Heutige Vorlesung - ein Überblick - Einführung in die evolutionäre Bioinformatik
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www.bachelor-and-more.de
Einführung in die evolutionäre Bioinformatik
Evolutionsbiologie II für Bachelor-/Lehramtsstudierende
5. Februar 2019
Dr. Sonja Grath
grath@bio.lmu.de
Heutige Vorlesung – ein Überblick
✔ Was ist Bioinformatik?
✔ Sequenziermethoden
✔ Datenbanken und Modellorganismen
✔ Möglichkeiten des Sequenzvergleichs
✔ Maße zum Sequenzvergleich
✔ Bioinformatik in der Evolutionsbiologie
Was ist Bioinformatik?
Eine Definition
Bioinformatik, die:
Zweig der Biowissenschaften, der sich mithilfe der
Computertechnologie mit der Erforschung komplexer
biologischer Zusammenhänge befasst
www.duden.de
Sequenziermethoden
Überblick Sequenzier-Strategien
Shotgun sequencing/
Sanger
Next-generation
sequencing
454, Illumina
Scheibye-Alsing et al. (2009)
Sanger-Sequencing
Frederick Sanger
(*1918, +2013)
Nobelpreis:
1958,1980
Next-Generation Sequencing
MacLean et al., 2009
2007 2014
Next Generation Sequencing Single Cell Sequencing
Datenbanken
Motivation: Projekte in der AG Parsch
Fokus
Evolution von Genen, Gen-Expression und Gen-Regulation
Studienobjekt:
Taufliege
(Drosophila)
Warum?
Drosophila ist ein „Modell-Organismus“
Was ist ein Modell-Organismus?
Definition (Wikipedia):
“A model organism is a non-human species that is extensively
studied to understand particular biological phenomena, with the
expectation that discoveries made in the organism model will
provide insight into the workings of other organisms”
Allgemein:
● Zugang und Handhabung im Labor einfach
● Klein
● Einfach zu manipulieren
● Große Menge an biologischer Information verfügbar
● Ökonomischer oder medizinischer Nutzen
Beispiele
Caenorhabditis elegans
Escherichia coli
Trichoplax adhaerens
Danio rerio
Chorthippus parallelus
Physcomitrella patens
Daphnia pulex
Mus musculus
Die Taufliege – Drosophila melanogaster
● Einfach im Labor zu halten und zu züchten
● Kurze Generationenfolge
● Hohe Anzahl von Nachkommen
● Männchen/Weibchen einfach unterscheidbar
● Techniken zur genetischen Transformation und Manipulation
verfügbar
●
Kleines Genom (~140 Mb (=140.000.000bp), zum Vergleich:
Mensch ~3 Gb (=3.000.000.000bp)
● Ganzes Genom sequenziert
Modellorganismen haben in der Regel eigenen
Genome-Browser
Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster
wormbase.org flybase.org
Saccharomyces cerevisiae
http://www.yeastgenome.org/ Arabidopsis thaliana
http://www.arabidopsis.org/
...und viele, viele mehr – z.B. ensembl.org
Beispiel: Drosophila
Beispiel: Mensch
UCSC Genome Browser: Human
http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway
Beispiel: Mensch
GenBank
GenBank
● Geführt vom National Center for Biotechnologies
(NCBI)
● GenBank ist das “Gedächtnis der Biowissenschaften”
● Enthält JEDE DNA-Sequenz, die jemals publiziert
wurde
● GenBank ist die Originalquelle für die meisten
biologischen Datenbanken
● GenBank ist komplizierter zu nutzen als Gen-
zentrische Datenbanken
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/GenBank
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
GenBank
Ein Prokaryotischer GeneBank-
Eintrag
ACCESSION ist die “Accession number”:
● Einzigartig für jeden Eintrag
● Permanent
LOCUS enthält Informationen über die
Gen-Größe
ORGANISM bestimmt den Organismus,
in dem das Gen enthalten ist
REFERENCE bezeichnet, wer die
Sequenz produziert hat
FEATURES listet einige funktionale
Eigenschaften des Gens auf
GenBank-Einträge können mehr als ein
Gen enthaltenGenBank
Ein Eukaryotischer GeneBank- Eintrag
● Die Überschriften (einzelne Sektionen) sind die gleichen wie bei
prokaryotischen Einträgen
● SOURCE enthält eine Map-Einheit, welche das Chromosom
angibt, welches das Gen enthält
● GENE enthält Hinweise zur Rekonstruktion der codierenden
Sequenz (CDS) des Gens
Erinnerung: Eukaryotische Gene enthalten Introns
GenBank
Zusammensetzung einer CDS
Die Sektionen gene, mRNA, und CDS enthalten die Informationen, welche
Segmente von welchem Eintrag verbunden werden müssen um das Gen, die
mRNA oder die CDS zu rekonstruierenGenBank
GenBank-Einträge können enthalten:
• Vollständige Gene
• Teile von Genen
• Viele Gene
GenBank-Einträge können von ungleicher Qualität sein
• Duplikate und/oder ungenau
• Alle Datensätze sind gleichberechtigt
GenBank-Einträge sind nicht die 'absolute Wahrheit'
• Keine verlässliche biologische Bedeutung
• Vielmehr Buchführung über alles, was sequenziert wurde
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
Warum hilft uns ein Vergleich weiter?
