Chlamydia psittaci und Lymphome der okulären Adnexe - besteht ein Zusammenhang?
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Aus der Universitäts-Augenklinik der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Chlamydia psittaci und Lymphome der okulären Adnexe –
besteht ein Zusammenhang?
INAUGURAL – DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Vorgelegt 2008
von Nora Göbel
geboren in Berlin1 Dekan Prof. Dr. C. Peters 1. Gutachter PD Dr. Claudia Auw-Hädrich 2. Gutachter Prof. Dr. M. Kist Jahr der Promotion 2008
2
Inhalt
I Einleitung................................................................................................................................ 5
1 Chlamydien ......................................................................................................................... 5
a. Von Protozoen über Viren zu Bakterien (Geschichte) ................................................... 5
b. Taxonomie...................................................................................................................... 7
c. Krankheitsbilder ............................................................................................................. 8
- Chlamydia pneumoniae ............................................................................................... 8
- Chlamydia trachomatis ................................................................................................ 8
- Chlamydia psittaci ....................................................................................................... 9
2 Lymphome ........................................................................................................................ 10
a. Definition...................................................................................................................... 10
b. Einteilung ..................................................................................................................... 10
c. Lymphome der okulären Adnexe ................................................................................. 12
d. Pathogenese der EMZL ................................................................................................ 13
3 Assoziation Chlamydien – Lymphome der okulären Adnexe .......................................... 14
4 Zielsetzung ........................................................................................................................ 15
II Material und Methoden..................................................................................................... 16
1 Patienten und Präparate ..................................................................................................... 16
2 Versuchsbedingungen ....................................................................................................... 20
a. Sensitivität Chlamydia psittaci-PCR, β-Globin-PCR................................................... 20
b. Sensitivitätsbestimmung und -vergleich der DNA-Extraktion aus nativem und
formalinfixiertem, paraffineingebettetem Material...................................................... 21
c. Spike-Versuch: Inhibiert die DNA-Extraktion den Vorgang der PCR? ...................... 22
3 DNA-Extraktion ................................................................................................................ 23
a. Roche ............................................................................................................................ 23
b. Wassmer-Protokoll....................................................................................................... 24
c. NaOH-Protokoll ........................................................................................................... 24
d. Evaluation der benötigten Menge an Material anhand von Roche-Aufarbeitung
und NaOH-Protokoll .................................................................................................... 25
4 Polymerasekettenreaktion (PCR) ...................................................................................... 26
a. Chlamydia psittaci-PCR ............................................................................................... 27
b. β-Globin-PCR und SOCS-PCR.................................................................................... 29
5 Agarose-Gelelektrophorese ............................................................................................... 313
a. Agarose-Gel.................................................................................................................. 31
b. Elektrophorese.............................................................................................................. 32
c. Ethidiumbromid-Färbung ............................................................................................. 33
III Ergebnisse.......................................................................................................................... 35
1 Versuchsbedingungen ....................................................................................................... 35
a. Sensitivitätsbestimmung und -vergleich der DNA-Extraktion aus nativem
und formalinfixiertem, paraffineingebettetem Material............................................... 35
b. Spike-Versuch: Inhibiert die DNA-Extraktion den Vorgang der PCR? ...................... 35
2 DNA-Extraktion: Evaluation der benötigten Menge an Material anhand von Roche-
Aufarbeitung und NaOH-Protokoll ................................................................................... 35
3 PCR ................................................................................................................................... 36
a. Chlamydia psittaci-PCR ............................................................................................... 36
b. β-Globin-PCR und SOCS-PCR.................................................................................... 37
c. Synopse......................................................................................................................... 39
IV Diskussion .......................................................................................................................... 41
1 Studienlage Assoziationen ................................................................................................ 41
2 Diskussion der unterschiedlichen Ergebnisse ................................................................... 44
a. Präparate ....................................................................................................................... 44
- Art und Alter .............................................................................................................. 44
- Menge an Material ..................................................................................................... 45
- Inhomogenität ............................................................................................................ 46
b. Methoden...................................................................................................................... 46
- DNA-Extraktion......................................................................................................... 46
- Nachweistechnik ........................................................................................................ 47
- Technische Probleme ................................................................................................. 48
c. Geographie ................................................................................................................... 48
3 Schlussfolgerungen ........................................................................................................... 50
V Zusammenfassung .............................................................................................................. 52
VI Literaturverzeichnis ......................................................................................................... 53
VII Danksagung...................................................................................................................... 58
VIII Lebenslauf ...................................................................................................................... 59
IX Erklärung .......................................................................................................................... 614 Abkürzungen ATP Adenosintriphosphat bp Basenpaare CD- cluster of differentiation DLBCL Diffuses großzelliges B-Zell Lymphom DNA Desoxyribonukleinsäure EMZL Extranodales Marginalzonen B-Zell Lymphom vom MALT-Typ FFPE formalinfixiert und paraffineingebettet FL Follikuläres Lymphom HLA human leukocyte antigen IFU infection forming units IPSID immunoproliferative small intestinal disease KHK koronare Herzkrankheit MALT mucosa associated lymphoid tissue MCL Mantelzell-Lymphom µm Mikrometer ( = 10-6 m) NaOH Natriumhydroxid = Natronlauge NHL Non Hodgkin Lymphom OAL ocular adnexal lymphoma PCR Polymerasekettenreaktion SOCS suppressor of cytokin signaling TETR PCR touchdown enzyme time release PCR TWAR Taiwan acute respiratoy agent WHO Weltgesundheitsorganisation
5
I Einleitung
Die Ursachen für die Entstehung maligner Tumoren sind oft noch unverstanden. Der
Erforschung von Umweltfaktoren wird dabei neben der Genetik großer Wert beigemessen.
Hierbei häuften sich in den letzten Jahren die Hinweise, daß auch Bakterien maßgeblich daran
beteiligt sein könnten. Populärstes und am besten belegtes Beispiel dafür ist die Entstehung
des MALT-Lymphoms (MALT = mucosa associated lymphoid tissue) des Magens auf dem
Boden einer chronischen Helicobacter pylori Infektion (Wotherspoon, Ortiz-Hidalgo et al.
1991).
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Frage, ob auch Chlamydia psittaci eine Rolle als
infektiöses Agens spielt und ursächlich an der Entstehung okulärer MALT-Lymphome
beteiligt ist. Um den Ursprung dieser Hypothese nachvollziehen zu können, werden zunächst
Chlamydien und MALT-Lymphome näher beleuchtet.
1 Chlamydien
a. Von Protozoen über Viren zu Bakterien (Geschichte)
Die erste Beschreibung von Chlamydien stammt aus dem Jahre 1907 von Halberstaedter und
von Prowazek, die auf Java konjunktivale Epithelzellen von Trachom-Patienten untersuchten
(Abbildung 1).
