Klinisches Institut für Medizinische und Chemische Labordiagnostik (KIMCL) AKH Wien - Christine Mannhalter 2007
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Klinisches Institut für Medizinische und
Chemische Labordiagnostik (KIMCL)
AKH Wien
Christine Mannhalter 2007
Molekulargenetische Untersuchungen in
der Diagnostik hämatologischer
Erkrankungen
„Cancer is a genetic disease“
Deregulation von Genen, die das Gleichgewicht
zwischen Proliferation und Absterben von Zellen
kontrollieren, begünstigt neoplastische Erkrankungen
Mannhalter 2007
Molekulargenetische Diagnostik bei akuten
Leukämien
Molekulare Aberration wurden bei zahlreichen
Neoplasien identifiziert
Bei 50% aller Patienten mit akuten Leukämien
findet man chromosomale
Translokationen/Rearrangements
Mannhalter 2007
Molekulargenetische und zytogenetische
Abnormalitäten bei AML
WHO Classification AML: Recurrent genetic abnormalities
FAB subtype Cytogenetics PCR
AML M2(1) t(8;21) AML1-ETO
AML M3(v) t(15;17) PML-RARA
AML M4eo inv(16) t(16;16) CBFB-MYH11
AML M4/5 11q23 MLL with partners
T. Haferlach et al. Ann Hematol 2007; 86: 311-327
Mannhalter 2007Chimäre Fusionsgene bei leukämischen Erkrankungen
ETO MTG-16
(8q22) (16q24)
ALK (2p23)
MLF1 (3q25) NPM (5q35)
NUMA (11q13) AML1 (=CBFA) (21q22)
PLZF (11q23)
PML (15q22) RARA (17q12) EVI1,EAP,MDS1 (3q26)
MYH 11 (16p13) CBFB (16q22) CAN (6p23) DEK (9q34)
SET (9q34)
CHOP (12q13)
ERG (21q22) FOP (6q27)
TLS/FUS (16p11) FGFR1 (8p11) CEP1 10 (9q33)
ZNF198 (13q12)
TIF2 (8q13) MOZ (8p11) CBP (16p13)
p300 (22q13) ABL (9q34) BCR (22q11)
AF-1p (1p32) MLL (11q23) ETV6 (=TEL) (12p13)
AF-1q (1q21)
AF-4 (4q21) GAS7 (17p13) ARG (1q25)
AF-6 (6q27) NUP98 (11p15)
AF-17 (17p21) TOP1 BTL (4q11)
AF-6q21 (6q21) PMX1 ACS2 (5q31)
MSF (17q25) (1q23) (20q11)
AF-9 (9p22) ELL (19p13.1) PDGFR (5q33) HIP1 (7q11)
AF-10 (10p12) EEN (19p13.3) STL (6q23)
ABI-1 (10p11) HOXD13 HOXA9 DDX10
ENL (19p13.3) (7p15) (11q22) JAK2 (9p24)
(2q31) CDX2 (13q12)
hCDCrel (22q11)
AF-X1 (X13) TRKC (15q25)
MLL (11q23) MNI (22q11)
Mannhalter 2007Molekularbiologische Diagnostik
Translokationen und Genrearrangements meist auf
bestimmte Genfusionen zurückzuführen - können mit
molekularbiologischen Methoden analysiert werden
Routinemäßig möglich, da die erforderlichen
Techniken enorm weiterentwickelt wurden – vom
arbeitsaufwendigen Southern Blot zur standardisierten
und schnellen quantitativen Real-Time PCR
