Fit für die Zukunft: SciVario twin - Eppendorf Corporate
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Nr. 54 – 2021
> >
Fit für die Zukunft:
SciVario® twin (BN 54) JANUAR 2021
Parallele Fed-Batch CHO-Kultur
auf dem SciVario® twin
SEITE 1
AMANDA SUTTLE UND MA SHA, EPPENDORF, INC., ENFIELD, CT, USA
KONTAKT: BIOPROCESS-EXPERTS@EPPENDORF.COM
> Centrifuge 5425 R: mehr Coolness, für Sie und Ihre Proben
Zusammenfassung Der pH wurde mit einem potentiometrischen Sensor gemes-
sen, welcher steril in eine zusätzliche PG 13.5 Schnittstelle der
Wir führten Fed-Batch Kulturen in BioBLU® 1c und 3c Einweg-
biologischen Sicherheitswerkbank eingeführt wurde, nachdem
bioreaktoren durch, welche parallel durch das neue SciVario
er zuvor separat in einem autoklavierbaren Beutel sterilisiert
twin Bioreaktor-Steuerungssystem kontrolliert wurden. Dieser
worden war. Der pH wurde durch eine Kaskade von CO2 (Säure)
Versuchsaufbau unterstreicht die Fähigkeiten des SciVario
und 0,45 M Natriumbikarbonat (Base) bei 7,0 gehalten (Tot-
twin, komplexe Prozesse in Gefäßen unterschiedlicher Größen
zone = 0,1). Alle Kulturen wurden bei einer endgültigen Dichte
zu steuern. Unsere 3 L CHO-Kultur erreichte eine maximale
zwischen 0,25 und 0,27 x 106 Zellen/mL angeimpft. Die Zellen
Zelldichte von über 17 x 106 Zellen pro mL am 11. Tag mit mini-
wurden bei einer konstanten Temperatur von 37 °C kultiviert.
malem Bedienungsaufwand. Die Experimente verdeutlichten
Tabelle 1 fasst wichtige Prozessparameter zusammen.
> Kostenreduktion im Zellkulturlabor
sowohl die Flexibilität als auch die Leistungsfähigkeit der
Fed-Batch Zellkultur auf der SciVario twin Plattform. Parameter 1c Sollwerte 3c Sollwerte
Startvolumen 500 mL 1,5 L
Einleitung
Endvolumen 1L 3L
Der SciVario twin ist das erste von Eppendorf entwickelte Nährlösung Dosierungsrate 5 % des Gesamtvolumens 5 % des Gesamtvolumens
pro Tag pro Tag
Bioreaktor-Steuerungssystem, welches zwei Bioreaktoren
Glukose Bolus Dosierungsziel > 3 g/L > 3 g/L
sowohl parallel als auch individuell steuern kann. Diese
Agitation 230 rpm (0,6 tip speed) 174 rpm (0,6 tip speed)
dynamische, einfach zu bedienende Bioprozess-Steuerung
Temperatur 37 °C 37 °C
passt sich flexibel an Ihre Bedürfnisse an und kann sowohl
DO Sensor polarographischer Sensor polarographischer Sensor
Glas- als auch BioBLU-Einwegbioreaktoren steuern. Zukünf- DO Sollwert 50 %, (P= 0,1; I= 0,001) 50 %, (P= 0,2; I= 0,002)
tige Software-Aktualisierungen und modulare Hardware- pH Sensor potentiometrisch potentiometrisch
> Eppendorf Planet of Knowledge: virtuelle Erlebniswelt
Erweiterungen ermöglichen Anpassungen an Ihre Prozesse pH Sollwert 7,0 (Totzone = 0,1), CO 2 Kaskade (Säure)
ohne die Notwendigkeit, in ein neues Steuerungssystem zu Kaskade mit 0,45 M Sodium Bicarbonat (Base)
investieren. Ziel Inokulationsdichte 0,3 x 10 6 Zellen/mL 0,3 x 10 6 Zellen/mL
Begasungsrate 0,02 SLPH – 30 SLPH 0,02 SLPH – 90 SLPH
Die breite Spannweite an Gasdurchflussraten deckt sowohl Begasungskaskade Der O 2 Sollwert in % Der O 2 Sollwert in %
geringe Sauerstoffbedarfe bei Standard Batch-Läufen als auch wurde bei 30 % auf 21 % wurde bei 30 % auf 21 %
und ab 100 % auf 100 % und ab 100 % auf 100 %
hohe Bedarfe bei Kulturen mit hoher Zelldichte ab. Hierdurch gestellt. Die Flussrate gestellt. Die Flussrate
wurde bei 0 % (bei Bedarf) wurde bei 0 % (bei Bedarf)
wird es ermöglicht, einfache und komplexe Protokolle zur auf 0,02 SLPH, und bei auf 0,02 SLPH, und bei
gleichen Zeit durchzuführen. Als erstes Bioprozess-Steuerungs- 100 % (bei Bedarf) auf 100 % (bei Bedarf) auf
30 SLPH gestellt. 90 SLPH gestellt.
system mit VisioNize®-onboard ist der SciVario twin mit einer
intuitiven Benutzeroberfläche ausgestattet, die bereits in ande- Tabelle 1: Zusammenfassung der Prozessparameter aller Zellkultur-Durchläufe
ren Eppendorf-Produkten wie z.B. PCR-Cyclern, Inkubations-
Probenentnahme und Analytik
schüttlern und Gefriergeräten zur Anwendung kommt.
Täglich wurden aus jedem Bioreaktor zwei Proben entnommen,
In dieser Application Note beschreiben wir die parallele
um offline Werte zu überprüfen, wie z.B. Zelldichte, Viabilität,
Prozesssteuerung von Fed-Batch CHO-Kulturen in 1 L und 3 L
Glukose, Ammoniak (NH3), Laktat und die Konzentration des
BioBLU Einwegbioreaktoren.
hMAb.
Application Notes
Material und Methoden
Anhand des offline pH-Wertes wurde die pH-Kalibrierung der
Verfahren Steuerung, wenn nötig, täglich abgeglichen, um Diskrepanzen
zwischen online und offline Messungen zu vermeiden. Mit
Sämtliche Experimente wurden mit einer CHO Suspensions-
Hilfe der erhaltenen offline Glukosekonzentration wurde die
Zelllinie von TPG Biologics, Inc. durchgeführt, welche einen
Glukose-Zielkonzentration innerhalb der Kultur erreicht, indem
humanen monoklonalen Antikörper (hMAb) exprimiert.
die entsprechende Menge an 200 g/L steriler Glukoselösung
Alle Experimente wurden in mit 8 mM L-Glutamin und 1 % nach Bedarf in die Kultur gepumpt wurde.
Gibco® Anti-Clumping-Mittel (ThermoFisher Scientific) ver-
Fütterung
Parallele Fed-Batch CHO-Kultur auf dem SciVario® twin ∙ Mikroinjektion in Zebrafisch-
setztem Dynamis™ AGT ™ Medium (ThermoFisher Scientific)
durchgeführt. Das Bioreaktor-Inokulum wurde in einem Wir führten die Bolus-Glukosefütterung wie oben beschrieben
New Brunswick™ S41i CO2 Inkubationsschüttler angesetzt.* durch, mit einer endgültigen Zielkonzentration von > 3 g/L in
beiden Läufen. Falls die Glukosekonzentration zum Zeitpunkt
Bioreaktor Steuerungs- und Prozessparameter
der Probenentnahme bei oder unter 3 g/L lag, wurden die Bio-
Für alle Experimente wurde gelöster Sauerstoff (DO) mit Hilfe reaktoren auf ~4 g/L Bolus gefüttert. Eine der Hauptstrategien
eines polarographischen Sensors (Mettler Toledo®) ermittelt zur Gesunderhaltung der CHO-Kultur ist es, die Ammoniakkon-
und mittels Begasung mit Luft und/oder O2 durch Anwender- zentration niedrig zu halten – bei maximal 3 mmol/L – indem,
und Medaka-Embryonen im Frühstadium: von der Transgenese bis zu CRISPR ∙ etc.
definierte Kaskaden auf 50 % eingestellt. wenn nötig, die Fütterungsrate angepasst wird.