Abbildung 1 Original-Titelseite der Veröffentlichung von Halberstaedter und von Prowazek 1907
(Everett and Ward 2002)6 Dabei fanden sie in Giemsa-gefärbten Präparaten intrazytoplasmatische Vakuolen mit Einschlüssen und sahen diese ganz richtig als die Ursache der Erkrankung an. Sie nannten diese neuen Organismen „Chlamydozoen“: „Manteltierchen“ (griech. chlamys = Mantel, zoon = Lebewesen), da die blaugefärbte Matrix, in die die Organismen eingebettet waren, wie eine Ummantelung aussah und die Forscher Protozoen vor sich wähnten. Im Laufe der Zeit entdeckte man in neubeschriebenen Krankheitsbildern wie der Einschlußkonjunktivitis, der Nicht-Gonokokken-Urethritis, der Psittakose uvm. die immer wieder gleichen Einschlußkörperchen. Aufgrund ihrer geringen Größe und ihrer rein intrazellulären Vermehrung (kein Wachstum auf künstlichen Nährböden) wurden Chlamydien dann bis in die sechziger Jahre den Viren zugeordnet (Levinson 1965; Wang 1999). Erst 1965, mit der Entwicklung neuer Techniken wie zum Beispiel der Elektronenmikroskopie, konnte bewiesen werden, daß es sich bei den Chlamydien nicht um Viren, sondern tatsächlich um Bakterien handelt. Was ist nun so besonders an Chlamydien? Erstens: Sie vermehren sich obligat intrazellulär, da sie selbst kein ATP (Adenosintriphosphat) zu synthetisieren vermögen und somit von der Wirtszelle als Energielieferant abhängig sind. Zweitens treten sie in ihrem Vermehrungszyklus in zwei Erscheinungsformen auf: Als infektiöse, nur 0,2 µm kleine Elementarkörperchen gelangen sie in den menschlichen Körper, heften sich von außen an die Wirtszelle und lassen sich phagozytieren. Im Phagosom wandelt sich das Elementarkörperchen in das größere Initialkörperchen (synonym Retikularkörperchen) um, als welches es sich nun vermehren kann. Mikroskopisch imponiert dieser Zustand als Einschlußkörperchen. Die Initialkörperchen kondensieren dann wiederum zu Elementarkörperchen, die nach Zugrundegehen der Wirtszelle nach zwei bis drei Tagen freigesetzt werden und neue Zellen befallen können. (Collier 1990; Davis, Dulbecco et al. 1990; Köhler, Eggers et al. 2001; Hof and Dörries 2002; Ward 2002; Hahn, Falke et al. 2005; Kayser, Böttger et al. 2005)
7
b. Taxonomie
Die Taxonomie der Chlamydien ist derzeit umstritten. Nach bisheriger Klassifikation kannte
die Ordnung Chlamydiales eine einzige Familie Chlamydiaceae mit nur einer Gattung namens
Chlamydia, in der es vier Arten gab (Tabelle 1):
Ordnung Familie Gattung Art
Chlamydiales Chlamydiaceae Chlamydia C. pecorum
C. pneumoniae
C. psittaci
C. trachomatis
Tabelle 1 Frühere Taxonomie der Chlamydien
Neuerdings beinhaltet die Ordnung Chlamydiales die Familien Chlamydiaceae,
Parachlamydiaceae, Waddliaceae und Simkaniaceae. Außerdem unterscheidet die Familie
Chlamydiaceae die Gattungen Chlamydia mit drei und Chlamydophila mit sechs Arten
(Everett, Bush et al. 1999) (Tabelle 2):
Ordnung Familie Gattung Art
Chlamydiales Chlamydiaceae Chlamydia C. muridarum
C. suis
C. trachomatis
Chlamydophila C. abortus
C. caviae
C. felis
C. pecorum
C. pneumoniae
C. psittaci
Parachlamydiaceae
Waddliaceae
Simkaniaceae
Tabelle 2 Aktuelle Taxonomie der Chlamydien
Nachdem diese neue Taxonomie jedoch noch nicht in den allgemeinen Gebrauch
übergegangen ist, halte ich mich in vorliegender Arbeit an die alte Regelung, indem ich als
Gattungsnamen Chlamydia statt Chlamydophila verwende.8 c. Krankheitsbilder Humanpathogen sind lediglich die Arten Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis und Chlamydia psittaci. CHLAMYDIA PNEUMONIAE Chlamydia pneumoniae ist die jüngste Chlamydienspezies. Sie existiert seit 1989, nachdem sie zunächst als sog. TWAR-Chlamydien der Art Chlamydia psittaci untergeordnet wurde (Grayston, Kuo et al. 1989). TWAR steht für ‚Taiwan acute respiratoy agent’, nachdem der Erreger 1965 zum ersten Mal in Taiwan isoliert wurde (Kuo, Chen et al. 1986). Chlamydia pneumoniae verursacht respiratorische Infektionen bis hin zu Pneumonien, vor allem bei Kindern und Jugendlichen, die zumeist relativ blande verlaufen. Die Infektion erfolgt aerogen. Es besteht eine hohe Durchseuchung in der Bevölkerung (serologische Studien ergaben einen positiven Antikörpernachweis in 60% aller Erwachsenen (Kayser, Böttger et al. 2005)), weshalb man davon ausgehen kann, daß viele Infektionen klinisch stumm verlaufen. Seit einiger Zeit wird eine ursächliche Beteiligung von Chlamydia pneumoniae an der Entstehung von KHK (koronare Herzkrankheit) und Herzinfarkt diskutiert, nachdem man den Erreger zunächst serologisch und schließlich auch aus atheromatösen Plaques dieser Patienten isolieren konnte. CHLAMYDIA TRACHOMATIS Chlamydia trachomatis lässt sich in die Serotypen A-C, D-K und L1-L3 unterteilen, welche jeweils ganz unterschiedliche Krankheitsbilder hervorrufen. Chlamydia trachomatis Serovar A-C ist der Erreger des Trachoms (synonym „Ägyptische Augenkrankheit“), einer follikulären Keratokonjunktivitis, die chronisch verlaufend zur Erblindung führt. Die Übertragung erfolgt per Schmierinfektion, weswegen das Trachom in Regionen mit schlechten hygienischen Verhältnissen endemisch und dort die Ursache der meisten Erblindungen ist, bei uns jedoch faktisch nicht vorkommt.
9 Die Serovare D-K verursachen die Einschlußkonjunktivitis, die vor allem bei Neugeborenen auftritt, welche den Erreger im Geburtskanal der Mutter akquirieren und auch eine Pneumonie durch Chlamydia trachomatis entwickeln können. Bei Erwachsenen rufen sie die so genannte „Schwimmbadkonjunktivitis“ hervor. Außerdem ist Chlamydia trachomatis Serovar D-K verantwortlich für die meisten Urogenitalinfektionen in den Industrieländern. Erregerreservoir ist immer der Mensch, zumeist die Endozervix der Frau. Klinisch manifestiert sich eine Infektion beim Mann meist als Urethritis, bei der Frau als Urethritis oder Zervizitis. In der Folge einer Chlamydia trachomatis-Infektion kann es zur Ausbildung einer Reaktiven Arthritis bzw. eines Reiter-Syndroms (= Trias aus Arthritis, Konjunktivitis und Urethritis) kommen. Vor allem Männer sind betroffen, und hier besonders HLA-B27-positive. Chlamydia trachomatis Serovar L1-L3 ist der Erreger des Lymphogranuloma venereum (syn. Morbus Durand-Nicolas-Favre), wird durch sexuellen Kontakt übertragen und ist in tropischen Gebieten mit schlechten hygienischen Verhältnissen verbreitet. CHLAMYDIA PSITTACI Chlamydia psittaci ruft grippeähnliche Symptome mit Verläufen bis zur schweren atypischen Pneumonie, dann mit Schüttelfrost, Fieber, Kopfschmerzen und Husten hervor, die unter der Bezeichnung Psittakose (Papageienkrankheit) zusammengefasst werden, da die erste Erregerisolation aus einem Papagei gelang. Inzwischen weiß man, dass auch andere Vögel Reservoire für Chlamydia psittaci sind, so dass man den Begriff der Ornithose (Vogelkrankheit) eingeführt hat. Die Infektion erfolgt über das Einatmen von erregerhaltigem getrocknetem Vogelkot. Eine Infektion ist in Deutschland namentlich meldepflichtig. Die Therapie aller Chlamydien-Erkrankungen besteht in der Gabe von Doxycyclin oder Makroliden. (Davis, Dulbecco et al. 1990; Köhler, Eggers et al. 2001; Hof and Dörries 2002; Hahn, Falke et al. 2005; Kayser, Böttger et al. 2005)
10 2 Lymphome a. Definition Der Begriff ‚Lymphom’ bezeichnet zunächst einmal lediglich einen Tumor (lat. Anschwellung, Geschwulst) aus Zellen des lymphatischen Gewebes, also zum Beispiel auch eine benigne Lymphknotenvergrößerung im Rahmen einer Infektion. Ein bösartiges lymphatisches Neoplasma würde man dann korrekterweise ‚Malignes Lymphom’ nennen. b. Einteilung Maligne Lymphome werden zuerst grob in die Kategorien Hodgkin- und Non-Hodgkin- Lymphom (NHL) eingeteilt. Hodgkin-Lymphome sind definiert durch das Vorhandensein der sogenannten Hodgkin- oder Sternberg-Reed-Riesen-Zellen. Non-Hodgkin-Lymphome unterteilt man weiterhin in B- und T-Zell-Lymphome (Tabelle 3). MALT-Lymphome (MALT = mucosa associated lymphoid tissue) zählen zu den B-NHL. Es sind Lymphome des extranodalen Marginalzonengewebes und können auch nicht- mukosaassoziiert auftreten, weswegen der Begriff „Extranodales Marginalzonen B-Zell Lymphom vom MALT-Typ“ (EMZL) zutreffender ist. Die Inzidenz der NHL beträgt circa 15:100.000, wobei Männer häufiger erkranken als Frauen (male predominance: m/w = 1,5/1). Das Haupterkrankungsalter (median) liegt zwischen 60 und 70 Jahren (Classen, Diehl et al. 2004; KompetenznetzMaligneLymphome 2005; RKI and GEKID 2006).
