Amylase-Aktivität im Serum
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Lab.med. 8: 262-267 (1984)
Bestimmung der -Amylase-Aktivität im Serum
mit p-Nitrophenyl- , D-maltoheptaosid als Substrat
0. Sonntag
Institut für Klinische Chemie l. Medizinische Hochschule Hannover
Zusammenfassung:
Die Bestimmung der x-Amylase-Aktivität wurde am EppendorfACP 5040 und am Röche Cobas Bio durchge-
führt. Der Vergleich zur Maltoietraose mit Patientenseren ergab eine gute Korrelation.
Bei der Verwendung von p-Nitrophenyl- , D-maltoheptaosid als Substrat zeigten sich am ACP 5040 folgende
Effekte:
a) bilirubinhaltige Seren (Bilirubin >30 / ) ergeben erniedrigte oc-Amylase-Aktivitäten,
b) ikterische Seren von Patienten unter Heparintherapie zeigen bei steigender Heparinkonzentration eine
Zunahme der a-Amy'läse-Aktivität
Am Cobas Bio lassen sich diese Effekte nicht nachweisen. Der Unterschied läßt sich durch die unterschiedli-
chen Photometerlampen beider Geräte erklären. Das Bilirubin wird durch die hohe Lichtintensität der Xenon -
Blitz-Lampe am Cobas Bio zerstört, und kann somit die Bestimmung der a-Amylase-Aktivität nicht mehr
stören.
Schlüsselwörter:
x-Amylase - p-Nitrophenylmaltoheptaosid - Maltotetraose - ACP 5040 - Cobas Bio - BHirubininterfe-
renz - Heparininterferenz
Summary:
The determination of o(.-amylase-activity was performed on both the Eppendorf ACP 5040 and the Röche
Cobas Bio. The comparison to maltotetraose with patient-serum showed a good correlation.
By using p-nitrophenyl-oL, D-maltoheptaoside äs Substrate, following results were obtained with the ACP
5040:
a) bilirubinemic serum (bilirubin > 30 / ) Iowered a-amylase-activity,
b) icteric serum from patients under hepar/n therapy showed an increase of oi-amylase-activity.
With the Cobas Bio these effects could not be detected. The difference is to be explained by the different
photometric lamps of both Instruments. The bilirubin is destroyed by the high light-intensity of the xenon-
flash-lamp ofthe Cobas Bio and therefore the determination of a-amylase-activity can not be disturbed.
Keywords:
x-amylase - p-nitrophenylmaltoheptaoside - maltotetraose - ACP 5040 - Cobas Bio - bilirubin -
interference - heparin-interference
Einleitung Prinzip (vereinfacht):
p-Nitrophenylmaltoheptaosid «-Amylase ) p-Nitrophenyl-
Die Bestimmung der a-Amylase (EC 3.2.1.1; ot-1,4-Glu- maltosid + p-Nitrophenylmaltotriosid + p-Nitrophenyl-
can-4-glucanohydrolase)-Aktivität wird hauptsächlich maltotetraosid + Oligosaccharide;
bei Verdacht auf eine akute Pankreatitis und als Nachweis
eines entzündlichen Schubes bei der chronischen Pan- p-Nitrophenylmaltosid + p-Nitrophenylmaltotriosid —
kreopathie durchgeführt. g-Giucosidase) p-Nitrophenol + Glucose.
Als neues Substrat für die Bestimmung der a-Amylase- Die Freisetzung von p-Nitrophenol wird in einem kineti-
Aktivität wurde 1981 p-Nitrophenyl- , D-maltoheptaosid schen Verfahren bei 405 nm registriert. Die Berechnung
(PNP-G7) vorgestellt (1,2). Das Prinzip dieser Methode erfolgt über das Spaltmuster unter Berücksichtigung, daß
basiert auf der Spaltung von PNP-G7 durch Amylase aus einem Mol Substrat 0,35 Mol p-Nitrophenol gebildet
in p-Nitrophenylmaltosid, p-Nitrophenylmaltotriosid, p- werden (3, 4). Die getestete Methode ist nach Henkel et
Nitropnenylmaltotetraosid und Oligosaccharide. Gebil- al.(5) modifiziert.
