Posttranslationale Modifikationen der IL-6-Typ-Zytokin-Rezeptoren gp130 und LIFR und ihr Einfluss auf die Assoziation mit Detergenz-resistenten ...
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Posttranslationale Modifikationen der IL-6-Typ-
Zytokin-Rezeptoren gp130 und LIFR und ihr
Einfluss auf die Assoziation mit Detergenz-
resistenten Membranmikrodomänen (DRM)
Dissertation zu Erlangung des Doktorgrades der
Naturwissenschaften (Dr. rer. nat)
Fakultät Naturwissenschaften
Universität Hohenheim
Institut für Biologische Chemie und Ernährungswissenschaften
vorgelegt von
Inna Ziegler
aus Duschanbe (Tadschikistan)
2008Die vorliegende Arbeit wurde am 26.01.2005 der Fakultät Naturwissenschaften der Universität Hohenheim als „Dissertation zu Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften“ angenommen. Dekan: Prof. Dr. Heinz Breer 1. Berichtende Person: Prof. Dr. Lutz Graeve (Betreuer) 2. Berichtende Person: Prof. Dr. Tilman Grune 3. Prüfer: Prof. Dr. Christiane Bode Eingereicht am: 09.06.2008 Tag der mündlichen Prüfung: 10.10.2008
Meiner Familie, für all ihre Unterstützung
Teile dieser Arbeit wurden als Poster auf folgenden Kongressen präsentiert: Inna Ziegler, Deborah Buk, Sibylle Gündisch, Irene Kieß, Gabriele Pfanner, Lutz Graeve “Posttranslational modifications of the components of the ciliary neurotrophic factor (CNTF) receptor complex and their role in sorting and signal transduction” (58. Mosbacher Kolloquium, „Protein and lipid sorting in health and disease, 29.03.-31.03.2007, Mosbach, Deutschland) Inna Ziegler, Jennifer Hood, Deborah Buk, Lutz Graeve “Association of wild-type gp130 and gp130 mutants with detergent-resistant membranes (DRMs) and the role of the exoplasmatic domain of gp130 for its signal transduction” (10 years STS Anniversary Meeting, „Signal Transduction: Receptors, Mediators and Genes”, 01.-04.11.2006, Weimar, Deutschland) Inna Ziegler, Gabriele Pfanner, Irene Kieß, Deborah Buk, Lutz Graeve “The role of N-Glycans in the cellular sorting of the Ciliary Neurotrophic Factor Receptor” (43. Wissenschaftlicher Kongress, Deutsche Gesellschaft für Ernährung, 09-10.03.2006, Universität Hohenheim, Stuttgart, Deutschland) Inna Ziegler, Olga Renner, Deborah Buk, Antje Stäbler, Lutz Graeve “Cellular Trafficking of IL-6-Receptor subunits: lipid rafts association of gp130 mutants and apical-basolateral sorting of gp80∆412 and gp80 ∆cd” (28Th Annual Meeting of the German Society for Cell Biology, 16-19.03.2005, Heidelberg, Deutschland) Inna Ziegler, Maria Vlzakova, Antje Stäbler, Deborah Buk, Lutz Graeve “The role of lipid modifications in the targeting of proteins, association with microdomains and resulting changes in signal transduction” (9th Joint Meeting of Signal Transduction Society (STS), “Signal Transduction: Receptors, Mediators and Genes”, 10-12.11.2005, Weimar, Deutschland)
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ....................................................................................1
1.1 Zytokine ................................................................................................. 1
1.1.1 Interleukin (IL)-6-Typ-Zytokine ........................................................ 1
1.1.2 IL-6-Typ-Zytokinrezeptoren ............................................................. 2
1.1.3 Signaltransduktor gp130 ................................................................. 4
1.1.4 LIF und LIF-Rezeptor ...................................................................... 6
1.1.5 IL-6-Rezeptor-Komplex und Jak/STAT Signalweg .......................... 7
1.2 Struktur und Funktion von Detergenz-resistenten Membrandomänen... 8
1.3 Posttranslationale Modifikationen von Proteinen ................................... 9
1.4 Zielsetzung der Arbeit .......................................................................... 12
2 Material und Methoden.............................................................14
2.1 Ausgangsplasmide............................................................................... 14
2.2 Kultivierung und Konservierung von E. coli Stämmen ......................... 15
2.2.1 Herstellung kompetenter Bakterien: RbCl-Methode ...................... 15
2.2.2 Hitzeschocktransformation von E. coli Zellen................................ 15
2.3 Präparation und Analyse von Plasmid-DNA......................................... 16
2.3.1 Minipräparation von Plasmid-DNA ................................................ 16
2.3.2 Maxipräparation von Plasmid-DNA ............................................... 16
2.3.3 Quantitative Bestimmung von DNA............................................... 16
2.3.4 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen.......................... 17
2.3.5 Agarose-Gelelektrophorese .......................................................... 17
2.3.6 Aufreinigung der DNA-Fragmente aus der Agarose mittels QIAquick
PCR Purification Kit....................................................................... 18
2.3.7 Ligation ......................................................................................... 18
2.4 Sequenzierung..................................................................................... 22
2.5 Präparation der RNA und Synthese der cDNA mittels Reverser
Transkriptase .................................................................................................. 23
2.5.1 Synthese der cDNA aus Gesamt-RNA.......................................... 23
2.5.2 Amplifizierung von gp130 und GapDH .......................................... 24
2.6 Kultivierung und Transfektion von eukaryontischen Zellen .................. 28
2.6.1 Kultivierung von eukaryontischen Zellen....................................... 28
IInhaltsverzeichnis
2.6.2 Calcium-Phosphat-Transfektion von COS-7 und MDCK Zellen .... 29
2.7 Nachweis der Proteinexpression und Funktionalität der Rezeptoren... 30
2.7.1 Indirekte Immunfluoreszenzfärbung .............................................. 30
2.7.2 Gesamtzelllysat nach Stimulation und Proteindetermination ........ 31
2.7.3 Zelllysat zum Nachweis der Proteinexpression ............................. 32
2.7.4 Immunpräzipitation........................................................................ 33
2.8 Isolierung von Detergenz-resistenten Membrandomänen ................... 34
2.8.1 Isolierung von Detergenz-resistenten Membranmikrodomänen
mittels Pellet/Überstand-Fraktionierung ........................................ 34
2.8.2 Trichloressigsäure (TCA)-Fällung ................................................. 34
2.8.3 Isolierung der Detergenz-resistenten Membranmikrodomänen nach
Stimulation mit anschließender Immunpräzipitation ...................... 35
2.9 Verdau mit Endo-Glykosidase Hf (Endo Hf) ......................................... 35
2.9.1 Einfluss von Endof H auf LIFR nach der Isolierung von Detergenz-
resistenten Membranmikrodomänen............................................. 36
2.10 SDS-PAGE und Western Blot .............................................................. 37
2.10.1 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektophorese ................ 37
Chemikalien: ............................................................................................... 37
2.10.2 Proteintransfer auf eine PVDF-Membran mittels Wet-Western Blot
38
2.10.3 Semi-dry Western Blot .................................................................. 39
2.11 Immundetektion ................................................................................... 40
2.11.1 Entfernung aller Antikörper von PVDF-Membranen ...................... 42
2.12 Assoziation von gp130-wt und C→A-Mutanten mit Triton X-100 und Brij
58 Detergent-Resistenten Membrandomänen................................................ 42
3 Ergebnisse ................................................................................43
3.1 Die Rolle der transmembranären Cysteine 711 und 725 von gp130 für