Charles Robert Darwin
(*1809, +1882)Welche Tiere sind das?
Das Beispiel der folgenden Folien basiert auf dem Buch
“An Introduction to Molecular Evolution and Phylogenetics” (2016) von Lindell Bromham
PLAZENTATIERE
BEUTELTIEREHomologie vs. Analogie
Beutelwolf Hund
Thylacinus Canis familiaris
cynocephalus
Beutelmaus Spitzmaus
Sminthopsis Sorex cinereus
psammophila
Beutelmarder Katze
Dasyurus Felis silvestris
geofroyii
Beutelmulle Maulwurf
Notoryctes Talpa europaea
typhlops
Homologie Analogie
Gemeinsamer Anpassung,
Ursprung unabhängige
Evolution
Homologie vs. Orthologie vs. Paralogie
Homolog
Gemeinsamer Ursprung
Ortholog Paralog
Gemeinsamer Ursprung durch Gemeinsamer Ursprung durch
Artbildung Genduplikation
© 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter WalterHomologie vs. Orthologie vs. Paralogie
Orthologe haben Paraloge, nach
“homologe Funktion” Duplizierung:
● Subfunktionalisierung
● Neofunktionalisierung
● Nonfunktionalisierung
(Pseudogene)
© 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter
Homologie versus Sequenzähnlichkeit
http://biosiva.50webs.org/alignment.htmMöglichkeiten des Sequenzvergleichs
Dotplot
Definition:
Graphische Darstellung von SequenzähnlichkeitenTypische Anwendungen für Dotplots
Vergleich einer Sequenz gegen sich selbst:
– Wiederholungen von Domänen
– Wiederholungen von Motiven (motifs) (low complexity)
– Gespiegelte Regionen (Palindrome) in Nukleinsäuren
Alignment
Beispiel: Ein Teil des 12S ribosomalen RNA-Gens
Paarweises Alignment
Beutelwolf GGTCCTGGCCTTACTGTTAATTCTTATTAGACCTAC
Hund GGTCCTAGCCTTCCTATTAGTTTTTAGTAGACTTAC
Multiples Alignment
Beutelwolf GGTCCTGGCCTTACTGTTAATTCTTATTAGACCTAC
Beutelmarder GGTCCTGGCCTTACTGTTAATTTTTATTAGACCTAC
Beutelmaus GGTCCTGGCCTTACTGTTAATTTTTATTAGACCTAC
Beutelmulle GGTCCTAGCCTTATTATTAATTATTGCTAGTCCTAC
Hund GGTCCTAGCCTTCCTATTAGTTTTTAGTAGACTTAC
Katze GGTCCTGGCCTTTCTATTAGTTATTAATAAGATTAC
Spitzmaus GGTCCTAGCCTTCCTATTAGTTGTTAGTAAACTTAC
Maulwurf GGTCCTAGCCTTTCTATTAGCTGTCAGTAAAATTACWas ist ein Alignment?