detes p : Nitrophenylmaltosid und p-Nitrophenylmaltote-
traosid werden in einem zweiten Schritt durch Zum Methodenvergleich wurde das Substrat Maltote-
-Glucosidase in p-Nitrophenol und Glucose gespalten. traose (6) herangezogen. Bei diesem Verfahren spaltet die
262 Lab.med. 8: 262 (1984)-Amylase Maltotetraose in 2 Mol Maltose. Die gebildete Geräteeinstellungen
Maltose wird durch Maltosephosphorylase (MP) in Glu-
cose und Glucose-1 -phosphat überführt. In einem weite- PNP-G7 Malto-
ren Schritt wird aus Glucose-1-phosphat durch ß-Phos- tetraose
phoglucomutase (ß-PGM) Glucose-6-phosphat gebil- Temperatur eC 25 25
det. Glucose-6-phosphat und NAD reagieren in Gegen- Takt sec. 20 30
wart von Glucose-6-phosphatdehydrogenase (G-6- Wellenlänge 405 334
PDH) zu 6-Phosphogluconat und NADH. Abgleich 0,0 0,0
Faktor 6878 2104
Rotordrehung 1 1
Prinzip (vereinfacht): Startposition 12 12
Maltotetraose + H 2 O. g>Amylase ) 2 MaltOSe; Volumen Pos/ 1 250 250
M Volumen Pos/ 2 10 10
Maltose + *> >Glucose + ß-Glucose 1 -phosphat; Volumen Pos/ 5 0 0
ß-Glucose-1-phosphat ß-pGM > Glucose-6-phosphat;
Glucose-6-phosphat + NAD + G-S-PDH , 6-Phospho- Auflösungen des Reagenzes nach Vorschrift der Hersteller.
gluconat + H+ + NADH.
Cobas Bio, Fa. Hoffmann-La Röche AG, 7889 Grenzach-
Das entstandene NADH kann photometrisch bei 334,340 Whylen
oder 366 nm gemessen werden. Die Berechnung erfolgt
über den molaren Extinktionskoeffizienten von NADH, Geräteeinstellungen
mit der Berücksichtigung, daß aus 1 Mol Maltotetraose
im Reaktionsansatz 2 Mol NADH gebildet werden (7). PNP-G7 Malto-
tetraose
Der folgende Bericht zeigt die Erfahrungen mit dem Sub-
strat p-Nitrophenyl- , D-maltoheptaosid auf. Zum bisher 1 Units U/L U/L
in der Literatur beschriebenen Bilirubineffekt wird Stel- 2 Calculation factor 6614 2023
3 Standard 1 conc. 0 0
lung bezogen und mit Hilfe eigener Untersuchungen eine 4 Standard 2 conc. 0 0
Klärung dieser Problematik versucht. 5 Standard 3 conc. 0 0
6 Limit 0,3 0,75
7 Temperature (Dec. C) 25,0 25,0
8 Type of analysis 2 2
Material und Methoden 9 Wavelength (NM)
10 Sample volume (UL)
405
10
334
10
Testmethode (PNP-G7) modifiziert nach Henkel et al. 11 Diluent volume (UL) 20 50
12 Reagent volume (UL) 200 150
(5). 13 Incubation time (sec.) 0 0
Substrat: p-Nitrophenyl- , D-maltoheptaosid. 14 Start reagent volume (UL) 0 0
1 5 Time or first reading (sec.) 300 600
Reagenz: M + D Amylase PNP-G7, Best.-Nr. 140004, 16 Time interval (sec.) 10 10
Fa. AHS Deutschland Bereich Merz & Dade, 8000 Mün- 1 7 Number of readings 12 12
chen 50. 18 Blänking mode 0 0
1 9 Print mode 1 1
Konzentration'im Test: Phosphatpuffer, 100 mmol/l, pH
6,5, Natriumchlorid 25 mmol/l, p-Nitrophenyl- , D-mal-
toheptaosid 1,6 mmol/l, a-Glucosidase 300 U/l, Stabili- Auflösen der Reaktionslösung:
satoren. PNP-G7 mit 30,5 ml bidest. H20, Maltotetraose mit
11,5 ml bidest. H20.