Mannhalter 2007Molekularbiologische Abnormalitäten
und Diagnostik
bei hämatologischen Erkrankungen
⇒ Klonalitätsnachweis
⇒ Klassifizierung und Prognose
⇒ minimale Resterkrankung (MRD)
Mannhalter 2007Molecular Diagnostics
Fusion gene transcripts and gene mutations
routinely tested
Ig heavy chain gene rearrangement -
B-cell malignancies
T-cell receptor gamma chain gene rearrangement -
T-cell malignancies
Mannhalter 2007Molecular Diagnostics
BCR/ABL-P210 and P190 fusion gene transcripts
- CML and Ph+ALL
BCL-2 -
follicular lymphoma
BCL-1 -
mantle cell lymphoma
Mannhalter 2007Molekularbiologische Diagnostik
bei akuten myeloischen Leukämien
t(8;21)(q22;q22) AML1/ETO
inv(16)(p13;q22), t16;16)(p13;q22) CBFB/MYH11
t(15;17)(q22;q12) PML/RARA
11q23 Abnormalitäten MLL
Mannhalter 2007Multiplex RT-PCR System für die
Typisierung/Subtypisierung von Leukämien
1998 publizierten Pallisgaard et al eine Multiplex RT-PCR
für den gleichzeitigen Nachweis von 29 Translokationen und
chromosomalen Aberrationen mit mehr als 80 Bruchpunkt-
varianten bei akuten Leukämien
Pallisgaard, Blood 1998; 92: 574-588
Entwicklung des mDx® Hema Vision® Multiplex RT-PCR
Systems für die Typisierung / Subtypisierung von Leukämien
durch die Firma BioRad
Mannhalter 2007Hema Vision RT-PCR Multiplex System
Mannhalter 2007Hema Vision RT-PCR Multiplex System
Mannhalter 2007Hema Vision® RT-PCR Multiplex System Master Chromosomale Involvierte Gene mix Veränderung M7A t(6;9)(p23;q34) DEK(6p23) CAN(9q34) M7B t(9;9)(q22;p13) SET(9q34) CAN(9q34) M7C inv(16)(p13;q22) CBFβ(16q22)MYH11(16p13) M7D t(3;21)(q26;q22) AML1(21q22) EAP(3q26) M8A t(11;17)(q23;q21) PLZF(11q23)RAR α(17q21) M8B t(3;21)(q26;q22) AML1(21q22)MDS1(3q26) M8C t(15;17)(q21;q22) PML(15q22)RARα(17q21) M8D t(5;17)(q34;q21) NPM(5q34)RARα(17q21) M8E t(3;5)(q25.1;q34) NPM(5q34)MLF1(3q25.1) M8F t(9;22)(q34;q11) BCR(22q11)ABL(9q34)Mannhalter 2007
Hema Vision RT-PCR Multiplex System
Abarbeitung in 3 Tagen möglich
Gleichzeitige Analyse von 10 Patientenproben
Hochsensitive und spezifische Detektion der
Fusionsgene bzw. der chromosomalen
Rearrangements (1 in 10 000 Zellen)
Mannhalter 2007Probenmaterial
Knochenmark 5 ml
peripheres Blut 32 ml
Sondermaterial (Gewebe, Paraffinschnitte,
Liquor, andere Körperflüssigkeiten, sortierte
Zellen...)
Antikoagulans: EDTA
Präanalytik zu beachten: Proben sofort nach Abnahme
kühlen (Kühlschrank, Flockeneis, Kühlaggregate...) und
gekühlt transportieren!
