Entwicklung eines Assays für die quantitative und qualitative Einschätzung humaner Mitochondrien-DNA bei biologischen Minimalspuren
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Universitätsklinikum Ulm Institut für Rechtsmedizin Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. Erich Miltner Entwicklung eines Assays für die quantitative und qualitative Einschätzung humaner Mitochondrien-DNA bei biologischen Minimalspuren Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm vorgelegt von Eva Franke geboren in Breisach am Rhein 2019 1
Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Peter Wiegand 2. Berichterstatter: PD Dr. Bernd Baumann Tag der Promotion: 22.10.2020 i
INHALTSVERZEICHNIS Abkürzungsverzeichnis ...................................................................................................................... iii 1. Einleitung ................................................................................................................................... 1 1.1. Mitochondriale Humane DNA ................................................................................................ 1 1.2. mtDNA Sequenzierung und deren Nutzung in der forensischen Spurenanalyse ................. 4 1.3. Bedeutung der mtDNA Quantifizierung ................................................................................ 7 2. Material und Methoden .......................................................................................................... 10 2.1. Material ................................................................................................................................ 10 2.2. Geräte ................................................................................................................................... 11 2.3. Proben ................................................................................................................................... 11 2.4. Versuchsaufbau .................................................................................................................... 12 2.5. DNA-Extraktion ..................................................................................................................... 13 2.6. PCR-Amplifikation und Agarose Kontrolle .......................................................................... 14 2.7. Aufreinigung PCR-Amplifikat ............................................................................................... 18 2.8. Klonierung............................................................................................................................. 18 2.9. Real Time PCR ....................................................................................................................... 20 2.10. Umrechnung der Messungen der Standardkurve von Kopienzahl in ng/l ..................... 27 2.11. Schmelzkurvenanalyse ....................................................................................................... 29 2.12. Sequenzierung nach Sanger und Kapillarelektrophorese ................................................. 29 3. Ergebnisse ................................................................................................................................ 34 3.1. Klonierung............................................................................................................................. 34 3.2. Real Time PCR ....................................................................................................................... 34 3.3. Schmelzkurven-Analyse ....................................................................................................... 41 3.4. Ergebnis Sequenzierung ....................................................................................................... 45 4. Diskussion ................................................................................................................................ 51 4.1. Probengewinnung und Material .......................................................................................... 51 4.1.I.DNA-Extraktion................................................................................................................ 51 4.1.II. PCR und Klonierung ....................................................................................................... 52 4.2. Real Time PCR ....................................................................................................................... 53 4.3. Standardkurve ...................................................................................................................... 58 4.4. Sequenzierung ...................................................................................................................... 60 5. Zusammenfassung ....................................................................................................................... 65 6.Literaturverzeichnis....................................................................................................................... 67 Anhang ............................................................................................................................................. 71 Danksagung ................................................................................................................................... 80 Lebenslauf...................................................................................................................................... 81 ii
Abkürzungsverzeichnis BLAST: Basic Local Alignment Search Tool (Sammlung von DNA- und Protein- Sequenzdaten zum Vergleich von Mutationen) bp: Basenpaare BRCA-Gen: Breast-Cancer-Gen (Brustkrebsgen) Ct: Treshold cycle (theoretische Größe für den Beginn eines expotentiellen Wachstums einer Kurve) D-Loop: displacement loop (Verdrängungsschleife, spezifische Sekundärstruktur der DNA) DNA: deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) dNTP: Desoxyribonukleosidtriphosphat dUTP: Deoxyuridintriphosphat GE: Genome equivalent HVR: Hypervariable Region LB-Medium: Lysogeny Broth-Medium LF: Long Forward LR: Long Reverse MSH: Mundschleimhaut mtDNA: Mitochondriale DNA ng: Nanogramm NCBI: National Center for Biotechnology Information PCR: Polymerase Chain Reaktion (Polymerasekettenreaktion) pg: Picogramm rpm: rounds per minute (Runden pro Minute, Umdrehungszahl der Zentrifuge) iii
RNA: Ribonukleinsäure rRNA: ribosomale-Ribonukleinsäure SF: Short Forward SNP: Single Nucleotide Polymorphism (Einzelnukleotidpolymorphismus) SR: Short Reverse STR: Short tandem repeat (Mikrosatelliten) tRNA: transfer-Ribonukleinsäure qPCR: quantitative Echtzeit-PCR, Real Time PCR UDG: Uracil-DNA-Glykosidase iv
