU/ml)      kontrolle      kontrolle       Negativ-
                 (IU/ml)        (IU/ml)         kontrolle
                                                (IU/ml)*
                 ≥0,35 und
                 ≥ 25% der
                                   Beliebig
                 Negativ-
                 kontrolle                                                          Infektion mit
                                                    Beliebig     Positiv†           M. tuberculosis
                                ≥ 0,35 und                                          wahrscheinlich
                                ≥ 25% der
                   Beliebig
                                Negativ-
    ≤ 8,0
                                kontrolle

                  8,0§                          Beliebig                                        nicht ermittelt werden

∗ Die Werte der Mitogen-Positivkontrolle (und gelegentlich auch die TB-Antigen-Werte) liegen häufig
  außerhalb des Messbereichs des Mikrotiterplatten-Photometers. Dies hat für die Testergebnisse keine
  Konsequenzen.
†
    In Fällen, in denen eine Infektion mit M. tuberculosis nicht vermutet wird, können anfänglich positive
    Ergebnisse durch erneutes Testen der Original-Plasmaproben in Doppelbestimmung im QFT-Plus-ELISA
    bestätigt werden. Ergibt die Testwiederholung bei mindestens einer der zwei Probenmessungen ein
    positives Ergebnis, so ist das Testergebnis als positiv zu bewerten.
‡
    Mögliche Ursachen siehe Abschnitt „Hilfe zur Fehlersuche“.
§
    In klinischen Studien wiesen weniger als 0,25 % der Teilnehmer eine IFN-γ Konzentration von
    > 8,0 IU/ml bei der Negativkontrolle auf.

Aus der Höhe der gemessenen IFN-γ-Konzentration lassen sich keine Rückschlüsse auf
das Stadium oder den Grad der Infektion, das Ausmaß der Immunreaktivität oder die
Wahrscheinlichkeit einer Progression zu einer aktiven Erkrankung ziehen. Eine positive
TB-Reaktion bei Personen mit negativer Mitogen-Reaktion ist selten, wurde aber bei
Personen mit TB-Erkrankung beobachtet. Ein solches Ergebnis zeigt an, dass die IFN-γ-
Reaktion auf das TB-Antigen stärker ist als die auf das Mitogen. Dies ist grundsätzlich
möglich, da die Menge an Mitogen die IFN-γ-Produktion der Lymphozyten nicht
maximal stimuliert.

      QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015                                      23
Nein
                                                                                          TB1 - Negativk. und/oder
                                                                                        TB2 - Negativk. ≥ 0,35 IU/ml
      Interpretation
                                                                                                               Ja

                                                                        Nein
                                                                                           TB1 - Negativk. und/oder
                                                                                          TB2 - Negativk. ≥ 25% der
                                                                                          Negativkontrolle in IU/ml*

                                                                                                               Ja

                                  Mitogen - Negativk.         Ja                 Nein

      Validierung                    < 0,50 IU/ml                  Unschlüssig          Negativkontrolle ≤ 8,0 IU/ml
                             und/oder Negativk. > 8,0 IU/ml

                                Nein                                                                           Ja

                                                                                                   Positiv
                                       Negativ

* Die Werte für TB1 minus Negativkontrolle und TB2 minus Negativkontrolle sind nur dann gültig, wenn der ≥ 25 %
  der Negativkontrolle betragende Wert von dem gleichen Röhrchen stammt wie der ≥ 0,35 IU/ml betragende Wert.

Abbildung 3. Flussdiagramm zur Interpretation des QFT-Plus-Tests.