die Assoziation mit Detergenz-resistenten Membranmikrodomänen .............. 43
3.1.1 Zelluläre Lokalisation von gp130-wt und der C→A-Mutanten in Cos-
7-Zellen ......................................................................................... 43
3.1.2 Expression von gp130-wt und C→A-Mutanten in stabil transfizierten
MDCK-Zellen................................................................................. 48
IIInhaltsverzeichnis
3.1.3 Die Assoziation von gp130-wt und C→A-Mutanten mit Triton X-100
und Brij 58 Detergenz-resistenten Membranmikrodomänen ......... 51
3.2 Einfluss der Glykosylierung von gp130 und LIFR auf die Assoziation mit
Detergenz-resistenten Membranmikrodomänen in MDCK-Zellen................... 55
3.3 Phosphorylierung von LIFR und gp130 und deren Verteilung in
Detergenz-resistenten Membranmikrodomänen............................................. 58
3.3.1 Phosphorylierung des LIFRs und Verteilung in Detergenz-
resistenten Membranmikrodomänen in HepG2-Zellen.................. 60
3.3.2 Phosphorylierung von gp130 und Verteilung in Detergenz-
resistenten Membranmikrodomänen in HepG2-Zellen.................. 62
3.3.3 Phosphorylierung des LIF-Rezeptors und Verteilung in Detergenz-
resistenten Membranmikrodomänen in 3T3-L1-Zellen.................. 64
4 Diskussion.................................................................................66
4.1 Einfluss der Cysteine in der Transmembrandomäne auf die Assoziation
von gp130 mit Detergenz-resistenten Membranmikrodomänen ..................... 66
4.2 Unterschiedliche Glykosylierungsformen des LIF-Rezeptors in MDCK-
Zellen 70
4.3 Wie beeinflussen Ligandenbindung und Phosphorylierung eines
Rezeptors die Wechselwirkungen mit Plasmamembranmikrodomänen? ....... 72
5 Zusammenfassung ...................................................................77
6 Summary ...................................................................................79
7 Literaturverzeichnis..................................................................80
8 Anhang ......................................................................................86
8.1 Abbildungsverzeichnis ......................................................................... 86
8.2 Tabellenverzeichnis ............................................................................. 87
8.3 Abkürzungsverzeichnis ........................................................................ 88
IIIEinleitung
1 Einleitung
1.1 Zytokine
Zytokine werden in vielen unterschiedlichen Zellen synthetisiert, und meist nach
Stimulation durch andere Zytokine oder bei entzündlichen Reaktionen
freigesetzt. Sie spielen eine wichtige Rolle bei Wachstum, Differenzierung,
Entzündung und anderen regulatorischen Prozessen (Heinrich et al., 1998;
Abroun et al., 2004). Es sind Proteine mit einem Molekulargewicht von 6-70 kDa,
die sehr schnell synthetisiert und freigesetzt werden können und die schon im
nanomolaren Bereich wirken. Menge und Art der freigesetzten Zytokine hängen
vom Zelltyp, vom Differenzierungsgrad und dem Aktivierungszustand der Zelle
ab. Zytokine sind neben Neurotransmittern und Hormonen die wichtigsten
Kommunikationsmittel zwischen Zellen. Ihre Wirkung ist oft lokal auf benachbarte
Zellen oder Gewebe begrenzt. Sie binden an spezifische Rezeptoren an der
Zelloberfläche, leiten Signalvorgänge ein und beeinflussen die Genexpression
verschiedener Zielgene. Zytokine wirken para-, endo- oder autokrin. Einerseits
können verschiedene Zytokine bei einer Zelle die gleiche Signalkaskade
auslösen (redundant) und andererseits kann ein Zytokin auf verschiedene Zellen
unterschiedlich wirken (pleiotrop). Die Kombination von zwei oder mehreren
Zytokinen kann sowohl synergistische als auch antagonistische Effekte
(Aggarwal et al., 1986) hervorrufen. Zytokine wirken also in einem komplexen
Netzwerk.
1.1.1 Interleukin (IL)-6-Typ-Zytokine
Zu den IL-6-Typ-Zytokinen gehören Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-11 (IL-11),
Interleukin (IL-27), leukemia inhibitory factor (LIF), oncostatin M (OSM), ciliary
neurotrophic factor (CNTF), Neuropoetin (NP), cardiotrophin-1 (CT-1) und
cardiotrophin-like cytokine (CLC). Zu dieser Familie gehört außerdem novel
neurotrophin-1/B-cell-stimulating factor-3 (NNT-1/BSF-3) (Schuettauf et al., 2005;
Senaldi et al., 1999).
1Einleitung
Die IL-6-Typ-Zytokine sind durch vier antiparallele α-Helices charakterisiert
(Bazan, 1990) und weisen, mit Ausnahme von CNTF und CT-1, eine N-terminale
Signalsequenz sekretorischer Proteine auf. IL-6, LIF und OSM sind zusätzlich N-
glykosyliert.
Eine fehlerhafte Regulation der Produktion und/oder der Signaltransduktion der
IL-6-Typ-Zytokine führt zur Entstehung und Manifestation diverser Erkrankungen
wie z.B. Osteoporose, Multiple Sklerose, entzündliche Darmerkrankungen und
mancher Krebsarten wie der Waldenström´schen Makroglobulinämie.
Ausgangspunkt für diese Erkrankung sind entartete B-Lymphozyten, die ins
Blutgefäßsystem wandern und dort vermehrt Antikörper vom IgM-Typ
produzieren. Diese Erkrankung kann u.a. durch erhöhte IL-6-Spiegel
diagnostiziert werden (Hatzimichael et al., 2001; Chng et al., 2006).
Die Bestimmung von IL-6 im Plasma wird heute auch als Prognosemarker bei
Lungen- und Brustkrebs herangezogen (Sansone et al., 2007).
1.1.2 IL-6-Typ-Zytokinrezeptoren
Die IL-6-Typ-Zytokinrezeptoren sind, mit Ausnahme des CNTF-Rezeptors, Typ-I-
Transmembranproteine und werden durch die Bindung der Zytokine aktiviert. Die
Rezeptoren (R) können in die Liganden-bindenden (CNTFRα, IL-6Rα, IL-11Rα)
und signalweiterleitenden Untereinheiten (Glykoprotein (gp) 130, LIFR und
OSMR) unterteilt werden (Heinrich et al., 2003; Kishimoto et al., 1995). Die
Zytokinrezeptorkomplexe enthalten alle mindestens ein Molekül gp130. IL-6 und
IL-11 sind die einzigen IL-6-Typ-Zytokine, deren Signale ausschließlich über ein
gp130-Homodimer weitergeleitet werden. CNTFR, LIFR, IL-27-R und OSMR
bilden Heterodimere mit gp130 aus. IL-6, IL-11, IL-27, CLC, CT-1 und CNTF
benötigen außerdem ihre spezifischen, nicht signalisierenden α-Rezeptoren
(siehe Abbildung 1) (Davis et al., 1991; Hilton et al., 1994; Yamasaki et al.,
1988).
2Einleitung
Abbildung 1: IL-6-Typ-Zytokinrezeptoren
Durch Kristallstrukturanalysen konnte für den humanen IL-6-R gezeigt werden,
dass dieser einen Hexamer aus je zwei Molekülen IL-6, gp130 und IL-6-R bildet
(Boulanger et al., 2003). Die genaue räumliche Organisation und Stöchiometrie
anderer Rezeptoren vor und nach der Ligandenbindung sind noch nicht
vollständig aufgeklärt.
Die membranständige α-Rezeptoruntereinheit von IL-6, IL-11 und CNTF kann
auch durch eine lösliche Form, der die membranäre Verankerung fehlt, ersetzt
werden. So kann z.B. durch den löslichen IL-6-R (sIL-6-R, sgp80), welcher mit
IL-6 an gp130 bindet, die Signaltransduktion eingeleitet werden. Anders
hingegen verhält es sich mit der löslichen Form von gp130 (sgp130); diese wirkt
antagonistisch zum membranständigen gp130 und vermag das Signal zu
inhibieren (Mackiewicz et al., 1992).
Die exoplasmatische Domäne der α-Untereinheiten der Typ I-Zytokinrezeptoren,
zu denen auch die IL-6-Typ-Zytokin-Rezeptoren gehören, beinhaltet ein CBM-
Modul (cytokine-binding module) bestehend aus zwei FN III (fibronectin-type III)-
like Domänen. Die N-terminale Domäne des CBM enthält vier konservierte
Cysteine, die C-terminale das für die Typ-I-Zytokinrezeptoren typische WSXWS
(Trp-Ser-X-Trp-Ser) Motiv (Heinrich et al., 1998). Zudem enthalten alle IL-6-Typ-
Zytokinrezeptoren eine IgG-ähnliche Domäne entweder am N-Terminus oder wie
im Falle von LIFR und OSMR eine Domäne zwischen zwei CBM Modulen. LIFR,
gp130 und OSM enthalten außerdem die drei FN III-ähnliche Domänen D4, D5
und D6, die sich in der membranproximalen Region befindet. Die cytosolische
Domäne der Rezeptoren ist unterschiedlich lang und fehlt beim CNTFR
3Einleitung
vollständig. Dieser Rezeptor weist als einziges Mitglied der IL-6-Typ-Zytokin-
Familie einen Glykosylphosphatidylinositol (GPI)-Anker auf.