Your local distributor: www.eppendorf.com/contact
Eppendorf AG · Barkhausenweg 1 · 22339 Hamburg · Germany · E-Mail: eppendorf@eppendorf.com · www.eppendorf.com
2 EDITORIAL · WILLKOMMEN
Impressum
Herausgeber
Eppendorf AG, Barkhausenweg 1,
22339 Hamburg, Deutschland
Telefon: + 49 40 53 801- 0
Fax: + 49 40 53 801- 556
E-Mail: bionews@eppendorf.de
www.eppendorf.com/bionews
Redaktionsteam
Berrit Hoff (Projektleitung),
Dr. Jan-Hendrik Bebermeier,
Dr. Tanja Musiol, Natascha Weiß
Gestaltung
Holger Paulsen Grafik-Design, Hamburg
Druck
MOD Offsetdruck GmbH, Dassow
Bildnachweis
Alle Bilder Eppendorf AG. Ausnahmen:
S. 12: PhagoMed Biopharma GmbH;
S. 14 links: Tony Luong; S. 14 rechts: ETH
Willkommen Zürich; S. 24: Science/AAAS; Application
Note S. 5 – 6: COS Heidelberg
Kontakt
bei einer neuen Ausgabe der BioNews. Im Leitartikel und in der Application Note 1– 2 Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH
stellen wir Ihnen das modulare Bioreaktor-Steuerungssystem SciVario® twin vor. Mit Peter-Henlein-Str. 2
SciVario twin können Sie sich schnell und effizient an geänderte Anforderungen im 50389 Wesseling-Berzdorf
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Eppendorf sein Zentrifugengeschäft für die Pharma- und Life-Science-Branchen so-
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wie für die akademische und industrielle Forschung (S. 7).
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Mehrere Labore rasch zu einer Einheit vernetzen und experimentelle Arbeit über ver- 4124 Schönenbuch/Basel
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virtuelle Eppendorf-Erlebniswelt, kreiert und stetig aktualisiert von realen Eppendorf- Ihre Beiträge sind willkommen. Für unver-
Kollegen (S. 13). langt eingesandte Manuskripte wird keine
Verantwortung übernommen. Die Einfüh-
Damit wir alle in nicht allzu ferner Zukunft auch wieder persönlich in Kontakt treten
rung von Produkten kann in verschiedenen
können, läuft die SARS-CoV-2-Forschung und Impfstoffentwicklung unverändert auf
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Hochtouren. Wissenschaftler weltweit ringen täglich um neue Erkenntnisse auf dem
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die alle Geschlechter einbezieht.
und Workflow-Lösungen für die SARS-CoV-2-Forschung.
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vorbehalten. Alle Rechte vorbehalten,
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einschließlich der Grafiken und Bilder.
Markenhinweise auf Seite 14.
PS: Möchten Sie uns etwas mitteilen zur BioNews? Haben Sie Ideen und Wünsche? Dann schreiben Sie eine Mail an © Copyright Eppendorf AG, Januar 2021.
bionews@eppendorf.de. Wir freuen uns auf Ihr Feedback!
Klimaneutral gedruckt in Deutschland.
INHALT 3
6 8 9
IM BLICKPUNKT Ist mein Bioreaktor-Steuerungssystem fit für die Zukunft? 4–5
LABORPRAXIS Kostenreduktion im Zellkulturlabor 8
Nachhaltigkeit im Labor: eine kontinuierliche Reise 11
Mehrere Labore rasch zu einer Einheit vernetzen 12
INNOVATION Mehr Coolness, für Sie und Ihre Proben 6
NAHAUFNAHME Get Ready to Move It ! ®
13
NEWS / TIPPS epServices in der Eppendorf App 5
> >
Noch mehr Zentrifugen von Eppendorf 7
Auf Kundenwunsch noch vielseitiger 7
Top-Produkte + Geringere Lebensdauerkosten = Eppendorf OEM 9
Lassen Sie uns über morgen sprechen! 10
Lauren Orefice & Randall Platt: Hamburg-Besuche verschoben 14
SERVICE Eppendorf Planet of Knowledge: Ihre virtuelle Erlebniswelt 13
Markenhinweise 14
Preisrätsel: Move It® Pipette zu gewinnen 15
AMANDA SUTTLE, MA SHA
(BN 54) JANUAR 2021 SEITE 1
Parallele Fed-Batch CHO-Kultur
auf dem SciVario® twin
AMANDA SUTTLE UND MA SHA, EPPENDORF, INC., ENFIELD, CT, USA
KONTAKT: BIOPROCESS-EXPERTS@EPPENDORF.COM
Parallele Fed-Batch CHO-Kultur 1– 2
auf dem SciVario® twin
Zusammenfassung Der pH wurde mit einem potentiometrischen Sensor gemes-
sen, welcher steril in eine zusätzliche PG 13.5 Schnittstelle der
Wir führten Fed-Batch Kulturen in BioBLU® 1c und 3c Einweg-
biologischen Sicherheitswerkbank eingeführt wurde, nachdem
bioreaktoren durch, welche parallel durch das neue SciVario
er zuvor separat in einem autoklavierbaren Beutel sterilisiert
twin Bioreaktor-Steuerungssystem kontrolliert wurden. Dieser
worden war. Der pH wurde durch eine Kaskade von CO2 (Säure)
Versuchsaufbau unterstreicht die Fähigkeiten des SciVario
und 0,45 M Natriumbikarbonat (Base) bei 7,0 gehalten (Tot-
twin, komplexe Prozesse in Gefäßen unterschiedlicher Größen
zone = 0,1). Alle Kulturen wurden bei einer endgültigen Dichte
zu steuern. Unsere 3 L CHO-Kultur erreichte eine maximale
zwischen 0,25 und 0,27 x 106 Zellen/mL angeimpft. Die Zellen
Zelldichte von über 17 x 106 Zellen pro mL am 11. Tag mit mini-
wurden bei einer konstanten Temperatur von 37 °C kultiviert.
malem Bedienungsaufwand. Die Experimente verdeutlichten
MARC-MANUEL HAHN
Tabelle 1 fasst wichtige Prozessparameter zusammen.
sowohl die Flexibilität als auch die Leistungsfähigkeit der
Fed-Batch Zellkultur auf der SciVario twin Plattform. Parameter 1c Sollwerte 3c Sollwerte
Startvolumen 500 mL 1,5 L
Einleitung
Skalierbare Automation der Library Preparation von AmpliSeq™
Endvolumen 1L 3L
3–4
Der SciVario twin ist das erste von Eppendorf entwickelte Nährlösung Dosierungsrate 5 % des Gesamtvolumens 5 % des Gesamtvolumens
pro Tag pro Tag
Bioreaktor-Steuerungssystem, welches zwei Bioreaktoren
Glukose Bolus Dosierungsziel > 3 g/L > 3 g/L
sowohl parallel als auch individuell steuern kann. Diese
Agitation 230 rpm (0,6 tip speed) 174 rpm (0,6 tip speed)
dynamische, einfach zu bedienende Bioprozess-Steuerung
Temperatur 37 °C 37 °C
passt sich flexibel an Ihre Bedürfnisse an und kann sowohl
für Illumina® Kits auf der epMotion®
DO Sensor polarographischer Sensor polarographischer Sensor
Glas- als auch BioBLU-Einwegbioreaktoren steuern. Zukünf- DO Sollwert 50 %, (P= 0,1; I= 0,001) 50 %, (P= 0,2; I= 0,002)
tige Software-Aktualisierungen und modulare Hardware- pH Sensor potentiometrisch potentiometrisch
Erweiterungen ermöglichen Anpassungen an Ihre Prozesse pH Sollwert 7,0 (Totzone = 0,1), CO 2 Kaskade (Säure)
ohne die Notwendigkeit, in ein neues Steuerungssystem zu Kaskade mit 0,45 M Sodium Bicarbonat (Base)
investieren. Ziel Inokulationsdichte 0,3 x 10 6 Zellen/mL 0,3 x 10 6 Zellen/mL
Begasungsrate 0,02 SLPH – 30 SLPH 0,02 SLPH – 90 SLPH
Die breite Spannweite an Gasdurchflussraten deckt sowohl Begasungskaskade Der O 2 Sollwert in % Der O 2 Sollwert in %
geringe Sauerstoffbedarfe bei Standard Batch-Läufen als auch wurde bei 30 % auf 21 % wurde bei 30 % auf 21 %
und ab 100 % auf 100 % und ab 100 % auf 100 %
hohe Bedarfe bei Kulturen mit hoher Zelldichte ab. Hierdurch gestellt. Die Flussrate gestellt. Die Flussrate
THOMAS THUMBERGER, JOACHIM WITTBRODT, SANDRA STOBRAWA
wurde bei 0 % (bei Bedarf) wurde bei 0 % (bei Bedarf)
wird es ermöglicht, einfache und komplexe Protokolle zur auf 0,02 SLPH, und bei auf 0,02 SLPH, und bei
gleichen Zeit durchzuführen. Als erstes Bioprozess-Steuerungs- 100 % (bei Bedarf) auf 100 % (bei Bedarf) auf
30 SLPH gestellt. 90 SLPH gestellt.
system mit VisioNize®-onboard ist der SciVario twin mit einer
intuitiven Benutzeroberfläche ausgestattet, die bereits in ande- Tabelle 1: Zusammenfassung der Prozessparameter aller Zellkultur-Durchläufe
Mikroinjektion in Zebrafisch- und Medaka-Embryonen
ren Eppendorf-Produkten wie z.B. PCR-Cyclern, Inkubations-
5–6
Probenentnahme und Analytik
schüttlern und Gefriergeräten zur Anwendung kommt.