Definition ('Informatik'):
Finden der optimalen Paarung zweier Sequenzen unter
Beibehaltung der Elementenreihenfolge
ATTCGCGAC ATTGCGCATAT
Annahme in der Biologie:
Je ähnlicher zwei Sequenzen, desto näher sind sie evolutionär oder
funktionell verwandt
Der Alignmentalgorithmus sucht nach einer Abfolge von
Mutationen, welche die Anzahl der Mutationen (= 'Edit Distance')
minimiert (Parsimonie-Kriterium)
ATTCGCGAC
ATTGCGCATAT
Alignment (Anordnung, Ausrichtung)
Wichtige Definitionen
Beutelmarder ACC-TAATTA
Beutelwolf ACC-TAATAC
Hund ACCATAATTA
InDel Substitution
Alphabet: A, C, G, T (für Nukleotide), – (Gap)
Ziel eines Alignments:
Die Alinierung zweier oder mehrerer Sequenzen, so dass die
Wahrscheinlichkeit homologe Positionen zu vergleichen, maximiert
wird.Motivation: Genomassemblierung
Shotgun Sequencing und Assemblierung
Die Ausgangs-DNA wird in eine Sammlung von Fragmenten geteilt
Die Enden jedes Fragments (in grün) werden sequenziert
Basierend auf Sequenzähnlichkeit, werden die einzelnen Stücke (reads) assembliert
Modifiziert von: http://www.cbcb.umd.edu/research/assembly_primer.shtmlGenomassemblierung
Start: Sammlung von reads Annahme:
ATCTGTAT Überlappung zwischen
GTATTTCG reads
= TAGAAAGC
CGTATATA
GTGTAGGG Reads stammen vom
gleichen Ort im Genom
Aufgabe: Berechnung der Überlappungen Ausgabe: Satz von contigs
(= contiguous pieces of DNA)
( n2 ) Operationen
Indexstrategien →
Laufzeit ~ O(n)
Alle paarweisen Alignments
ATCTGTATCGCG...TAGGG
Genomsequenz
Was ist “scaffolding”?
Ideale Welt:
Organismus mit 4 Chromosomen Assembly mit 4 Contigs
I TA...................CG
II CG...................AT
III CT...................GA
IV AT...................GC
I II III IV
Realität:
Scaffolding
Ordne und orientiere
contigs entlang
Set von unabhängigen eines Chromosoms Information von paired-end
contigs SequenzierungAlignment
12S ribosomales RNA-Gen
Beutelwolf GGTCCTGGCCTTACTGTTAATTCTTATTAGACCTAC
Beutelmarder GGTCCTGGCCTTACTGTTAATTTTTATTAGACCTAC
Beutelmaus GGTCCTGGCCTTACTGTTAATTTTTATTAGACCTAC
Beutelmulle GGTCCTAGCCTTATTATTAATTATTGCTAGTCCTAC
Hund GGTCCTAGCCTTCCTATTAGTTTTTAGTAGACTTAC
Katze GGTCCTGGCCTTTCTATTAGTTATTAATAAGATTAC
Spitzmaus GGTCCTAGCCTTCCTATTAGTTGTTAGTAAACTTAC
Maulwurf GGTCCTAGCCTTTCTATTAGCTGTCAGTAAAATTAC
Alignment
12S ribosomales RNA-Gen – eine andere Stelle
Beutelmarder ACC-TAATTAGAATACGCTAAAAA----GAGGAG
Beutelwolf ACC-TAATACGAATACG-TAAAAAA---GAGGAG
Hund ACCATA-TTAACTTAA-CTAAAACACAAGAGGAG
Beutelwolf – Beutelmarder: 2 Unterschiede
Beutelwolf – Hund: 6 Unterschiede
Beutelmarder ACC-TAATTAGAATACGCTAAAAA---------GAGGAG
Beutelwolf ACC-TAAT--AC-GAA--TA---CG-TAAAAAAGAGGAG