1.1.3 Signaltransduktor gp130
Alle lL-6-Typ-Zytokinrezeptoren beinhalten in ihrem Rezeptorkomplex
mindestens ein Molekül gp130, das in nahezu allen Zellen exprimiert wird.
Dieses Protein besteht aus 818 Aminosäuren und enthält ein Signalpeptid von 22
Aminosäuren. Die exoplasmatische Region von gp130 enthält 597 Aminosäuren,
die zytoplasmatische 277 Aminosäuren. Die Transmembranregion von gp130,
die 22 Aminosäuren umfasst. In zahlreichen Studien konnte gezeigt werden,
dass Cysteine palmitoyliert werden können, wodurch das Protein lipophiler wird
und stärker in Wechselwirkung mit dem Plasmamembranbilayer tritt
(Bhattacharya et al., 2004; Moffett et al., 2000). Dies kann zu einer verstärkten
DRM (Detergenz-resistente Membrandomänen)-Assoziation eines Proteins
führen. Gp 130 enthält in seiner Transmembrandomäne zwei Cysteinreste (C711
und C725). Der Einfluss dieser Cysteine auf die DRM-Assoziation von gp130
wird unter anderem in dieser Arbeit untersucht.
Gp130 besitzt außerdem 10 potentielle N-Glykosylierungsstellen, von denen 9
tatsächlich glykosyliert werden (Moritz et al., 2001). Die mit PNGase (Peptide N-
Glykosidase) F behandelte und daher deglykosylierte Form des Rezeptors wird
bei 90 kDa detektiert (Gerhartz et al., 1994). Es ist seit langem bekannt, dass
diverse Zelltypen Proteine unterschiedlich glykosylieren, was auf eine variable
Ausstattung der Enzymmaschinerie der einzelnen Zellarten zurück zu führen ist.
4Einleitung
CBM
Abbildung 2: Struktur des Signaltransduktors gp130, modifiziert nach Wortmann
(Wortmann, 2004)
Der extrazelluläre Teil von gp130 enthält eine Immunglobulin-ähnliche Domäne
D1, gefolgt von einem cytokine binding Modul (CBM), das die Domänen D2 und
D3 enthält. Die zwei Domänen besitzen vier konservierte Cysteinreste und das
WSEWS Motiv (Trp-Ser-Glu-Trp-Ser) (Hibi et al., 1990). In der
membranproximalen Region befindet sich der FN III-ähnliche Bereich (D4, D5,
D6) (siehe Abbildung 2).
Innerhalb des zytoplasmatischen Anteils von gp130 gibt es hochkonservierte
Bereiche, nämlich Box1 und Box2. Diese sind für die Bindung der Janus Kinasen
notwendig und kommen auch in anderen Zytokinrezeptoren wie z.B. EPOR oder
IL-3-R vor. Die Box2 enthält hauptsächlich hydrophobe und positiv geladene
Aminosäuren. In der Box1 ist ein prolinreiches Motiv von 8 Aminosäuren
lokalisiert (Murakami et al., 1991; Heinrich et al., 1998; Pellegrini & Dusanter-
Fourt, 1997). In der zytoplasmatischen Region sind außerdem Tyrosine
enthalten, die für die Bindung zytosolischer Faktoren von Bedeutung sind. So
5Einleitung
bindet z.B. die Tyrosinphosphatase SHP-2 und SOCS3 an das phosphorylierte
Tyrosin 759 (Schmitz et al., 2000). STAT1 bindet ausschließlich an die phospho-
Tyrosine 905 und 915, während STAT3 an die phospho-Tyrosine 767, 814, 905
und 915 bindet (siehe Abbildung 2) (Gerhartz et al., 1996; Stahl et al., 1995).
Timmermann et al. konnten zeigen, dass alle Tyrosin-Motive, aber auch die
Box1/2, essentiell für eine korrekte Signalübertragung sind (Timmermann et al.,
2002). Für das Di-Leucin Motiv (L786, L787) im zytoplasmatischen Teil von
gp130 konnte gezeigt werden, dass dieses sowohl für die Sortierung an die
Plasmamembran, als auch für die Internalisierung des Proteins ins Zytosol
notwendig ist (Dittrich et al., 1994; Dittrich et al., 1996; Martens et al., 2000).
Doumanov et al. konnten mit unterschiedlichen Deletionsmutanten zeigen, dass
eine Sequenz von 10 Aminosäuren (782-792), die auch das Di-Leucin Motiv
enthält, für die basolaterale Sortierung in polaren Epithelzellen verantwortlich ist
(Doumanov et al., 2006).
1.1.4 LIF und LIF-Rezeptor
Leukemia inhibitory factor (LIF) ist ein pleiotrop wirkendes Zytokin. Es ähnelt
sowohl strukturell als auch funktional dem Oncostatin M (OSM), welches
ebenfalls an den hochaffinen LIFR bindet (siehe Abbildung 1) (Gearing et al.,
1992). Es wird zusammen mit vielen anderen Wachstumsfaktoren (z.B. insulin-
like-growth factor IGF, tumor necrosis factor TNF, colony-stimulating factor CSF,
IL-1 und IL-6) im Embryo und/oder im weiblichen Genitaltrakt synthetisiert. Bei
embryonalen in vitro Kulturen konnte gezeigt werden, dass diese Zytokine die
Entwicklung, den Ablauf der Apoptose und den Metabolismus der
Präimplantationsembryonen beeinflussen (Kolle et al., 2004). Stewart et al.
konnten zeigen, dass LIF-/- Knockout Mäuse trotz normaler Ovulation und
Fertilisation unfruchtbar sind, da die Embryonen sich nicht in das Endometrium
implantieren können (Stewart et al., 1992).
Gearing et al. konnten 1991 die cDNA des humanen und des murinen LIFR
klonieren (Gearing et al., 1991). Der humane LIFR enthält 1097 Aminosäuren
(AS), wobei die Signalsequenz aus 44 und die extrazelluläre Domäne aus 789
6Einleitung
Aminosäuren bestehen. Der Transmembrandomäne kommen 26 und der
zytosolischen Domäne 238 Aminosäurereste zu. Der Rezeptor enthält 20
mögliche Glykosylierungsstellen, von denen sich 19 in der exoplasmatischen
Domäne befinden. Die Transmembrandomäne enthält unpolare Aminosäuren
und ein Cystein in der Nähe der zytosolischen Domäne. Smith und Treutlein
postulierten 1998, dass das zweite LIFR Zytokin-Bindungs-Modul (CBM) über die
Bindung an die D-A-Helices (LIF enthält vier α-helicale Strukturen mit einer upup-
down-down-Anordnung: A, B, C, D) des LIFs mit der CBM des gp130 in
Wechselwirkungen tritt (Smith & Treutlein, 1998). Außerdem existieren
unterschiedliche Bindungsaffinitäten zwischen den CBMs des LIFR. Während
humanes LIF eher an die erste CBM bindet, zeigt murines LIF eine höhere
Affinität zu der zweiten CBM.
1.1.5 IL-6-Rezeptor-Komplex und Jak/STAT Signalweg
Bei den IL-6-Typ-Zytokinrezeptoren wird die Signalkaskade nach Bindung des
Liganden an die α-Untereinheit/en ausgelöst. Nach der Homo- und/oder
Heterodimerisierung der Untereinheiten zu einem Rezeptorkomplex kommt es
zur Aktivierung der konstitutiv mit gp130 assoziierten Kinasen (Jak1/2, Tyk2)
(Lutticken et al., 1994; Stahl et al., 1994; Guschin et al., 1995). Diese
phosphorylieren ihrerseits gp130. Die phosphorylierten Tyrosinreste dienen dann
als Adaptor für weitere Faktoren der Signaltransduktionkaskade wie z.B. STAT
und Grb2 (Growth factor receptor-bound protein 2). Nach Bindung von STAT3
(via Src-homology 2 Domäne) an gp130 wird es phosphoryliert, dissoziiert dann
vom Rezeptor ab und dimerisiert mit einem weiteren Tyrosin-phosphorylierten
STAT3. Diese Homodimere translozieren daraufhin in den Kern, wo sie an die
DNA binden und so die Genexpression beeinflussen (siehe Abbildung 3). Über
die Expression von SOCS, aber auch durch PIAS (protein inhibitor of activated
STATs) erfolgt die negative Regulation der Zytokin-Signalkaskade (Endo et al.,
1997; Chung et al., 1997; Liu et al., 1998). Über Jak2, Src-homology-2 domain
containing protein tyrosine phosphatase (SHP-2) und Grb2 kann es zum cross
7Einleitung
talk mit dem MAPK/ERK (p38 mitogen-activated protein/ extracellular signal-
related kinase) Signalweg kommen (Brann et al., 2002).