Täglich wurden aus jedem Bioreaktor zwei Proben entnommen,
In dieser Application Note beschreiben wir die parallele
um offline Werte zu überprüfen, wie z.B. Zelldichte, Viabilität,
Prozesssteuerung von Fed-Batch CHO-Kulturen in 1 L und 3 L
Glukose, Ammoniak (NH3), Laktat und die Konzentration des
BioBLU Einwegbioreaktoren.
im Frühstadium: von der Transgenese bis zu CRISPR
hMAb.
Material und Methoden
Anhand des offline pH-Wertes wurde die pH-Kalibrierung der
Verfahren Steuerung, wenn nötig, täglich abgeglichen, um Diskrepanzen
zwischen online und offline Messungen zu vermeiden. Mit
Sämtliche Experimente wurden mit einer CHO Suspensions-
Hilfe der erhaltenen offline Glukosekonzentration wurde die
Zelllinie von TPG Biologics, Inc. durchgeführt, welche einen
Glukose-Zielkonzentration innerhalb der Kultur erreicht, indem
humanen monoklonalen Antikörper (hMAb) exprimiert.
die entsprechende Menge an 200 g/L steriler Glukoselösung
Alle Experimente wurden in mit 8 mM L-Glutamin und 1 % nach Bedarf in die Kultur gepumpt wurde.
Gibco® Anti-Clumping-Mittel (ThermoFisher Scientific) ver-
Fütterung
SIOK-FONG CHIN, RAFAL GRZESKOWIAK
setztem Dynamis™ AGT ™ Medium (ThermoFisher Scientific)
durchgeführt. Das Bioreaktor-Inokulum wurde in einem Wir führten die Bolus-Glukosefütterung wie oben beschrieben
New Brunswick™ S41i CO2 Inkubationsschüttler angesetzt.* durch, mit einer endgültigen Zielkonzentration von > 3 g/L in
7– 8
beiden Läufen. Falls die Glukosekonzentration zum Zeitpunkt
Bioreaktor Steuerungs- und Prozessparameter
Plastik statt Glas: Vergleich der UPLC-Spektren von Proben, die in Glas
der Probenentnahme bei oder unter 3 g/L lag, wurden die Bio-
Für alle Experimente wurde gelöster Sauerstoff (DO) mit Hilfe reaktoren auf ~4 g/L Bolus gefüttert. Eine der Hauptstrategien
eines polarographischen Sensors (Mettler Toledo®) ermittelt zur Gesunderhaltung der CHO-Kultur ist es, die Ammoniakkon-
und mittels Begasung mit Luft und/oder O2 durch Anwender- zentration niedrig zu halten – bei maximal 3 mmol/L – indem,
definierte Kaskaden auf 50 % eingestellt. wenn nötig, die Fütterungsrate angepasst wird.
Your local distributor: www.eppendorf.com/contact
Eppendorf AG · Barkhausenweg 1 · 22339 Hamburg · Germany · E-Mail: eppendorf@eppendorf.com · www.eppendorf.com
bzw. in Eppendorf Conical Tubes 25 mL bearbeitet wurden
4 IN THE SPOTLIGHT · IST MEIN BIOREAKTOR-STEUERUNGSSYSTEM FIT FÜR DIE ZUKUNFT?
DAVID SOLBACH, EPPENDORF AG BIOPROCESS CENTER, JÜLICH
Ist mein Bioreaktor-Steuerungs
system fit für die Zukunft?
Während sich der Markt für biologische Präparate stets weiterentwickelt, erfährt die pharmazeutische Industrie
einen Paradigmenwechsel, weg von der Produktion von Blockbuster-Medikamenten hin zu gezielten patienten-
spezifischen Medikamenten. Auch die Entwicklung von neuen, nukleinsäure-basierten Impfstoffen erfordert ein
Umdenken der Produktionsanlagen, da signifikant geringere Produktionsvolumina benötigt werden. Das modulare
Bioreaktor-Steuerungssystem SciVario® twin bietet die Flexibilität, sich den verändernden Anforderungen moder-
ner Arbeitsabläufe im Labor anzupassen.
Die Flexibilität des Systems spiegelt sich
in jedem einzelnen Aspekt wider. Zum
Beispiel werden moderne thermische
Massendurchflussregler (TMFCs) benö-
tigt, um auch in größeren Maßstäben
> eine zuverlässige und präzise Gaszufuhr
>
zu gewährleisten. Derzeitige TMFCs
sind entweder für kleine oder größere
Volumina optimiert. Ausgestattet mit 14
unserer selbst entwickelten und optimier-
ten TMFCs, mit einem Reduzierverhält-
nis von 12.000:1, kann der SciVario twin
Bioprozesscontroller sowohl für kleinfor-
matige Bioreaktoren als auch für Bioreak-
toren im Laborbankformat mit Volumina
von 0,2 L bis 3,7 L ohne Hardware-Modifi-
kationen eingesetzt werden. Schon bald
wird das Angebot an Gefäßen für Zell-
kulturanwendungen um Bioreaktoren zum
Einmalgebrauch mit Arbeitsvolumina bis
zu 40 L erweitert werden.
Eine Steuerung voller Innovationen
Der SciVario twin wurde entwickelt, um
Zukunftsfähiges Equipment für sich bors auf neue Projekte. Die Ausrichtung
zwei Bioreaktoren zum Einmalgebrauch
verändernde Anforderungen eines Labors zu verändern zieht zahl
oder Bioreaktoren aus Glas im Volumen-
reiche Probleme nach sich. Vorhandene
„Ein großer Vorteil der neuen Steuereinheit bereich von 0,2 L bis 40 L individuell
Bioreaktor-Steuerungssysteme benöti-
ist die ausgeklügelte Modularität, die einen oder parallel zu steuern. Dabei setzt er
gen u. U. neue Hardware-Konfiguratio-
einfachen Austausch verschiedener Gefäß- neue Maßstäbe in Bezug auf Flexibilität,
nen oder müssen im ungünstigsten Fall
größen ermöglicht, ohne in ein komplett Präzision und Anwendungsspektrum.
komplett ausgewechselt werden, weil
neues Steuerungssystem zu investieren.“
sie den neuen Anforderungen nicht ge- Diese Flexibilität wird durch die fort-
SenseUp GmbH, Dr. Regina Mahr
wachsen sind. Für heutige und zukünfti- schrittliche Hardware der Basiseinheit
Die derzeitige Pandemie zeigt, wie wich- ge Anforderungen entwickelt, wird der ermöglicht. Zusätzlich zu den eingebauten
tig es ist, sich schnell und effizient an neu SciVario twin mit Hard- und Software- TMFCs bietet das innovative Bay-Drawer
artige Situationen anzupassen. Fehlende funktionen geliefert, die es dem System Konzept die Freiheit, Hardware-Teile wie
Flexibilität und Platzmangel führen zu ermöglichen, sich wechselnden Prozessen zusätzliche Pumpen oder Sensoren flexibel
Engpässen bei der Umstellung eines La- anzupassen. auszuwechseln.
