HLA-E als prognostisches und potentiell therapeutisches Zielmolekül bei Non-Hodgkin Lymphomen

HLA-E als prognostisches und potentiell
therapeutisches Zielmolekül bei Non-Hodgkin
 Lymphomen

 Inaugural-Dissertation

 zur

 Erlangung des Doktorgrades

 Dr. rer. nat.

 der Fakultät für

 Biologie

 an der

 Universität Duisburg-Essen

 vorgelegt von

 Bettina Patricia Wagner

 aus Essen

 August 2020

Die der vorliegenden Arbeit zugrunde liegenden Experimente wurden am Institut für
Transfusionsmedizin des Universitätsklinikums Essen durchgeführt.
1. Gutachter: PD Dr. Vera Rebmann

2. Gutachter: Prof. Dr. Alexander Schramm

3. Gutachter: Prof. Dr. Rainer Blasczyk

Vorsitzender des Prüfungsausschusses: Prof. Dr. Fleischhauer

Tag der mündlichen Prüfung: 19.03.2021

Alle Rechte vorbehalten

 Diese Dissertation wird via DuEPublico, dem Dokumenten- und Publikationsserver der
 Universität Duisburg-Essen, zur Verfügung gestellt und liegt auch als Print-Version vor.

 DOI: 10.17185/duepublico/74195
 URN: urn:nbn:de:hbz:464-20210419-112425-1

 Alle Rechte vorbehalten.

 2

Vermerk
Teilergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden veröffentlicht:

Wagner B, Dührsen U, Hüttmann A, Nückel H, Michita RT, Rohn H, Schramm S,
Horn PA, Rebmann V. Genetic Variants of the NKG2C/HLA-E Receptor-Ligand Axis
Are Determinants of Progression-Free Survival and Therapy Outcome in Aggressive
B-Cell Lymphoma. Cancers (Basel). 2020 Nov 18;12(11):3429. doi:
10.3390/cancers12113429. PMID: 33218185; PMCID: PMC7699209.

Wagner B, da Silva Nardi F, Schramm S, Kraemer T, Celik AA, Dürig J, Horn PA,
Dührsen U, Nückel H, Rebmann V. HLA-E allelic genotype correlates with HLA-E
plasma levels and predicts early progression in chronic lymphocytic leukemia.
Cancer. 2017 Mar 1;123(5):814-823. doi: 10.1002/cncr.30427. Epub 2016 Nov 2.
PMID: 27859015.

 3

Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis………………………………………………………………….VI
Abbildungsverzeichnis…………………………………………………………………..VII
Tabellenverzeichnis……………………………………………………………………..VIII

1. Einleitung........................................................................................................... 11
 1.1. Non-Hodgkin Lymphome ..................................................................................... 11
 1.1.1. Epidemiologie ................................................................................................................. 11
 1.1.2. Die chronisch lymphatische Leukämie ............................................................................ 12
 1.1.3. Die diffus großzelligen B-Zell Lymphome ....................................................................... 14

 1.2. Tumorerkennung, Eliminierung und „Escape“ .................................................. 15
 1.3. Die Tumor-Mikroumgebung ................................................................................. 17
 1.3.1. Extrazelluläre Vesikel ...................................................................................................... 18

 1.4. Humane Leukozyten Antigene ............................................................................ 21
 1.4.1. HLA-E als mögliches Zielmolekül bei NHL ..................................................................... 22
2. Zielsetzung ........................................................................................................ 26
3. Material und Methoden ..................................................................................... 27
 3.1. Material .................................................................................................................. 27
 3.2. Kollektiv ................................................................................................................. 32
 3.2.1. Patientenkollektiv der CLL .............................................................................................. 32
 3.2.2. Vergleichskollektiv der CLL ............................................................................................. 33
 3.2.3. Patientenkollektiv der aggressiven B-NHL ...................................................................... 33
 3.2.4. Vergleichskollektiv der aggressiven B-NHL .................................................................... 35