11
Tabelle 3 Gegenüberstellung der Kiel- und WHO-Klassifikation der Non-Hodgkin-Lymphome
(KompetenznetzMaligneLymphome 2002)12 c. Lymphome der okulären Adnexe Lymphome der okulären Adnexe sind Tumoren des lymphatischen Gewebes der Konjunktiven, Lider, des Tränensackes und der Orbita mit der Tränendrüse. Symptomatisch werden sie meist durch eine Schwellung, Rötung und Irritation der Konjunktiven, schmerzlosen Exophthalmus, eventuell mit Doppelbildern, oder eine Raumforderung im Lidbereich (Coupland, Krause et al. 1998). Von allen Malignomen am Auge sind sie mit 25 (-50)% der häufigste (Rootman, Chang et al. 2003). Lymphome der okulären Adnexe (in der englischsprachigen Literatur: OAL = ocular adnexal lymphoma) stellen 6% aller primär extranodalen NHL (Freeman, Berg et al. 1972). 35-90% aller Lymphome der okulären Adnexe sind vom histologischen Typ ein extranodales Marginalzonen-B-Zell-Lymphom vom MALT-Typ (EMZL), jeweils 10% sind ein diffus großzelliges B-Zell-Lymphom und ein follikuläres Lymphom. Diese Häufigkeitsverteilung am Auge steht im Gegensatz zu derjenigen im restlichen Körper, wo EMZL mit nur 7-8% aller NHL nach dem diffus großzelligen B-Zell-Lymphom und dem follikulären Lymphom den dritthäufigsten Subtyp darstellen. Interessanterweise ist im Gegensatz zu den meisten anderen Tumorerkrankungen die Inzidenz und auch die Mortalität der NHL, okuläre EMZL inklusive, weltweit steigend, was nur zum Teil durch die heute höhere Lebenserwartung erklärt werden kann. Desweiteren gibt es Hinweise auf mögliche Zusammenhänge mit Immunsuppression, Autoimmunerkrankungen, Infektionen, spezifischen chemischen Stoffen, UV-Strahlung und genetischer Prädisposition, was darauf hindeutet, daß das NHL ein außer Kontrolle geratenes funktionierendes Immunsystem darstellt. Histologisch ist das EMZL der okulären Adnexe charakterisiert durch ein CD20-positives B- Zell-Infiltrat, die B-Lymphozyten sind ebenfalls CD5-, CD10- und CD23-positiv und tragen Oberflächen-Immunglobuline. Dazwischen finden sich einige CD3-positive T-Lymphozyten. Die Stadieneinteilung erfolgt nach der Ann-Arbor-Klassifikation, die ursprünglich nur für den Morbus Hodgkin erstellt wurde, jedoch inzwischen auch auf viele andere Lymphome angewandt wird (Tabelle 4). Therapeutisch kommen je nach Tumorlokalisation und -stadium in absteigender Reihenfolge Radiatio, Chemotherapie, chirurgische Exzision, anti-CD20-Antikörper- oder Immuntherapie mit Interferon-α oder Rituximab zur Anwendung (Coupland 2004).
13
Stadium I Befall einer einzigen Lymphknotenregion (I/N) oder Vorliegen eines
einzigen lokalisierten extranodalen Herdes (I/E)
Stadium II Befall von 2 oder mehr Lymphknotenregionen auf einer Seite des
Zwerchfells (II/N) oder Vorliegen lokalisierter extranodaler Herde und
Befall einer oder mehrerer Lymphknotenregionen auf einer Seite des
Zwerchfells (II/E)
Stadium III Befall von 2 oder mehr Lymphknotenregionen auf beiden Seiten des
Zwerchfells (III/N) oder Befall von lokalisierten extranodalen Herden
und Lymphknotenbefall, so dass ein Befall auf beiden Seiten des
Zwerchfells vorliegt (III/E)
Stadium IV Disseminierter Befall einer oder mehrerer extralymphatischer Organe
mit oder ohne Befall von Lymphknoten
Die Stadien I bis IV erhalten den Zusatz B, wenn ein oder mehrere der folgenden Allgemeinsymptome
vorliegen, und den Zusatz A, falls diese fehlen.
Allgemeinsymptome sind:
- nicht erklärbares Fieber über 38 °C
- nicht erklärbarer Nachtschweiß
- nicht erklärbarer Gewichtsverlust von mehr als 10% des Körpergewichts innerhlb von 6 Monaten
N = Lymphknoten
E = extranodal
Tabelle 4 Ann-Arbor-Stadieneinteilung, nach (Classen, Diehl et al. 2004)
d. Pathogenese der EMZL
EMZL sind niedrigmaligne B-Zell Lymphome mit noch immer unklarer Pathogenese. In
verschiedenen Lokalisationen wurden EMZL jedoch mit vorausgehenden bakteriellen
beziehungsweise viralen Infektionen und Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht:
so fanden sich Assoziationen zwischen EMZL des Magens und Helicobacter pylori
(Wotherspoon, Ortiz-Hidalgo et al. 1991; Wotherspoon, Doglioni et al. 1993; Bayerdorffer,
Neubauer et al. 1995; Isaacson 1999; Fischbach, Goebeler-Kolve et al. 2004), kutanem EMZL
und Borrelia burgdorferi (Roggero, Zucca et al. 2000), Milz-MALT und Hepatitis C Virus
(Ascoli, Lo Coco et al. 1998; Hermine, Lefrere et al. 2002), IPSID (= immunoproliferative
small intestinal disease) und Campylobacter jejuni (Lecuit, Abachin et al. 2004), EMZL der
Thyreoidea und der Hashimoto-Thyreoiditis (Thieblemont, Mayer et al. 2002) sowie EMZL
der Speicheldrüse und dem Sjögren Syndrom (Grosbois, Jego et al. 1998). Hinweise auf eine
Abhängigkeit der Tumorentwicklung von einer Antigenstimulation in diesen Lokalisationen
liefern nicht nur klinische Studien, sondern auch genetische Analysen, in welchen sich
somatische Mutationen in den variablen Regionen der Gene fanden, die für die schweren
Ketten der Immunglobuline kodieren. Eine Antigen-Selektion beschreiben Coupland et al.