Vergleichsmethode
Substrat: Maltotetraose. Weitere Geräte
Reagenz: EnzAmyl-K, Best.-Nr. 84793, Fa. Gödecke AG, DMR 21, Fa. Zeiss, 7082 Oberkochen, UV-Strahler, Min
7800 Freiburg. UVIS, Fa. Desaga, 6900 Heidelberg,
ACA IN, Fa. Du Pont de Nemours, 6350 Bad Nauheim;
Konzentration im Test: Phosphatpuffer, 50 mmol/l, pH Methode: TBIL zur Bestimmung von Gesamt-Bilirubin
6,6 ± 0,15 (30°C), Maltotetraose 5 g/l, NAD 4 2,5 mmol/ (8).
l. Maltosephosphorylase 3000 U/l (37°C), ß-Phospho-
glucomutase 1000 U/l (37°C), Glucose-6-phosphatde- SMAC, Fa. Technicon GmbH, 6368 Bad Vilbel; Metho-
hydrogenase 6000 U/l (30°C). den: Glucose-Hexokinase, Technicon Nr. SG4-
0046 FG8 (9); Protein-Biuret, Technicon Nr. SG4-
0014PC6 (1-0) und Gesamt-Bilirubin, Technicon Nr.
Reagenzien für die Bilirubininterferenz- Studie SG4-0018FJ6 (8).
1. Bilirubin, Best.-Nr. 24520.
2. 1 N NaOH, Best.-Nr. 9135. Probenmaterial
Für den Methodenvergleich wurden 113 visuell unauffäl-
(1 + 2 von Fa. Merck, 6200 Darmstadt) lige (nicht hämolytische ikterische oder lipämische) Pa-
3. 7%ige Albuminlösung; 70g Humanalbumin ad 1 l tientenseren verwendet. Die Bestimmung der a-Amylase-
H20 bidest, Humanalbumin, Best.-Nr. ORHA 20/21 (Fa. Aktivität erfolgte innerhalb von 4 Std. nach Probenahme;
Behring, 3550 Marburg). um Verdunstungseffekte zu vermeiden, wurden die Seren
in verschlossenen Gefäßen aufbewahrt.
Geräte Zur Qualitätskontrolle und zur Ermittlung der Präzision
ACP 5040, Fa. Eppendorf Gerätebau GmbH, 2000 Ham- von Tag zu Tag über 10 Tage, wurden 5 verschiedene
burg 63. Kontrollseren verwendet. Monitrol IE, Best.-Nr. LTD-178
Lab.med 8: 263 (1984) 263und Monitrol II E, Best.-Nr. B 5113 (AHS Deutschland Statistische Auswertung
Merz + Dade GmbH. 8000 München 50), Validate A, Die statistische Auswertung erfolgte durch Mitteiwertbil-
Best.-Nr. 917623 und Validate N, Best.-Nr. 917613 (Gö- dung (x), Berechnung der Standardabweichung (s), des
decke AG, 7800 Freiburg) und Serodos, Best.-Nr. Variationskoeffizienten (Vk) in Prozent der standardisier-
580951 (Boehringer Ingelheim, 8046 Garching). Für die ten Hauptkomponentenanalyse (y = ax + b) und des
Ermittlung der Präzision in der Serie wurden unterschied- Korrelationskoeffizienten (r) (11,12).
liche Patientenseren verwendet.
Für die Überprüfung der Linearität wurde Humanspei-
chelamylase verwendet. Der Speichel wird nach der Zen-
trifugalion mit 0,85%iger NaCI entsprechend der ge- Ergebnisse
wünschten 3-Amylase-Aktivität verdünnt.
Präzision
Interferenzstudie Die Präzision in der Serie schwankte mit einem Varia-
tionskoeffizienten von 0,78 bis 5,58% für den ACP 5040
Ein möglicher Einfluß endogener Chromogene (Bilirubin, und von 0,41 bis 2,35% für den Cobas Bio (Tab. 1). Die
Hämoglobin, Trübung durch Triglyceride), wurde unter- Präzision von Tag zu Tag schwankte zwischen einem
sucht. Zusätzlich erfolgten Aufstockversuche mit Biliru- Variationskoeffizienten von 2,1 und 6,1% für den ACP
bin. 2 mg Bilirubin wurden mit 25 1 N NaOH und 5040 und von 1,9 und 4,1 % für den Cobas Bio (Tab. 2).