IST MEIN BIOREAKTOR-STEUERUNGSSYSTEM FIT FÜR DIE ZUKUNFT? · IN THE SPOTLIGHT 5
Tipp
epServices in der
Eppendorf App
Die epServices-Kachel in der Eppendorf
App bietet Ihnen den vollen Überblick über
unsere Angebote zu
>> Wartung und Zertifizierung
>> Technischer Service
>> Seminare und Schulung
>> Applikationssupport
Mit tausenden von möglichen Schubla- soren, wie z.B. Hamilton® ARC® oder
denkombinationen und 19 Gefäßvarian- Mettler Toledo ISM®, wird der Benutzer
ten zum Zeitpunkt der Produkteinfüh- gewarnt, falls das eingesetzte Zubehör
rung ausgestattet, bietet der SciVario nicht passt oder ein Sensor bereits vor
twin unübertroffene Flexibilität für ge- Laufbeginn beschädigt ist. Dies minimiert
> genwärtige wie künftige Prozesse. das Risiko von Störungen während des
>
Prozesses. Der Anwender spart Zeit, wert-
Intuitiv, innovativ und intelligent
volle Ressourcen und schont seine Nerven.
Die Komplexität des Systems bedeutet
Das Display ist so konzipiert, dass stets
nicht, dass es kompliziert zu bedienen ist.
beide Prozesse gleichzeitig verfolgt wer-
„Die Software war sehr einfach zu verste- den. Parameter einer Einheit können ein-
hen. Insbesondere gefiel uns, dass die Be- gestellt werden, während die zweite Ein-
nutzeroberfläche uns durch den Workflow heit unabhängig läuft.
leitet, was dabei hilft, Fehler zu vermeiden.“
York & Sven My Great SciVario 16:30
GenMab A/S, Dänemark, Patrick Priem L Idle Start Setup for "Cell Culture Fed-Batch" R
CHO Batch
4711
Here is a short preview of what happens in every upcoming process state:
DO
Während der gesamten Entwicklung war Ready
Setup:
to•• Setup
Define the structure of the process
Calibrate the pH sensor and pumps as needed 51.0 %
50.5 %
a Process? • Mount vessel when ready for conditioning pH
es unser erklärtes Ziel, ein benutzerfreund- Conditioning: • Calibrate the DO and other functions as needed
• Inoculate immediate before running 7.00
7.13
liches und einfach zu bedienendes System 36.5 °C
Temperature
Templates Recently Used
Running: • The process will run
36.5 °C
Feed 5.00 mL/h
Finished: • Add data from samples as needed
zu konzipieren. Neue Bioprozess-Steue- E-Coli Batch
Eppendorf Template
• Export process / save process as template as needed
CHO Batch
Eppendorf Template
Repeat Process
from Record
Copy Process from
Right Unit
5.00 mL/h
Feed
5.00 mL/h
0.00 mL/h
rungen werden i.d.R. mit neuer Software Vessel Mounted Inoculation
Agitation
135 rpm
135 rpm
Antifoam
no foam
geliefert. Dies birgt das Risiko, sich mit
Idle Setup Conditioning Running Finished
on
EGC
on
Start Setup
der neuen Software vertraut machen zu
müssen, was zu manuellen Bedienfehlern Discard
Process
Start
Conditioning
Back Left Menu Right Overview Stop Pause
Schnell und unkompliziert: Unter „Wartung
führen kann. Als Teil der neuen VisioNize®
Fernüberwachung & Zertifizierung“ finden Sie das passende
Plattform wurde auch der SciVario twin
Service-Produkt für Ihr Eppendorf-Gerät.
mit der intuitiven und benutzerfreundli- Dank VisioNize-onboard können Sie
Erhalten Sie kompakte Informationen über
chen VisioNize-onboard Software ausge- SciVario twin mit VisioNize verbinden
produktspezifische Service-Leistungen:
stattet. – Eppendorfs digitaler Plattform für
wertvolle Services rund um unsere >> Beschreibung des Leistungsumfanges
Die intelligente Software führt den An-
Eppendorf-Geräte. Bleiben Sie sicher >> Service-Produktvarianten
wender Schritt für Schritt durch den
zuhause und überwachen Sie Ihre Pro- >> Bestellnummern
Prozess, von den ersten Vorbereitungs-
zesse aus der Ferne und erhalten im >> FAQs
schritten bis hin zum endgültigen Export
Problemfall Benachrichtigungen. >> Links zu Service- and Supportseiten
der Daten. Die Software erkennt die ver-
>> Button zur schnellen Kontaktaufnahme
bundenen Bioreaktoren und Zubehör auto- Um mehr über den SciVario twin
matisch und führt eine Konsistenzprüfung zu erfahren, besuchen Sie Alles in einer App! Jetzt gratis herunter
durch. In Kombination mit digitalen Sen- http://eppendorf.global/kZw laden: http://eppendorf.global/kZA
6 INNOVATION · MEHR COOLNESS, FÜR SIE UND IHRE PROBEN
FLORIAN BUNDIS, EPPENDORF AG
Mehr Coolness, für Sie
und Ihre Proben
Viele Eppendorf-Produkte sind zu langjährigen Gefährten unserer Kunden geworden, auf die sie sich ohne Wenn
und Aber verlassen können. So wie die legendäre Mikrozentrifuge 5424 R. Mit der gekühlten Centrifuge 5425 R
steht jetzt ein würdiger Nachfolger in den Startlöchern. Für mehr Coolness, für jede Herausforderung!
Beim ersten Hinschauen kaum von der Steigerung Ihres Durchsatzes sowie der Modellen einsetzbar. Durch den Einsatz
Centrifuge 5424 R zu unterscheiden – 10-Platz-Rotor für 5-mL-Gefäße. Das auf von optional erhältlichen Adaptern lassen
beide Geräte haben die gleichen Abmes- 5 mL erhöhte Probenvolumen pro Gefäß sich sogar verschiedene Gefäßgrößen
sungen – bietet die Centrifuge 5425 R ist besonders interessant für Anwendun- und -typen innerhalb eines Rotors ver-
folgende Neuerungen und Vorteile. gen wie das Ernten von Bakterien- und wenden.
> Hefekulturen.
>
Mehr Anwendungen, mehr Durchsatz Verbesserte Ergonomie
Mehr Flexibilität
Mit sechs statt bisher vier Rotoren stei- Eppendorf QuickLock® Rotoren lassen
gen Anwendungsvielfalt und Durchsatz. Besitzer einer luftgekühlten Centrifuge sich mit nur ¼ Drehung verschließen.
Neu sind der Ausschwingrotor für PCR- 5425 können sich freuen (und sparen), Das spart Zeit und nimmt repetitive Be-
Streifen und teilbare 96-Well-Platten zur denn alle Rotoren sind flexibel in beiden lastung von Ihrem Handgelenk.
Mehr Bedienkomfort
Ein helles, gut lesbares Display, die ver-
besserte Short-Spin-Funktion (das kon
tinuierliche Drücken der Taste entfällt)
und die End-of-Run-Anzeige (Zeit seit
Rotorstopp) erleichtern die tägliche
Arbeit spürbar.
Bleiben Sie cool – wie Ihre Proben
Die Centrifuge 5425 R ist die neue ge-
kühlte 24-Platz-Standard-Mikrozentri
fuge für wärmeempfindliche Proben.
Modernste Kühltechnologie hält selbst
bei voller Drehzahl die Temperatur bei
4 °C – für maximalen Probenschutz und
beste Separationsresultate. Mit einer Ge-
schwindigkeit von bis zu 21.300 × g ist
sie perfekt für alle modernen molekular-
biologischen Anwendungen in Eppendorf-
und PCR-Gefäßen geeignet.
Mehr Informationen unter
http://eppendorf.global/l3D
NOCH MEHR ZENTRIFUGEN VON EPPENDORF · NEWS 7
CORPORATE COMMUNICATIONS, EPPENDORF AG
Noch mehr Zentrifugen Tipp
von Eppendorf Auf Kundenwunsch
noch vielseitiger
Kann ein Allrounder noch vielseitiger
werden? Ja, er kann! Mit dem im Sommer
Himac ist mit seinen rund 200 Zentrifugen-Experten und Premium-Produkten
2020 eingeführten Rotor F-45-22-17 für
ein echter Zugewinn für die Eppendorf Gruppe, die mit der Akquisition der 5-mL-Mikrozentrifugationsgefäße erfüllen
wir den Wunsch vieler Kunden. Mit nun-
japanischen Erfolgsmarke ihr Zentrifugen‐Portfolio erweitert und damit eines
mehr 16 Rotoren ist der Concentrator plus
ihrer Kerngeschäfte nachhaltig stärkt. in puncto Vielseitigkeit endgültig zur
Legende geworden. Die Nachfrage nach
dem 5-mL-Rotor zeigt aber auch, dass das
Eppendorf Tubes® 5.0 mL aus dem Labor
nicht mehr wegzudenken sind.