Hund ACCATA-TTAACTTAA-CTAAAACACAA-----GAGGAG
Beutelwolf – Beutelmarder: 5 Unterschiede
Beutelwolf – Hund: 3 Unterschiede
Welches Alignment stimmt? Wie kann man Alignments vergleichen?Vergleich von Alignments
Einfachste Möglichkeit: Bestimmung der Identität (in %) …
Beutelmarder ACCTAATTAT 8/10 = 0.8 = 80%
Beutelwolf ACCTAATACT
… unter Berücksichtigung von Insertionen/Deletionen
(Indels, 'gaps')
Beutelmarder ACCTAATTA-T 9/11 = 0.82 = 82%
Beutelwolf ACCTAAT-ACT
Vergleich von Alignments
Einfachste Möglichkeit: Bestimmung der Identität (in %) …
Beutelmarder ACCTAATTAT 8/10 = 0.8 = 80%
Beutelwolf ACCTAATACT
… unter Berücksichtigung von Insertionen/Deletionen
(Indels, 'gaps')
Beutelmarder ACCTAATTA-T 9/11 = 0.82 = 82%
Beutelwolf ACCTAAT-ACT
Problem:
Durch das Einfügen von Indels (“gaps”) in ein Alignment kann die Identität künstlich
erhöht werden. Deshalb wird das Einfügen von gaps in der Praxis mit einem “gap
penalty” bestraft.Substitutionsmatrizen
Einheitsmatrix
Nukleotide (DNA): A, C, G, T
A C G T
A 1 0 0 0
C 0 1 0 0
G 0 0 1 0
T 0 0 0 1
Sequenz1 ATCG
Score: 3
|| |
Sequenz2 ATGG
Natürlich auch für Aminosäuren möglich (20 x 20 Matrix)
Zusätzlich: Einführung einer “gap penalty”, hier: negativer
Wert, z.B. -1Transition vs. Transversion (DNA)
http://www.mun.ca/biology/scarr/Transitions_vs_Transversions.html
Eigenschaften von Aminosäuren
http://de.wikipedia.org/wiki/AminosäurenEigenschaften von Aminosäuren
© Dr. Rainer Merkl, Universität Regensburg
Point Accepted Mutation Matrix
PAM-Matrix
Dayhoff (1978)
Margaret Oakley Dayhoff
(*1925, +1983)
Basieren auf 71 Protein-Familien mit 85% AS Identität
• PAM = “Point/Percent Accepted Mutations”
• PAM1: eine Punktmutation auf 100 AS
• Höhere PAM-Matrizen werden durch Matrix-Multiplikation
generiert
• PAM2 = PAM1 · PAM1 etc.
• PAM-Matrizen basieren auf einem evolutionären Modell
• PAM-Matrizen sind symmetrisch P(A->B) = P(B->A)
• Annahme: Mutationen sind unabhängig voneinander und
positions-/sequenzabhängigBeispiel: PAM250
Margaret Oakley Dayhoff
(*1925, +1983)
http://biosiva.50webs.org/alignment.htm
BLOcks SUbstitution Matrix
BLOSUM
Henikoff & Henikoff (1992)
Basieren auf BLOCKS (ungapped alignment blocks, „true“
Alignments)
• Basieren auf empirischen Daten – kein zugrunde liegendes
evolutionäres Modell
• z.B. BLOSUM62 basiert auf BLOCKS mit 62% Sequenzidentität
• BLOSUM62 am häufigsten genutzt (in Datenbanksuchen)
https://de.wikipedia.org/wiki/BLOSUMSubstitutionsmatrizen
Ähnlichkeitsmatrix BLOSUM62
A C G T
A 1 0 0 0
C 0 1 0 0
G 0 0 1 0
T 0 0 0 1
Distanzmatrix
Ist das eine Ähnlichkeits-
A C G T oder Distanzmatrix?