500 7%iger Albuminlösung aufgelöst, anschließend
mit 7%iger Albuminlösung auf 2 ml aufgefüllt. Aus dieser
Stammlösung konnte eine Verdünnungsreihe hergestellt Richtigkeit
werden, die innerhalb von 20 min weiterverarbeitet wer- Beim Vergleich der Kontrollserensollwerte mit den Meß-
den muß. Die Lösungen sind vor direktem Lichteinfall zu werten wurden negative Abweichungen zwischen 6,2
schützen. und 10,0% gefunden. Die Abweichungen waren am ACP
Der Einfluß von Glucose und Protein wurde mit verschie- 5040 und Cobas Bio gleich groß.
denen Patientenseren geprüft. Glucose wurde zusätzlich
den Patientenproben zugesetzt, um extrem hohe Gluco- Methoden vergleich
sekonzentrationen zu erzeugen.
Der Vergleich mit visuell unauffälligen Patientenproben
Der Heparineinfluß wurde auf zwei verschiedenen Wegen ergab eine gute Übereinstimmung beider Methoden
untersucht. Nach Abnahme der Probe wurde diese aufge- (Abb. 1). Für den Cobas Bio wurde keine graphische
teilt, der eine Teil mit Heparinzusatz, der andere ohne Darstellung angefertigt; die statistische Auswertung mit
Zusatz (in vitro Versuch). Serum von Patienten, die unter der standardisierten Hauptkomponentenanalyse ergab:
einer Heparintherapie standen, wurde zusätzlich heran- n = 113; r = o,99; = 25,25; y = 83,02; y = 3,66x-
gezogen (in vivo Versuch). 9,76.
Tab. 1: Präzision in der Serie (n = 20 Bestimmungen) an 3 Tagen
von verschiedenen Patientenseren (visuell unauffällig), Amylase Linearität
PNP-G7-Methode (am Cobas Bio wurden andere Patientense- Die Methode ist bis zu einer oc-Amylase-Aktivität von
ren verwendet als am ACP 5040)
1000 U/l, am ACP 5040 und Cobas Bio, linear.
Gerät 1-Tag 2. Tag 3. Tag
1
x ) VK ) 2
x VK x VK Interferenz durch endogene Serumbestandteile
Ein Einfluß durch Protein (30-100 g/l) und Triglyceride
ACP 5040 42,4 5,58 87,3 3,72 51,2 4,93 bis 15,0mmol/l auf die a-Amylase-Aktivitätsbestim-
243,4 0,78 152,3 2,03 279,3 0,83 mung wurde nicht beobachtet. Glucosekonzentrationen
127,4 0,78 56,1 2,35
über 60 mmol/l führen zu einer Erniedrigung der oc-Amy-
Cobas Bio 127,6 1,01
lase-Aktivität; dieser Effekt tritt sowohl in wäßrigen als
227,2 0,58 241,3 0,42 302,3 0,41 auch in proteinhaltigen Proben auf (Abb. 2). Hämoglobin
1
) x = Mittelwert in U/l führt ab 2,5 g/l zu falsch erniedrigten oe-Amylase-Aktivi-
2
) VK * Variationskoeffizient in % täten.