1. EINLEITUNG 1.1. MITOCHONDRIALE HUMANE DNA Nahezu die gesamte menschliche DNA liegt durch Proteine verpackt, als 22 gepaarte homologe autosomale Chromosomen und 2 Geschlechtschromosomen, X und Y, vor. Man nennt dies auch diploider Chromosomensatz, wobei jeweils ein Chromosom von einem Elternteil vererbt wird. Diese DNA nennt man Kern-DNA, da sie sich im Zellkern befindet. Auf molekularer Ebene ist die doppelsträngige Desoxyribonukleinsäure auf Nukleosomen aufgewickelt und je nach Phase, in der sich die Zelle befindet mehr oder weniger verdichtet. Diese genomische DNA hat Abschnitte mit für die Zelle wichtigen Informationen, die als Gen bezeichnet werden. Ein Gen ist „eine lokalisierbare Region genomischer DNA-Sequenz, die einer Erbeinheit entspricht und mit regulatorischen, transkribierten und/oder funktionellen Sequenzregionen assoziiert ist“ (Pearson H. 2006). Das Gen wird dann, während der sogenannten Transkription (Nordheim A. et al. 2015) , abgelesen und es entsteht ein RNA-Strang, den man nach seiner Funktion in tRNA, mRNA und rRNA einteilt. Das transkribierte Gen enthält jedoch auch Abschnitte ohne relevante Information, die sogenannten Introns, welche bei der Bearbeitung der prä-RNA zur RNA herausgeschnitten werden. Übrig bleiben die Exons mit codierender Sequenz. Das Verhältnis von Introns zu Exons ist in jedem Gen unterschiedlich und schwankt zwischen über 10% Exons beispielsweise im BRCA2-Gen (Górski B. u. Debniak T, Jakubowska A, Cybulski C, Huzarski T, Byrski T, Złowocka E, Lubiński J. 2003) und 0,4% im Dystophin-Gen (Shiga N. et al. 1997). Insgesamt codiert nur etwa 1,5% der gesamten Kern-DNA für Proteine während 98,5% sogenannte „Junk-DNA“ (Lander E. S. et. al. 2001) aus Introns und anderen nicht-kodierenden Desoxyribonukleinsäuren bestehen. Kodierende DNA ist bei Individuen größtenteils identisch, nicht-kodierende DNA jedoch enthält auf bestimmten Abschnitten Wiederholungen bestimmter Basenpaare, welche interindividuell verschieden bei einem Menschen sind. Diese Wiederholungen von Basen, beispielsweise TAGTAGTAG… nennt man Mikrosatelliten oder auch short tandem repeats (STRs). Dies sind Sequenzlängenpolymorphismen, welche in der forensischen Untersuchung von biologischen Spuren standardmäßig genutzt wird (Butler J. M. 2005). 1
Ein Prozent der genetischen Information jedoch ist in einer anderen Zellorganelle vorhanden, dem Mitochondrium. 1963 wurde die mitochondriale DNA, abgekürzt mtDNA, von Margit M. K. Nass und Sylvan Nass elektronenmikroskopisch entdeckt (Nass M. M. K. u. Nass S. 1968). Der Endosymbiontentheorie (Sagan L. 1967) zufolge waren Mitochondrien ursprünglich Prokaryonten, welche sich in die tierische Vorläuferzellen eingeschleust haben. Hinweise darauf sind die zirkulär angeordnete Form der DNA, die Ähnlichkeit der Proteinbiosynthese, die Lagerung von DNA in Nukleoid und der Aufbau der DNA, der größtenteils aus Exons besteht. Der größte Teil der mitochondrialen DNA codiert für Proteine der Atmungskette einer Zelle. Die Atmungskette ist eine Abfolge von molekularchemischen Reaktionen, bei denen es durch verschiedene Reduktions- und Oxidationsvorgängen zur Bildung von ATP (Adenosintriphosphat), einem Hauptenergieträger von Zellen, kommt. Am Ende dieser Atmungskette steht die Reduktion von Sauerstoff zu Wasser, welches bei der physiologischen Atmung in der Lunge wieder ausgetauscht wird. Da die mtDNA also einen wichtigen Teil der Proteine für die Atmungskette codiert und diese im Mitochondrium liegt, wird das Mitochondrium auch als „Kraftwerk der Zelle“ (Jakobs S. 2004) bezeichnet. Ein weiterer Unterschied von mtDNA zur Kern-DNA ist die Art der Vererbung. MtDNA wird ausschließlich von der Mutter vererbt. Die paternale mtDNA befindet sich im Hals des Spermiums, der kein Teil der Zygote wird, und wird daher von der Eizelle mit Ubiquitin markiert, sodass sie anschließend abgebaut wird (Nordheim A. et al. 2015). Im Tierversuch seien jedoch auch kleine Anteile väterlicher mtDNA nachgewiesen worden. (Schwartz M. u. Vissing J. 2002) Das komplette mitochondriale Genom beinhält 37 Gene für Proteine, Transfer-RNAs (tRNA) und ribosomale-RNAs (rRNA). Zwei rRNAs und 14 tRNAs, sowie 12 von 13 proteinkodierenden Genen kodieren auf dem schwereren, Purin-reichen Strang oder auch heavy (H-)strand. Acht tRNA-Gene und ein proteinkodierendes Gen kodieren auf dem leichteren, Pyrimidin-reichen Strang oder light (L-)strand (Anderson et al. 1981). Des Weiteren gibt es eine Kontrollregion, auch D-Loop genannt, die wiederum 3 Hypervariable Regionen (HVR I-III) (van Oven M. u. Kayser M. 2009) enthält. Im Gegensatz zur restlichen mtDNA ist der D-Loop, mit circa 1100 Basenpaaren, nicht kodierend für Proteine und beinhaltet daher mehr inter- sowie intraspezifische Unterschiede. Hier liegt die größte interindividuelle Varianz (Budowle B. et al. 1999). 2
Innerhalb dieser Region liegt zwischen 16024-16365bp die Hypervariable Region I, zwischen 73-340bp die HVR II, sowie die HVR III zwischen 438-574bp ABBILDUNG 1) HYPERVARIABLE REGIONEN AUF DEM D-LOOP DER MITOCHONDRIELLEN DESOXYRIBONUKLEINSÄURE, QUELLE: VERENA THIAS, EINE FORENSISCHE METHODE ZUR EINZELZELLUNTERSUCHUNG MIT SEQUENZIERUNG DES D-LOOPS DER MITOCHONDRIALEN DESOXYRIBONUKLEINSÄURE, 2008 HYPERVARIABLE REGIONEN I, II UND III UND DEREN POSITION AUF DEM D-LOOP Die zirkuläre Mitochondrien-DNA besitzt zwei Stellen, eine auf jedem Strang, als Start der Replikation. Der „Origin of replication“ des H-Strangs, sowie die Promoter-Region für beide Stränge sind in der D-Loop Region enthalten. Am „Origin of replication“ beginnt die DNA Replikation also die Vervielfachung der Gen-Sequenzen. Diese Promoter-Region ist der Beginn der Transkription für die Bildung der verschiedenen RNAs. ABBILDUNG 2) AUFBAU DER MENSCHLICHEN MITOCHONDRIALEN DESOXYRIBONUKLEINSÄURE (QUELLE: WILDLIFE DNA ANALYSIS, 2013, DNA, GENOMES AND GENETIC VARIATION. IN A. LINACRE, & S. S. TOBE, WILDLIFE DNA ANALYSIS (1ST ED.). WEST SUSSEX: WILEY-BLACKWELL MITOCHONDRIELLER DESOXYRIBONUKLEINSÄURE-RING MIT 37 GENEN, ÄUßERER HEAVY-STRANG UND INNERER LIGHT-STRANG 3