A 0 1 1 1
C 1 0 1 1
G 1 1 0 1
T 1 1 1 0
PAM versus BLOSUM
PAM1 PAM120 PAM250
BLOSUM80 BLOSUM62 BLOSUM45
Hohe Sequenzähnlichkeit/ Geringe Sequenzähnlichkeit/
Verwandtschaft VerwandtschaftMaße zum Sequenzvergleich
Maße zum Sequenzvergleich
● Hamming-Distanz: Anzahl der Positionen mit unterschiedlichen
Buchstaben ('mismatches')
AGTC
||
CGTA
Hamming-Distanz: 2
● Levenshtein-Distanz: Minimale Anzahl an Edit-Operationen
(Substitution, Deletion, Insertion), die nötig sind um Sequenz 1 in
Sequenz 2 zu überführen
AGTCC
| ||
CGCTCA
Levenshtein-Distanz: 3
Substitutionen A ↔ C, C ↔ A
Insertion – ↔ CMaße zum Sequenzvergleich
● Score-basierte Methoden: Die Substitutionsmatrizen können
auch komplexer sein und beispielsweise Substitutionen anders
gewichten als Insertionen und Deletionen
● Ziel: Optimierung einer Punktezahl
● Werte für Übereinstimmung ('match'), Nicht-Übereinstimmung
('mismatch') und Lücke ('gap')
Beispiel
Match = 1, Mismatch = -1, Gap = 0
Sequenz1 ATCCG
|| | → Score: 1+11+0+1 = 2
Sequenz2 ATGG
Algorithmus zur Bestimmung eines optimalen
paarweisen Alignments
Ziel: Optimierung (= Maximierung) des Scores für ein paarweises
Alignment
Erinnerung:
3 mögliche Operationen (Substitution, Deletion, Insertion)
2 Sequenzen (Längen m und n)
Scoring-Schema (Werte für Match, Mismatch, Gap)
Vorgehen:
Berechnung einer (m+1)x(n+1)-Matrix (Tabelle)
D(i-1, j-1) D(i-1, j)
D(i, j-1) D(i, j)Globales vs. Lokales Alignment
Ein globales Alignment überdeckt die gesamte Länge der
betroffenen Sequenzen
→ Der Needleman-Wunsch-Algorithmus findet das beste
globale Alignment zweier Sequenzen
Ein lokales Alignment überdeckt nur Teile der Sequenzen
→ Der Smith-Waterman-Algorithmus findet das beste
lokale Alignment zweier Sequenzen
QKESGPSSSYC
Globales
| ||| |
Alignment
VQQESGLVRTTC
ESG
||| Lokales
ESG AlignmentWas hat mit Evolution zu tun?
➔ Modularität ist ein Kennzeichen von Evolution
Domänen sind die Bausteine von Proteinen
>P11974|1PKN
SKSHSEAGSAFIQTQQLHAAMADTFLEHMCRLDIDSAP ITARNTGIICTIGPASRSVETLKEMIKSGMNVARMN
Konservierte FSHGTHEYHAETIKNVRTATESFASDPILYRPVAVALDTKGPEIRTGLIKGSGTAEVELKKGATLKITLDNAYM
AACDENILWLDYKNICKVVEVGSKVYVDDGLISLQVKQKGPDFLVTEVENGGFLGSKKGVNLPGAAVDLPAVSE
Sequenzbereiche KDIQDLKFGVDEDVDMVFASFIRKAADVHEVRKILGEKGKNIKIISKIENHEGVRRFDEILEASDGIMVARGDL
GIEIPAEKVFLAQKMIIGRCNRAGKPVICATQMLESMIKKPRPTRAEGSDVANAVLDGADCIMLSGETAKGDYP
(PF00224, PF02887) LEAVRMQHLIAREAEAAMFHRKLFEELARSSSHSTDLMEAMAMGSVEASYKCLAAALIVLTESGRSAHQVARYR
PRAPIIAVTRNHQTARQAHLYRGIFPVVCKDPVQEAWAEDVDLRVNLAMNVGKAAGFFKKGDVVIVLGWRPGSG
FTNTMRVVPVP
Unabhängige
strukturelle
Regionen
Eukaryotic DNA
Topoisomerase I
catalytic core
Funktionale
Einheiten
Eukaryotic DNA
Topoisomerase I
DNA binding regionWie werden Domänen entdeckt und
beschrieben?