Tab. 2: Präzision von Tag zu Tag (n= 10 Tage), a-Amylase-Aktivität bestimmt mit der PNP-G 7-Methode am ACP 5040 und Cobas
Bio
Kontrollserum Charge Cobas Bio ACP 5040
2 3
Sollwert VK ) ) Sollwert x VK
U/l U/l U/l U/l
Monitrol l 169 150 136 1,9 -10,0 150 135 2,1 -10,0
Monitrol II 68 650 609 2,3 - 6.7 650" 610 3,5 - 6,2
Validate A 2657051 250 2,2 - 251 2,8 -
Validate N 2235110 50 4.1 - • 49 6,1 -
Serodos 4529 137 3,2 - 136 3,9 -
2 3
') = Mittelwert. ) VK = Variationskoeffizient, ) « Abweichung vom Sollwert
264 Lab.med. 8: 264 (1984)WwM ^iSSSS'
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XIIBilirubinkonzentrationen über 30 / zeigen am ACP
5040 eine Beeinflussung der a-Amylase-Aktivitätsbe-
stimmung. Mit steigendem Bilirubingehalt nimmt die
a-Amylase-Aktivität ab (Abb. 3, 4). Je kleiner die a-
Amylase-Aktivität, um so ausgeprägter ist der Bilirubin-
einfluß. Am Cobas Bio wird dieser Effekt nicht beobachtet
(Abb. 5). Die Ursache für diese Differenz liegt in der Ver-
wendung einer Xenonblitzlampe am Cobas Bio, während
am ACP 5040 eine Quecksilberdampflampe installiert ist.
Die Lichtintensität der Xenonblitzlampe beträgt 5 W, die
der Quecksilberdampflampe 5-50 \ Durch die hohe
Lichtintensität wird das Bilirubinmolekül im Reaktion-
sansatz zerstört (Abb. 6). Vermutlich erfolgt die Spaltung
in der Molekülmitte, und es entstehen Dipyrole, die die
Reaktion nicht beeinflussen.
Läßt man ikterische Proben vor der Messung 10 min von
UV-Licht (Min UVIS, = 366 nm, 8 W, Abstand Licht-
quelle-Probe 15cm) bestrahlen, ergeben sich am ACP
5040 und am Cobas Bio identische Werte (Tab. 3). Unter-
sucht man in den bestrahlten Proben den Bilirubingehalt
am ACA III oder am SMAC mit Hilfe der Jendrassik-Grof-
Methode, findet man eine Abnahme der Bilirubinkonzen-
Abb. 1: Patientenvergleich mit visuell unauffälligen Proben am tration von etwa 3-6%. Die Abnahme ist so gering, da
ACP 5040. n = 113; r = 0,99; = 25,29 U/l; y = 82.98 U/l; mit der Jendrassik-Grof-Methode auch die Spaltpro-
standardisierte Hauptkomponentenanalyse: y - 3,67x-9,83 dukte des Bilirubins mitbestimmt werden. M ißt man direkt
den Bilirubinfarbstoff mit Hilfe des Spektralphotometers
D M R 2 1 , kann eine deutliche Abnahme des Bilirubins
beobachtet werden (Abb. 6). Die gleichen Ergebnisse
lassen sich erzielen, wenn man die Proben direkt in die
Küvetten des Cobas Bio gibt und bestrahlen läßt.
u/i
a-Amylase Mit Heparin gewonnenes Plasma (750 mg Heparin/l),
sowie visuell unauffälliges Serum von Patienten, denen
Heparin verabreicht wurde, war unauffällig. Ikterisches
Serum von Patienten unter Heparintherapie zeigten am
ACP 5040 eine Aufhebung der oben beschriebenen Bili-
rubininterferenz. Mit steigender Heparinkonzentration
nimmt der Bilirubineinfluß ab. Dieser Effekt wird zur Zeit
weiter abgeklärt.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
mmol/l Glucose
Abb. 2: Einfluß der Glucose auf die PN P-G 7-Methode
(O O^ und die Maltotetraose-Methode (#· #) am ACP
5040 und Cobas Bio
u/l
-Amylase
260
240
220
200
180
160
140
120
100
0 100 200 300 400 500 600
/ Bilirubin
Abb. 4: Überprüfung der Abhängigkeit bei 55 Patientenproben
mit verschiedenen Bilirubinkonzentrationen am ACP 5040
Abb. 3: Einfluß von Bilirubin auf die PNP-G 7-Methode am ACP MeßwertPNP-G7
5040 (O O; und Cobas Bio (* #) in zwei unterschied-
lichen Proben (Aufstockversuch) Meßwert Maltotetraose
Lab.med. 8: 265 (1984) 265Diskussion thodenvergleich mit visuell unauffälligen Seren konnte
eine gute Korrelation zwischen der PNP-G7- und der
Übereinstimmend mit anderen Untersuchern (5,13) zeigt Maltotetraose-Methode gefunden werden. Protein (30-
die Bestimmung der -Amylase-Aktivität mit dem Sub- 100 g/l) und Triglyceride bis 15 mmol/l zeigen keine Be-
strat p-Nitrophenyl-x o-maltoheptaosid eine gute Präzi- einflussung der Methode. Glucose über 60 mmol/l und
sion und eine zufriedenstellende Richtigkeit. Beim Me- Hämoglobin über 2,5 g/l (14) führen zu falsch niedrigen
a-Amylase-Aktivitäten.