Die zwei oben genannten rRNAs, 16S und 12S rRNA, bilden, zusammen mit Proteinen, das Ribosom, welches den Ort der Proteinbiosynthese darstellt. Die 16S Region ist circa 1500 bp lang (Yang B. et al. 2016;Keller P. M. et al. 2010). Da diese kodierenden Regionen bei jedem Individuum identische Sequenzen aufweisen und die 16S-Region für Mutationskrankheiten nur wenig anfällig ist (Elson J. L. et al. 2015), wurde in diesem Versuch die 16S- Region als Referenzregion gewählt. 1.2. MTDNA SEQUENZIERUNG UND DEREN NUTZUNG IN DER FORENSISCHEN SPURENANALYSE Mitochondriale DNA ist ein wichtiger Teil der forensischen Spurenanalyse. Wenn Tatortspuren gesichert werden, handelt es sich häufig um sehr geringe Zellantragungen mit zum Teil degradierter DNA. Bei so geringen DNA-Mengen von maximal 100pg spricht man geläufig von „Low Template DNA" (Buckleton J. 2009). Die Sequenzierung von low-template DNA ist, mit der Identifizierung bedeutender Personen, in den letzten Jahren in der Gesellschaft bekannt geworden. 2007 die Identifizierung der russischem Zaren-Familie (Clark D. P., Pazdernik N. J. 2009) und 2014 die von mexikanischen Studenten, welche von einem mexikanischen Drogenkartell ermordet und verbrannt wurden (Eades L. 2015). Bei beiden Bespielen handelte es sich um stark degradierte Proben, wie verbrannter Knochen. Die Analyse genomischer DNA ist dadurch besonders beeinträchtigt. Die verhältnismäßig große Länge der typisierten Kern-DNA Sequenzen und die Tatsache, dass pro Zelle nur eine Kopie der genomischen DNA vorliegt, können eine konventionelle Analyse mittels STR- Profil massiv erschweren. Die Masse eines nukleären Genoms einer Zelle liegt bei circa 6pg. Mit einer Probe, die diese 6pg oder weniger DNA-Menge enthält, ist man an der Detektionsgrenze für humane diploide Zellen angelangt und die Erlangung eines vollständigen DNA-Profils ist nicht mehr zu erwarten. Im Gegensatz dazu gibt es pro Zelle 102 bis 104 Kopien mitochondrialen Genoms (Rooney J. P. et al. 2015;Bogenhagen D., Clayton D. A. 1974, 1974), je nach Metabolismus der Zelle. Des Weiteren ist die mitochondriale DNA weitaus kürzer und durch ihre Ringstruktur stabiler (Budowle B. et al. 2005) gegenüber Umwelteinflüssen und Degradation. So kann es sein, dass eine 4
Analyse der gleichen Probe von mitochondrialer DNA zu einem validen Ergebnis führt, jedoch nicht auf Basis genomischer STRs. Bei der Analyse und Interpretation von solch geringen und degradierten DNA-Mengen mittels mitochondrialer Marker ist es besonders wichtig die Art und Weise der Spurenantragung zu bedenken. Sekundär- oder Tertiärtransfer (Lowe A. et al. 2002), das heißt eine Zellübertragung von einer Person auf eine Weitere, oder auf ein Objekt oder gar wiederum auf eine weitere Person oder ein weiteres Objekt, ist häufig und schwer detektierbar und kann möglicherweise zu Schwierigkeiten bei der Ergebnisinterpretation führen. Dieser Sekundär- oder Tertiärtransfer kann natürlich auch von bekannten Einflussfaktoren herrühren, daher ist Kontamination ein weiterer Punkt, den es zu beachten gilt, wenn man eine sehr geringe Spur interpretiert. Eine Kontamination ist sowohl während der Spurensicherung als auch im Labor möglich. Daher sind strenge Arbeitsschutzregeln wie regelmäßiger Handschuhwechsel, das Tragen eines Mundschutzes und getrennte Räume von prä- und post-PCR Schritten unerlässlich. Nichtsdestotrotz kann eine Kontamination nie ganz ausgeschlossen werden. Wie bereits erwähnt, besitzt die mtDNA kaum Introns sondern fast nur kodierende DNA. Will man eine Analyse mit mtDNA-Proben durchführen, bietet sich die D-Loop Region und darin insbesondere die Hypervariablen Regionen an. Da diese Sequenzbereiche nicht kodierend sind, können sie eine natürliche Varianz zwischen Personen unterschiedlicher maternaler Abstammung zeigen. Hierbei ist jedoch zu beachten, dass innerhalb einer Familie mit gleicher mütterlicher Abstammung keine maßgebenden Unterschiede zu erwarten sind. Die Analyse ist also weniger diskriminativ und dient eher dem Ausschluss von berechtigten Personen. Was für die Forensik eher eine negative Auswirkung hat, wird in der Biogeographie dafür genutzt, anhand von Haplogruppen Bevölkerungsgruppen verschiedenen Ursprungsorten zuzuordnen. Menschen mit der gleichen Mutation von Nukleotidsequenzen an bestimmten Orten des Genoms haben somit einen bestimmten Haplotyp und gehören gemeinsam einer Haplogruppe an. Anhand von Phylotrees (van Oven M. 2015) oder ähnlichen Programmen, kann man die Haplogruppen klassifizieren und geographisch ihrer Abstammung einordnen. Um einen wissenschaftlichen Vergleich herstellen zu können, wurde 1981 an der Cambridge Universität das Genom einer aus Europa 5
stammenden Frau vollständig sequenziert und als Cambridge Referenzsequenz (CRS) benannt. Heute gilt diese in vielen Ländern als Vergleichsreferenz. Mitochondriale DNA ist 5-10 mal anfälliger für Mutationen (Giles R. E. et al. 1980) als nukleäre DNA. Dies wird durch verschiedene Faktoren erklärt. In Mitochondrien gibt es keine schützenden Histone, die Reparaturmechanismen sind weniger effizient als im Zellkern und es besteht eine höhere Konzentration an reaktiven Sauerstoffspezies, die als Nebenprodukt der Zellatmung in den Mitochondrien entstehen. Im Gegensatz zu der Detektion von Längenunterschieden, bei der STR-Analyse der Kern-DNA, werden bei der mitochondrialen DNA-Analyse Mutationen einzelner Basen untersucht. Punktmutationen, welche eine Purinbase in die jeweils andere oder eine Pyrimidinbase in die jeweils andere verwandelt, nennt man Transition (Clauss W. , Clauss C. 2009). Dabei kann ein Wechsel von A zu G und umgekehrt und von T zu C und umgekehrt stattfinden. Bei einer Transversion wird eine Purinbase in eine Pyrimidinbase oder umgekehrt verwandelt (zB. Springer Klinisches Wörterbuch, 2007, ISBN 978-3-540-34602-9). Aber auch Längenheteroplasmien kommen vor. In der mitochondrialen Kontrollregion ab Basenpaar 303 – 309 kommt es gehäuft zu C- Strech Längenheteroplasmien. Wie in Lutz-Bonengel S. 2001 beschrieben, werden hierfür „Insertionen (…) von Cytosin-Resten an der Position 309.x und ein „slippage“ der DNA-Polymerase während der Replikation“ verantwortlich gemacht. Dies ist beispielhaft Abbildung 21 im Anhang dargestellt. Diese Mutationen können sich stabil über viele Generationen weitervererben und verbreiten. Wenn man bedenkt, dass alle heute lebenden Menschen von ein paar wenigen weiblichen Vorfahren abstammen, kann man sich gut vorstellen, dass diese ehemaligen Punktmutationen zu einem Marker für genetische Abstammung werden, die sogenannten Single Nucleotide Polymorphismus (SNPs). Dabei sind circa 2/3 aller Polymorphismen C zu T Transformationen, da dieser Austausch durch Methylierung und anschließende Desaminierung verhältnismäßig einfach von statten geht. Eine andere Art von Punktmutationen sind Insertionen beziehungsweise Deletionen. Hierbei werden die Basen nicht verändert, sondern es bilden sich neue zusätzliche Basen, was man Insertionen nennt oder Basen verschwinden, was zu einer Deletion führt. 6