> >
>> Kapazität: 22 x Eppendorf Tubes 5.0 mL
mit Schnapp- oder Schraubdeckel
>> Gefäßgröße: Ø 17 / 59,4 – 67,4 mm
>> Max. g-Zahl: 242 x g
>> Max. Geschwindigkeit 1.400 rpm
>> Max. Beladung: 10 g pro Bohrung
(Gefäß inkl. Inhalt)
Concentrator plus
Seine moderne Heiztechnologie sorgt für
Vor 75 Jahren legte ein Maschinenbauer keitszentrifugen sowie auf klinische und
eine optimale Probenbehandlung und
in Leipzig den Grundstein für ein heute automatisierte Zentrifugen. Mit dieser Ak-
gewährleistet somit die schnelle, effiziente
weltbekanntes Kompetenzzentrum für quisition erweitert und festigt Eppendorf
und schonende Vakuumkonzentration von
die Entwicklung und Fertigung von Zentri- nun sein Zentrifugengeschäft für die
DNA/RNA, Nukleotiden, Proteinen und
fugen. Und seit 65 Jahren werden nahe Pharma- und Life-Science-Branchen so-
anderen wässrigen oder alkoholischen
Tokio Zentrifugen hergestellt, die seit- wie für die akademische und industrielle
Proben.
dem nicht nur japanweit als Benchmark Forschung.
gelten. Führt man beide zusammen, wird
„Gemeinsam werden wir unseren Kunden
daraus ein globaler Premium-Anbieter von
die qualitativ hochwertigsten Lösungen
Separationstechnologien. So geschehen
anbieten und schaffen gleichzeitig nach-
bei der Übernahme des Zentrifugenge-
haltige Wachstumsperspektiven für die
schäfts der japanischen Koki Holdings Co.,
Eppendorf Gruppe“, erklärt Marlene
Ltd., deren Produkte unter dem Marken-
Jentzsch, Head of Division Separation &
namen Himac vertrieben werden, durch
Instrumentation bei Eppendorf.
Eppendorf am 1. Juli 2020.
Während Eppendorf in den vergangenen
Jahren seine globale Position als führen-
der Anbieter für Tischzentrifugen konti- Weiterführende Links:
nuierlich ausbauen konnte, fokussiert sich www.eppendorf.com/concentrator
Himac auf Stand- und Hochgeschwindig- www.eppendorf.com/5mL
8 LABORPRAXIS · KOSTENREDUKTION IM ZELLKULTURLABOR
CHRISTIAN HABERLANDT, EPPENDORF AG
Kostenreduktion
im Zellkulturlabor
CO 2 Inkubatoren gehören zur Standardausstattung eines Zellkulturlabors. Die laufenden Kosten für einen CO 2
Inkubator können leicht den ursprünglichen Kaufpreis übersteigen und ein signifikanter Kostenfaktor werden.
Die folgenden fünf Faktoren, Fragen und Empfehlungen sollten Sie vor einer Kaufentscheidung für Ihren nächsten
CO 2 Inkubator bedenken.
der Hinterseite des sauberen Inkubators reinstalliert werden
1. Flexibilität für die Zukunft: Anpassung an wechselnde
müssen?
Laborgestaltung und experimentelle Bedingungen
5. V
erschleißteile: regelmäßiger Austausch von
Werden Sie Ihr Zellkulturlabor künftig umgestalten oder kom-
HEPA-Filtern oder UV-Lampen
> plett an einen neuen Standort verlegen müssen? Werden Sie >
zukünftig möglicherweise neue experimentelle Designs wie
Manche CO 2 Inkubatoren nutzen lüfterassoziierte HEPA-Filter,
hypoxische Bedingungen nutzen? Fragen Sie den Hersteller
die zweimal jährlich gewechselt werden müssen, um einen un-
nach späteren Upgrade-Optionen wie wechselbare Türgriffposi-
gehinderten Luftstrom und Atmosphärengenauigkeit zu gewähr-
tion, O 2 Kontrolle oder segmentierte Innentüren.
leisten. Fragen Sie den Hersteller nach den Kosten für Verschleiß-
teile über die erwartete Lebensdauer des Inkubators. Diese können
2. Gasverbrauch: CO2 und N2
sich schnell auf mehrere Tausend € belaufen.
Immer wenn Sie die Tür Ihres Inkubators öffnen, entweichen
Gase, und die Kammer muss nach dem Schließen wieder befüllt
werden. Je häufiger und länger die Tür in einem belebten Labor
geöffnet ist, desto mehr CO2 (und ggf. besonders teures N2) ist
notwendig. Fragen Sie den Hersteller nach Gasverbrauchsdaten,
berechnen Sie die Kosten über die Zeit mit Ihren lokalen Gas-
preisen und bedenken Sie auch die Wechselhäufigkeit für Gas-
zylinder. Besonders für N2 können die Kosten in weniger als fünf
Jahren die Anschaffungskosten übersteigen.
3. G efäßkapazität: nutzbarer Raum vs. notwendige
Laborstellfläche
Durch innenliegende Teile (z.B. Lüfter, Luftschächte, HEPA-Filter)
entspricht das theoretische Volumen (z.B. 170 L) nicht dem tat-
sächlich nutzbaren Volumen. Vergleichen Sie die tatsächliche
Anzahl an Gefäßen, die der Inkubator fassen kann.
4. R
isiko von Ausfallzeiten, potentieller Probenverlust und CellXpert CO 2 Inkubator
Wartungsaufwand: Anti-Kontaminationskonzept
Kostenreduktion ist wichtig für Sie?
Wie lange dauert es, den Inkubator zu zerlegen und sachge-
recht zu reinigen? Sind temperaturempfindliche HEPA-Filter- Entdecken Sie den neuen CellXpert® CO2 Inkubator, mit dem Sie
kartuschen nötig, die vor einer 180 °C Desinfektion entnom- die Kosten für Ihr Zellkulturlabor über fünf Jahre um bis zu
men und danach bei lange geöffneter Tür mit langem Arm an 8.300 € reduzieren können. http://eppendorf.global/l1P
(BN 54) JANUAR 2021 SEITE 1
Parallele Fed-Batch CHO-Kultur
auf dem SciVario® twin
AMANDA SUTTLE UND MA SHA, EPPENDORF, INC., ENFIELD, CT, USA
KONTAKT: BIOPROCESS-EXPERTS@EPPENDORF.COM
Zusammenfassung Der pH wurde mit einem potentiometrischen Sensor gemes-
sen, welcher steril in eine zusätzliche PG 13.5 Schnittstelle der
Wir führten Fed-Batch Kulturen in BioBLU 1c und 3c Einweg-
®
biologischen Sicherheitswerkbank eingeführt wurde, nachdem
bioreaktoren durch, welche parallel durch das neue SciVario
er zuvor separat in einem autoklavierbaren Beutel sterilisiert
twin Bioreaktor-Steuerungssystem kontrolliert wurden. Dieser
worden war. Der pH wurde durch eine Kaskade von CO2 (Säure)
Versuchsaufbau unterstreicht die Fähigkeiten des SciVario
und 0,45 M Natriumbikarbonat (Base) bei 7,0 gehalten (Tot-
twin, komplexe Prozesse in Gefäßen unterschiedlicher Größen
zone = 0,1). Alle Kulturen wurden bei einer endgültigen Dichte
zu steuern. Unsere 3 L CHO-Kultur erreichte eine maximale
zwischen 0,25 und 0,27 x 106 Zellen/mL angeimpft. Die Zellen
Zelldichte von über 17 x 106 Zellen pro mL am 11. Tag mit mini-
wurden bei einer konstanten Temperatur von 37 °C kultiviert.
malem Bedienungsaufwand. Die Experimente verdeutlichten
Tabelle 1 fasst wichtige Prozessparameter zusammen.