Abbildung 3: IL-6-Rezeptor-Komplex und Jak/STAT Signalweg (Lang, 2004)
1.2 Struktur und Funktion von Detergenz-resistenten
Membrandomänen
Detergenz-resistente Membrandomänen, häufig auch als membrane rafts/ lipid
rafts bezeichnet, weisen einen hohen Gehalt an Cholesterin und Sphingolipiden
auf und spielen eine entscheidende Rolle bei der Signaltransduktion (Simons &
Toomre, 2000a). Wegen ihrer Unlöslichkeit in nicht-ionischen Detergenzien wie
Brij 58, Brij 98, CHAPS und Triton X-100 werden sie auch als Detergenz-
resistente Membrandomänen (DRM) bezeichnet (Brown & London, 1998; Parton
& Simons, 1995; Brown & Rose, 1992). DRM können aufgrund des hohen
Lipidgehaltes und der hohen Dichte mittels Sukrosedichtegradienten von den
restlichen Zellbestandteilen getrennt werden (Brown & Rose, 1992). Simons und
8Einleitung
Ikonen untersuchten die Dynamik der Biomembran und der darin enthaltenen
Proteine. Sie stellten fest, dass sich die Rezeptoren während der
Signaltransduktion innerhalb des Membranbilayers bewegen und in
Wechselwirkungen mit anderen Proteinen/Rezeptoren treten (Simons & Ikonen,
1997). Cheng et al. zeigten, dass lipid rafts auch beim initialen Schritt der
Signaltransduktion des B cell antigen receptor (BCR) und der
Antigenpräsentation eine entscheidende Rolle spielen (Mielenz et al., 2005;
Cheng et al., 1999).
Aufgrund ihrer Struktur beinhalten die DRM im Vergleich zu anderen
Membrandomänen ein anderes Proteinmuster. Die Affinität eines Proteins zu
Detergenz-resistenten Domänen wird durch unterschiedliche Faktoren
beeinflusst (z.B. Glykosylierung, GPI-Anker, Palmitoylierung). Proteine, wie
Kinasen der src-Familie oder die α-Untereinheiten trimerer G-Proteine (Resh,
1999), aber auch palmitoylierte Proteine (Brown & London, 1998) können
aufgrund ihrer höheren Lipophilität stärker mit den DRM interagieren.
1.3 Posttranslationale Modifikationen von Proteinen
Proteine werden oft schon während der Synthese (z.B. Glykosylierung) meistens
aber posttranslational modifiziert. Die Modifikationen sind sehr unterschiedlich
und laufen unter anderem im ER (Glykosylierung), Golgi-Apparat (Trimmen der
Oligosaccharidreste), Nukleus (De/Acylierung, De/Phosphorylierung) oder im
Zytosol (Ubiquitinylierung, De/Phosphorylierung) ab. Durch Verknüpfung von
Kohlenhydratketten, Lipiden und Phosphaten mit Aminosäuren werden Struktur,
Funktionalität, Lokalisation der Proteine und Signaltransduktionsvorgänge
beeinflusst. Glykosylierung, Palmitoylierung und Phosphorylierung stehen im
Mittelpunkt dieser Arbeit und werden daher im Folgenden ausführlich
beschrieben.
Die meisten Proteine, die in eukaryontischen Zellen sezerniert oder an der
Zelloberfläche exprimiert werden, sind Glykoproteine. Auf die Aminosäuren
Asparagin (N-glykosidisch) bzw. Serin und Threonin (O-glykosidisch) werden
Kohlenhydratseitenketten enzymatisch übertragen. Die N-glykosidisch
9Einleitung
gebundenen Kohlenhydratketten werden in drei Typen eingeteilt: komplex, hybrid
und high-Mannose. Wie aus Abbildung 4 zu entnehmen ist, besitzen alle drei
Glykosylierungs-Typen die sogenannte „Core-Struktur“ (Asn-(N-Acetyl-D-
Glukosamin)2-(Mannnose)3) (Lottspeich, 1998). Diese Struktur entspricht dem
„Vorläufer-Typ“ und wird bei manchen Proteinen im Golgi-Apparat noch weiter
zur „reifen“ Form modifiziert. Dabei werden die Mannose-Reste teilweise
abgespalten und durch N-Acetyl-D-Glukosamin, D-Galaktose oder N-
Acetylneuraminsäure ersetzt.
Abbildung 4: Drei Typen der N-Glykosylierung (Lottspeich, 1998)
Die Glykosylierung von Proteinen, insbesondere die N-Glykosylierung, ist wichtig
für die korrekte Faltung, den intrazellulären Transport, die Sekretion bzw. die
Oberflächenexpression. Davis et al. konnten für den Rezeptor des Follikel-
stimulierenden Hormons (FSHR) zeigen, dass eine Kombination von
verschiedenen Glykosylierungsstellen für die Oberflächenexpression notwendig
ist (Nagayama et al., 1998; Davis et al., 1995). Weiterhin ist für manche
Rezeptoren bekannt, dass eine Mutation der N-Glykosylierungsstellen zur
Aggregation im ER (Lanctot et al., 2005; Lanctot et al., 1999), zum gestörtem
Oberflächentransport in un/polaren Zellen oder zur Umverteilung in DRM führen
kann (Gut et al., 1998; Yeaman et al., 1997; Ray et al., 1998).
Bei der Palmitoylierung werden langkettige Fettsäuren kovalent mit Cysteinresten
der Proteine verknüpft (Casey, 1994; Dunphy und Linder, 1998). Die
Palmitoylierung ist, bis auf wenige Ausnahmen, im Vergleich zur Myristoylierung
10Einleitung
oder Isoprenylierung, ein reversibler Prozess (Parat und Fox, 2001; Casey,
1994). Der genaue Mechanismus und die daran beteiligten Enzyme sind nach
wie vor nicht gut erforscht. Allein aus der Primärstruktur eines Proteins lassen
sich keine Vorhersagen über dessen mögliche Palmitoylierung treffen. So gibt es
einerseits Rezeptoren, die mehrere Cysteinreste enthalten, aber nicht
palmitoyliert werden und andererseits Proteine, die an einem (TNFα) oder an
mehreren Cysteinen modifiziert sind (Synaptotagmin 1, Rhodopsin) (Weber,
2006). Untersuchungen an palmitoylierten Proteinen haben ergeben, dass viele
von ihnen mit DRM assoziiert sind (Bhattacharya et al., 2004; Gagnoux-Palacios
et al., 2003; Moffett et al., 2000).
Bei der Phosphorylierung werden Phosphatgruppen an bestimmte Aminosäuren
(Tyrosin, Serin, Threonin), Zucker oder Nukleotide angehängt. Dieser Prozess
ist reversibel und wird unter Verbrauch von ATP von Kinasen katalysiert. Nach
der Phosphorylierung kommt es häufig zur Konformationsänderung und darauf
folgenden Aktivierung bzw. Inaktivierung des phosphorylierten Substrats. So
werden z.B. Enzymaktivität, Rezeptoren während der Signaltransduktion und
Transkriptionsfaktoren durch Kinasen und Phosphatasen reguliert.
Es ist bis heute bei vielen membranständigen Rezeptoren nicht bekannt wie die
Ligandenbindung und Rezeptoraktivierung verläuft. Weiterhin ist unklar, in
welchen Mikrodomänen (DRM oder nicht-DRM) der aktive beziehungsweise der
inaktive Rezeptorkomplex zu finden ist, und ob nach der Ligandenbindung und
der nachgeschalteten Phosphorylierung eine Verlagerung von Detergenz-
löslichen zu Detergenz-unlöslichen Mikrodomänen statt findet.
11Einleitung
1.4 Zielsetzung der Arbeit
Posttranslationale Modifikationen sind wichtige Veränderungen an Proteinen, die
Proteinfaltung, Stabilität, Aktivität und auch Lokalisation innerhalb der Zelle
beeinflussen. Zu den Modifikationen zählen unter anderem der
Glykosylphosphatidylinositol-Anker, Glykosylierung, Palmitoylierung und
Acylierung (Fiedler & Simons, 1995; Gut et al., 1998; Melkonian et al., 1999).