1.3. BEDEUTUNG DER MTDNA QUANTIFIZIERUNG Das Prinzip der Real-Time PCR beruht auf der herkömmlichen Polymerase-Ketten- Reaktion mit zusätzlicher Quantifizierung der DNA einer Probe in Echtzeit. In dieser Arbeit wurde dazu die ABI-Prism-7500-Real-Time PCR genutzt. Das Prinzip dahinter verläuft nach den Phasen „Erregung, Emission und Kollektion“ (Applied biosystems 28.08.2019a). Über einen optischen Heizdeckel wird sowohl die Temperatur, um die Zyklen der PCR zu temperieren, geregelt, als auch die Energie aus einem Argon-Laser gelenkt (Seifert J. u. Ekkernkamp A. 2006). Nach jedem PCR Zyklus wird ein Farbstoff, beispielsweise SYBR-Green, in den Reaktionstubes angeregt. Das gewählte Kit SYBR Green Power Up beinhaltet eine DUAL-Lock-DNA Polymerase, die bei niedrigen Temperaturen noch keine Funktion ausübt und so die eigene Aktivität kontrolliert, den interkalierende Fluoreszenzfarbsoff SYBR Green (Abbildung 19) und ein Referenzfarbstoff ROX Dye, durch den die Fluoreszenz zwischen den einzelnen Reaktionen für das Messinstrument vergleichbar gemacht wird. Weitere Reagenzien sind MgCl2, dNTPs und Stabilisatoren. SYBR Green hat eine maximale Emission von grünem Licht bei 520 nm (Sigma-Aldrich 2019)(Abbildung 20)Diese Fluoreszenz kann dann von dem ABI-Prism®-7500-Sequence-Detection-System erkannt und in ein elektrisches Signal umgewandelt werden. Die resultierende emittierte Fluoreszenz wird über ein optisches System erkannt und gemessen (Abbildung 18). Je mehr DNA amplifiziert wird, desto mehr Fluoreszenz wird emittiert. Die Quantifizierung, also Messung der DNA-Menge einer „Spur“ hat vor allem vor Gericht hinsichtlich der Interpretation von Wahrscheinlichkeiten verschiedener Hypothesen für Tathergänge Bedeutung. Hierbei beruht der Großteil der Studienlage bisher auf Versuchen mit Kern-DNA (Reuss E. 2008). DNA-Spuren am Tatort können zunächst einmal in Tat-relevante Spuren durch „aktiven Transfer“ und Spuren die nicht direkt mit dem Tathergang in Verbindung gebracht werden können, „passiver Transfer“ (Gill P. 2014;Fonneløp A. E. et al. 2015) unterteilt werden. Ein passiver Transfer wird beispielsweise im Rahmen von Unbeteiligten vor der Tat am Tatort angetragen oder kann von Ermittlern nach der Tat durch Ermittlungsarbeit entstanden sein. Es ist also eine Kontamination hinterher oder eine bereits bestehende „Verunreinigung“ eines Objekts vor der Tat. Eine DNA-Spur, welche passiv angebracht 7
wurde, hat also nichts mit dem Tathergang zu tun. Ein aktiver Transfer wird von der Person, welche die eigentliche Tat durchführt, angebracht. Dies kann auf unterschiedliche Art, beispielsweise über Aerosol oder direkt beim Berühren von Objekten passieren (Fonneløp A. E. et al. 2015). Wenn man nun von einer aktiven Spur ausgeht, gilt es diese im Bezug auf mögliche Arten der Spurenantragung zu vergleichen. Hierfür wird unter den Möglichkeiten an Tathypothesen „jene Hypothese (bestimmt), die unter Berücksichtigung der Art des Beweismittels und der Umstande des Falles wirklich angewendet werden können“ (Fonneløp A. E. et al. 2015). Die gewählte Hypothese des Tathergangs und somit der Spurenantragung kann dann mit der Art und Menge der Spur verglichen werden. Die Spurenantragung hat viele verschiedene Einflussfaktoren. Eine gelungene Zusammenfassung bietet „Die Analyse von Hautkontaktspuren“ von (Pfeifer C. et al. 2016). Dabei wird ersichtlich, dass zusätzlich zur Ursprungsebene (Cook R. et al. 1998), also der ursprüngliche Spurenverursacher, auch die Aktivitätsebene, wie beispielsweise Sekundärantragungen, von Bedeutung sein können. So kann zum Beispiel eine durch Primärantragung angebrachte DNA-Spur auf einer Plastik-Fläche relativ leicht durch Reibung auf eine raue Sekundärfläche übertragen werden (Pfeifer C. et al. 2016). Ein solches Szenario ist bereits mit Kern- DNA Mengen der Primärspur von 2ng möglich und kann bei optimalem Transfer (glatte Oberfläche auf raue Oberfläche, Reibung als Kontaktart und einer zeitlich noch frischen Spur) eine Spur mit 1ng ergeben. Wenn der DNA-Gehalt einer Sekundär-Spur also sehr hoch ist, können bestimmte Hypothesen der Antragung von einer Primärspur mit niedrigerem DNA-Gehalt aufgrund der geringen Wahrscheinlichkeit bereits ausgeschlossen werden. Andersherum kann eine Spur mit geringem DNA-Gehalt ausgeschlossen werden, wenn die Antragungsmöglichkeiten sehr vielseitig sind und somit keinen tatkräftigen Beweis darstellen, da beispielsweise niedrigste DNA-Spuren mittels Tertiärtransfer sehr große Schwankungen im Bezug auf Antragungswahrscheinlichkeiten aufweisen. Es gilt immer eine Spur nicht nur ihrem Besitzer zuzuordnen, sondern auch die Aussagekraft dieser Spur hinsichtlich einer Tathypothese zu vergleichen. 8
Zielsetzung der Arbeit: Die Quantifizierung von mtDNA hat, aus forensischer Sicht, verschiedene Vorteile. Ein Vorteil ist die oben genannte Rekonstruktion der Tathypothese. Ein weiterer Vorteil soll in dieser Arbeit verifiziert werden, also ob es möglich ist, ausgehend von der Quantifizierung die Qualität der Sequenzierung vorherzusagen. Ebenso stellt sich die Frage, wie niedrig die Qualität der Sequenzierung sein kann um diese Ergebnisse noch zu nutzen und wie viel DNA dafür mindestens gebraucht wird. Es wird nach einem Cut- off der einzusetzenden DNA-Menge gesucht, die es für eine Sequenzierung nach Sanger bedarf. Diese Erkenntnis ist nicht nur wichtig um spurenschonend mit quantitativ niedrigen Spuren umzugehen, sondern könnte auch zu einem ökonomischeren Arbeiten in der Forensik führen, sodass man vor der Sequenzierung einer Probe eine Quantifizierung voranstellt und somit deren Sequenziererfolg vorhersagen kann. In dieser Arbeit wird der Sequenziererfolg in % angegeben, also wie viel % der Länge des gewünschten DNA-Abschnittes ergeben eine Nukleotid-Abfolge. Ziel dieser Arbeit war also die Entwicklung eines mtDNA-Quantifizierungs-Assays bei gleichzeitiger Bestimmung des Degradationsstatus. 9
2. MATERIAL UND METHODEN 2.1. MATERIAL i. DNA Extraktion: Chelex 5% (BioRad), Proteinase K Solution (Promega, Mannheim) ii. PCR-Reaktion: MgCl2 Solution 25mM, BSA 10mg/ml, 10x PCR Puffer 2, 10µM dNTP, Ampli Taq Gold –Polymerase 250 Units (alle Thermo Fisher Scientific, Dreieich) iii. Amplifikationskontrolle mit Agarose-Gel: Hyperladder 1 (200- 10000 bp) inklusive 5x loading buffer (bioline, Luckenwalde), Agarose High Resolution (Carl Roth, Karlsruhe) , Ethidiumbromid 0,5mg/ml , TAE-Puffer (96,8g Tris, 22,8ml Essigsäure, 7,4g EDTA, pH 8,0) iv. Aufreinigung PCR-Produkt: EXOI Exonuclease I 20U/µl, FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase 1U/µl (Fermentas GmbH, St. Leon-Roth) v. BigDye Sequenzierung nach Sanger: Big-DyeTM Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific) vi. Aufreinigung DyeEx: DyeEx 2.0 Spin Kit (Qiagen, Hilden) vii. Kapillarelektophorese: Hi-Di Formamid, POP7, 36-cm-Kapillare (alle Thermo Fisher Scientific) viii. Gel-Extraktion: QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen) ix. Photometrische DNA-Messung: QuantiFlour dsDNA System (Promega) x. 16S-Amplifizierung mittels Vectortransformation in E. coli-Zellen: Vector (), kompetente Zellen E. coli (), Nährmedium/Platten (), Flüssig-Nährmedium () xi. Klonierung: Lysogeny Broth-Medium, Sfi1- Enzym, pAC1- Vector (Promega) xii. DNA-Aufreinigung aus den Zellen: GenElute Plasmid Miniprep Kit (Sigma Aldrich, Taufkirchen) xiii. qPCR: SYBR GreenER qPCR SuperMix Universal (Thermo Fisher Scientific) 10