sowohl die Flexibilität als auch die Leistungsfähigkeit der
Fed-Batch Zellkultur auf der SciVario twin Plattform. Parameter 1c Sollwerte 3c Sollwerte
Startvolumen 500 mL 1,5 L
Einleitung
Endvolumen 1L 3L
Der SciVario twin ist das erste von Eppendorf entwickelte Nährlösung Dosierungsrate 5 % des Gesamtvolumens 5 % des Gesamtvolumens
pro Tag pro Tag
Bioreaktor-Steuerungssystem, welches zwei Bioreaktoren
Glukose Bolus Dosierungsziel > 3 g/L > 3 g/L
sowohl parallel als auch individuell steuern kann. Diese
Agitation 230 rpm (0,6 tip speed) 174 rpm (0,6 tip speed)
dynamische, einfach zu bedienende Bioprozess-Steuerung
Temperatur 37 °C 37 °C
passt sich flexibel an Ihre Bedürfnisse an und kann sowohl
DO Sensor polarographischer Sensor polarographischer Sensor
Glas- als auch BioBLU-Einwegbioreaktoren steuern. Zukünf DO Sollwert 50 %, (P= 0,1; I= 0,001) 50 %, (P= 0,2; I= 0,002)
tige Software-Aktualisierungen und modulare Hardware- pH Sensor potentiometrisch potentiometrisch
Erweiterungen ermöglichen Anpassungen an Ihre Prozesse pH Sollwert 7,0 (Totzone = 0,1), CO 2 Kaskade (Säure)
ohne die Notwendigkeit, in ein neues Steuerungssystem zu Kaskade mit 0,45 M Sodium Bicarbonat (Base)
> investieren. Ziel Inokulationsdichte 0,3 x 10 6 Zellen/mL 0,3 x 10 6 Zellen/mL >
Begasungsrate 0,02 SLPH – 30 SLPH 0,02 SLPH – 90 SLPH
Die breite Spannweite an Gasdurchflussraten deckt sowohl Begasungskaskade Der O 2 Sollwert in % Der O 2 Sollwert in %
geringe Sauerstoffbedarfe bei Standard Batch-Läufen als auch wurde bei 30 % auf 21 % wurde bei 30 % auf 21 %
und ab 100 % auf 100 % und ab 100 % auf 100 %
hohe Bedarfe bei Kulturen mit hoher Zelldichte ab. Hierdurch gestellt. Die Flussrate gestellt. Die Flussrate
wurde bei 0 % (bei Bedarf) wurde bei 0 % (bei Bedarf)
wird es ermöglicht, einfache und komplexe Protokolle zur auf 0,02 SLPH, und bei auf 0,02 SLPH, und bei
gleichen Zeit durchzuführen. Als erstes Bioprozess-Steuerungs- 100 % (bei Bedarf) auf 100 % (bei Bedarf) auf
30 SLPH gestellt. 90 SLPH gestellt.
system mit VisioNize®-onboard ist der SciVario twin mit einer
intuitiven Benutzeroberfläche ausgestattet, die bereits in ande- Tabelle 1: Zusammenfassung der Prozessparameter aller Zellkultur-Durchläufe
ren Eppendorf-Produkten wie z.B. PCR-Cyclern, Inkubations-
Probenentnahme und Analytik
schüttlern und Gefriergeräten zur Anwendung kommt.
Täglich wurden aus jedem Bioreaktor zwei Proben entnommen,
In dieser Application Note beschreiben wir die parallele
um offline Werte zu überprüfen, wie z.B. Zelldichte, Viabilität,
Prozesssteuerung von Fed-Batch CHO-Kulturen in 1 L und 3 L
Glukose, Ammoniak (NH3), Laktat und die Konzentration des
BioBLU Einwegbioreaktoren.
hMAb.
Material und Methoden
Anhand des offline pH-Wertes wurde die pH-Kalibrierung der
Verfahren Steuerung, wenn nötig, täglich abgeglichen, um Diskrepanzen
zwischen online und offline Messungen zu vermeiden. Mit
Sämtliche Experimente wurden mit einer CHO Suspensions-
Hilfe der erhaltenen offline Glukosekonzentration wurde die
Zelllinie von TPG Biologics, Inc. durchgeführt, welche einen
Glukose-Zielkonzentration innerhalb der Kultur erreicht, indem
humanen monoklonalen Antikörper (hMAb) exprimiert.
die entsprechende Menge an 200 g/L steriler Glukoselösung
Alle Experimente wurden in mit 8 mM L-Glutamin und 1 % nach Bedarf in die Kultur gepumpt wurde.
Gibco® Anti-Clumping-Mittel (ThermoFisher Scientific) ver-
Fütterung
setztem Dynamis™ AGT ™ Medium (ThermoFisher Scientific)
durchgeführt. Das Bioreaktor-Inokulum wurde in einem Wir führten die Bolus-Glukosefütterung wie oben beschrieben
New Brunswick™ S41i CO2 Inkubationsschüttler angesetzt.* durch, mit einer endgültigen Zielkonzentration von > 3 g/L in
beiden Läufen. Falls die Glukosekonzentration zum Zeitpunkt
Bioreaktor Steuerungs- und Prozessparameter
der Probenentnahme bei oder unter 3 g/L lag, wurden die Bio-
Für alle Experimente wurde gelöster Sauerstoff (DO) mit Hilfe reaktoren auf ~4 g/L Bolus gefüttert. Eine der Hauptstrategien
eines polarographischen Sensors (Mettler Toledo®) ermittelt zur Gesunderhaltung der CHO-Kultur ist es, die Ammoniakkon-
und mittels Begasung mit Luft und/oder O2 durch Anwender- zentration niedrig zu halten – bei maximal 3 mmol/L – indem,
definierte Kaskaden auf 50 % eingestellt. wenn nötig, die Fütterungsrate angepasst wird.
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SEITE 2 (BN 54) JANUAR 2021
Parallele Fed-Batch CHO-Kultur
auf dem SciVario® twin
Ergebnisse
A 20 100
Die Ammoniakwerte wurden täglich überwacht, 18 90
und die Fütterung wurde am 3. Tag eingeleitet, 16 80
Zelldichte/mL (x 10 6)
Zellviabilität (%)
14 70
sobald sich die Ammoniakwerte einer Konzentration
12 60
von 3 mmol/L näherten. Ammoniak sollte unter 10 50
3 mmol/L liegen und über den gesamten Lauf, mit 8 40
Ausnahme der Rückgangsphase, 4 mmol/L nicht 6 30
überschreiten. 4 20
2 10
Im BioBLU 1c wurde am 13. Tag eine maximale 0 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Zelldichte von 13,8 x 106 Zellen/mL (Abb. 1A) und Zeit (Tage)
eine Antikörper-Spitzenproduktion am 15. Tag Zelldichte Zellviabilität
erreicht (682 mg/L; s. Abb. 1B), während der
BioBLU 3c die maximale Dichte von 17,4 x 106 B 10 800
Zellen/mL am 11. Tag erreichte (Abb. 2A) und die 9
Glukose (g/L), NH3 (mmol/L),
700
IgG-Konzentration (mg/L)
Antikörper-Spitzenproduktion von 776 mg/L am 8
600
15. Tag am höchsten war (Abb. 2B). Die Stoffwech- 7
Laktat (g/L)
6 500
selprofile für die BioBLU 1c und 3c Läufe sind in
5 400
Abb. 1B bzw. 2B dargestellt. 4 300
3
Diskussion und Fazit 200
2
100
Mit Hilfe des SciVario twin waren wir in der Lage, 1
0 0
in 1 L und 3 L Gefäßen parallele Fed-Batch CHO- 0 2 4 6 8 10 12 14 16
Kulturen mit hoher Ausbeute anzuzüchten, wobei Zeit (Tage)
die höchste Ausbeute nahezu 18 x 106 Zellen/mL Glukose Laktat NH 3 IgG-Konzentration
> betrug.