Durch Anhängen lipophiler und/oder kohlenhydratreicher Reste an Proteine
können mögliche Veränderungen in der zellulären Lokalisation und/ oder
Funktion, sowie auch in der Assoziation mit Detergenz-resistenten
Membrandomänen herbeigeführt werden. Die Bindung an einen Liganden und
bestimmte Sortiersignale innerhalb der Proteinsequenz können ebenfalls die
Interaktion mit den Membrandomänen beeinflussen (Matter & Mellman, 1994;
Doumanov et al., 2006).
Inwiefern bestimmte Protein-Modifikationen den Transport zu
Plasmamembrandomänen beeinflussen, war der Gegenstand dieser Arbeit.
Dabei wurden vor allem die Palmitoylierung, die N-Glykosylierung und die
Phosphorylierung nach der Ligandenbindung näher betrachtet.
Eine der Fragestellungen der vorliegenden Arbeit war, ob die Cysteine in der
Transmembrandomäne des Signaltransduktors gp130 palmitoyliert sind, und
wenn ja, welche Rolle sie bei der Assoziation von gp130 mit Detergenz-
resistenten Membrandomänen spielen. Zu diesem Zweck wurden drei Mutanten
generiert, in denen Cystein-711 (gp130 C711A), Cystein-725 (gp130 C725A) und
im Falle der Doppelmutante beide Cysteine durch Alaninreste ersetzt wurden
(gp130 C711/725A). Diese Konstrukte wurden in der Diplomarbeit mit dem Titel
„Rolle der Cysteine in der Transmembrandomäne des IL-6-Signaltransduktors
gp130 für die Assoziation mit Lipid Rafts“ erzeugt (Inna Ziegler, 2004). Aus stabil
exprimierenden MDCK-Zellen wurden mittels Triton X-100 oder Brij 58 DRM
isoliert und die Assoziation der Mutanten im Vergleich zum Wildtyp untersucht.
Im Weiteren wurden die Glykosylierung des LIF-Rezeptors und von gp130
analysiert und die Verteilung unterschiedlicher Glykosylierungsformen in
Detergenz-resistenten Mikrodomänen überprüft.
12Einleitung
Da die DRM-Assoziation eines Rezeptors auch durch Bindung des jeweiligen
Liganden beeinflusst werden und eine Stabilisierung des Rezeptorkomplexes
oder eine veränderte Verteilung in DRM zur Folge haben kann, wurde
anschließend in dieser Arbeit der Phosphorylierungsstatus der Rezeptoren (LIFR
und gp130) vor und nach der Stimulation mit LIF untersucht.
13Material und Methoden
2 Material und Methoden
Anmerkung: Es wurden, sofern nicht anders angegeben, ausschließlich
Chemikalien des Reinheitsgrades pro analysis der Firmen Fluka Chemie AG
(Buchs, Schweiz), Merck (Darmstadt, Deutschland), Roth (Karlsruhe,
Deutschland), Serva (Heidelberg, Deutschland), Sigma-Aldrich (Taufkirchen,
Deutschland), PAA Laboratories GmbH (Pasching, Österreich) und VWR-
International (Darmstadt, Deutschland) verwendet.
2.1 Ausgangsplasmide
¾ pSVL-hgp130-C→A711, mit AmpR (erzeugt durch Mutagenese, hier wurde
ein Cystein an der Stelle 711 durch ein Alanin ersetzt)
¾ pSVL-hgp130-C→A725, mit AmpR (erzeugt durch Mutagenese, hier wurde
ein Cystein an der Stelle 725 durch ein Alanin ersetzt)
¾ pSVL-hgp130-C→A725/711, mit AmpR (erzeugt durch Mutagenese, hier
wurden beide Cysteine an den Stellen 711 und 725 durch Alanine ersetzt)
¾ pM5-Nrf-Fus: die Genexpression von diesem retroviralen Vektor unterliegt
der viralen long terminal repeat sequence. Der Vektor enthält außerdem
die IRES (internal ribisomal entry site) Sequenz und das Gen für das
Fusionsprotein GFP (Green Fluorescent Protein)-Neomycin. Bereitgestellt
von Fred Schaper (RWTH, Aachen).
Die pSVL-gp130-C→A-Konstrukte wurden in der Diplomarbeit “Die Rolle der
Cysteine in der Transmembrandomäne des Signaltransduktors gp130 für die
Assoziation mit Detergenz-resistenten Membrandomänen“ erzeugt (Inna Ziegler,
2004).
14Material und Methoden
2.2 Kultivierung und Konservierung von E. coli Stämmen
Die E. coli XL 1 Blue Zellen wurden im LB-Medium (20 g Lennox L broth/ 1 L dd
H2O) über Nacht bei 37°C auf dem Schüttler inkubiert. Bei transformierten
Bakterien wurde das Medium zusätzlich mit dem Antibiotikum Ampicillin
(Endkonzentration 100 µg/ml) versetzt. Für die Konservierung der Bakterien
wurden 700 µl einer Übernachtkultur mit 300 µl 50% Glyzerinlösung versetzt,
gemischt und bei –80°C gelagert.
2.2.1 Herstellung kompetenter Bakterien: RbCl-Methode
0,1-0,5 ml einer LB-Übernachtkultur wurden auf 100 ml frisches Medium (ohne
Ampicillin) umgesetzt und bis zu einer Optischen Dichte (OD) von 0,5-0,6
kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien 5 min bei 4000 rpm in sterilen 50
ml Falkons zentrifugiert, der Überstand (ÜS) verworfen und die Zellen ab diesem
Zeitpunkt immer auf Eis gelagert. Das Pellet wurde in 30 ml eiskaltem TFB1-
Puffer (100 mM RbCl, 50 mM MnCl2 x 4 H2O, 30 mM KAc, 10 mM CaCl2 x 2H2O,
15% Glyzerin, pH = 5,8; steril filtriert) resuspendiert und 90 min auf Eis inkubiert.
Die Bakterien wurden erneut 5 min bei 4000 rpm zentrifugiert, der ÜS verworfen
und das Pellet in 4 ml kaltem TFB2-Puffer (10 mM MOPS
(Morpholinopropanesulfonic acid), 10 mM RbCl, 75 mM CaCl2 x 2 H2O, 15%
Glyzerin, pH = 8; steril filtriert) aufgenommen. Nach einer 15-60 minütigen
Inkubation auf Eis wurden die kompetenten Bakterien sofort in 100 µl Aliquots
aufgeteilt, für 10 s in flüssigen Stickstoff schock gefroren und anschließend bei
-80°C gelagert.
2.2.2 Hitzeschocktransformation von E. coli Zellen
Zu 50 µl kompetenten Bakterien wurden 10 µl des Reaktionsansatzes (DNA und
Wasser) pipettiert und 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde der
Transformationsansatz 90 s bei 42°C und danach exakt 2 min auf Eis inkubiert.
Zum Reaktionsansatz wurden 0,5 ml LB-Medium (ohne Antibiotikum) zugegeben
und der Ansatz 1,5 h unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Die Bakterien wurden in
15Material und Methoden
unterschiedlichen Konzentrationen auf ampicillinhaltigen Agarplatten
(Endkonzentration 100 µg/ml) ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
2.3 Präparation und Analyse von Plasmid-DNA
2.3.1 Minipräparation von Plasmid-DNA
Einzelne Bakterienkolonien wurden in ca. 3 ml LB-Medium überimpft und über
Nacht bei 37°C kultiviert. Ausgehend von einer Glycerinkultur wurden 10 µl des
Ansatzes in ca. 3 ml LB-Medium überimpft und ebenfalls über Nacht bei 37°C
kultiviert. Nach Abtrennung von 2 ml einer Übernachtkultur durch Zentrifugation
wurde der Überstand verworfen und die Plasmidisolation nach dem Protokoll der
Firma QIAGEN (QIAprep®Spin Miniprep Kit, QIAGEN, Hilden, Deutschland)
durchgeführt.
2.3.2 Maxipräparation von Plasmid-DNA
Für die Maxipräparation wurden 50-150 ml einer Übernachtkultur mittels Maxi Kit
von der Firma QIAGEN (Plasmid Maxi Kit, QIAGEN, Hilden, Deutschland)
verarbeitet. Die Präparation wurde gemäß Firmenprotokoll des Herstellers
durchgeführt.