(Coupland, Foss et al. 1999) und Mannami et al. (Mannami, Yoshino et al. 2001) für EMZL
der okulären Adnexe.14 3 Assoziation Chlamydien – Lymphome der okulären Adnexe Die Assoziation zwischen Chlamydienerkrankung und Tumorentstehung ist nicht ganz neu. Chlamydia trachomatis wurde erstmals 1964 von Levin et al. mit dem Rektumkarzinom (Levin, Romano et al. 1964) in Verbindung gebracht. 1979 postulierten Paavonen et al. (Paavonen, Vesterinen et al. 1979) und 2002 Smith et al. (Smith, Munoz et al. 2002) auch einen Zusammenhang mit dem Zervixkarzinom. Chlamydia pneumoniae soll nach serologischen Untersuchungen an der Entstehung von Lungenkrebs (Laurila, Anttila et al. 1997) und des kutanen T-Zell-Lymphoms (Abrams, Balin et al. 2001) mitverantwortlich sein. Nachdem Anttila et al. 1998 serologisch eine Assoziation zwischen Chlamydieninfektionen und malignen Lymphomen aufzeigten (Anttila, Lehtinen et al. 1998), gelang Ferreri et al. 2004 der Nachweis einer Assoziation von Chlamydia psittaci und Lymphomen der okulären Adnexe: Sie konnten DNA dieses Erregers in 32 von 40 (80%) Patienten mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) detektieren (Ferreri, Guidoboni et al. 2004). Daraufhin fanden auch You et al. 2005 in 78% ihrer Patienten mit Lymphomen der okulären Adnexe Chlamydia psittaci (You, Ryu et al. 2005). Gracia et al. hingegen fanden 2005 nur in 1 von 20 (5%) Patienten Chlamydia psittaci (Gracia, Mazzucchelli et al. 2005) und de Cremoux et al. in 1 Fall von 16 (6%) (de Cremoux, Subtil et al. in press 2006). Negative Ergebnisse kommen aus New York (Vargas, Fallone et al. 2006), South Florida (Rosado, Byrne et al. 2006), den Niederlanden (Mulder, Heddema et al. 2006) und Japan (Daibata, Nemoto et al. 2006), wo die Forscher keinen Zusammenhang zwischen Lymphomen der okulären Adnexe und Chlamydia psittaci finden konnten. In Studien der letzten Jahre fand man Chlamydien auch in arthritischen Gelenken, atheromatösen Plaques, in Patienten mit Multipler Sklerose, Alzheimer und Chronischem Müdigkeitssyndrom. Ob Chlamydien ursächlich an der Entstehung dieser Krankheiten beteiligt sind, inwiefern Chlamydien den Verlauf chronifizieren oder ob sie lediglich zufällig zusammen auftreten ist unklar und Gegenstand aktueller Forschung. „Aber Anwesenheit am Tatort beweist ja noch gar nichts“ bemerkte eine Journalistin ganz treffend zu diesem durchaus umstrittenen Thema.
15 4 Zielsetzung Nachdem es zahlreiche Hinweise auf Zusammenhänge einerseits zwischen Chlamydieninfektionen und der Entstehung von Tumoren, andererseits zwischen bakteriellen Infektionen und der Entwicklung von EMZL gibt, stellte sich die Frage einer möglichen Assoziation von Chlamydia psittaci mit okulären EMZL. Die derzeitige Datenlage zu diesem Thema ist höchst widersprüchlich, was weitere Forschung sinnvoll und notwendig macht. Wir untersuchten daher anhand von 40 Patienten, ob in Deutschland ein Zusammenhang zwischen einer chronischen Chlamydia psittaci Infektion und der Ausbildung eines EMZL der okulären Adnexe besteht. Hierzu führten wir anhand von formalinfixiertem und paraffineingebettetem Material chlamydienspezifische PCRs (= Polymerasekettenreaktion) durch. Nicht zuletzt die daraus resultierenden therapeutischen Konsequenzen (Antibiotika statt Radiatio?) zeugen von der klinischen Relevanz dieses Themas.
16 II Material und Methoden Mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde nach Chlamydia psittaci-DNA in formalinfixierten und paraffineingebetteten Präparaten von Lymphomen der okulären Adnexe gesucht. 1 Patienten und Präparate Untersucht wurden 47 Präparate formalinfixierter und in Paraffin eingebetteter Lymphome der okulären Adnexe von insgesamt 40 Patienten. Bei einigen Patienten wurden Proben aus verschiedenen Regionen eines Lymphoms konserviert, und es erschien sinnvoll, alle getrennt voneinander zu untersuchen, da Chlamydien eventuell nicht im gesamten Lymphom zu finden sind. Im Einzelnen sind dies: 26 Proben von 22 MALT-Lymphom-Patienten und 21 Proben von 18 Patienten mit nicht-MALT-Lymphomen, davon neun Fälle follikuläres Lymphom, drei Fälle Mantelzell-Lymphom, drei mit diffus großzelligem B-Zell-Lymphom, zwei mit Immunozytom und ein kleinzelliges B-lymphozytisches Lymphom. Die Diagnosestellung erfolgte entsprechend der WHO-Klassifikation, basierend auf spezifischen immunohistochemischen Färbemethoden, die in manchen Fällen zusätzlich mittels PCR bestätigt wurden. Das Alter der Patienten bei Biopsie-Entnahme lag zwischen 26 und 90 Jahren (Median 68 Jahre). Von den Patienten waren 19 männlichen und 24 weiblichen Geschlechts. Daraus ergibt sich eine male-female-ratio von 0,79. Außerdem wurde als Negativkontrolle ein formalinfixiertes und in Paraffin eingebettetes, somit auf gleiche Weise aufbereitetes Präparat eines akuten Entzündungsherdes im Glaskörper (Vitritis) mitgeführt.
17
Folgende Tabelle (Tabelle 5) gibt eine Übersicht über das Geschlecht und das Alter der
Patienten, das Jahr der Biopsie-Entnahme, sowie die Diagnose, das Stadium bei
Diagnosestellung und die initiale Symptomatik:
# Probe Geschlecht Alter Jahr Diagnose Stadium Symptome initial
initial
1 11 w 73 2005 EMZL IV A Protrusio bulbi, Doppelbilder,
eingeschränkte Motilität mit
Abduktionshemmung rechts
2 9, 10 m 77 2005 DLBCL IEA Schmerzen, Parästhesien rechtes
Auge
3 7, 8 m 65 2005 EMZL IEA Exophthalmus, Schmerzen rechts,
Schwindel, Doppelbilder,
Gesichtsfelddefekte
4 6 w 81 2005 EMZL IEA subkutane Knoten rechtes Unterlid
5 5, 14 m 79 2005 MCL IV E A Prominenz, Ptosis,
Visusminderung, Brennen bds
6 4 w 81 2004 EMZL IV A Konjunktivitis bds, Schwellung
Tränendrüse rechts
7 3 m 52 2004 EMZL IEA Schwellung rechtes Unterlid
8 2 m 55 2004 EMZL IEA Konjunktivitis bds
9 1 w 48 2004 EMZL II E A konjunktivale Schwellung bds
10 12 w 65 2004 FL IV Rötung, Schwellung linkes Auge
11 15 m 78 2003 EMZL IEA Abducensparese, Schwellung,
Protrusio, Ptosis linkes Auge
12 16 m 56 2003 FL I° IV B Schmerzen rechtes Auge
13 17 m 63 2003 MCL IEA spinnenetzartige Schlieren ohne
Visuseinschränkung rechts
14 18 w 26 2003 EMZL IE Konjunktivitis bds
15 19 w 64 2003 Mitbeteiligung RAI IV, Schwellung, Rötung linkes Auge
B-CLL Binet A
16 20, 21 w 81 2003 FL I° III E Schwellungen der Ober- und
Unterlider bds, Tränendrüse rechts
17 23 m 68 2002 EMZL IEA konjunktivale Schwellung links
18 24 w 64 2002 EMZL IEA Schwellung rechtes Unterlid
19 25 m 70 2002 EMZL II Lidschwellung rechts
20 26 w 83 2001 FL k.A. k.A.