 3.3. Methoden ............................................................................................................... 35
 3.3.1. Isolierung von mononukleären Zellen aus peripherem Blut ............................................ 35
 3.3.2. Bestimmung der Zellzahl und Vitalität ............................................................................. 35
 3.3.3. Einfrieren und Auftauen von Zellen ................................................................................. 36
 3.3.4. DNA Isolierung und Quantifizierung ................................................................................ 36
 3.3.5. Genotypisierung von HLA-E ........................................................................................... 37
 3.3.6. ELISA-basierte Quantifizierung von sHLA-E .................................................................. 37
 3.3.7. Koppeln von HLA-E Molekülen aus dem Blutplasma an Mikrobeads ............................. 37
 3.3.8. Isolation von NK-Zellen ................................................................................................... 38
 3.3.9. Analyse der NK Zellfunktion ............................................................................................ 38
 3.3.10. ELISA-basierte Quantifizierung von TGF-β ................................................................ 38
 3.3.11. Isolation von extrazellulären Vesikeln......................................................................... 39
 3.3.12. Detektion der HLA-E Oberflächenexpression ............................................................. 39

 3.4. Statistische Analyse ............................................................................................. 39
4. Ergebnisse......................................................................................................... 41
 4

4.1. Analyse von HLA-E bei Patienten mit CLL und Kontrollen .............................. 41
 4.1.1. Vergleich der HLA-E*01:01/HLA-E*01:03 Frequenzen bei CLL Patienten und Kontrollen
 ……………………………………………………………………………………………………41
 4.1.2. HLA-E*01:03 Status ist mit dem 5-Jahres PFS der CLL assoziiert ................................ 41
 4.1.3. Der HLA-E*01:03 positive Status ist mit einer IGVH Mutation und einer 13q14 Deletion
 assoziiert ...................................................................................................................................... 43
 4.1.4. Der HLA-E*01:03 Status ist ein prädiktiver Marker für die 5-Jahres PFS der CLL
 Patienten ...................................................................................................................................... 44
 4.1.5. Der HLA-E*01:03 Status ist mit einer erhöhten HLA-E Oberflächenexpression auf B-
 Zellen assoziiert ........................................................................................................................... 45
 4.1.6. Erhöhte sHLA-E Konzentrationen bei CLL Patienten im Binet Stadium C ..................... 46
 4.1.7. Erhöhte sHLA-E Konzentrationen sind mit einem reduzierten 5-Jahres PFS assoziiert 48
 4.1.8. sHLA-E Konzentrationen sinken nach Therapie ............................................................. 49
 4.1.9. Suppressiver Effekt von sHLA-E auf die NK-Zell-Aktivität .............................................. 50
 4.1.10. Der HLA-E*01:03 Status ist mit einer erhöhten sHLA-E Konzentration von CLL
 Patienten assoziiert ...................................................................................................................... 53

 4.2. Analyse von HLA-E bei Patienten der aggressiven B-NHL .............................. 55
 4.2.1. Vergleich der HLA-E*01:01/HLA-E*01:03 Frequenzen bei Patienten mit aggressiven B-
 NHL und Kontrollen ...................................................................................................................... 55
 4.2.2. Der HLA-E*01:01 positive Status ist mit einer kompletten Remission der Patienten mit
 aggressiven B-NHL assoziiert ...................................................................................................... 57
 4.2.3. Erhöhte sHLA-E Konzentrationen bei Patienten mit aggressiven B-NHL ....................... 58
 4.2.4. Assoziation von sHLA-E und sHLA-E EV mit den prognostischen Parametern der
 Patienten mit aggressiven B-NHL ................................................................................................ 60
 4.2.5. Erhöhte sHLA-E Konzentrationen sind mit einem längeren 5-Jahres OS assoziiert ...... 62
 4.2.6. Keine Assoziation des HLA-E*01:01 Status mit sHLA-E Konzentrationen ..................... 65
5. Diskussion ......................................................................................................... 67
 5.1. HLA-E trägt zur Progression der CLL bei ........................................................... 67
 5.2. HLA-E ist ein schützender Faktor bei aggressiven B-NHL ............................... 70
6. Zusammenfassung ........................................................................................... 76
7. Summary............................................................................................................ 77
8. Literaturverzeichnis .......................................................................................... 78
9. Anhang............................................................................................................... 85
 9.1. Protokoll zur Genotypisierung von HLA-E ......................................................... 85
 9.2. Danksagung .......................................................................................................... 87
 9.3. Lebenslauf ............................................................................................................. 88
 9.4. Eidesstattliche Erklärung ..................................................................................... 89