2.3.3 Quantitative Bestimmung von DNA
Die Konzentrationsbestimmung erfolgte mit dem UV-Spektrometer Smart Spec™
3000 der Firma Biorad (München, Deutschland). Das Gerät misst die Absorption
der gelösten DNA in einer 1 ml Quarzküvette bei einer Wellenlänge von 260 nm.
Zusätzlich wird die Absorption bei 280 nm angegeben, um die Reinheit der Probe
bestimmen zu können. Wurde ein Quotient der optischen Dichte bei 260 und 280
nm (OD260/OD280) von 1,8 bis 1,9 ermittelt, so wies die Probe keine
Proteinverunreinigungen auf.
Eine vom Hersteller ermittelte Gesetzmäßigkeit für dieses Gerät ist: OD260 von
1,0 entspricht 20µg ssDNA bzw. 50 µg dsDNA. Für die Messungen wurde eine 1:
100 Verdünnung in Wasser hergestellt und gemessen.
16Material und Methoden
2.3.4 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen
Um den Erfolg der Ligation zu überprüfen, wurden die Konstrukte mit
Endonukleasen (siehe Tabelle 1) verdaut und mittels Agarose-Gelelektrophorese
analysiert. Es wurden Enzyme der Firma MBI Fermentas (St. Leon-Roth,
Deutschland) verwendet. Genauere Angaben zu Enzymen und den
Reaktionsbedienungen siehe www.fermentas.com.
Tabelle 1: Verwendete Enzyme für die Umklonierung in den pM5NRF-Fus-Vektor
Konstrukte Verwendete Reaktionsbedingungen
(ca. 300-500 ng DNA/ Ansatz) Enzyme
pM5NRF-Fus-gp130C→A- XhoI und BamHI 1-2 h, 37°C, 2-3 Units/
Mutanten Ansatz (300-500 ng
DNA)
2.3.5 Agarose-Gelelektrophorese
Chemikalien:
- Agarose, Peqlab, Erlangen
- 50x TAE-Puffer (Tris-Acetat-EDTA): 2 M Tris-Base; 50 mM EDTA, pH 8,0
- 1x TAE-Puffer: eine 1:50-Verdünnung des 50x TAE-Puffers
- Ethidiumbromidstammlösung: 0,5 mg/ml;
- 6x DNA-Probenpuffer Buffer, Fermentas, St. Leon-Roth oder Gennaxon,
Biberach
- DNA-Marker Gene Ruler 50 bp DNA-Ladder, Fermentas, St. Leon-Roth
Zur Auftrennung wurden 0,8%ige Agarosegele verwendet, welchen 20 µl
Ethidiumbromidlösung (Endkonzentration: 0,1 µg/ml) zugesetzt wurden. Die
Agarose wurden in dem 1x TAE-Puffer unter Erwärmen gelöst, mit
Ethidiumbromidlösung versetzt und in die Gelgießvorrichtung gegossen. Der
Kamm wurde sofort reingesteckt und das Gel für 20 min polymerisiert. Danach
wurde das Gel in den mit Puffer gefüllten Tank überführt und der Probenkamm
entfernt. Jede Probe wurde mit 2-3 µl DNA-Probenpuffer versetzt und in die
Tasche geladen. Zum Größenvergleich wurde eine Marker (5-10 ml) auf ein Gel
17Material und Methoden
mit aufgetragen. Die Elektrophorese wurde bei 120 V für 1-1,5 h durchgeführt
und das Gel anschließend unter UV-Licht fotografiert.
2.3.6 Aufreinigung der DNA-Fragmente aus der Agarose mittels
QIAquick PCR Purification Kit
Die mit Restriktionsenzymen verdauten DNA-Proben wurden auf einem 0,8%igen
Agarosegel aufgetrennt, die Banden mit einem Skalpell herausgeschnitten und in
ein vorgewogenes Eppendorfgefäß überführt. Die DNA-Banden wurden mittels
QIAquick PCR Purification Kit gemäß den Angaben des Herstellers aufgereinigt
(QIAGEN, Hilden, Deutschland).
2.3.7 Ligation
Für die Ligation wurden die aufgereinigte Fragmente (siehe 2.3.6) zunächst in
einem Kontrollgel (0,8% Agarose) analysiert. Dabei wurden gleiche Volumina
(jeweils 2 und 4 µl) von Vektor und Insert auf das Gel aufgetragen und
Bandenstärken verglichen. Waren sie gleich intensiv, wurde für die Ligation das
Verhältnis von Vektor zu Insert 1:3 bis 1:6 gewählt. Waren die Banden nicht
gleich intensiv, wurde der Vektor entsprechend verdünnt.
Die DANN, Wasser und die Primer wurden gemischt und 10 min bei 65°C
inaktiviert, anschließend wurden sie mit 2 µl Ligationspuffer (1µl ATP und 9 µl
Puffer, MBI Fermentas, St. Leon-Roth, Deutschland), 1 µl T4-DNA-Ligase (lc)
(MBI Fermentas, St. Leon-Roth, Deutschland) versetzt und auf 20 µl mit dd H2O
aufgefüllt. Die Ligation erfolgte über Nacht bei 4-8°C.
2.3.7.1 Umklonierung des gp130-wt und der C→A-Mutanten in den
pM5NRF-Fus-Vektor
Für die Umklonierung des gp130-wt und der C→A-Mutanten in den pM5Nrf-Fus-
Vektor wurden sowohl der pm5NRF-Fus-Vektor als auch die pSVL-gp130-
Konstrukte mit den Enzymen XhoI und BamHI verdaut (1-2 h). Da der pm5NRF-
Fus-Vektor 2 BamHI-Schnittstellen aufweist, wurde der Vektor entweder nur 5-10
min verdaut und das ca. 6400 bp große Fragment isoliert oder 1 h verdaut und
18Material und Methoden
die beiden ca. 5000 und ca. 1400 bp große Fragmente isoliert. Die Auftrennung
der Fragmente erfolgte auf einem 0,8% Agarosegel. Es wurde außerdem das ca.
3000 bp große gp130-Fragment isoliert. Die Aufreinigung der DNA erfolgte
mittels DNA QIAquick Gel Extraktion Kit (QIAGEN GmbH, Deutschland) gemäß
den Angaben des Herstellers (siehe 2.3.6). Danach wurden die Fragmente ligiert
(siehe 2.3.7). Für die Differenzierung der sense/antisense-Klone (falls der
pm5NRF-Fus-Vektor 1 h verdaut wurde) erfolgte nach der Ligation ein
Kontrollverdau mit EcoRI und BbrPI (Eco72 I). Dabei entstanden bei der sense-
Orientierung ca. 8300 und 1000 bp große Fragmente, bei der antisense-
Orientierung hingegen wanderten die DNA-Banden auf der Höhe von 6000 und
3300 bp. Die genaue Lokalisation der Restriktionsstellen innerhalb des Vektors
kann den Abbildungen 5 bis 7 entnommen werden.
In dieser Arbeit erzeugte Konstrukte:
¾ pM5NRF-Fus-hgp130C→A711: das entstandene Konstrukt enthält das
gesamte gp130 mit der Mutation Cysteine gegen Alanin an der Stelle 711.
¾ pM5NRF-Fus-hgp130C→A725: das entstandene Konstrukt enthält das
gesamte gp130 mit der Mutation Cystein gegen Alanin an der Stelle 725.
¾ pM5NRF-Fus-hgp130C→A711/725 (Doppelmutante): das entstandene
Konstrukt enthält das gesamte gp130 mit den Mutationen Cystein gegen
Alanin an den Stellen 711 und 725.
19Material und Methoden
gp130-wt-pSVL
Abbildung 5: gp130-wt-pSVL Vektor
Abgebildet ist der gp130-wt-pSVL Vektor mit der IRES-, der GFP-Neomycin- und der
Ampicilinsequenz. Der Vektor enthält außerdem das gp130-wt Gen, mit der
Gesamtgröße von ca. 3000 bp. Die Größe des Vektors entspricht ca. 7700 bp. An den
Seiten sind die Endonukleaseschnittstellen mit der entsprechenden Lokalisation im
Vektor angegeben. Die Mutationsschnittstellen 711 und 725 sind ebenfalls in der gp130
Sequenz aufgeführt.