21 27 w 64 2001 FL I° IV A Schwellung linkes Auge
22 28 w 78 2001 DLBCL IE Exophthalmus, Exotropie,
Bewegungseinschränkung rechts
23 29 w 79 2000 FL II° k.A. Doppelbilder mit
Abduktionshemmung rechts
24 30 w 69 2000 FL I° k.A. Schwellung linkes Oberlid mit
Protrusio bulbi
25 31 w 48 2000 FL I° IV A Schwellung innerer Lidwinkel links18
26 32 w 77 2000 FL II° k.A. Schwellung linkes Unterlid
27 33 w 76 1998 EMZL II Fremdkörpergefühl, Exophthalmus
rechts
28 34 w 62 1998 EMZL IEA Epiphora, Schwellung linkes Auge
29 37 w 90 1995 EMZL IEA Schwellung rechtes Auge
30 38 m 73 1995 EMZL IEA Exophthalmus, konjuktivale
Rötung bds
31 40 m 81 1993 EMZL k.A. Tumoren der Unterlider
32 42 m 81 1993 EMZL IV konjunktivale Schwellung
33 31 I m 57 1991 Immunozytom II Lidschwellung
34 30 I w 66 1991 EMZL IE Orbitatumor
35 29 a, b, w 38 1991 EMZL IE Lidschwellung
c, d I
36 28 I w 66 1989 EMZL IE Lidschwellung
37 27 I m 58 1989 EMZL IE Lidschwellung
38 26 I m 75 1987 Immunozytom IE Orbitatumor
39 25 I m 66 1985 MCL III konjunktivale Schwellung
40 24 I w 81 1985 DLBCL IE konjunktivale Schwellung
41 13 m 61 2004 Vitritis - konjunktivale Rötung
Tabelle 5 Klinische Daten der Patienten – #: laufende Nummer; Probe: Probennummer;
Geschlecht: m männlich, w weiblich; Alter: in Jahren; Jahr: Jahr der Biopsie-
Entnahme; Diagnosen: nach WHO-Klassifikation; B-CLL: B-Zellen Chronische
lymphatische Leukämie, DLBCL: Diffuses großzelliges B-Zell Lymphom,
EMZL: Extranodales Marginalzonen B-Zell Lymphom vom MALT-Typ, FL:
Follikuläres Lymphom, MCL: Mantelzell-Lymphom; Initiales Stadium: nach
Ann Arbor, k. A.: keine Angabe möglich.
Das Material wurde im Zeitraum von 1985 bis 2005 in der Universitäts-Augenklinik Freiburg
im Breisgau gewonnen und im Histologischen Labor der Augenklinik formalinfixiert und
paraffineingebettet und in Form von Blöcken archiviert. Von diesen Blöcken gelangte jeweils
circa 50 µm Material in 10 µm dicken Schnitten zur Bearbeitung.
Zur Bestimmung der Größe des Lymphommaterial-Anteils pro Paraffinblock wurde das
Volumen des jeweiligen Gewebsstückes berechnet, welches zur Formalinfixierung und
Paraffineinbettung eingereicht wurde. Die so erhobenen Daten führt Tabelle 6 unter der
Probennummer auf.
Die Berechnung eines fraglichen Zusammenhanges zwischen Materialmenge und dem Erhalt
eines positiven DNA-Nachweises ergab einen p-Wert von 0,32. Dies bedeutet, dass kein
Zusammenhang besteht.19 Probe Materialmenge in mm³ Probe Materialmenge in mm³ 1 3 26 k.A. 2 1 27 1904 3 4140 28 72 4 2 29 12 5 150 30 350 6 1200 31 192 7 105 32 41851 8 75 33 1386 9 196 34 1620 10 315 37 54 11 2400 38 120 12 450 40 2660 13 1000 42 40 14 630 31 I 40 15 40 30 I 250 16 125 29 a I 1500 17 1000 29 b I 1500 18 243 29 c I 1500 19 48 29 d I 1500 20 288 28 I 1152 21 40 27 I k.A. 23 144 26 I 448 24 3960 25 I 140 25 96 24 I k.A. Tabelle 6 Materialmenge je Präparat
20 2 Versuchsbedingungen Vor Beginn der Versuche wurden die Versuchsmethoden auf Sensitivität und Fehler geprüft, um eine Vorstellung davon zu bekommen, was man von den erhobenen Daten erwarten durfte. Es interessierten insbesondere die Sensitivität der DNA-Extraktion, der Chlamydia psittaci-PCR und der β-Globin-PCR. Denn wäre die Sensitivität gering, wäre ein negatives Versuchsergebnis, welches durchaus in Betracht gezogen werden musste, nicht sehr aussagekräftig. Es zeigte dann eventuell lediglich, dass mit diesen Methoden nichts detektiert werden konnte. Ebenso wurde auf eine mögliche Inhibition getestet. Damit ermittelt man, ob der Prozess der Aufarbeitung dazu führt, dass anschließende Versuchsschritte gestört beziehungsweise gehemmt werden. Auch dies ist eine mögliche Ursache für falschnegative Versuchsergebnisse, die es auszuschließen galt. a. Sensitivität Chlamydia psittaci-PCR, β-Globin-PCR Die Sensitivität einer Methode sagt aus, wie viel Material benötigt wird, um es noch nachweisen zu können. In diesem Fall war die Frage, wie viel Chlamydia psittaci- respektive β-Globin-DNA in einer Probe vorhanden sein muss, um sie per PCR noch detektieren zu können. Die Methoden der Chlamydia psittaci- und β-Globin-PCR sind am Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Freiburg bereits etabliert und werden dort täglich in der Routinediagnostik angewandt. Daher wurde schon vormals deren Sensitivität bestimmt, worauf ich freundlicherweise im Rahmen meiner Doktorarbeit zurückgreifen durfte. Die Sensitivitätsbestimmung erfolgt mittels Verdünnungsreihe. Das Prinzip der Verdünnungsreihe ist folgendes (siehe dazu auch Abbildung 1): Ausgangspunkt ist eine Probe Chlamydia psittaci- beziehungsweise β-Globin-positiven Materials bekannter Konzentration. Nun bringt man in einem neuen Reagenzgefäß ein Teil davon mit neun Teilen eines neutrale Reagens, gewöhnlich nimmt man hierfür destilliertes Wasser (Aqua bidest.), in Lösung. Somit ist die Ausgangslösung 1:10 verdünnt. Gleichermaßen kann man nun weiterverdünnen und erhält dadurch Verdünnungsstufen der Zehner-Potenz, also 1:100, 1:1.000, 1:10.000 und so weiter. Anschließend führt man von jeder Verdünnungsstufe eine PCR durch. Die Sensitivität
21
der PCR markiert dann diejenige Verdünnungsstufe, bei der als letzte eine Bande als positives
Signal erscheint.
Theoretisch kann man jetzt mit einer anderen, also zum Beispiel Zweier-Potenzreihe die
Sensitivität genauer eingrenzen. In der Praxis jedoch genügt die Zehner-Potenzreihe zumeist.
