PRAKTIKUM TRENNMETHODEN SOSE 2021 - PROTOKOLL
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Praktikum Trennmethoden
SoSe 2021
Protokoll
C2 - Säulenchromatographie
Betreuer: Prof. Dr. Ralf Hoffmann
Franz Thiemann (3750567)
Georg Müller ()
Versuchsdurchführung: 26.07.2021
Protokollabgabe: 22.09.2021Inhaltsverzeichnis
I. Trennung und Identifizierung von Farbstoffen in Laubblättern 3
1. Aufgabenstellung 3
2. Chemikalien 3
3. Geräte und Materialien 3
4. Durchführung und Beobachtungen 3
5. Auswertung 4
5.1. Retentionszeiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
5.2. Idendifikation der Farbstoffe und Begründung der Farbigkeit . . . . . . . . . . . . . . 4
5.3. Diskussion der Elutionsreihemfolge . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
5.4. Alternative Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
II. Trennung eines Peptidgemisches mittels LC-MS 5
6. Auswertung 5
6.1. Effizienz der Synthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
III. Literatur 7
2C2 - Säulenchromatographie 4.0
Teil I.
Trennung und Identifizierung von
Farbstoffen in Laubblättern
1. Aufgabenstellung
Mittels Säulenchromatographie sollen die extrahierten Farbstoffe aus Laubblättern an einer Normal-
phase getrennt werden. Anschließend werden die isolierten Farbstoffe mittels UV/VIS-Spektroskopie
charakterisiert
2. Chemikalien
• Kieselgel 60
• Aceton
• Petrolether
3. Geräte und Materialien
• Säule
• Korkring
• Reagenzglasständer und Reagenzgläser (15x)
• UV-VIS Spektrometer
• Waage
• Becherglas
• Flashbirne
4. Durchführung und Beobachtungen
Es wurde wie in der Versuchsanleitung1 beschrieben vorgegangen:
Zuerst wurden 500 mL Eluent aus 350 mL Petrolether und 150 mL Aceton hergestellt (7:3). An-
schließend wurden 15,04 g Kieselgel 60 abgewogen und mit 75 ml der mobilen Phase aufgeschlämmt.
Die aufgeschlämmte Lösung wurde in die Glassäule überführt. Nach dem Setzen der stationären
Phase wurde der Eluent abgelassen, bis der Meniskus kurz über die Kieselgel-Schicht lag. Anschlie-
ßend wurde 1 mL des zu trennenden Gemisches behutsam in die Säule gegeben und die Probe wird
durch öffnen des Hahnes einlaufen gelassen.
Weiterhin kann nun die Säule vorsichtig mit Fließmittel gefüllt werden.
3C2 - Säulenchromatographie 5.2
Nach dem erneuten Öffnen des Hahnes beginnt die Trennung, die Fraktionen werden in Rea-
genzgläsern aufgefangen. Mit Hilfe eines Reagenezglases mit Volumenskale wurde die Fleißge-
schwingigkeit von 3,56 ml min−1 bestimmt. Die erhaltenen Fraktionen werden anschließend in einem
UV/VIS-Spektrometer analysiert.
Es konnte beobachtet werden, dass eine letzte Fraktion in der Säule nach ca. 2 h Elutionszeit
verblieb.
5. Auswertung
5.1. Retentionszeiten
Tabelle 1: Retentionszeiten
Farbe tR [min] λmax Farbstoff
1 bl. gelb 4:40
2 gelb 5:40 449 nm, (476 nm) Carotin
3 bl. gelb 7:10
4 farblos 8:10
5 dunk. 8:40 (382 nm), (411 nm), 431 nm, Chlorophyll A
grün (617 nm), 662 nm
6 dunk. 9:10 (Chlorophyll A)
grün
7 grün-gelb 10:20 (378 nm), 431 nm, (455 nm), Chlorophyll A + B
(661 nm)
8 gelb-grün 11:35 (Chlorophyll B)
9 gelb 13:45 (378 nm), 448 nm, (471 nm), Lutein + Violaxanthin +
(645 nm) Chlorophyll B
10 bl. gelb 15:15 446 nm, (472 nm) Lutein + Violaxanthin
11 bl. gelb 17:55 (443 nm), (470 nm) (Lutein) + Violaxanthin
12 farblos 19:25
13 farblos 22:05 (440 nm), (469 nm) Violaxanthin
... ... ...
... gelb >2:00:00 (Neoxanthin)
5.2. Idendifikation der Farbstoffe und Begründung der Farbigkeit
Die Fraktionen 1, 2, 3 können auf Carotin zurückgeführt werden. Die Farbigkeit der Carotine geht
von einem großen konjugierten π-System aus, welches zur beobachteten, gelben Farbe führt.
Fraktion 5, 6 können Chlorophyll A zugeordnet werden, da die Absorptionsbanden sich den Lite-
raturwerten annähern. Fraktion 7 scheint eine Mischfraktion aus Chlorophyll A und B zu sein, da
weiterhin die intensiven Banden von Chlorphyll A zu sehen sind und die weniger intensiven durch
Chlorophyll B erklärt werden können. Fraktion 8 könnte reineres Chlorophyll B enthalten, da die
beobachtete Farbe eher mit den Literaturwerten übereinstimmt. Die Farbigkeit von Chlorophyll
kommt durch die Absorption von rotem und blau-violetten Licht, was das Auge eine grüne Farbe
wahrnehmen lässt. Dabei sollte die Absorption durch den Chlorin-Teil des Moleküles geschehen, in
welchem je nach Chlorophyll-Typ ein Rest angefügt ist und ein Magnesium (II) komplexiert ist.