2. Primer (biomers.net, Ulm) Detaillierte Liste im Anhang 2.2. GERÄTE 1. Thermomixer comfort 1,5ml (Eppendorf) 2. Peqlab perfect Spin 24 Plus- Zentrifuge (PEQLAB) 3. Labnet International Inc. Vortex Mixer (Labnet) 4. Sarstedt Handzentrifuge (Sarstedt) 5. Alpha Mager EP + PC-Programm Alpha ease FC 6. Electrophoresis Power Supply EPS 301 (Amersham pharmacia biotch) 7. Quantus Flourometer (Promega) 8. Standard-Thermocycler Biometra (Analytik Jena, Jena) 9. Geräte für die Real-Time-PCR: ABI-Prism-7500-Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific) 10. 3130 Genetic Analyser -Sequenzierung (Thermo Fisher Sientific) 2.3. PROBEN - Mundschleimhautproben wurden von 20 freiwilligen Probanden mittels DNA- freier Watteabriebtupfer abgenommen - Haarproben mit telogener Wurzel, welche natürlicherweise ausgefallen waren - Haarschäfte - Einzelhautschuppen, geprickt 11
2.4. VERSUCHSAUFBAU Da mitochondriale DNA bei einem Tathergang dann zu Rate gezogen wird, wenn es sich bei einer Spur um wahrscheinlich zu geringe Mengen genomischer DNA handelt, wurde hier Probenmaterial von den Probanden entnommen welches voraussichtlich unterschiedliche mtDNA-Mengen beinhaltet. Es wurden telogene Haare gesammelt und deren Wurzeln und Schäfte untersucht, sowie Einzelhautschuppen gepickt um Proben mit geringem DNA-Material zu erhalten. Zur Referenz wurden Mundschleimhautproben der betreffenden Personen aus deren Wangeninnenseiten zum Abgleich mit den untersuchten Spuren entnommen. Für diesen Versuch wurde die 16S-Region als Referenzregion gewählt. Dieser Abschnitt wurde mittels der Primer L2025 und H3108 amplifiziert. Auf der 16S-Region wiederum wurden ein kurzes Segment gewählt, mit 167bp (Short-Fragment) und ein langes mit 492bp (Complete-Fragment) Länge, die für die spätere Quantifizierung, als Short- und Long-Segment wichtig werden. Aufgrund von Schwierigkeiten in der Versuchsdurchführung wurde während der PCR das Short- und Complete-Fragment genutzt und bei der qPCR das Short- und Long-Fragment. Die Primer auf der 16S Region wurden nach (Fregel R. et al. 2011) ausgesucht und zu einer multiplex qPCR optimiert, sodass sowohl das Short als auch das Long-Fragment, zu ähnlichen Teilen amplifiziert wurden. L2025 1083pb H3108 S 167- SR F Short SF 492-complete LR LF 314-LONG LR ABBILDUNG 3) 16S -REGION MIT DEM KURZEM, LANGEM UND COMPLETE-FRAGMENT SOWIE DEREN PRIMERN UND LÄNGE ALS BASENPAAREN VEREINFACHT DARGESTELLT, QUELLE: EIGENE DARSTELLUNG DIE 16S-REGION MITTELS DER PRIMER L2025 UND H3108 AMPLIFIZIERT UND DIE DARAUF ENTHALTENEN FRAGMENTE, DAS COMPLETE-SEGMENT ÜBERSCHNEIDET DAS SHORT- UND LONG-SEGMENT UND WIRD AUS DEREN PRIMERN AMPLIFIZIERT 12
Darüber hinaus wurde die komplette 16S-Region mit den Primern L2025 und H3108 aus (Maca-Meyer N. et al. 2001)amplifiziert. Daraufhin wurde die 16S-Region mit den Primern L2015_Sfi1_neu und H3108_Sfi1_neu, die jeweils um die Randsequenzen der Restriktionsstelle des Endonukleaseenzyms SfiI erweitert wurden, aus einer MSH- Probe amplifiziert und anschließend in den Vektor pAC1 ligiert. Durch eine Klonierung in E. coli Zellen wurde die 16S-Region stark vervielfacht. Die nach der Plasmid- Aufreinigung hochkonzentrierte Lösung aus 16S-Fragment in Plasmiden wurde nun in bestimmten Verdünnungen als Standardreihe bei der qPCR verwendet. Diese Real- Time-PCR quantifiziert mitochondriale DNA mittels der Relation zur vorgegebenen Standardreihe. Die zwei unterschiedlich großen Fragmente in der 16S-Region lassen zudem eine Einschätzung des Degradationsgrades einer Probe zu. Die D-Loop- Regionen der unterschiedlich konzentrierten DNA-Extrakte aus MSH und Haar-Proben wurden dann in einer Sequenzierreaktion nach Sanger analysiert und zur Kontrolle mit der rCRS abgeglichen. 2.5. DNA-EXTRAKTION Die Mundschleimhautproben wurden durch einen Abrieb beider Wangeninnenseiten mit einem DNA-freien Wattetupfer entnommen. Die Haarwurzelproben waren telogene Haare, also solche, die von allein ausgefallen waren. Die Haarschäfte wurden vorher leicht mit 10%iger Ethanollösung abgerieben. Für die DNA-Proben aus telogenen Haarwurzeln wurden circa 1,5 bis 2 cm lange Stücke eines Haares ab der Wurzel abgeschnitten. Von den Haarschaftproben wurden circa 5 cm Haarschaft in einem Tube aufgefangen. Hautschuppen wurden durch Abklebung mit Neschenfolien von getragener Kleidung gewonnen und für die Analyse mit einem Skalpell aus den Folien ausgeschnitten. Die Extraktion verlief wie in 2.b.i. beschrieben. Die extrahierte DNA der Proben wurde zwischen den Versuchen bei -20°C im Gefrierschrank aufbewahrt. Die verdünnten MSH-Proben wurden zu Beginn der Versuchsreihe hergestellt und waren somit bis zu 10 Monate alt. Der zweite Teil, die Haarproben, wurde erst später hergestellt und war somit nur circa bis zu 8 Monate alt. Nun wurde die DNA aus ihren, zum Teil, noch intakten Zellen herausgelöst und aufgereinigt. Die hier verwendete Extraktion war die sogenannte Kochlyse. Dazu wurden eine 5% Chelexlösung und Proteinase K verwendet. Bei den höher 13