+ 9/10 + 9/10 + 9/10 + 9/10
Aqua bidest. Aqua bidest. Aqua bidest. Aqua bidest. ...
1/10 1/10 1/10 1/10 ...
1 1 : 10 1 : 100 1 : 1.000 1 : 10.000 …
Abbildung 1 Prinzip Verdünnungsreihe. Unter dem jeweiligen Gefäß ist die resultierende
Verdünnungsstufe verzeichnet.
Demnach liegt die Sensitivität der Chlamydia psittaci-PCR bei einer Plasmidkopie. Das heißt,
eine einzige Kopie Bakteriengenom genügt, um einen positiven Nachweis zu erhalten. Dies
ist maximal sensitiv.
Die Sensitivität der β-Globin-PCR beträgt 2 x 104 Zellen/µl.
b. Sensitivitätsbestimmung und -vergleich der DNA-Extraktion aus nativem und
formalinfixiertem, paraffineingebettetem Material
Nachdem eine hohe Sensitivität der PCRs gewährleistet war, hing die Sensitivität der
gesamten Versuchsreihe von der DNA-Extraktion ab. Hier waren Einbußen zu erwarten,
nachdem Formalin für seine DNA-schädigende Wirkung bekannt ist und alle Präparate damit
behandelt worden waren. Es wurde nun nicht nur die Sensitivität der DNA-Extraktion aus
formalinfixiertem paraffineingebettetem Material bestimmt, sondern auch gleichzeitig mit der
Sensitivität der DNA-Extraktion aus nativem Gewebe verglichen. Damit ließ sich der Grad an
nicht beeinflussbaren Parametern wie Beschaffenheit und Qualität der formalinfixierten,22 paraffineingebetteten Präparate abschätzen und von der Sensitivität der Methode an sich abgrenzen. Dazu diente Chlamydia psittaci-positives Lungengewebe vom Kaninchen, das vom Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Freiburg zur Verfügung gestellt wurde. Ein Teil davon wurde direkt, also nativ, zur DNA-Gewinnung aufgearbeitet, ein anderer, gleichgroßer Teil wurde formalinfixiert, in Paraffin eingebettet und dann in Form von 10 µm dicken Schnitten der DNA-Extraktion unterzogen. Beides geschah mit dem Präparationskit der Firma Roche und mit derselben Aufarbeitungsmethode (Beschreibung siehe unter Punkt 3). Daraufhin wurden von dieser DNA Verdünnungsstufen von 1:1 bis 1:100.000 hergestellt, mit denen anschließend Chlamydia psittaci-PCR (Reaktionsansatz siehe unter Punkt 4 a.) durchgeführt wurde. Anhand dieser Verdünnungsreihe konnte man dann wiederum die Sensitivität ablesen. c. Spike-Versuch: Inhibiert die DNA-Extraktion den Vorgang der PCR? Nachfolgend war nun herauszufinden, ob die Aufarbeitung der DNA-Gewinnung den Vorgang der PCR inhibiert, ob also bei der DNA-Extraktion unerwünschte Nebenprodukte entstehen, welche dann mit den PCR-Reagenzien solcherart interagieren, dass ein geregelter und vollständiger PCR-Ablauf nicht mehr erfolgt. Dies ist eine häufige Ursache für falschnegative Ergebnisse, die es auszuschließen galt (Newton and Graham 1994). Hierzu wurde eine Chlamydia psittaci-Negativkontrolle, zur Verfügung stand eine Biopsie der Wirbelsäule, wiederum nativ sowie formalinfixiert und paraffineingebettet mit dem Roche- Kit zur DNA-Extraktion aufgearbeitet (siehe unter Punkt 3). Nun wurde je eine Chlamydia psittaci-Verdünnungsreihe mit jeweils 5µl dieser DNA-Extrakte versetzt (‚spike’) und damit Chlamydia psittaci-PCR (siehe unter Punkt 4 a.) durchgeführt. Konnte dann Chlamydia psittaci-DNA bis zur gleichen Verdünnungsstufe wie in der unter Punkt II 2 b. beschriebenen PCR der Chlamydia psittaci-Verdünnungsreihe nachgewiesen werden, lag keine Inhibition vor, andernfalls war eine Inhibition nicht auszuschließen.
23 3 DNA-Extraktion Um aus formalinfixierten, paraffineingebetteten Präparaten DNA zu gewinnen, kamen mehrere Methoden zur Anwendung (in Klammern jeweils die Hersteller- beziehungsweise Firmennamen der verwendeten Reagenzien und Geräte): a. Roche Zunächst wurde das Präparationskit der Firma Roche (Roche High Pure PCR Template Preparation Kit) gemäß Herstellerangaben verwandt: Hierbei werden 2-3 Materialschnitte in 500 µl Xylol (Merck) bei 37 °C 25 Minuten lang entparaffiniert (Thermomixer 5436 der Firma Eppendorf) und anschließend fünf Minuten bei 14.000 U/min (Umdrehungen pro Minute) zentrifugiert (Tischkühlzentrifuge 5417 R der Firma Eppendorf). Das Xylol wird nun vollständig abpipettiert. Darauf erfolgt eine absteigende Alkoholreihe, wobei das Material nacheinander in jeweils 500 µl 100-, 80-, 60- und 40%igem Alkohol (J.T. Baker) und zuletzt in destilliertem Wasser für jeweils eine Minute gewaschen wird. Über Nacht inkubiert man bei 37 °C mit 200 µl Tissue Lysis Buffer (Gewebe Lyse Puffer) und 40 µl Proteinase K (Roche/ Qiagen). Am nächsten Tag werden weitere 20 µl Proteinase K zugegeben und nochmals für ein bis zwei Stunden bei 55 °C inkubiert. Mit Zugabe von 200 µl Binding Buffer (Bindepuffer) bedarf es einer weiteren zehnminütigen Inkubation bei 70 °C. Abschließend kommen noch 100 µl Isopropanol (Merck) dazu. Diese Lösung wird nun in eine so genannte Filter Tube mit Collection Tube umgefüllt und eine Minute bei 8.000 U/min zentrifugiert. Das jetzt in der Filter Tube befindliche Zentrifugat wird in eine neue Collection Tube gestellt und nach Zugabe von 500 µl Inhibitor Removal Buffer nochmals eine Minute bei 8.000 U/min zentrifugiert. Die Collection Tube wird erneut durch eine frische ersetzt, 500 µl Wash Buffer zugegeben und wiederum eine Minute bei 8.000 U/min zentrifugiert. Die Waschung wird einmal wiederholt. Die abzentrifugierte Flüssigkeit wird verworfen und der Rest jetzt zehn Sekunden bei 14.000 U/min zentrifugiert. Zuletzt wird die Filter Tube (in der sich die DNA befindet) in ein Eppendorfgefäß gestellt, 200 µl auf 70 °C vorgewärmter Elution Buffer zugegeben und alles eine Minute bei 8.000 U/min zentrifugiert. Nun befindet sich die DNA im Eppendorfgefäß in Lösung.