20Material und Methoden
pM5NRF-Fus
Abbildung 6: pM5NRF-Fus Vektor
Abgebildet ist der pM5NRF-Fus Leervektor mit der IRES-, der GFP-Neomycin- und der
Ampicilinsequenz. Die Größe des Vektors entspricht ca. 6500 bp. An den Seiten sind die
Endonukleaseschnittstellen mit der entsprechenden Lokalisation im Vektor angegeben.
Die Multikloningsite befindet sich am N-terminalen Ende der IRES-Sequenz.
21Material und Methoden
gp130-wt-pM5NRF-Fus
Abbildung 7: gp130-wt-pM5NRF-Fus Vektor
Abgebildet ist der gp130-wt-pM5NRF-Fus Vektor, der neben der gp130-wt Sequenz die
IRES-, die GFP-Neomycin- und die Ampiccilinsequenz enthält. Die Größe des Vektors
entspricht ca. 9900 bp. An den Seiten sind die Endonukleaseschnittstellen mit der
entsprechenden Lokalisation im Vektor angegeben. Die Mutationsschnittstellen 711 und
725 sind ebenfalls in der gp130 Sequenz aufgeführt.
2.4 Sequenzierung
Die Sequenzierung der Konstrukte wurde von der Firma GATC (Konstanz)
durchgeführt. Der Sequenzvergleich erfolgte mit der SPIN Software Version 2.0.
22Material und Methoden
2.5 Präparation der RNA und Synthese der cDNA mittels
Reverser Transkriptase
Die gesamt-RNA wurde mittels RNeasy® Mini Kit (QIAGEN, Hilden) nach
Angaben des Herstellers aus stabilen MDCK-Zellen isoliert. Dazu wurden die
konfluent gewachsenen Zellen trypsiniert, pelletiert und mit einer Kanüle im
Lysispuffer homogenisiert. Das Lysat wurde auf eine Säule gegeben, diese mit
dem Waschpuffer gewaschen und die RNA mit 30 µl Wasser (RNAse-frei) eluiert
und die RNA-Konzentration bestimmt. Die Proben wurden bis zur weiteren
Verwendung bei -20°C gelagert.
2.5.1 Synthese der cDNA aus Gesamt-RNA
Chemikalien:
- Revert AidTM HMinus M-MuLV Reverse Transkriptase (200 U/µl), Fermentas,
St. Leon-Roth
- 5x Puffer für die Revert Aid TM HMinus M-MuLV Reversen Transkriptase,
Fermentas, St. Leon-Roth
- dNTPs Nucleotid-Mix (je 10 mM), Promega, Mannheim
Mit Hilfe der Reversen Transkriptase wurden ca. 2 µg Gesamt-RNA in cDNA
umgeschrieben. Pipettierschema der Reaktion ist aus der Tabelle 2 zu
entnehmen. Die Reagenzien (ohne Enzym) wurden auf Eis in ein PCR-
Reaktionsgefäß pipettiert, kurz abzentrifugiert und 10 min bei 70°C denaturiert.
Danach wurde die Reversen Transkriptase zugegeben kurz gemischt und erneut
abzentrifugiert. Die Proben wurden 1 h bei 37 °C inkubiert und anschließend die
Reversen Transkriptase-Reaktion 10 min bei 70°C inaktiviert. Aus der
neusynthetisierten cDNA konnte nun gp130 mit spezifischen Primern amplifiziert
werden (siehe 2.5.2). Man erhielt 25 µl cDNA-Ansätze, davon wurden für weitere
PCR-Reaktion 2-4 µl eingesetzt.
23Material und Methoden
Tabelle 2: Pipettierschema für die cDNA-Synthese
Reagenzien Volumen
RNA (1 µg) 1 µl
dd H2O (RNAse-frei) 15 µl
Oligo-dT-Primer 1 µl
( Sequenz: `5 ttt ttt ttt ttt ttt ttt ttt ttt `3)
5x Puffer 5 µl
dNTPs 2 µl
Reverse Transkriptase 1 µl
Endvolumen 25 µl
2.5.2 Amplifizierung von gp130 und GapDH
Chemikalien:
- Primer, biomers.net, Ulm
- dNTPs Nucleotid-Mix (je 10 mM), Promega, Mannheim
- 5x Colorless GoTag Flexi Puffer, Promega, Mannheim
- GoTag DNA-Polymerase (5U/µl), Promega, Mannheim
- 10x PCR Buffer S (mit 15 mM MgCl), Genaxxon, Biberach
- Tag-Polymerase (5 U/µl), Genaxxon, Biberach
- DNA Marker: Gene Ruler DNA-Ladder 0,1-10 kb (bis 10 000 bp, #SM 0331),
MBI, Ferments
- DNA 6x Loading Buffer, Genaxxon, Biberach
GapDH (Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase) ist ein Enzym der
Glykolyse und zählt zu den Housekeeping Genen. Mit der Amplifikation von
GapDH kann überprüft werden, ob die cDNA-Synthese erfolgreich war. Die
Sequenz der verwendeten GapDH- und gp130-Primer ist in der Tabelle 3
aufgeführt. Die Reagenzien werden wie in der Tabelle 4 (GapDH) bzw. 6 (gp130)
angegeben pipettiert, gemischt und kurz abzentrifugiert. Die PCR-Bedingungen
sind aus den Tabellen 5 (GapDH) und 7 (gp130) zu entnehmen.
Die erwarteten DNA-Fragmente liegen bei der GapDH-PCR bei ca. 250 bp und
bei der gp130-PCR bei ca. 600 bp (siehe Abbildung 8 und 9).
Nach Ablauf der PCR wurden die Proben mit 2-3 µl DNA 6x Loading Buffer
versetzt, gemischt und auf Agarose-Gel geladen. Die Proben wurden wie unter
24Material und Methoden
2.3.5 beschrieben aufgetrennt. In der Abbildung 8 ist das Ergebnis der GapDH-
PCR gezeigt. Bei allen Proben konnte erwartungsgemäß eine GapDH-Bande bei
ca. 200-300 bp detektiert werden.
Tabelle 3: Sequenzen der GapDH- und gp130-Primer
Primer Sequenz Länge/bp Tm/°C GC-Gehalt
/%
GapDH-for `5 tca tct ctg ctc ctt ctg ct ´3 20 49 50
GapDH-rev `5 gcc tgc ttc act acc ttc ttg´3 21 51 52
gp130-for `5 g ggg cat gca tgt cat ctt cta 28 54 63
ggc caa ´3
gp130- rev `5 gga tcc cat gta gcc gcc tt 20 56 60
´3
Tabelle 4: Pipettierschema für Amplifizierung von GapDH
Volumen
Reagenzien MDCK gp130-wt Mutanten
5x GoTag Flexi-Puffer 2 µl 2 µl 2 µl
Wasser 6 µl 6 µl 7 µl
dNTPs (10 mM) 1 µl 1 µl 1 µl
GapDH-for 0,5 µl 0,5 µl 0,5 µl
GapDH-rev 0,5 µl 0,5 µl 0,5 µl
GoTag DNA-Polymerase 0,25 µl 0,25 µl 0,25 µl
(5U/µl)
Template/cDNA 2 µl 2 µl 4 µl
Gesamtvolumen 20 µl 20 µl 20 µl
Tabelle 5: PCR-Bedingungen für Amplifizierung von GapDH
Vorgang Temperatur Zeit Zyklen-Zahl
Initiale Denaturierung 95°C 4 min 1x
Denaturierung 95°C 45 s
Annealing 48°C 45 s 45x
Elongation 72°C 90 s
finale Elongation 72°C 5 min 1x
Aufbewahrung 4-8°C 9-18 h 1x
25Material und Methoden
M K wt 711 725 DM H2O
10000 bp→
6000 bp→
3000 bp→
1500 bp→
1000 bp →
500 bp →
200 bp → ← GapDH cDNA
Abbildung 8: GapDH-PCR zum Nachweis der cDNA-Synthese
Die Gesamt-RNA wurde aus stabil transfizierten MDCK-Zellen isoliert, 1 µg mittels
ReverseTranskriptase-PCR in cDNA umgeschrieben und in 30 µl RNAse-freiem Wasser eluiert.
Für die GapDH-PCR wurden 2-4 µl der cDNA eingesetzt, in Eppis pipettiert (Tabelle 4) und nach
den Bedingungen, die in der Tabelle 5 aufgeführt sind durchgeführt. In der ersten Spur ist der
Marker und in der 2 Spur die Kontrolle (MDCK-Zellen) aufgetragen. Die Spuren 3-6 sind mit
gp130-Wildtyp (wt), gp130C711A (711), gp130C725A (725) und der Doppelmutante (DM)
gp130C711/725A beladen. In der letzten Spur wurde die cDNA der MDCK-Zellen ohne die Primer
pipettiert. Dieser Reaktionsansatz diente als Negativkontrolle (H2O).