Grenzen des Verfahrens
Die Ergebnisse des QFT-Plus-Tests müssen im Zusammenhang mit der epidemiologischen
Anamnese jedes einzelnen Patienten, seinem derzeitigen Gesundheitszustand und
sonstigen diagnostischen Untersuchungen betrachtet werden.
Ergebnisse mit einem Negativkontrolle-Wert über 8,0 IU/ml werden als „unschlüssig“
bewertet, da eine um 25 % höhere Reaktion auf die TB-Antigene außerhalb des
Messbereichs des Tests liegen kann.
Unzuverlässige oder unschlüssige Ergebnisse können folgende Ursachen haben:
     Abweichungen von dem in dieser Packungsbeilage beschriebenen Verfahren
     Übermäßig hohe IFN-γ-Konzentration in der Blutbahn oder Vorliegen von
      heterophilen Antikörpern
     Überschreitung der Frist von 16 Stunden zwischen Blutabnahme und Inkubation
      bei 37 °C

    24                       QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015
Leistungsmerkmale

Klinische Studien
Da kein definitiver Standardtest für LTBI existiert, kann eine Abschätzung der Werte
für Empfindlichkeit und Spezifität des QFT-Plus-Tests nicht direkt vorgenommen
werden. Die Spezifität des QFT-Plus-Tests wurde annähernd abgeschätzt durch
Ermittlung der Falsch-positiv-Rate bei Personen mit geringem Risiko für eine
Tuberkuloseinfektion (keine Risikofaktoren bekannt). Die Empfindlichkeit wurde
annähernd abgeschätzt durch Auswertung von Patientengruppen mit durch Kultur
bestätigter aktiver Tuberkulose.

Spezifität
An einer Studie zur Bewertung der Spezifität des QFT-Plus-Tests nahmen 409 Pro-
banden teil. Die demographischen Angaben und Tuberkulose-Risikofaktoren wurden
mit Hilfe eines standardisierten Fragebogens zum Zeitpunkt des Tests ermittelt.
Bei Zusammenfassung der Ergebnisse der 2 Patientengruppen mit geringem Risiko für
eine Tuberkuloseinfektion (keine Risikofaktoren bekannt) betrug die Spezifität des QFT-
Plus-Tests insgesamt 97,6 % (399/409) (Tabellen 3 und 4).
Tabelle 3. Ergebnisse der Studie zur Spezifität des QFT-Plus-Tests nach
Studienzentrum

 Studie              Positiv           Negativ           Unschlüssig       Spezifität (95%-KI)
 Japan                  4                203                  0             98 % (95–100)

 Australien             6                196                  0              97 % (94–99)

Tabelle 4. Ergebnisse der Studie zur Spezifität des QFT-Plus-Tests nach TB-Antigen-
Röhrchen
                               TB1                 TB2                      QFT-Plus
 Positiv                        5                  10                          10

 Negativ                       404                399                          399

 Unschlüssig                    0                   0                           0

 Spezifität               98,8 %                 97,6 %                      97,6 %
 (95%-KI)               (97,2–99,6)            (95,6–98,8)                 (95,6–98,8)

    QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015                     25
Empfindlichkeit für aktive Tuberkulose
Für LTBI existiert kein definitiver Standardtest; zur Ermittlung der Empfindlichkeit
ist aber eine mikrobiologische Kultur von M. tuberculosis ein geeigneter Ersatz,
da erkrankte Personen per Definition infiziert sind. Zur Ermittlung der
Empfindlichkeit des QFT-Plus-Tests wurden Personen mit Verdacht auf Tuberkulose,
deren M.-tuberculosis–Infektion anschließend durch Kultur bestätigt worden war,
aus 4 Prüfzentren in Australien und Japan getestet (Tabellen 5 und 6). Die
Patienten waren vor der Blutentnahme für den QFT-Plus-Test weniger als 14 Tage
lang behandelt worden.
Bei Zusammenfassung der Ergebnisse der 4 Patientengruppen von M.-tuberculosis-
kulturpositiven Patienten betrug die Empfindlichkeit des QFT-Plus-Tests insgesamt
95,3 % (164/172). In den 4 Gruppen waren 159 Patienten positiv aufgrund von
sowohl TB1- als auch TB2-Röhrchen, 1 Patient war nur positiv aufgrund von TB1
und 4 waren nur positiv aufgrund von TB2. Insgesamt war bei 1,1 % (2/174)
der Tests das Ergebnis unschlüssig. Durch das TB2-Ergebnis wurde 1 durch Kultur
bestätigter Patient korrekt identifiziert, der anhand des TB1-Ergebnisses allein als
unschlüssig (niedriger Mitogen-Wert) eingestuft worden wäre (siehe Tabellen 5
und 6).
Tabelle 5. Ergebnisse der Studie zur Empfindlichkeit des QFT-Plus-Tests
nach Studienzentrum
                             Positiv       Negativ        Unschlüssig     Empfindlichkeit* QFT-
Studienzentren
                                                                             Plus (95%-KI)
Zentrum Japan 1                36             7                0              84 % (69–93)