Mannhalter 2007Hema Vision® Multiplex RT-PCR
System
Sensitivität der Multiplex RT-PCR entspricht der
1-Stufen PCR (10-3 - 10-4)
Die Technik eignet sich auch für den
Nachweis von minimaler Resterkrankung
(MRD) in Verlaufsproben
Mannhalter 2007Hema Vision RT-PCR Multiplex System
RT-PCR kann jedoch zytogenetische
Untersuchungen nicht vollständig ersetzen
Limitationen
1. Nummerische Abnormalitäten werden nicht erfaßt
2. Unbekannte Abnormalitäten können nicht
gefunden werden
3. Nur balancierte Abnormalitäten sind nachweisbar
Mannhalter 2007Molekularbiologische Untersuchungen bei
akuten Leukämien
Bei ca. 55% aller Patienten mit akuten
myeloischen Leukämien (AML) findet man
zytogenetische Abnormalitäten, ca. 45% haben
normalen Karyotyp
Ca. 30% aller ALL haben normalen Karyotyp
Mannhalter 2007Molekularbiologische Abnormalitäten bei
AML mit normalem Karyotyp
Mutations and frequency (%)
NPM1 50
FLT3-LM/ITD 40
MLL-PTD 11
CEPBA 15
NRAS 9
FLT3-TKD 6
T. Haferlach et al. Ann Hematol 2007; 86: 311-327
Mannhalter 2007FLT3 Mutationsanalyse und AML
Punktmutationen im „fms-like tyrosine kinase
(FLT3)“ Gen → konstitutive Aktivierung des
Rezeptors
Mutationen häufig bei AML Patienten mit normalen
Karyotypen auf
Patienten mit Punktmutationen - signifikant höhere
Zahl an WBC (mean 34.8 x 10(9)/l) als Patienten ohne
Mutationen (mean 26.4 x 10(9)/l)
Mannhalter 2007Punktmutationen und AML
Aktivierende FLT3 Mutationen
Partielle Tandemduplikationen (ITD), Insertionen
und/oder Deletionen in der juxtamembranösen
Domäne (23% der AML-Patienten) sind mit einem
erhöhten Rezidivrisiko assoziiert
Mannhalter 2007Molekularbiologische Diagnostik
bei akuten Leukämien
▲ Rezidive gehen meistens von residualen
Leukämiezellen (MRD) aus
▲ Die quantitative Erfassung der leukämischen
Zellen während der Therapie ist essentiell um
den Behandlungserfolg zu beurteilen
Mannhalter 2007Monitoring of Therapeutic Response
At diagnosis of acute leukaemia, the tumour mass
consists of about 1012 tumour cells
Chemotherapy or bone marrow transplantation
can induce complete remissions defined by a
reduction of leukaemia cells to a level of below 5%
in the bone marrow
Mannhalter 2007Detektion von minimaler Resterkrankung
Induktionstherapie
Konsolidierungstherapie
1012 100%
Morphologie
Morphologische Detektion Zytogenetik, FISH
1010 CR 10-2 Southern Blot
Sensitivität verschiedener Techniken
Anzahl leukämischer Zellen
1-Stufen PCR
108 10-4
Minimale Resterkrankung
2-Stufen PCR
6 -6
10 10
104
102
100
0 2
Jahre
Mannhalter 2007Molekularbiologische Diagnostik
bei akuten Leukämien
Durch hochsensitive, spezifische
molekularbiologische Velaufskontrollen
(‘molekulares Monitoring’) kann die Dynamik des
malignen Klons beobachtet werden (Effizienz der
Behandlung, Risiko eines Rezidivs)
Mannhalter 2007Molekularbiologische Diagnostik
bei hämatologischen Erkrankungen
Quantitative Diagnostik
Analyse der Kinetik des malignen Klons
⇒ Patienten-spezifische Therapie
Mannhalter 2007Real-Time Quantitative PCR
Real-time quantitative RT-PCR ermöglicht
eine rasche und spezifische Amplifikation
und Quantifizierung von Zielmolekülen
Fusionstranskripte können bis zu einer
Konzentration von 1 in 10-4 - 10-5 detektiert
und quantifiziert werden
Intra- und inter-assay Variations-
koeffizienten liegen zwischen 10% und 20%
Mannhalter 2007Real Time PCR in Patients Treated with STI571
Mannhalter 2007Akute Promyelozyten-Leukämie (APL)
Patienten mit hämatologischem Rezidiv
Mannhalter 2007Quantitative PCR
Quantitative PCR ist heute die wichtigste
Methode zum Nachweis minimaler
Resterkrankung
Die Bedeutung der qRT-PCR steht in direktem
Zusammenhang mit der hohen Sensitivität
(Detektion von 1 Tumorzelle in Gegenwart von
10-4 - 10-6 normalen Zellen)
Mannhalter 2007Molekularbiologische Diagnostik
Limitation
Die Bedeutung der minimalen Resterkrankung
hängt von der Natur der malignen Erkrankung und
von der verabreichten Therapie ab
Residuale Leukämie- oder Lymphomzellen müssen
nicht in jedem Fall ein Rezidiv verursachen –
Zusammenschau mit Klinik und anderen Methoden
Mannhalter 2007Molekularbiologische Diagnostik
Limitation
Analysenergebnisse können zwischen Labors
stark differieren
Mannhalter 2007Schlußfolgerungen - Ringversuch RT-
PCR für BCR-ABL Nachweis
Keine Vergleichbarkeit der quantitativen
Ergebnisse zwischen verschiedenen Zentren
Unterschiedliche Qualität einzelner Zentren
Notwendigkeit weiterer Standardisierung
molekularbiologischer Methoden - Teilnahme
an Ringversuchen!