konzentrierten MSH-Proben wurde pro Tupfer 195µl 5% Chelex mit 5µl Proteinase K und bei den niedrigen Haarproben pro Haar 50 µl Chelex mit 10 µl Proteinase K verwendet. Durch mechanische Schüttel-Bewegung werden die Zellen bei einer optimalen Inkubationstemperatur für Proteinase K von 56°C aufgebrochen. Dies braucht für die MSH-Proben circa eine Stunde und für die Haarproben circa 16 Stunden. Nach der Extraktion wird die Proteinase K durch 9-minütiges Kochen bei 92°C denaturiert und somit deaktiviert. Das Chelex wird bei 10.000rpm abzentrifugiert. Übrig blieb im Überstand aufgereinigte DNA, welche eingefroren gelagert werden kann. 2.6. PCR-AMPLIFIKATION UND AGAROSE KONTROLLE Es wurden verschiedene PCR-Reaktionen durchgeführt: 1. 16S Region und darauf liegendes Short- und Complete-Fragment, Kontrolle der Klonierung 2. Short und Complete-Fragment zur Optimierung der PCR zur späteren Verwendung in der qPCR 3. Midi-Ansatz zur Sequenzierung der qPCR-Proben 1) 16S Region Die 16S- Region, der gewählte Abschnitt auf der mtDNA, wurde nach Fregel et al.( 2011) ausgewählt. Dies ist eine Gensequenz, die für die 30S Untereinheit des mitochondrialen Ribosoms kodiert. Die komplette 16S-Region wird mit den Primern H3108 (TCGTACAGGGAGGAATTTGAA) und L2025 (GCCTGGTGATAGCTGGTTGTCC) amplifiziert. Innerhalb dieser Sequenz befinden sich ein Short- und ein Long-Segment. Durch die Primer mtDNA_SF und mtDNA_SR wird das Short-Segment mit 167bp und durch die Primer mtDNA_SF und mtDNA_LR das Long-Segment mit 314bp gebildet. Diese sind ebenfalls ausgewählt aus (Fregel, R., et al 2011). Der Vorteil dieser Fragmente ist ihre unterschiedliche Länge. Das Verhältnis dieser Fragmente kann zu einer Einschätzung des Degradationszustandes der DNA verhelfen. Ist eine Amplifizierung des Long-Fragments nicht möglich während das kurze Fragment 14
optimal amplifiziert wird, so kann dies ein Hinweis darauf sein, dass die DNA-Probe bereits degradiert ist oder die Probe insgesamt zu wenig DNA-Menge enthält. Der Unterschied des genutzten Programmes zur PCR-Amplifikation zum publizierten PCR-Programm von (Fregel, R., et al 2011) liegt in der Zeit und Temperatur für den Annealing-Schritt. Im Original wird dies bei 62°C für eine Minute durchgeführt. In Testreihen zeigte sich jedoch, dass diese Primer besser bei niedrigeren Temperaturen in 2 Schritten funktionieren. Der PCR-Ansatz belief sich auf 20µl pro Probe. Eingesetzt wurde 11 µl H2O, 1,4 µl MgCl2, 0,6 µl BSA, 2 µl Puffer, 1 µl dNTPs, 0,6 µl Taq Polymerase und insgesamt 1 µl 10 µM Primer aus einer 1:1 Mischung aus L2025 und H3108. Zur den 18 µl Mastermix wurden 2µl DNA-Extrakt aus einer MSH-Probe hinzugefügt. Das PCR-Programm beginnt bei 96°C für 8 Minuten. Dabei trennt sich der Doppelstrang zu Einzelsträngen und die Polymerase wird aktiviert. Darauf folgt 1 Minute lang 93°C. Nun folgen 50 Sekunden bei 55°C und 20 Sekunden bei 58°C. Hierbei binden die Primer an die passende Stelle auf der DNA. Die Elongation, also Verlängerung des neu amplifizierten Stranges durch die Taq-Polymerase, findet bei 72°C für 30 Sekunden statt. Nach 30 Zyklen schließt die PCR mit einer finalen Extension für 45 sec bei 72°C ab. Zur Kontrolle, dass die ausgesuchten Primer die auf 16S liegenden Short und Long Fragmente amplifizieren, wurde zuerst eine PCR der 16S-Region und anschließend mit den daraus resultierenden PCR-Produkten eine PCR mit den Primern für Short und Long durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass sich alle Produkte auf 16S befinden. 16S+Adapter Die PCR zur Amplifizierung der 16S Region mit angehängten Adaptern zur Ligation in die Schnittstelle des Restriktionsenzyms SfiI wurde ebenfalls auf 20 µl mit dem gleichen Mastermix und der gleichen Menge MSH-Probe durchgeführt. Anstatt der vorher benannten Primer L2025 und H3108 wurden nun L2520_Sfi1_neu und H3108_Sfi1_neu ebenfalls in einer 1:1 Mischung mit insgesamt 1 µl 10 µM Primer auf 20 µl Ansatz pro Probe verwendet. Aufgrund der längeren Primer wurde ein TouchDown-Programm anstelle des normalen PCR-Programms angewandt. Dabei begann das PCR Programm ebenfalls bei 96°C für 8 Minuten, dann 93°C für eine Minute und dann jeweils 15 Sekunden in 2°C-Schritten eine Erniedrigung der Temperatur von 61°C auf 51°C und am Ende 72°C für 45 Sekunden. Die PCR betrug 22 Zyklen. 15
2) Short- und Complete-Fragment Das PCR-Programm und die Reagenzien wurden nach dem gleichen Prinzip wie in der Amplifizierung der 16S-Region genutzt. Die Primer der Real-Time PCR aus Fregel, R., et al 2011 wurden bei der Standard-Amplifizierung leicht verändert genutzt, da sich das Long-Fragment aus LF und LR schlecht amplifizieren ließ. Deshalb wurde der LF- Primer weggelassen und somit ein Complete-Fragment mit 492 bp aus dem SF- und LR-Primer amplifiziert. Das Short-Fragment aus SF und SR mit 167 bp wurde belassen. Die Konzentrationen der drei Primer wurde vom genannten Paper von 8 µM Short- Primer und 16 µM Long-Primer auf 10 µM angepasst. Zusätzlich wurde in der PCR ein Verhältnis von 2,3:1 der Short-Primer zu dem Long-Primer benötigt, um eine ähnlich starke Ausbeute beider Fragmente zu erhalten. Pro Reaktion wurde wie bei der 16S Region 1 µl Primer eingesetzt, für das Short und Long-Segment also 0,5 µl SF, 0,35 µl SR und 0,15 µl LR. Das PCR-Programm war das gleiche wie zur 16S-Amplifizierung. Es beginnt bei 96°C für 8 Minuten, nun 1 Minute lang 93°C. Nun folgen 50 Sekunden bei 55°C und 20 Sekunden bei 58°C. Darauffolgend 72°C für 30 Sekunden. Nach 30 Zyklen schließt die PCR mit einer finalen Extension für 45 sec bei 72°C ab. 3) PCR für Midi Ansatz Die eigentliche Sequenzierung zur Identifizierung von SNPs findet auf nicht- kodierenden Segmenten statt. Hierzu wurde der D-Loop auf dem Mitochondrium gewählt. Der komplette D-Loop, auch Kontrollregion genannt, ist 1180 Basenpaare lang. Er beginnt ab Position 16024 und geht über den Origin of Replication bis Position 576. Um diesen großen Bereich abzudecken wurde die Midi-Methode nach (Berger u. Parson 2009) gewählt. Hierbei wird das circa 1200 bp lange Stück in 5 überlappenden Fragmenten amplifiziert. Die Fragmente haben eine Länge zwischen 280 bp bis 444 bp. Dadurch ist es möglich, auch degradierte Proben umfassend zu sequenzieren. Der Midi-Ansatz (Berger u. Parson 2009) wird in 2 Reaktions-Ansätze geteilt. In Ansatz I werden 3 „Hauptfragmente“, hier benannt als I1, I2, I3, gebildet. Im Ansatz II zwei überlappende Fragmente, II1 und II2. Anders als im Paper beschrieben wurde der Ansatz I in 3 Singleplex-Reaktionen durchgeführt, da eine Multiplex-Reaktion keine zufriedenstellenden Ergebnisse brachte. Hierbei wurde das 444 bp lange Fragment I1 mittels der Primer F15989 und R16433, das 250 bp lange Fragment I2 mittels den Primern F16450 und R130 und das 280 bp lange Fragment I3 durch die Primer F317 16