Zentrum Japan 2                53             1                2              98 % (90–100)

Zentrum Japan 3                54             0                0             100 % (93–100)

Zentrum Australien             21             0                0             100 % (84–100)

* Die Empfindlichkeit wird auf Grundlage der Gesamtzahl an gültigen Tests, ohne unschlüssige Ergebnisse,
 berechnet.

    26                     QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015
Tabelle 6. Ergebnisse der Studie zur Empfindlichkeit des QFT-Plus-Tests nach TB-
Antigen-Röhrchen
                                 TB1                     TB2                       QFT-Plus
    Positiv                      160                    163                           164

    Negativ                      11                       9                            8

    Unschlüssig                   3                       2                            2

    Empfindlichkeit†          93,6 %                  94,8 %                       95,3 %
    (95%-KI)                (88,8–96,7)             (90,3–97,6)                  (90,9–97,9)

†
    Die Empfindlichkeit wird auf Grundlage der Gesamtzahl an gültigen Tests, ohne unschlüssige Ergebnisse,
    berechnet.

Beobachtete Verteilung der Werte – stratifiziert nach Risiko
Die in klinischen Studien beobachteten Werte der IFN-γ-Reaktion in TB1-, TB2- und
Kontrollröhrchen wurden nach dem Risiko für eine M.-tuberculosis-Infektion stratifiziert
(Abbildungen 4–7). Die Zusammensetzung der Gruppe mit uneinheitlichem Risiko
entspricht der einer allgemeinen Testpopulation aus Probanden mit und ohne
Risikofaktoren für TB-Exposition, bei der eine aktive Tuberkulose unwahrscheinlich ist
(also ein positives Ergebnis in der Regel auf LTBI zurückzuführen ist).

       QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015                                 27
A    Anzahl der Probanden

B    Anzahl der Probanden

C
     Anzahl der Probanden

Abbildung 4. Verteilung für die Negativkontrolle. A. Verteilung der Werte der
Negativkontrolle in einer Population mit geringem Risiko (n = 409). B. Verteilung der
Werte der Negativkontrolle in einer Population mit uneinheitlichem Risiko (n = 194).
C. Verteilung der Werte der Negativkontrolle in einer Population mit durch Kultur
bestätigter M.-tuberculosis-Infektion (n = 174).

    28                 QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015
A
      Anzahl der Probanden

      Anzahl der Probanden
B

C     Anzahl der Probanden

Abbildung 5. Verteilung für TB1 und TB2 (minus Negativkontrolle). A. Verteilung
der TB1- und TB2-Werte (minus Negativkontrolle) in einer Population mit
geringem Risiko (n = 409). B. Verteilung der TB1- und TB2-Werte (minus
Negativkontrolle) in einer Population mit uneinheitlichem Risiko (n = 194).
C. Verteilung der TB1- und TB2-Werte (minus Negativkontrolle) in einer
Population mit durch Kultur bestätigter M.-tuberculosis-Infektion (n = 174).

    QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015             29
A
          Anzahl der Probanden

B
          Anzahl der Probanden

 C        Anzahl der Probanden

Abbildung 6. Verteilung für Mitogen (minus Negativkontrolle). A. Verteilung der
Mitogenwerte (minus Negativkontrolle) in einer Population mit geringem Risiko
(n = 409). B. Verteilung der Mitogenwerte (minus Negativkontrolle) in einer
Population mit uneinheitlichem Risiko (n = 194). C. Verteilung der Mitogen-
werte (minus Negativkontrolle) in einer Population mit durch Kultur bestätigter
M.-tuberculosis-Infektion (n = 169).