>
Abb. 1: BioBLU 1c – Zellwachstum, Antikörperproduktion und Stoffwechselprofil
A: Gesamtzahl lebensfähiger Zellen/mL über den 1c Fed-Batch Lauf
Der SciVario twin besitzt die Fähigkeit, mehrere B: Antikörperproduktion und Stoffwechselprofil
Prozesse mit Gefäßen verschiedener Größen zu-
gleich zu steuern und stellt somit eine außerordent-
A 20 100
lich vielseitige Prozesssteuerung dar. Seine Fähig-
18 90
keit, sowohl Glas- als auch Einwegbioreaktoren zu 16 80
Zelldichte/mL (x 10 6)
verwenden, erleichtert je nach Prozessbedarf den
Zellviabilität (%)
14 70
Wechsel zwischen Material für den Einmalgebrauch 12 60
und autoklavierbarer Ausstattung. 10 50
8 40
Mit der integrierten VisioNize-onboard Software 6 30
ermöglicht dieses Steuerungssystem die einfache 4 20
2 10
gleichzeitige Überwachung und Steuerung beider
0 0
Prozesse. Intelligente Assistenten minimieren das 0 2 4 6 8 10 12 14 16
Ausfallrisiko während des Prozesses. Bei der Markt- Zeit (Tage)
Zelldichte Zellviabilität
einführung auf Kulturen bis zu 4 L begrenzt, wird
das System dank agiler Entwicklungsmethoden
künftig Prozesse bis zu 40 L Arbeitsvolumen unter- B 10 800
stützen. Als erste Bioprozess-Steuerung vereint 9
Glukose (g/L), NH3 (mmol/L),
700
IgG-Konzentration (mg/L)
8
SciVario twin die Bedienung von Eppendorf-Gefäßen 7
600
im Klein- und Laborbankformat, wobei die parallele
Laktat (g/L)
6 500
Bedienung dem Kunden einzigartige Vorteile lie- 5 400
fert. Die Bandbreite der unterstützten Gefäßgrößen, 4 300
3
wird kontinuierlich erweitert und an die Bedürfnisse 200
2
unserer Kunden angepasst werden, um sicherzu- 1 100
stellen, dass SciVario twin als zukunftsorientiertes 0 0
System langfristig gute Dienste leistet. 0 2 4 6 8 10 12 14 16
Zeit (Tage)
*Für detaillierte Informationen s. Application Note 432 unter Glukose Laktat NH 3 IgG-Konzentration
http://eppendorf.global/l23
Abb. 2: BioBLU 3c – Zellwachstum, Antikörperproduktion und Stoffwechselprofil
A: Gesamtzahl lebensfähiger Zellen/mL über den 3c Fed-Batch Lauf
B: Antikörperproduktion und Stoffwechselprofil
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Skalierbare Automation der Library Preparation
von AmpliSeq™ für Illumina® Kits auf der epMotion®
KONTAKT: MARC-MANUEL HAHN, EPPENDORF AG, HAMBURG
(HAHN.M@EPPENDORF.DE)
Aufgrund der zunehmenden Anzahl relevanter Gene und entsprechende Sequenzierungs-Durchsätze anzupassen,
Varianten hat sich Next Generation Sequencing (NGS) als eindeutig darstellen. Diese Methode ermöglicht eine automa-
Standardmethode in der Krebsforschung und der molekularen tisierte Aufbereitung von bis zu 48 Proben auf der epMotion
Pathologie durchgesetzt. AmpliSeq Panels für Illumina wurden 5075t NGS solution und 16 Proben auf der epMotion 5073m
eingeführt, um die zunehmenden interessanten Varianten in NGS solution mit Hilfe des AmpliSeq Focus Panel [1]. PCR-
einer Vielzahl relevanter Gene zu untersuchen. Theoretisch Amplifikationen wurden „off deck“ (außerhalb der epMotion)
ermöglicht die Library Preparation mittels dieser Panels, mit auf dem Mastercycler ® X50 (Eppendorf) durchgeführt. Für
geringem Arbeitsaufwand interessante Genorte im Genom Labore mit niedrigerem Durchsatz haben wir auf der epMotion
und deren Transkription in einem breiten Probenspektrum, 5073m NGS solution einen automatisierten Arbeitsablauf für
einschließlich Blut, Zellkultur und Formalin-fixierten Paraffin- bis zu 16 Proben erstellt. Des Weiteren haben wir kürzlich
eingebetteten Geweben (FFPE-Schnitten), zu untersuchen. gezeigt, dass der zeitliche Arbeitsaufwand für die automatisier-
Besonders das Arbeiten mit den letztgenannten Materialien te Probenaufbereitung durch die Verwendung der Equalizer
kann eine Herausforderung darstellen. Abhilfe schaffen hier Chemie um nahezu 50 % reduziert wird [4].
robuste, etablierte Arbeitsabläufe für analytische Studien.
Ausblick
In diesem Artikel berichten wir über automatisierte Liquid
Handling-Arbeitsabläufe zur Library Preparation mit dem Diese Panel-Arbeitsabläufe stehen exemplarisch für weitere
AmpliSeq Focus Panel auf dem epMotion-System. Auf diesem AmpliSeq-Arbeitsabläufe, bei denen entweder DNA- oder
lassen sich sowohl RNA- als auch DNA-Proben in einem einzel- RNA-Proben aufgearbeitet werden. Da die automatisierte
nen automatisierten Ansatz bearbeiten [1, 2, 3]. Wir diskutieren Library Preparation mit Hilfe der epMotion NGS solutions auf
die Skalierbarkeit dieser Lösung auf den Systemen epMotion den Durchsatz angepasst werden kann, sind diese Systeme
5075t NGS solution und 5073m NGS solution. zuverlässige und attraktive Partner für verschiedene Sequenzer.
Tabelle 1 stellt dar, wie verschiedene epMotion-Systeme die
AmpliSeq Focus Panel für Illumina
erforderliche Flexibilität bieten, um die passende Anzahl von
> Diese gerichtete Sequenzier-Methode für ein breites Spektrum NGS-Libraries für verschiedene Sequenzer zu erstellen. Die >
an Probentypen, einschließlich FFPE-Gewebe und geringe Flexibilität und Skalierbarkeit dieses Ansatzes können bei
Probenmengen [2], ist besonders gut für den Vergleich geeig- Routine-Untersuchungen verschiedener Proben und bei ver-
net, da sie Einzelnukleotid-Varianten (SNVs), RNA-Fusions- schiedenen Durchsätzen unterstützen und gleichzeitig den
transkripte und DNA-Kopienzahlvarianten analysiert [2]. zeitlichen Arbeitsaufwand reduzieren.
Arbeitsabläufe auf der 5075t NGS solution Tabelle 1: Automationsplattformen für verschiedene Sequenzer.
und 5073m NGS solution Abhängig von der Abdeckung können Panels unterschiedlicher
Größen auf verschiedenen Sequenzern untergebracht werden.
Abb. 1 zeigt eine Zusammenfassung eines optimierten auto-
Zu diesem Zweck kann eine grobe Unterscheidung zwischen
matisierten Arbeitsablaufs, welcher mit über 128 Library
verschiedenen Plattformen getroffen werden [5]. Da dies
Preparations getestet wurde [1, 2, 3]. Diese Ansätze funktio-
proportional zu der Anzahl der Primer Pools pro Panel (DNA
nieren gut mit etablierten Referenzen wie z.B. Horizon™ DNA
und RNA) ist, können die Durchsätze pro Lauf weiter für die
Standards und SeraSeq® Fusion RNA Mix v3 [1] sowie mit
epMotion 5073m und 5075t NGS Plattformen unterteilt werden,
degradierten Materialien aus FFPE-Proben [2].
um diese der Anzahl der Proben pro Sequenzer gegenüberzu-
Mit Hilfe des AmpliSeq Focus Panel-Arbeitsablaufs konnten stellen. Dabei stellt die Anzahl der PCR-Reaktionen (eines jeden
wir Eppendorfs skalierbare Methode, die Erstellung von NGS- Primer Pools), welche auf dem Liquid Handling-Gerät aufbe-
Libraries einfach und zuverlässig zu automatisieren und auf reitet werden kann, die limitierende Variable dar [1].
iSeq™ 100 MiniSeq™ MiSeq™ NextSeq™
epMotion® 5073 > Focus Panel (8 Proben) > Immune Response > Immune Response > Keine Kits angegeben
(für bis zu 32 > BRCA Somatic (12 Proben) (24 Proben) (24 Proben)
Reaktionen*) > Immune Repertoire > Immune Repertoire
> C ancer Hotspot (16 Proben)
(24 Proben) (24 Proben)
epMotion® 5075 > BRCA Germline (96 Proben) > Focus Panel (48 Proben) > Focus Panel (48 Proben) > Comprehensive Cancer
(für bis zu 96 > BRCA Somatic (80 Proben) > BRCA Somatic (80 Proben) (12 Proben)
Reaktionen*) > Exome (8 Proben)
> Cancer Hotspot (96 Proben) > Cancer Hotspot (96 Proben)
> BRCA Germline (96 Proben) > BRCA Germline (96 Proben) > Transcriptome (40 Proben)
> Germline (96 Proben) > Germline (96 Proben) > Comprehensive v3
(48 Proben)
> Myeloid Panel (24 Proben) > Myeloid Panel (24 Proben)
*Dies ist in der Tabelle grob dargestellt und basiert auf insgesamt 96 PCR-Reaktionen, aufgeteilt auf die verschiedenen Pools pro Kit für die epMotion 5075 NGS solution und insgesamt
32 PCR-Reaktionen für die 5073m NGS solution. Das Focus Panel bietet beispielsweise 1 DNA- und 1 RNA-Primer Pool, welches daher die Aufbereitung von bis zu 16 Proben auf der
epMotion 5073m bzw. 48 Proben auf der epMotion 5075t ermöglicht und somit die Durchsätze von iSeq und MiSeq erfüllt.