Tabelle 6: Pipettierschema für Amplifizierung von gp130 und C→A-Mutanten
Volumen
Reagenzien Vektor-DNA cDNA:
gp130-wt und Mutanten
10x PCR Tag-Polymerase 2 µl 2 µl
S Puffer (mit 15 mM MgCl)
Wasser 12,25 µl 13,25 µl
dNTPs (10 mM) 2 µl 2 µl
gp130-for 0,25 µl 0,25 µl
Gp130-rev 0,25 µl 0,25 µl
Tag Polymerase (5U/µl) 0,25 µl 0,25 µl
Template/cDNA 2 µl (ca. 20 ng) 2 µl
Gesamtvolumen 20 µl 20 µl
26Material und Methoden
Tabelle 7: PCR-Bedingungen für die Amplifizierung von gp130 und C→A-Mutanten
Vorgang Temperatur Zeit Zyklen-Zahl
Initiale Denaturierung 95°C 4 min 1x
Denaturierung 95°C 45 s
Annealing 61°C 45 s 40x
Elongation 72°C 90 s
finale Elongation 72°C 10 min 1x
Aufbewahrung 4-8°C 9-18 h 1x
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10000 bp→
6000 bp→
3000 bp→
1500 bp→
1000 bp →
600 bp → ← gp130 cDNA
Abbildung 9: Amplifikation von gp130-cDNA, invertierte Darstellung
Die RNA wurde aus stabil transfizierten MDCK-Zellen isoliert und 1µg mittels
ReverseTranskriptase-PCR in cDNA umgeschrieben. Für die GapDH-PCR wurden 2-4 µl der
cDNA (aus einem Ansatz von 30 µl) eingesetzt, in Eppis pipettiert (Tabelle 6) und nach den
Bedingungen, die in der Tabelle 7 aufgeführt sind durchgeführt. Die Proben wurden wie folgt
aufgetragen: 1: Marker, 2: pSVL-gp130-Vektor, 3: pM5-gp130-Vektor, 4: pSB6-gp130-Vektor, 5:
gp130-wt-MDCK-Zellen, 6: gp130C711A-MDCK-Zellen, 7: gp130C725A-MDCK-Zellen, 8:
gp130C711/725A-MDCK-Zellen (Doppelmutante), Wasser-Kontrolle.
27Material und Methoden
2.6 Kultivierung und Transfektion von eukaryontischen
Zellen
2.6.1 Kultivierung von eukaryontischen Zellen
Alle Zellen wurden bei 37°C, 5% CO2 und in einer mit Wasserdampf gesättigten
Atmosphäre in Gewebekulturschalen kultiviert. Das Medium wurde alle 2-4 Tage
gewechselt. Zum Passagieren oder zur Cryokonservierung wurden die Zellen 2x
mit 2 ml 1xPBS- (1 g KCl, 1 g KH2PO4, 40 g NaCl, 7,2 g Na2HPO4x2H2O, pH 7,2,
ad dd H2O 5l, autoklaviert) gewaschen und trypsiniert. Für alle MDCK-Zelllinien
wurde das hochkonzentrierte (0,25%/0,02%) Trypsin/EDTA, für alle anderen
Zellen das niedrigkonzentrierte (0,05%/0,02%) Trypsin/EDTA (Biochrom, Berlin)
verwendet. Anschließend wurde die Reaktion mit 2 ml frischem Medium
abgestoppt und die Zellen pelletiert. Zum Splitten wurden die Zellen in 5 ml
frischem Medium suspendiert, in einer gewünschten Verdünnung auf neue
Platten verteilt und mit Medium auf 7-10 ml aufgefüllt. Für die Cryokonservierung
wurde das Zellpellet einer Platte in 1 ml 10% DMSO/FCS suspendiert, in ein
Cryo (Nalgene Nunc, Wiesbaden, Deutschland) überführt und schrittweise
zunächst bei –20°C, dann bei –80 °C und anschließend im flüssigem N2
eingefroren. Die verwendeten Medien sind der Tabelle 8 zu entnehmen.
Tabelle 8: Verwendete Zelllinien und Kultivierungsmedien
Zelllinie Medium
Cos-7, Affennierenzellen DMEM (Dulbecco`s Modified Eagle
Medium) high glucose 4,5 g/l, 10%
FCS, 1% Penicillin/Streptomycin
3T3-L1, undifferenziert embryonale DMEM low glucose, 10% FCS, 1% P/S
Mäusefibroblasten
HepG2, humane Hepatomzellen DMEM-Ham`s F12, 10% FCS, 1% P/S
MDCK II, Madin-Darby canine DMEM high glucose 4,5 g/l, 10% FCS,
kidney 1% P/S
MDCK-wt-gp130-pCB6 (stabil) DMEM high glucose, 10% FCS,
500 µg/ml G418
MDCK-C→A711-gp130-pM5NRF- DMEM high glucose, 10% FCS, 1% P/S
Fus (stabil) 500 µg/ml G418
MDCK- C→A725-gp130-pM5NRF- DMEM high glucose, 10% FCS, 1% P/S
Fus (stabil) 500 µg/ml G418
MDCK-C→A711/725-gp130- DMEM high glucose, 10% FCS, 1% P/S
pM5NRF-Fus (stabil) 500 µg/ml G418
28Material und Methoden
2.6.2 Calcium-Phosphat-Transfektion von COS-7 und MDCK Zellen
Für die Transfektion einer 100 mm Zell-Platte wurden 10 µg DNA (bei
Kotransfektion: von jeder DNA je 5 µg) eingesetzt. Am Tag vor der Transfektion
wurden 2,5x106 Zellen pro 100 mm Platten ausgesät. Am Tag der Transfektion
wurde der DNA-Mix hergestellt (10 µg DNA, auf 440 µl Tris-HCl 10 mM pH 7,5
auffüllen) und dazu 60 µl 2M CaCl-Lösung zugegeben. Anschließend wurde in
einem weiteren Eppi ein HBS-Mix hergestellt, der aus 500 µl 2x HBS (Hepes-
buffered saline pH 7,1: 5 mM Hepes, 280 mM NaCl) und 10 µl Natriumphosphat
(70 mM Na2HPO4-Lösung mit 70 mM NaH2PO4-Lösung auf pH 6,8 einstellen)
bestand. Dann wurde der DNA-Mix langsam tropfenweise zum HBS-Mix
gegeben und unter Einleiten von steriler Luft (5x mit einer Pipettenspitze)
langsam miteinander vermischt und anschließend für 1-2 h erschütterungsfrei
präzipitiert. In der Zwischenzeit wurden die Zellen trypsiniert, das Pellet in 1 ml
10% FCS in DMEM suspendiert (ohne Antibiotika) und auf einer 100 mm Platte
gut verteilt. Die DNA wurde tropfenweise auf der Platte unter Schwenken verteilt.
Nach einer 20 minütigen Inkubation bei Raumtemperatur erfolgte die Zugabe von
350 µg Chloroquin in 3 ml Medium (DMEM, 10 % FCS). Danach wurden die
Zellen 6-8 h bei 37°C inkubiert und anschließend einem Glyzerinschock
unterzogen. Dazu wurde das Medium durch 3 ml 15% Glyzerinlösung (in HBS,
steril filtriert) ersetzt und die Platten für 2 min im Brutschrank bei 37°C inkubiert.
Daraufhin wurde die Lösung abgesaugt, die Platten 2x mit 2 ml PBS- gewaschen
und 8 ml frisches Medium auf die Zellen gegeben. Nach 24 h erfolgte entweder
ein Mediumwechsel oder die Passage der Zellen auf Deckgläschen.
Tabelle 9: Verwendete Konstrukte und Zelllinien bei der Transfektion
Zelltyp Transfektionstyp Vektoren Konstrukte
MDCK stabil pM5NRF-Fus gp130C→A-Mutanten
COS-7 transiente Caveolin mit pSVL-gp130C→A-Mutanten mit
Kotransfektion gp130 pECFP-Caveolin-1-CFP
COS-7 transiente Golgi mit pSVL-gp130C→A-Mutanten mit
Kotransfektion gp130 pECFP-Caveolin-1-CFP
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