     30                    QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015
Geringes Risiko Uneinheitliches Risiko     Aktive TB
                    Risiko einer MTB-Infektion

Abbildung 7. Beobachtete Differenzen der TB1- und TB2-Werte (minus
Negativkontrolle), stratifiziert nach Risiko. Population mit geringem Risiko
(n = 409), Population mit uneinheitlichem Risiko (n = 189) und Population mit
durch Kultur bestätigter M.-tuberculosis-Infektion (n = 141). Die TB1-Werte
wurden von den TB2-Werten abgezogen. Probanden mit Werten für TB1 oder
TB2 > 10,0 IU/ml wurden von der Auswertung ausgeschlossen, da die Werte
außerhalb des linearen Bereichs des Tests liegen.

Leistungsmerkmale des Tests
Die Linearität des QFT-Plus-ELISA wurde gezeigt in einem Experiment, in dem
11 Plasmapools mit bekannten IFN-γ-Konzentrationen jeweils als Fünffach-
bestimmungen in zufälliger Anordnung auf der ELISA-Platte verteilt wurden.
Die Regressionsgerade hat eine Steigung von 1,002 ± 0,011 und einen
Korrelationskoeffizienten von 0,99 (Abbildung 8).
Die Nachweisgrenze des QFT-Plus-ELISA liegt bei 0,05 IU/ml und es gibt keine
Anzeichen für einen High-Dose-Hook-Effekt (Prozonenphänomen) bei IFN-γ-
Konzentrationen bis zu 10.000 IU/ml.

   QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015            31
Bestimmter IFN-γ-Wert (IU/ml)

                                         Erwarteter IFN-γ-Wert (IU/ml)

Abbildung 8. Linearitätsprofil des QFT-Plus-ELISA.
Die Intra- und Inter-Assay-Unpräzision (% CV) des QFT-Plus-ELISA wurden
bestimmt durch Untersuchung von 20 Plasmaproben mit verschiedenen IFN-γ-
Konzentrationen als Dreifachbestimmungen, in 3 Laboren, an 3 nicht
aufeinander folgenden Tagen und durch 3 verschiedene Mitarbeiter. Jede
Probe wurde also 27-mal getestet, in 9 unabhängigen Testdurchläufen. Eine
Probe war die Negativkontrolle, ihre IFN-γ-Konzentration wurde mit 0,08 (95%-
KI 0,07–0,09) IU/ml bestimmt. Die übrigen 19 Plasmaproben umspannten
einen Konzentrationsbereich von 0,33 (95%-KI 0,31–0,34) bis 7,7 IU/ml
(95%-KI 7,48–7,92).
Die Unpräzision innerhalb eines Testdurchlaufs („Intra-Assay“) wurde
abgeschätzt durch Bildung des Mittelwerts der prozentualen Variations-
koeffizienten (%CV) jeder IFN-γ enthaltenden Plasmaprobe für die einzelnen
Testplatten (n = 9). Die Unpräzision lag zwischen 4,1 und 9,1 %CV. Im Mittel
betrug die Kovarianz (± 95%-KI) innerhalb eines Testdurchlaufs 6,6 % ± 0,6 %.
Für die Plasmaprobe ohne IFN-γ betrug der prozentuale Variationskoeffizient im
Mittel 14,1 %.
Die Gesamtunpräzision („Inter-Assay“) wurde bestimmt durch Vergleich der 27
berechneten IFN-γ-Konzentrationswerte jeder Plasmaprobe. Die Inter-Assay-
Unpräzision lag zwischen 6,6 und 12,3 %CV. Im Mittel betrug der prozentuale
Variationskoeffizient (%CV ± 95%-KI) insgesamt 8,7 % ± 0,7 %. Für die
Plasmaprobe ohne IFN-γ betrug der Wert 26,1 % (%CV). Diese Größen-
ordnung ist zu erwarten, da die berechnete IFN-γ-Konzentration sehr niedrig ist
und die Variation um einen niedrigen Konzentrationswert stärker ist als bei
höheren Konzentrationen.
Zur Bestimmung der Reproduzierbarkeit des QFT-Plus-Tests wurden Blutproben
von 102 Probanden mit uneinheitlichen Risikofaktoren für eine M.-tuberculosis-

   32                                    QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015
Sie können auch lesen