Fraktion 9, 10 und 11 in kleinen Teilen enthält Lutein, welches ähnlich wie Carotin aufgebaut ist,
4C2 - Säulenchromatographie 6.0
jedoch ein kleineres π-System aufweist.
Weiterhin erhalten die Fraktionen 9, 10, 11 und 13 Violaxanthin. Dies besitzt im Gegensatz zu den
ähnlichen Molekül Lutein abermals ein kleineres π-System.
Es lässt sich vermuten, dass die letzte, nicht eluierte Fraktion auf das Neoxanthin zurückgeführt
werden kann, da diese eine gelbe Färbung aufweist und stärker mit der Säule wechselwirkt.
5.3. Diskussion der Elutionsreihemfolge
Bei der verwendeten Säule ist die stationäre Phase eine polare Kieselgel-Phase. Mit dieser Wech-
selwirken die polaren Moleküle, weswegen hydrophobere Moleküle wie z.B. Carotin eher eluieren.
Dafür sorgt auch die verwendete mobile Phase, welche einen eher unpolaren Charakter aufweist.
Somit findet eine Trennung nach steigender Hydrophilie/Polarität statt.
Carotin ist ein sehr unpolares Molekül, weswegen es zu erst eluiert. Chlorophyll A ist unpolarer
als B, da es eine Aldehyd-Gruppe weniger aufweist. Lutein und Violaxanthin besitzen beide die
Carotin-Grundstruktur, allerdings mit 2 Hydroxyl-Gruppen, weshalb diese stärker mit der stati-
onären Phase wechselwirkten. Neoxanthin besitzt 3 Hydroxyl-Gruppen und ist zusätzlich sterisch
anspruchsvoller, weswegen es sehr lange in der Säule verbleibt.
5.4. Alternative Methoden
Eine Trennung der Blattfarbstoffe ist ebenfalls mit Kieselgelplatten der Dünnschichtchromatographie
möglich. Eine alternative Detektion würde die Verwendung der Massenspektroskopie z.B. mit der
ESI(Electrospray-Ionisation)-Technik darstellen. Auch denkbar wäre eine Analyse mit einer NMR-
Messung (1 H oder 13 C, mit geeignetem Lösungsmittel). Einige der Moleküle lassen sich auch durch
IR-Spektroskopie unterscheiden.
Teil II.
Trennung eines Peptidgemisches mittels
LC-MS
6. Auswertung
Es wurde das Protein H-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln-Glu-Val-OH (M=1148,33 Da) mittels
RP-HPLC und On-Line Kopplung mit ESI-Iontrap-MS analysiert. Zur Detektion wurde außer-
dem die UV-Absorbtion bei λ = 214 nm genutzt, weil die Peptidbindung zwischen den einzelnen
Aminosäuren in diesem Bereich absorbiert.
Das gezeichnete Chromatogramm erhält weitere Informationen neben der Peptiddetektion mittels
UV-VIS-Strahlung: Ein Eluent A (wässr. 0,1 %ige Ameisensäure) zu Eluent B (0,1 %ige Amei-
sensäure in Acetonitril) Verhältnis und den Druck der HPLC Anlage in bar. Die Retentionszeiten
für die zwei Hauptpeaks sind 12,1 min und 14,4 min, wobei der erste Peak sowohl höher ist, als auch
5C2 - Säulenchromatographie 6.1
Abbildung 1: Das erhaltene Chromatogramm mit den Informationen über Eluenten-
Zusammensetzung, Druck, Messung der UV-Absorption und ESI-MS.
mehr Fläche unter der Kurve besitzt.
Der zweite Peak bei 14,4 min ist das erwünschte Protein, da durch eine Anlagerung von 2 Protonen
der m/z -Wert von 574,9 erreicht werden kann.
Der erste Peak bei 12,1 min besitzt eine niedrigere Masse. Bei der Anlagerung von ebenfalls 2 Proto-
nen ist davon auszugehen, dass die monoisotopische Masse ca. 1049 Da ist. Die Differenz von 99 Da
deutet auf Valin hin. Daher kann angenommen werden, dass bei diesem Peak das Valin, welches
den C-Terminus des zu bildenden Proteines ausmacht nicht korrekt gebunden wurde.
Folglich sind auch die Retentionszeiten erklärbar: Valin besitzt ein hydrophobes Ende, weswegen
dieses stärker mit der RP-Säule wechselwirken kann. Deswegen eluiert das synthetisierte Protein
mit Valin später als das ohne Valin.
6.1. Effizienz der Synthese
Generell ist die Synthese gelungen, da das erwünschte Protein hergestellt wurde. Dies wird auch
durch das Massenspektrum von MALDI-TOF/TOF bestätigt, da das Signal von 1148,9144 Da auf
das Produkt hindeutet. Die Abtrennung im Chromatogramm ist erfolgt, weswegen das Produkt
isoliert werden kann.
Es ist weiterhin möglich die relativen Produktanteile durch die Fläche unter den Kurven zu be-
6C2 - Säulenchromatographie 6.0
Abbildung 2: Das MALDI-TOF/TOF-Massen
stimmen:
1427043
Hauptprodukt: = 0,34 = 34 %
2752363 + 1427043
2752363
Nebenprodukt: = 0,66 = 66 %
2752363 + 1427043
Folglich ist die Synthese gelungen und es kann reines Produkt isoliert werden.
Teil III.
Literatur
Literatur
1. Hoffmann, P. D. R. Praktikum Trennmethoden (Zugegrifffen am 20.07.2021), https://moodle2.
uni - leipzig . de / pluginfile . php / 2243875 / mod _ resource / content / 1 / Anleitung _
Praktikum_2021.pdf.
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