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Skalierbare Automation der Library Preparation
von AmpliSeq™ für Illumina® Kits auf der epMotion®
5075t NGS solution 5073m NGS solution
Bis zu 48 Proben Bis zu 16 Proben
(48 DNA- und 48 RNA-Libraries) (16 DNA- und 16 RNA-Libraries)
= 96 Reaktionen = 32 Reaktionen
gDNA RNA RNA gDNA
Amplifikations-Setup RNA Setup reverse RNA Setup reverse Amplifikations-Setup
Transkription Transkription
Methode 1
Methode 2
Methode 1
Reverse Transkription Reverse Transkription PCR-Amplifikationslauf
Methode 2
Amplikons partiell
Amplifikations-Setup Amplifikations-Setup verdauen
> >
PCR-Amplifikationslauf PCR-Amplifikationslauf PCR-Amplifikationslauf
Amplikons partiell verdauen Ligations-Setup
Methode 3
Methode 3
Ligation Index-Adapter ligieren
Amplifikations-Setup Ligation
Methode 4
Aufreinigung Aufreinigung
PCR-Amplifikationslauf Amplifikations-Setup
Methode 4
Methode 5 Aufreinigung PCR-Amplifikationslauf
On deck-Schritt
Off deck-Schritt
Untermethode Aufreinigung
Abb. 1: Überblick über den automatisierten Arbeitsablauf für den AmpliSeq Focus Panel für Illumina auf der epMotion. Graue Kästen = Untermethoden; blaue Kästen = „on deck“, d.h. auf
der epMotion durchgeführte Schritte; grüne Kästen = „off deck“, d.h. außerhalb der epMotion durchgeführte Schritte. PCR-Amplifikationen wurden auf dem Mastercycler X50 durchgeführt.
Im Einklang mit den Protokollen wurden die Arbeitsabläufe in logische Einheiten unterteilt. Siehe [1] für detaillierte Laufzeiten sowie Bedarf an Verbrauchsmaterial.
Literatur Automate AmpliSeq™ for Illumina® Kits on the epMotion®.
http://eppendorf.global/leb
[1] Scalable Library Prep Automation of AmpliSeq™ for Illumina® Kits on
the epMotion®. http://eppendorf.global/laj [4] M. Hahn, V. Montel, N. Mouttham, E. Gancarek, S. Hamels, U. Wilke-
ning, J. Tsai: Poster at the European Human Genetics Virtual Conference
[2] Illumina: Analytical performance of the AmpliSeq™ for Illumina Focus ESHG 2020.2: P12.009.B – Establishing a scalable automation approach
Panel with FFPE samples. https://bit.ly/2QFTRKc with the epMotion and AmpliSeq for Illumina.
[3] Protocol: Flexible Library Preparation for Your Cancer Research Lab – [5] AmpliSeq for Illumina. Sequencing amplified. www.illumina.com
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Mikroinjektion in Zebrafisch- und Medaka-Embryonen
im Frühstadium: von der Transgenese bis zu CRISPR
THOMAS THUMBERGER UND JOACHIM WITTBRODT, CENTRE FOR ORGANISMAL STUDIES (COS) HEIDELBERG, UNIVERSITÄT HEIDELBERG
SANDRA STOBRAWA, EPPENDORF AG, HAMBURG
Einleitung Für die Injektion werden die Zygoten mit einem kürzeren, unflexiblen Auszug
unter dem Stereomikroskop in die Grä- aufweisen, um das feste Chorion durch-
Teleosten-Fische, wie z.B. der japanische
ben einer Agarose-Injektionsplatte dringen zu können. Füllen Sie 2 – 5 μL des
Reisfisch Medaka oder der Zebrafisch,
überführt. Überstandes eines frisch zentrifugierten
sind weitverbreitete Modellorganismen
Injektionsmixes in die Mikrokapillare.
(Wittbrodt, 2002; Abb. 1). Für CRISPR/Cas9 Knock-out und Knock-
in Design ist es sinnvoll, mit Hilfe eines Befestigen Sie die Kapillare im Kapillaren-
rechnergestützten Design-Werkzeugs halter des FemtoJet 4i, welcher mit einem
gute sgRNA-Zielsequenzen mit einer 45 ° Winkel an den InjectMan 4 montiert
geringen vorhergesagten „off-target“ ist. Beide Geräte sind durch das Schnitt-
Wahrscheinlichkeit zu identifizieren. stellenkabel miteinander verbunden, um
semi-automatische Injektionen zu ermög-
CRISPR/Cas9 Knock-out und Knock-in Mix
lichen.
>> 150 ng/µL Cas9 mRNA
Für den FemtoJet 4i Mikroinjektor betra-
>> 15 ng/µL per sgRNA
gen die empfohlenen Starteinstellungen
>> (5 ng/µL biotinyliertes PCR-Fragment
500 – 700 hPa für den Injektionsdruck (pi)
– für Knock-in Versuche)
und 80 – 100 hPa für den Kompensations-
Abb. 1: Adulte Medaka (Oryzias latipes) und Zebrafische >> ad 10 µL Nuklease-freies Wasser
(Danio rerio) druck (pc). Die optimale Injektionszeit
Für Zebrafisch-Injektionen empfehlen wir muss empirisch ermittelt werden. Die
Zahlreiche Vorteile wie z.B. ihre hohe
Mikrokapillaren, wie z.B. Femtotips® II Medaka-Embryonen müssen im Agarose-
Reproduktionsrate, in Kombination
(Eppendorf), mit einem langen, ausge- graben so ausgerichtet sein, dass die
mit ihrer kurzen Generationszeit und
zogenen Spitzenende und einer Öffnung Embryonalzellen oberhalb des Dotter-
Transparenz des Chorions als auch der
mit einem Durchmesser von ca. 0,5 µm. sacks liegen, um sie zu injizieren. Zebra-
> Embryonen, erleichtern die nicht-inva-
Die Kapillare für Medaka-Injektionen fisch-Embryonen hingegen können in
>
siven bildgebenden Verfahren in vivo
muss ein etwas stärkeres Spitzenende den Dottersack injiziert werden.
über längere Zeiträume. Die Verfügbar-
keit verschiedener genetischer Werk-
zeuge lässt sie zu weitverbreiteten
Modellorganismen für Entwicklungs-
A
studien sowie Studien der Genetik und
Molekularbiologie werden. Darüber
hinaus macht die hohe Effizienz der
Genom-Editierung durch CRISPR/Cas9
beide Modellorganismen sehr attraktiv
für die Erzeugung von Knock-out-Linien
(Stemmer, 2015); insbesondere in
Medaka können ebenfalls präzise ge
netische Modifikationen, wie z.B. die
Markierung bestimmter Gene durch Medaka
Fluoreszenzmarker (Gutierrez-Triana,
2018), vorgenommen werden. Im
Folgenden wird die Mikroinjektions- B
Methode zur gezielten Knock-out und
Knock-in Generierung mit Hilfe des
InjectMan® 4 und des FemtoJet ® 4
(Eppendorf) beschrieben, welche eine
schnelle und effiziente Injektion von
hunderten Fischzygoten ermöglichen.
Methoden
Es ist empfehlenswert, Fischembryonen
im Einzelzell-Stadium zu injizieren. Der
Zeitpunkt der Befruchtung und des Zebrafish
Eizell-Sammelns ist daher dementspre- Abb. 2: Mikroinjektion in das Zytoplasma eines Medaka-Embryos im Einzelzell-Stadium (A) oder in den Dottersack des
chend anzupassen. Zebrafisch-Embryos im Einzelzell-Stadium (B).
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