Mannhalter 2007New Molecular Diagnostic Markers
Myeloproliferative Disorders
In 2005, an acquired amino acid substitution (V617F)
in the Janus kinase 2 (JAK2) TK was identified in
patients with clonal myeloid disorders
Activating tyrosine kinase (TK) mutations are a
fundamental cause of human cancers
Mannhalter 2007Homozygous JAK2 mutations are associated
with classical PV complicated by major
thrombosis
Heterozygous JAK2 V617F mutations lead to
megakaryocyte proliferation in early PV and in
ET
Mannhalter 2007The positive predictive value of a JAK2 V617F
polymerase chain reaction test for the diagnosis
of MPDs is high (near to 100%)
The majority of PV (sensitivity 85 to 97%) are
JAK2 V617F positive
Mannhalter 2007A. Tefferi et al. Current Opinion in Hematology 2007; 14: 115-122
Mannhalter 2007New Molecular Diagnostic Markers
JAK2 V617F is useful in diagnostics of BCR/ABL
negative myeloproliferative disorders
Half of ET and MF patients are positive for
JAK2 mutatione (sensitivity 50%)
Studies on the mutation expanded the insights
into the molecular etiology of ET, PV, and
chronic idiopathic myelofibrosis (CIMF)
Mannhalter 2007Microarray Analysen
Messung der Expression von Genmustern
und Identifikation differentiell exprimierter
Gene in Tumor/Normalgewebe
Untersuchungsmaterial: RNA
Derzeit noch nicht für diagnostische
Untersuchungen anwendbar!
Mannhalter 2007Gen Expression und Molekulare
Diagnostik
Gen Expression ist in jeder Zelle genau geregelt
Über- oder Unterexpression ist meist mit
Krankheiten assoziiert
Mannhalter 2007Microarray Analysis
Mannhalter 2007Analysis of Microarrays
Mannhalter 2007Analysis of Microarrays
Mannhalter 2007Microarray Gen-Expressions-Analyse
Anhand molekularer Signaturen können
Patientensubgruppen unterschieden werden
(mindestens 16 Subgruppen von AML)
In Patientengruppen mit normalem Karyotyp -
Subgruppen identifizierbar
AML Patienten mit schlechtem
Behandlungsansprechen zeigen distinkte Gen-
Expressionssignatur
Mannhalter 2007Microarray-Analysen
Identifikation neuer Leukämie-Klassen
und Subgruppen: class discovery
Genaue Zuordnung von Patientenproben
zu bekannten Leukämie-Klassen: class
prediction
Mannhalter 2007Standardisierte Microarray-Analysen
Ein AmpliChip für die Leukämie-Forschung
zur Identifikation individueller
Genexpressions-Signaturen bei Patienten mit
MDS ist in Entwicklung
Für die in vitro Diagnostik ist noch kein Chip
verfügbar
Mannhalter 2007Zusammenfasung
Molekularbiologische Untersuchungen haben zur
Identifikation von Krebsgenen geführt, die von
großer diagnostischer Relevanz sind und als
Therapieziele dienen
Dadurch ist eine genauere und frühere Diagnose,
eine bessere Vorhersage des Ansprechens auf
Therapien und die Entwicklung von
krankheitsspezifischen Therapien möglich
Mannhalter 2007Sie können auch lesen