 5

Abkürzungsverzeichnis
ABC Aktiviertes B-Zell ähnliches Lymphom
APC antigenpräsentierende Zellen
APC Allophycocyanin
AUC Fläche unter der Kurve
BSA Rinderserumalbumin
B2m beta2-Mikroglobulin
CLL Chronisch lymphatische Leukämie
CR komplette Remission
DLBCL Diffus großzelliges B-Zell Lymphom
DMSO Dimethylsulfoxid
ECOG Eastern Co-operative Oncology Group
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest
EV Extrazelluläre Vesikel
FCS Fetales Kälberserum
GCB Keimzentrums-B-Zell ähnliches Lymphom
HLA Humanes Leukozyten Antigen
HLA-E Humanes Leukozyten Antigen-E
HLA-G Humanes Leukozyten Antigen-G
HL Hodgkin Lymphome
DAPI 4´, 6-Diamidino-2-phenylindol
DNA Desoxyribonukleinsäure
EDTA Ethylendiamintetraacetat
FITC Fluoresceinisothiocyanat
FSC Forward scatter
HZ Hämatopoetische Zellen
IL Interleukin
ILT Immunoglobulin-ähnliche Transkripte
IFN-γ Interferon-gamma
iPET interim PET
IPI Internationaler Prognostischer Index
mAK Monoklonaler Antikörper
MFI Mediane Fluoreszenzintensität
MHC Haupthistokompatibilitätskomplex
MSC Mesenchymale Stromazellen
NKG2D Natürliche Killer Zell Gruppe 2 Mitglied D Rezeptor
NHL Non-Hodgkin Lymphom
n.s. nicht signifikant
PCR Polymerase Kettenreaktion
SSP Sequenz Spezifische Primer
PBL Periphere Blutlymphozyten
PD Progressive Erkrankung
PE Phycoerythrin
PET Positronen-Emissionstomographie
PETAL Positronen-Emissionsgesteuerte Therapieoptimierungsstudie aggressiver NHL
PR Partielle Remission
rpm Umdrehungen pro Minute
RT Raumtemperatur
RNA Ribonucleinsäure
SD Standardabweichung
SD Stabile Erkrankung
SEM Durchschnittsfehler der Standardabweichung
TGF-b Tumornekrosefaktor-beta
TNF-a Tumornekrosefaktor-alpha
Treg Regulatorische T-Zellen
sHLA lösliches Humanes Leukozyten Antigen
sHLA-E lösliches HLA-E
sHLA-E EV lösliches HLA-E in extrazellulären Vesikeln
TMB 3,3’,5,5’- Tetramethylbenzidin

 6

OS Gesamtüberleben
PFS Progressionsfreies Überleben
VEGF Vaskulärer epidermaler Wachstumsfaktor
vs. versus

 7

Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Häufigste Tumorlokalisationen in Deutschland 2016 ........................................ 12
Abbildung 2: Tumor-Immun-Editing ........................................................................................ 16
Abbildung 3: Einfluss der Mikroumgebung auf zentralen Eigenschaften eines Tumors......... 17
Abbildung 4: Inhalt der Exosomen.......................................................................................... 20
Abbildung 5: Schematische Darstellung der Humanen Leukozytenantigene ......................... 21
Abbildung 6: HLA-E Signalweiterleitung ................................................................................. 24
Abbildung 7: Kaplan-Meier-Kurvenanalyse der HLA-E Genotypen bei CLL Patienten .......... 42
Abbildung 8: Assoziation von HLA-E*01:03 pos. Status mit reduzierten 5-Jahres PFS......... 42
Abbildung 9: Wald-Diagramm der Risikofaktoren für 5-Jahres PFS der CLL Patienten ........ 44
Abbildung 10: Erhöhte HLA-E Oberflächenexpression auf HLA-E*01:03 positiven B-Zellen . 45
Abbildung 11: Vergleich der sHLA-E Konzentrationen von CLL Patienten und Kontrollen .... 46
Abbildung 12: Erhöhte sHLA-E Konzentrationen mit fortgeschrittenem Binet Stadium bei
Diagnose ................................................................................................................................ 46
Abbildung 13: ROC-Kurvenanalyse der sHLA-E Konzentration bei CLL Patienten ............... 48
Abbildung 14: Erhöhte sHLA-E Konzentrationen sind mit einem reduziertem 5-Jahres PFS
der CLL Patienten assoziiert .................................................................................................. 49
Abbildung 15: Der Einfluss einer Therapie auf die sHLA-E Konzentration im Blutplasma der
CLL Patienten ......................................................................................................................... 50
Abbildung 16: Kein Einfluss der Mikrobeads auf die CD107a Mobilisierung und IFN-γ
Produktion von NK-Zellen....................................................................................................... 51
Abbildung 17: Reduzierte Degranulierungsaktivität von NK-Zellen ........................................ 52
Abbildung 18: Reduzierter Anteil IFN-γ produzierender NK-Zellen ........................................ 52
Abbildung 19: Induktion der TGF-β Freisetzung durch sHLA-E ............................................. 53
Abbildung 20: Assoziation der sHLA-E Konzentration mit dem HLA-E*01:03 Status bei CLL
Patienten ................................................................................................................................ 54
Abbildung 21: Assoziation des HLA-E*01:01 positiven Status mit einer kompletten Remission
der Patienten mit aggressiven B-NHL .................................................................................... 57
Abbildung 22: Wald-Diagramm der Risikofaktoren für komplette Remission der Patienten mit
aggressiven B-NHL ................................................................................................................ 58
Abbildung 23: Erhöhte sHLA-E und sHLA-E EV Konzentrationen bei Patienten mit
aggressiven B-NHL im Vergleich zu Kontrollen...................................................................... 59
Abbildung 24: Assoziation der sHLA-E EV Konzentrationen mit dem Ann-Arbor-Stadium .... 60
Abbildung 25: ROC-Kurvenanalyse der sHLA-E Gesamt und sHLA-E EV Konzentration ..... 62
Abbildung 26: Erhöhte sHLA-E Gesamt/EV Konzentrationen sind mit einem längeren 5-
Jahres OS assoziiert .............................................................................................................. 63