24 Nachdem kein DNA-Nachweis gelang, kamen Zweifel an der Methode auf, so dass zwei weitere DNA-Extraktionsmethoden getestet wurden: das so genannte Wassmer-Protokoll, das im Pathologischen Institut der Universität Freiburg zur Anwendung kommt, sowie eine Aufarbeitung mit NaOH, welche aus dem Histologischen Labor der Universitäts-Augenklinik stammt. Zur exakten Vergleichbarkeit der Resultate wurden für alle drei Methoden die gleichen Präparate verwandt. b. Wassmer-Protokoll Ein mindestens 5 µm großer Schnitt Materials wird mit 1 ml Roticlear (Roth) (Alternativprodukt für Xylol zum Entwachsen histologischer Schnitte) versetzt und zehn Minuten auf dem 58 °C warmen Schüttler inkubiert, dann zehn Minuten bei 14.000 U/min zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Diese Arbeitschritte werden zweimal wiederholt. Nach Zugabe von 1 ml 96-100%igem Alkohol wird das ganze fünf Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt, zehn Minuten bei 14.000 U/min zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Diese Alkoholwaschung wird einmal wiederholt. Anschließend lässt man das Pellet im speed vac. concentrator (Heto Intermed) bei 30 °C zehn bis zwölf Minuten gut trocknen. Daraufhin wird 100 µl Proteinase-K-Puffer hinzugegeben und auf dem Schüttler bei 55 °C zehn Minuten inkubiert, wonach man es auf Raumtemperatur abkühlen lässt. Zum Proteinase K-Verdau wird das Material mit 6 µl Proteinase K versetzt und bei 55 °C über Nacht inkubiert, bis keine Gewebsreste mehr zu sehen sind. Bei Bedarf wird mit weiteren 6 µl Proteinase K geboostert. Zuletzt wird alles 20 Minuten im Wasserbad gekocht und zwei Minuten bei 14.000 U/min zentrifugiert. Die DNA befindet sich zum Schluss im Überstand und kann in ein neues Gefäß überführt werden. c. NaOH-Protokoll 30-50 µm Schnittmaterial werden mit 1.200 µl Xylol versetzt fünf Minuten bei 14.000 U/min zentrifugiert, der Überstand entfernt und dieselbe Prozedur mit Ethanol anstelle von Xylol zweimal wiederholt. Nachdem das Pellet bei 37 °C getrocknet ist, werden 100 µl 0,1 M NaOH (Merck) zugegeben und bei 95 °C inkubiert, bis kein Pellet mehr sichtbar ist (ca. 1-2 Stunden). Anschließend erfolgt die DNA-Fällung mit 100 µl Isopropanol für 30 Minuten bei
25 minus 20 °C. Das Gemisch wird sodann fünf Minuten bei 14.000 U/min zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Mit 250 µl 70%igem Ethanol wird weitere fünf Minuten bei 14.000 U/min zentrifugiert, der Überstand entfernt und das Pellet, welches die extrahierte DNA darstellt, nachdem es getrocknet ist, mit 60 µl T ½E Puffer (Sigma) in Lösung gebracht. d. Evaluation der benötigten Menge an Material anhand von Roche-Aufarbeitung und NaOH-Protokoll Schließlich wurde noch untersucht, was die benötigte Mindestmenge an Material für die DNA-Extraktion ist, mit der man bei der anschließenden PCR noch einen positiven DNA- Nachweis erhielt und ob ein Mehr an Material zuverlässigere Ergebnisse garantierte. Zu diesem Zweck wurde eine menschliche Thoraxbiopsie, die vom Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene zu Verfügung gestellt wurde, formalinfixiert, paraffineingebettet und in 10 µm dünne Schnitte geschnitten. Davon wurde jeweils wenig (50 µm) und viel (100 µm) Material mit jeder der beiden Extraktionsmethoden nach der unter 3 a. beziehungsweise c. aufgeführten Anleitung aufgearbeitet. Die anschließende β-Globin-PCR zum Nachweis humaner DNA ergab dann das Resultat der DNA-Extraktion. Der experimentelle Vergleich der Methoden ergab für das unter Punkt 3 c. dargestellte NaOH-Verfahren die besten Resultate, so dass bei sämtlichen Proben diese Methode zur Anwendung kam.
26
4 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Kary Banks Mullis entwickelte 1983 die Polymerasekettenreaktion (PCR) als ein Verfahren
zur selektiven Amplifizierung bestimmter DNA-Sequenzen in vitro. Er erhielt dafür 1993
zusammen mit M. Smith den Nobelpreis für Chemie. Das Prinzip der PCR veranschaulicht
folgende Abbildung (Abbildung 3):
Abbildung 3 Schema PCR: 1. Denaturierung; 2. Annealing; 3. Elongation; 4. Resultate nach
mehrmaligem Wiederholen (Commons 2003)27
Der DNA-Doppelstrang wird zunächst durch Erhöhen der Temperatur auf circa 90 °C in zwei
Einzelstränge aufgetrennt (Denaturierung, Nummer 1 in der Abbildung). Danach werden zwei
aus ungefähr 15-25 Basenpaaren bestehende Oligonukleotide (sog. Primer) zugesetzt, die den
5’-Enden der zu vervielfältigenden DNA-Sequenz komplementär sind und bei Absenken der
Temperatur auf circa 50 °C an diese binden (Annealing, Nummer 2 in der Abbildung). Mittels
des Enzyms DNA-Polymerase, das an den Primern ansetzt, werden die beiden Einzelstränge
jeweils zu Doppelsträngen komplementiert (Elongation, Nummer 3 in der Abbildung). Dieser
Vorgang geschieht im Temperaturoptimum der Polymerase, welches bei circa 70 °C liegt.
Durch mehrmaliges Wiederholen dieses Zyklus Denaturierung-Annealing-Elongation erreicht
man eine exponentielle Vermehrung der amplifizierten DNA-Moleküle (Nummer 4 in der
Abbildung).
Früher musste nach jedem Zyklus jeweils neue Polymerase zugegeben werden, da diese bei
90 °C ebenfalls denaturierte. Inzwischen verwendet man die aus dem Bakterium
Thermophilus aquaticus gewonnene so genannte Taq-Polymerase, deren Temperaturoptimum
bei 72 °C liegt und welche den Denaturierungsprozess überlebt. (Saiki, Gelfand et al. 1988;
Newton and Graham 1994; Mullis and al. 1997)
a. Chlamydia psittaci-PCR
Für die Chlamydia psittaci-PCR wurden die Primer CPS-100 und CPS-101 (Tib Molbiol)
eingesetzt, deren Zielsequenz die 16S und 16S-23S spacer rRNA Gene sind. Die Größe des
Amplifikats beträgt 111 bp (Basenpaare). Im Folgenden sind die Primersequenzen und der
Reaktionsansatz aufgeführt:
PRIMER CPS-100: 5’ CCC AAG GTG AGG CTG ATG AC
CPS-101: 5’ CAA ACC GTC CTA AGA CAG TTA28
REAKTIONSANSATZ Aqua bidest. 28,6 µl
Puffer 10x HS-Qiagen 5 µl
dNTP (1,25 mM) 8 µl
MgCl2 2 µl
CPS 100 (30 µM) 0,5 µl
CPS 101 (30 µM) 0,5 µl
Hot-Start-Taq-Qiagen 0,4 µl
DNA 5 µl
Reaktionsansatz insgesamt 50 µl
Zusätzlich wurden stets zwei quantifizierte Chlamydia psittaci-Positivkontrollen (Pk 1 = 2 x
101 Kopien/µl und Pk 2 = 2 x 102 Kopien/µl) mitgeführt. Als Negativkontrolle wurde der
gleiche Reaktionsansatz mit destilliertem Wasser anstelle der DNA mitgeführt. Diese
Maßnahmen dienen einerseits der Kontrolle des regelrechten PCR-Ablaufes, andererseits dem
Ausschluss von falschpositiven Ergebnissen durch Kreuzreaktionen sowie Luft- und
Kontaktkontaminationen.
Durchgeführt wurde die PCR auf Thermocycler-Geräten Typ T3000 der Firma Biometra nach
folgendem Schema:
Zyklenzahl Temperatur Zeit
Denaturierung 1 Zyklus 95 °C 15:00 min
Denaturierung 40 Zyklen 95 °C 0:30 min
Annealing 55,8 °C 1:00 min
Elongation 72 °C 1:00 min
Vervollständigung 1 Zyklus 72 °C 10:00 min
4 °C bis Abbruch
Tabelle 7 PCR-Schema Chlamydia psittaci-PCR29
b. β-Globin-PCR und SOCS-PCR
β-Globin ist ein so genanntes ‚housekeeping gene’, das in allen menschlichen Zellen
vorhanden ist. Kann man β-Globin nachweisen, hat man folglich humane DNA vorliegen.