und R599 amplifiziert. Im Multiplex-Ansatz II reagieren alle 4 Primer zusammen als Multiplex-PCR. Hierbei bildeten F16197 und R16509 ein 312 bp langes Fragment und F109 und R460 ein 351 bp langes Fragment. Da die Primer der Rückreaktionen besonders niedrige Annealing-Temperaturen (zum Teil bis zu 13 °C Unterschied des Forward zum Reverse-Primer) haben, wurde die Annealing-Temperatur von 57°C auf 45°C herabgesetzt. Die 3 Ansätze von Midi I, Midi I1, I2, I3, wurden jeweils auf 15 µl pipettiert. Davon waren 5 µl DNA-Extrakt, 1,4 µl Primer (jeweils die forward und reverse Primer für ein Fragment des Ansatz 1 in 1:1 Mischung), 1,1 µl MgCl2, 1,5 µl Puffer, 0,5 µl BSA, 0,8 µl dNTPs, 4,1 µl DNA-freies Wasser und 0,6 µl Taq-Polymerase. Die Ansätze von II wurden auf 30 µl pipettiert, da aus ihnen insgesamt 4 Sequenzierreaktionen folgen sollten. Der Ansatz II enthielt 10 µl DNA-Extrakt, 2,1 µl MgCl2, 3 µl Puffer, 0,9 µl BSA, 1,5 µl dNTPs, 10,5 µl DNA-freies Wasser und 1,2 µl Taq-Polymerase. Dazu kamen 1,8 µl Primermix hinzu aus 0,3 µl F16197, 0,3 µl R16509, 0,45 µl F109 und 0,45 µl R460. Alle Primer hatten eine Konzentration von 200 µM. Das PCR-Programm begann bei 5 Minuten 95°C, hatte dann die Schritte Denaturierung, Annealing und Elongation in 36 Zyklen bei 20 sec 95°C, 30 sec 45°C und 30 sec 72°C. Agarose-Gelelektrophorese-Kontrolle: Zur Amplifikationskontrolle der PCR wurde ein Agarose-Gel benutzt. Hierbei wird ein 1%iges Agarosegel aus 1x TAE-Puffer und Agarose in Kammern gegossen. In deren Slots wurden, zum einen mit Loading Buffer versetzte PCR-Produkte, und zur Längendifferenzierung ein Längenstandard separat pipettiert. Der Loading Buffer war zur besseren Visualisierung beim Einpipettieren mit Bromphenolblau angefärbt und stabilisiert die DNA während der elektrophoretischen Auftrennung. Um die Fragmente einer bestimmten Länge zuordnen zu können wurde gleichzeitig zu den DNA–Proben ein Längenstandard aufgetragen. Da die Proben und die Ladder unter gleichen Bedingungen liefen, konnten die Fragmente der DNA-Proben somit einer Länge zugeordnet werden. Zur Kontrolle der 16S PCR wurde 5µl HyperLadder 1 Bioline benutzt, welche PCR-Produkte zwischen 200 bp und 10000 bp anzeigte. Für das Short- und Long-Segment wurde 5µl HyperLadder 25bp benutzt, welche PCR-Produkte zwischen 25 bp und 500 bp anzeigt. In beiden Fällen wurde 1µl 5x sample Loading Buffer mit 3µl DNA-Extrakt verwendet. Die Proben, die auf dem Gradienten-Cycler 17
amplifiziert wurden, also die 16S-Region, welche zur Klonierung und dann als Standardkurve für die qPCRs genommen werden sollte, wurden mit 18µl DNA-Extrakt und 6µl Puffer in die Gel-Kammern eingegeben, um einen möglichst hohen Ertrag zu gewinnen. Das beladene Gel lief bei 110V und 200mA für circa 45 Minuten in einer Elektrophoresekammer. Zur Visualisierung unter UV-Licht wurde die DNA durch Zugabe von Ethidiumbromid zu Agarosegel und Laufpuffer in der Elektrophoresekammer angefärbt. Zur Aufnahme eines Bildes wurde das System AlphaEase FC verwendet. 2.7. AUFREINIGUNG PCR-AMPLIFIKAT Die Aufreinigung der PCR-Produkte zur Sequenzierung als auch zur Klonierung wurde nach der Amplifizierung enzymatisch durchgeführt. Überschüssige Primer und einzelne Nukleotide wurden hierbei durch enzymatischen Verdau entfernt. Hierzu wurde pro 1 µl Probe, 0,26 µl FastAP und 0,14 µl EXOI 10 µM hinzu pipettiert und bei 37°C 30 Minuten verdaut. Um die hinzugegebenen Enzyme danach wieder zu deaktivieren, wurde die Lösung bei 95°C für 5 Minuten erhitzt. 2.8. KLONIERUNG Für eine Real-Time PCR benutzt man eine Standardkurve, womit die eingegebenen Proben verglichen werden. Diese Standardkurve besteht aus Vergleichsproben aus einer Verdünnungsreihe von bekannter Konzentration. Um eine stabile und reproduzierbare DNA-Amplifikation zu gewährleisten, wurde in diesem Fall eine Klonierung der 16S Region in E. coli-Zellen vorgenommen. Dabei wird eine PCR der 16S Region durchgeführt, wobei die Primer an den 5‘- Enden die Sequenz von Schnittstellen enthalten, welche später auch im Vektor von einem bestimmten Enzym, diesem Fall Sfi1, geschnitten werden können. Dies ermöglicht die Ligation beider Stücke mit Hilfe der produzierten „sticky ends“, der überstehende Enden, welche durch das Schneiden mit dem Enzym Sfi1 entstanden sind, die sich im folgenden Arbeitsschritt gut verbinden lassen. In diesem Fall wurde der Primer H3108_Sfi1_neu und L2025_Sfi1_neu gewählt. Mit diesen modifizierten Primern wurde eine PCR durchgeführt. Diese funktionierte mit einem Gradienten-Cycler mittels Touchdown- Programm wie in 2.6. beschrieben. Das amplifizierte 16S Stück mit SfiI-Adaptern 18
konnte im Agarose-Gel verifiziert und für die weitere Analyse ausgeschnitten werden. Um einen möglichst konzentrierten Ertrag zu bekommen, wurden circa 18 μl PCR- Produkt und 6 μl Loadingbuffer in die Taschen gefüllt. Zwei der stärksten Banden wurden ausgeschnitten und aufgereinigt. Die Aufreinigung wurde mit dem QIAEX Purifucation Kit durchgeführt. Hierbei wird das Agarose-Gel-Stück mit dem PCR- Amplifikat in QX1-Puffer in einem Verhältnis von 3x Puffer zu 1x Gel aufgelöst. Nun wird 10μl gevortextes QIAEX2 hinzugefügt und unter Schütteln bei 50°C für 10 Minuten bei saurem pH inkubiert. Dabei wird die DNA an QIAEX2 Partikel gebunden. Die Mischung wurde 30 Sekunden zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Das übergebliebene Pellet wurde mit QX1 Puffer gewaschen, zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Dieser Waschschritt entfernt die Agarose-Bestandteile. Darauffolgend wurde das Pellet zweimal mit PE-Buffer gewaschen, zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Hierbei werden Salzkontaminationen entfernt. Das Pellet mit der DNA wurde für 15 Minuten luftgetrocknet und danach mit DNA freiem Wasser für 5 Minuten gelöst. Nach erneutem Zentrifugieren erhält man gereinigte DNA im Überstand. Sowohl das PCR-Produkt als auch der gewählte Vektor wurden dann getrennt voneinander mit dem Restriktionsenzym verdaut und die bereits beschriebenen „sticky ends“ bildeten sich an deren Ende. Als Restriktionsenzym wurde Sfi_1 gewählt, welches auf dem Vector pAc1 schneidet. Es wurden jeweils 1 µl Sfi_1, 5µl Buffer Cut smart und 14 µl H2O mit 1) 30 µl PCR Produkt und 2) 14 µl pAc1 für 4 Stunden bei 50°C verdaut. Am Ende dieses Schrittes erhält man ein PCR-Produkt, in diesem Fall die 16S Region mit den Enden die von Sfi_1 erkannt und geschnitten wurden, sowie den gewählten Vektor, welcher ebenfalls an der gewünschten Stelle geschnitten wurde. Daraufhin wurden beide Ansätze mittels einer Säulenaufreinigung der GenElute Miniprep Binding Column mit 15 µl Elution Buffer aufgereinigt. Hierdurch wurde die DNA wieder von anderen Inhaltsstoffen getrennt. Die Ligation der oben beschriebenen „sticky ends“, also der passenden Enden des PCR- Produkts mit dem Vector, erfolgte mit 6 µl PCR-Produkt, 2 µl Vector, 1 µl Ligationspuffer und 1µl Ligase bei 14°C für 2 Stunden. Durch die Ligation erhält man 19