Bilirubin über 30 / führt zu einer Erniedrigung der
-Amylase-Aktivität, wenn die Bestimmung am ACP
5040 (Quecksilberdampflampe) durchgeführt wird. Er-
folgt die Bestimmung am Cobas Bio (Xenonblitzlampe)
stört Bilirubin bis 750 / nicht. Dieser in der Literatur
(4,13,15-17) unvollständig beschriebene Effekt wurde
mit Hilfe von Aufnahmen des Spektrums des Bilirubins
vor und nach Bestrahlung mit UV-Licht bzw. Xenonblitz-
lampe geklärt. Werden ikterische Seren vor der Bestim-
mung längere Zeit einem Lichteinfluß (Tageslicht Kunst-
licht) oder bei der photometrischen Messung mit hoher
Lichtenergie (Xenonblitzlampe) unterworfen, tritt ein
verminderter bzw. nicht feststellbarer Bilirubineffekt auf.
Bei frischen unbehandelten ikterischen Seren und photo-
metrischer Messung mit niedriger Lichtenergie (Queck-
silberdampflampe) tritt ein deutlicher Bilirubineinflußauf.
Je geringer die -Amylase-Aktivität der Proben, um so
ausgeprägter ist die Bilirubininterferenz.
Ein bisher noch nicht beschriebener Effekt ist der Einfluß
von Heparin auf die oben genannte Bilirubininterferenz.
Ikterische Seren von Patienten, denen aus therapeuti-
schen Gründen Heparin verabreicht wurde, zeigen eine
Abb. 5: Überprüfung der Abhängigkeit bei 28 Patientenproben Aufhebung der Bilirubininterferenz. Es wurden unabhän-
mit verschiedenen Bilirubinkonzentrationen am Cobas Bio gig von der in der Probe vorhandenen Bilirubinkonzentra-
Meßwert PNP-G7 tion sowohl am ACP 5040 als auch am Cobas Bio identi-
Meßwert Maltotetraose sche -Amylase-Aktivitäten gefunden.
Extinktion Extinktion
i L
vor Bestrahlung nach Bestrahlung
0,4 0,4
0,3 0,3
0,2 0,2
0,1 0,1
0,0 0,0
600 500 400 300 600 500 400 300
nm nm
Abb. 6: Spektren von Bilirubin vor und nach der Bestrahlung (5 min) mit UV-Licht (368 nm)
266 Lab.med. 8: 266 (1984)Tab. 3: Proben mit verschiedenen BHirubingehalten vor und nach der Bestrahlung mit UV-Licht (368 nm). Bestrahlungsdauer 10 min
* Gesarntbilirubin * ot-Amylase-Aktivität (PNP-G7-Methode)
/ U/l
ACP 5040 Cobas Bio
vor nach vor nach vor nach
der Bestrahlung der Bestrahlung der Bestrahlung
15 13 176/175 175/176 174/173 176/176
118 110 158/159 . 172/176 175/174 175/176
218 205 144/145 175/171 175/175 176/175
329 317 136/135 172/174 173/171 175/176
428 414 130/132 174/176 173/174 175/176
* Bestimmt am ACA III und SMAC (Mittelwert aus Doppelbestimmungen)
Der Zusatz von Heparin in Serum (in vitro) zeigt keinen 8. JEN D R ASSI K, L. GROF, P.: Vereinfachte photometrische Methode zur Bestim-
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