Dies macht man sich zunutze, um die DNA-Extraktion zu kontrollieren und falschnegative
Ergebnisse auszuschließen. In dieser Versuchsreihe wurde zu diesem Zweck parallel zur
Chlamydia psittaci-PCR mit allen Proben auch β-GlobinPCR durchgeführt.
Als Primer wurde das Paar KM 29/ KM 38 (Tib Molbiol) verwandt, welches heute in der
Routine-Diagnostik etabliert ist. Das Amplifikat ist 262 bp groß. Im Folgenden sind die
Primersequenzen und der Reaktionsansatz aufgeführt:
PRIMER KM 29: 5’ GGT TGG CCA ATC TAC TCC CAG G
KM 38: 5’ TGG TCT CCT TAA ACC TGT CTT G
REAKTIONSANSATZ Aqua bidest. 28,6 µl
Puffer 10x HS-Qiagen 5 µl
dNTP (1,25 mM) 8 µl
MgCl2 2 µl
KM 29 (30 µM) 0,5 µl
KM 38 (30 µM) 0,5 µl
Taq-Pol 5 U/µl 0,4 µl
DNA 5 µl
Reaktionsansatz insgesamt 50 µl
Auch hier wurde jeweils eine quantifizierte Positivkontrolle und eine Wasser-
Negativkontrolle mitgeführt. Das PCR-Thermocycler Schema sieht wie folgt aus:30
Zyklenzahl Temperatur Zeit
Denaturierung 1 Zyklus 94 °C 2:00 min
Denaturierung 30 Zyklen 92 °C 1:00 min
Annealing 55 °C 1:00 min
Elongation 72 °C 1:30 min
Vervollständigung 1 Zyklus 72 °C 5:00 min
4 °C bis Abbruch
Tabelle 8 PCR-Schema β-Globin-PCR
Da der β-Globin-Nachweis nicht in allen Fällen gelang, wurde versucht ein weiteres
‚housekeeping gene’ nachzuweisen, nämlich SOCS (= suppressor of cytokine signaling). Es
umfasst lediglich 204 bp und erschien dadurch unter dem Verdacht der DNA-Destruktion
eher nachweisbar als das größere β-Globin. Denn mit zunehmender DNA-Destruktion nimmt
die Größe der noch nachweisbaren DNA-Sequenzen immer mehr ab. Die hierfür verwendeten
Primer waren RT 809Rv und RT 606Fw, der Reaktionsansatz wie folgt:
PRIMER RT 809Rv: 5’ AGG GGG CGG CAT GTA GTG GTG
RT 606Fw: 5’ CCC GCC GGC ACC TTT CTG AT
REAKTIONSANSATZ Aqua bidest. 27,6 µl
Puffer 10x HS-Qiagen 5 µl
dNTP (1,25 mM) 8 µl
MgCl2 2 µl
RT 809Rv 1 µl
RT 606Fw 1 µl
Taq-Pol 5 U/µl 0,4 µl
DNA 5 µl
Reaktionsansatz insgesamt 50 µl
Das Cycler-Schema für diese PCR war ähnlich dem der β-Globin-PCR, lediglich in der
Annealing-Temperatur wurde es an die Primer angepasst leicht modifiziert:31
Zyklenzahl Temperatur Zeit
Denaturierung 1 Zyklus 94 °C 2:00 min
Denaturierung 30 Zyklen 92 °C 1:00 min
Annealing 60 °C 1:00 min
Elongation 72 °C 1:30 min
Vervollständigung 1 Zyklus 72 °C 5:00 min
4 °C bis Abbruch
Tabelle 9 PCR-Schema SOCS-PCR
5 Agarose-Gelelektrophorese
Zur Sichtbarmachung der PCR-Ergebnisse kam die Methode der Gelelektrophorese zur
Anwendung. Die PCR-Produkte werden auf ein Gel aufgetragen und durch Anlegen eines
elektrischen Feldes der Größe nach aufgetrennt, da DNA negativ geladen ist und somit
Richtung Anode wandert, wobei kleinere Fragmente schneller wandern als größere.
Ausschlaggebend für die Auftrennung ist hier nicht der Grad der Ladung, sondern tatsächlich
die Größe des DNA-Fragmentes, da DNA unabhängig von seiner Größe stets die gleiche
Ladung trägt. Als Maßstab läuft ein Molekulargewichtsstandard mit. Das sind Marker-DNA-
Fragmente bestimmter bekannter Größen, anhand derer dann die Größe des PCR-Produkts
bestimmt werden kann. Nach der Elektrophorese wird das Gel mit Ethidiumbromid angefärbt.
Ethidiumbromid interkaliert mit der DNA und lässt diese im UV-Licht als so genannte
Banden aufleuchten.
a. Agarose-Gel
Agarose ist ein Polysaccharid, das den Hauptbestandteil des hauptsächlich von den
Rotalgengattungen Gelidium und Gracillaria produzierten Agar darstellt. Wichtigste
Eigenschaft ist seine Fähigkeit zu gelieren. Dies macht Agarose zu einer einfach
herzustellenden Trägersubstanz zur elektrophoretischen Auftrennung von Nukleinsäuren.
Für diese Arbeit empfahl es sich, ein 3%iges Gel zu verwenden, da die Amplifikate recht
klein waren und in geringer konzentriertem, ‚großmaschigerem’ Gel nicht so gut hätten
aufgetrennt werden können.32 Zur Herstellung eines 3%igen Geles werden 12 g Agarose-Pulver (Roth) in 388 g TBE- Puffer-Lösung (TBE = Tris-Borat-EDTA) (Sigma) gebracht, alles sechs Minuten gekocht (Mikrowelle der Firma Siemens) und in ein Gelbett mit Probenkämmen (beides aus Plexiglas) gegossen. Nach circa einer halben Stunde ist das Gel ausgehärtet, und die Kämme können entnommen werden. Zurück bleiben Vertiefungen, so genannte Taschen (engl. slots), in welche die Proben im nächsten Arbeitsschritt pipettiert werden. b. Elektrophorese Je 8,5 µl PCR-Produkt werden in einer Mikrotiterplatte mit 1,5 µl Laufpuffer versetzt und sodann in die Geltaschen des in der Elektrophorese-Kammer (Bio Rad) befindlichen Gels pipettiert. Der Laufpuffer erfüllt hier zweierlei Funktionen: Zum einen ist er mit Bromphenolblau farblich markiert, so dass man das Fortschreiten der Elektrophorese optisch kontrollieren kann. Zum anderen besitzt er durch Glycerin eine hohe Dichte, wodurch das Einsinken der in die Geltaschen pipettierten PCR-Produkte gewährleistet wird. Schließlich ist darauf zu achten, daß das Gel vollständig von Pufferlösung umgeben ist, um ein gleichmäßiges elektrisches Feld erzeugen zu können. Daraufhin wird die Kammer an eine Stromquelle angeschlossen und ein Strom von 320 mA angelegt (Netzgerät der Firma Bio Rad). Dies veranlasst alle DNA-Fragmente aufgrund ihrer negativen Ladung in Richtung Anode zu wandern. Nach circa 25-40 Minuten ist eine ausreichende Auftrennung der DNA- Fragmente nach Größe erfolgt. Abgelesen wird dies am Farbmarker, der stets vor der DNA- Front läuft.
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