>P11974|1PKN
SKSHSEAGSAFIQTQQLHAAMADTFLEHMCRLDIDSAPITARNTGIICTIGPASRSVET
LKEMIKSGMNVARMNFSHGTHEYHAETIKNVRTATESFASDPILYRPVAVALDTKGPEI
RTGLIKGSGTAEVELKKGATLKITLDNAYMAACDENILWLDYKNICKVVEVGSKVYVDD
GLISLQVKQKGPDFLVTEVENGGFLGSKKGVNLPGAAVDLPAVSEKDIQDLKFGVDEDV
DMVFASFIRKAADVHEVRKILGEKGKNIKIISKIENHEGVRRFDEILEASDGIMVARGD
LGIEIPAEKVFLAQKMIIGRCNRAGKPVICATQMLESMIKKPRPTRAEGSDVANAVLDG
ADCIMLSGETAKGDYPLEAVRMQHLIAREAEAAMFHRKLFEELARSSSHSTDLMEAMAM
GSVEASYKCLAAALIVLTESGRSAHQVARYRPRAPIIAVTRNHQTARQAHLYRGIFPVV
CKDPVQEAWAEDVDLRVNLAMNVGKAAGFFKKGDVVIVLGWRPGSGFTNTMRVVPVP
H. sapiens = {
p1=(PF00224,PF02887),
p2=(PF00021,PF02832,PF00012),
>P11974|1PKN p3=(PF09283,PF56253,PF56253),
42 394 PF00224 1.9E-168 p4=(PF00007,PB9293823),
409 527 PF02887 1.4E-26 p5=(PF82736,PF73847),
p6=(PF78273,PB0029382,PF82732),
…
}
P11974 = (PF00224,PF02887)
Domänenarchitektur http://pfam.sanger.ac.uk/
Datenbank: 3D-Strukturen
http://www.rcsb.orgDomänen als Bausteine von Proteinen
Gegenwart
Repeat
Fusion
Fission
Terminal
X Loss
Domain
Gain
Vergangenheit
Konzept der modularen EvolutionSequenzlogo für multiple Alignments
clc.support.com
IUPAC Code
IUPAC = International Union of Pure and Applied ChemistryProtein-Domänen Sequenzformate
FASTA
>Taxon1
AATTCCCCAGCTTTCCACCAAGCTC
>Taxon2
AATTCCACAGCTTTCCACCAAGCTC
>Taxon3
AACTCCAGCACATTCCACCAAGCTC
>Taxon4
AACTCCACAACATTCCACCAAGCTC
Nexus
#NEXUS
Begin DATA;
Dimensions ntax = 4 nchar = 25;
Format datatype = NUCLEOTIDE gap = ;
Matrix
[ 1 11 21 ]
[ | | | ]
Taxon1 AATTCCCCAGCTTTCCACCAAGCTC
Taxon2 AATTCCACAGCTTTCCACCAAGCTC
Taxon3 AACTCCAGCACATTCCACCAAGCTC
Taxon4 AACTCCACAACATTCCACCAAGCTC
;
End;PHYLIP
4 25
Taxon1 AATTCCCCAGCTTTCCACCAAGCTC
Taxon2 AATTCCACAGCTTTCCACCAAGCTC
Taxon3 AACTCCAGCACATTCCACCAAGCTC
Taxon4 AACTCCACAACATTCCACCAAGCTC
PHYLIP – sequential
4 25
Taxon1 AATTCCCCAGCTTTCCACCAAGCTC
AATTCCCCAGCTTTCCACCAAGCTC
Taxon2 AATTCCACAGCTTTCCACCAAGCTC
AATTCCACAGCTTTCCACCAAGCTC
Taxon3 AACTCCAGCACATTCCACCAAGCTC
AACTCCAGCACATTCCACCAAGCTC
Taxon4 AACTCCACAACATTCCACCAAGCTC
AACTCCACAACATTCCACCAAGCTCPHYLIP – interleaved
4 25
Taxon1 AATTCCCCAG CTTTCCACCA AGCTCAGCTC
Taxon2 AATTCCACAG CTTTCCACCA AGCTCAGCTC
Taxon3 AACTCCAGCA CATTCCACCA AGCTCAGCTC
Taxon4 AACTCCACAA CATTCCACCA AGCTCAGCTC
AATTCCCCAG CTTTCC
AATTCCACAG CTTTCC
AACTCCAGCA CATTCC
AACTCCACAA CATTCC
CLUSTAL
CLUSTAL O(1.2.1) multiple sequence alignment
Taxon1 AATTCCCCAGCTTTCCACCAAGCTC 25
Taxon2 AATTCCACAGCTTTCCACCAAGCTC 25
Taxon3 AACTCCAGCACATTCCACCAAGCTC 25
Taxon4 AACTCCACAACATTCCACCAAGCTC 25
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