das modifizierte Plasmid, also einen Vektor mit der eingebauten gewünschten Sequenz, dem PCR-Produkt. Das entstandene Plasmid-Produkt konnte nun durch Transformation in E. coli Zellen überführt werden. Dabei wurden 5 µl Plasmid-Produkt mit 100 µl E. coli Zellen zuerst leicht vermischt und 10 Minuten auf Eis inkubiert und dann bei 42°C für 90 Sekunden aufgeheizt. Nun wurden 700 µl Lysogeny Broth-Medium ohne Antibiotika zu dem Mix hinzugefügt und die Zellen für eine Stunde bei 37°C und 1000rpm im Thermoschüttler geschüttelt. Daraufhin wird der Mix durch Zentrifugieren und durch Abpipettieren des Überstandes höher konzentriert und auf LB-Agarplatten (Bertani G. 1951) mit Antibiotikum ausgestrichen. Die Platte wird über Nacht bei 37°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden 25 Kolonien gepickt und zuerst in einen PCR-Mix mit den bereits vorher genutzten Primern H3108_Sfi1_neu und L2025_Sfi1_neu gemischt und dann auf einer weiteren Agarplatte ausgestrichen. Am folgenden Tag konnte man durch die PCR sehen, welche Kolonien die ausgewählte DNA-Sequenz aufgenommen hatten. Diese Zellen wurden wiederum in Flüssignährmedium (LB) angesetzt und bei 37°C über Nacht inkubiert. Nun konnte die eigentliche Aufreinigung des Plasmids mittels Mini- Prep erfolgen. Die Zellen wurden dabei in Resuspensions-Puffer gelöst und mit Lyse- Puffer lysiert. Diese Lösung wurde wiederum neutralisiert und mittels Säulenaufreinigung die DNA herausgetrennt. 2.9. REAL TIME PCR Zu beachten ist zu zunächst, dass in der Real-Time-PCR nicht wie in der PCR das Short- und Complete-Fragment amplifiziert wurden, sondern das Short- und Long-Fragment. Allgemein: Es wurden insgesamt 131 Proben mittels Echt-Zeit PCR auf ihre mtDNA- Quantität untersucht. Bei der Erstellung des Real-Time-Quantifizierung Designs wurden die MIQE Guidelines von (Bustin 2013) im Versuchsaufbau berücksichtigt. Das Prinzip einer Real-Time PCR beruht auf dem gewöhnlichen Ablauf einer PCR (Denaturierung, Annealing, Extension). Während der Extension interkaliert der Farbstoff SYBR Green in die doppelstränigen DNA Amplifikate und gibt ein fluoreszierendes Signal ab. Die PCR Reaktion wiederholt sich 40 Zyklen, sodass sich die Menge der Proben-DNA und somit auch die Intensität des Farbsignals, bei jedem Zyklus der exponentiellen Phase, vervielfacht. Um die gemessenen Proben einem DNA- 20
Masse-Wert zuordnen zu können, wird eine Standardkurve angelegt. Hierbei werden 6 Proben mit bekannter DNA-Konzentration zu einer Verdünnungsreihe hergestellt und bei jedem Lauf ebenfalls gemessen. Unbekannte Proben werden dann mit der jeweils laufeigenen generierten Standardkurve verglichen und hierdurch die DNA- Menge der Probe extrapoliert bestimmt. Dabei ist es wichtig, dass die Stammlösung für den Standard aus aufgereinigter DNA besteht und eine geeignete Referenzsequenz enthalten ist. Da man den gleichen Stock für die Standardkurven verschiedener Analyseläufe verwendet, sind die Ergebnisse vergleichbar. Hierfür ist eine stabile Lagerungsmöglichkeit notwendig wie beispielsweise in Plasmid-DNA eingebettet und tiefgefroren. In dem benutzen qPCR-Kit ist eine ROX Referenz (Jordan, L., Kurtz, R. 2010) bereits enthalten. Dieser Referenzfarbstoff normalisiert das Fluoreszenzsignal. Die Lichtquelle des Messinstrumentes hat einen unterschiedlichen Einstrahlungswinkel je nach Tube. Dadurch kommen verschiedene Lichtwege und Intensitäten beim Detektor an. Diese Variationen in der Messung werden durch die ROX Referenzfluoreszenz ausgeglichen, da die Unterschiede in der ROX Fluoreszenz mitbestimmt und von der Messung der SYBR Green Fluoreszenz abgezogen. Somit können Messungenauigkeiten korrigiert werden. Der SYBR Green Farbstoff interkaliert unspezifisch mit jeder Art doppelsträngiger DNA, weswegen anschließend eine Schmelzkurvenanalyse (Ririe et al. 1997) durchgeführt wurde. Dabei erhöht sich die Temperatur schrittweise (meist 0,5°C-Schritte) und die DNA trennt sich abhängig von ihrer Sequenzlänge voneinander in einzelsträngige Fragmente. Anhand der Temperaturkurve und der Temperaturspitze einer Kurve können dann Rückschlüsse auf die Länge der amplifizierten DNA-Fragmente gezogen werden. Somit kann kontrolliert werden, ob das gewünschte Fragment und in diesem Fall auch, welches der beiden Fragmente stärker amplifiziert wurde. Dieser Assay wurde im halben Ansatz durchgeführt und gegen den vollen Ansatz validiert. Der gewählte SYBR Green Mastermix ist für beide Ansatzmengen vom Hersteller optimiert. Die Real-Time PCR wurde für eine Konzentrationsspanne von 10 pg/µl – 0,0001 pg/µl optimiert. Dies ist die niedrigste Konzentrationsspanne, welche noch verlässliche Werte in wiederholten Messungen ergaben und realistisch bei degradierten Tatortspuren, z.B. ausgefallene oder ausgerissene Haare oder Hautschuppen gewonnen werden können. Es wurden insgesamt 25 qPCR Läufe durchgeführt wovon 21
17 eine Effizienz von mindestens 80% aufwiesen. Davon wurden wiederum 15 in diese Versuchsreihe eingeschlossen, da zwei Läufe Kontaminationen in der Negativ- Kontrolle aufwiesen. Die Werte der Proben lagen zwischen 0,001 ng/µg und 0,000 000 009 ng/µl (9E-09ng/µl), wobei Konzentrationen kleiner 0,000 09ng/µl unterhalb des niedrigsten Punktes der Standardkurve S5 liegen und somit nur extrapoliert sind. In die Bewertung der Probenergebnisse wurden also nur Proben von Läufen mit einbezogen, deren Negativ-Kontrollen leer waren und deren Standardkurve eine Effizienz oberhalb des Threshold von 0,02ΔRn aufwies. Standardkurve: Da man, wie bereits erwähnt, nicht von der Fluoreszenzstärke direkt auf eine DNA-Konzentration schließen kann, bedarf es Referenzwerte. Diese müssen vorher bekannt sein und in Verdünnungsreihen in mindestens 5 verschiedenen Konzentrationen mitanalysiert werden. Da es sich bei den DNA-Sequenzen um mitochondriale DNA handelt, ist es wichtig, dass die Standardreihe eine konservative, also mutationsunanfällige mtDNA-Sequenz enthält, auf dem die zu amplifizierenden Stücke erhalten sind. Dies ist hier durch die Klonierung der 16S Region in ein Plasmid als Ausgangsmaterial für die Standardkurve gelungen. Die komplette Plasmidamplifizierung ist im Absatz 2.b.v. beschrieben. Daraus erhielt man circa 300μl aufgereinigtes pAc1-Plasmid, welches zwischen den Sfi1-Schnittstellen (2525) die Sequenz der 16-S-Region enthält. Die Konzentration dieser DNA in Lösung wurde erstmals mit dem Nanodrop gemessen. Für diesen Assay wurden Konzentrationen gewählt, welche in der forensischen Spurenanalyse bei schwierigen und degradierten Proben häufig vorkommen. Zur Herstellung der Standardreihe wurde die Stammlösung der Klonierung mit 31ng/µl 16S-Region in 0,01ng/µl konzentrierte Stocklösungen aliquotiert. Diese dienten dann als S1 Verdünnung, woraus dann jedes Mal eine neue Verdünnungsreihe aus 5 µl S1 Lösung mit 45 µl DNA-freiem Wasser hergestellt wurde. Dies ergab die S2 Lösung, welche dann wiederum zehnfach verdünnt zur S3 Lösung wurde. S1 - 10pg S2 - 1pg S3 - 0,1pg 22
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