 8

Abbildung 27: Wald-Diagramm der Risikofaktoren für das 5-Jahres OS der Patienten mit
aggressiven B-NHL ................................................................................................................ 65
Abbildung 28: Keine Assoziation der sHLA-E/sHLA-E EV Konzentrationen und dem HLA-
E*01:01 positiven Status bei Patienten mit aggressiven B-NHL ............................................ 66
Abbildung 29: Duale Rolle des HLA-E*01:01/01:03 Polymorphismus bei B-NHL .................. 74
Abbildung 30: Duale Rolle von sHLA-E/sHLA-E EV bei B-NHL ............................................. 74

 9

Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Stadieneinteilung nach Binet ................................................................................. 13
Tabelle 2: Ann-Arbor-Klassifikation ........................................................................................ 14
Tabelle 3: Liste der Geräte ..................................................................................................... 27
Tabelle 4: Liste des Verbrauchsmaterials .............................................................................. 28
Tabelle 5: Liste der Chemikalien und Reagenzien ................................................................. 29
Tabelle 6: Liste der verwendeten Primer ................................................................................ 30
Tabelle 7: Liste der Zellkulturmedien...................................................................................... 30
Tabelle 8: Liste der Zusätze für Zellkulturmedien................................................................... 30
Tabelle 9: Liste der Puffer und Lösungen............................................................................... 30
Tabelle 10: Liste der verwendeten Reagenzsysteme............................................................. 31
Tabelle 11: Liste der Antikörper.............................................................................................. 31
Tabelle 12: Liste der Software ................................................................................................ 31
Tabelle 13: Demographisches Profil der CLL Patienten......................................................... 32
Tabelle 14: Demographisches Profil der Patienten mit aggressiven B-NHL .......................... 34
Tabelle 15: Verteilung der HLA-E*01:01/HLA-E*01:03 Frequenzen bei CLL Patienten und
Kontrollen ............................................................................................................................... 41
Tabelle 16: Assoziation von prognostischen Parametern mit dem HLA-E*01:03 Status ....... 43
Tabelle 17: Assoziation der prognostischen Parameter und sHLA-E Konzentrationen von
CLL Patienten ......................................................................................................................... 47
Tabelle 18: Verteilung der Allel- und Genotyp Frequenzen von HLA-E bei Patienten mit
aggressiven B-NHL und Kontrollen ........................................................................................ 55
Tabelle 19: Assoziation der prognostischen Parameter mit dem HLA-E*01:01 Status der
Patienten mit aggressiven B-NHL .......................................................................................... 56
Tabelle 20: Assoziation der klinischen Parameter mit den sHLA-E Konzentrationen der
Patienten mit aggressiven B-NHL .......................................................................................... 61

 10

Einleitung

1. Einleitung
Krebserkrankungen gehören zu den häufigsten Todesursachen weltweit, deren
Auswirkungen durch die wachsende und alternde Population weiterhin steigen werden
(Torre, et al. 1). Lymphome stellen maligne Tumore des Immunsystems dar und
werden in zwei große Gruppen der Hodgkin Lymphome (HL) und Non-Hodgkin
Lymphome (NHL) unterteilt (Swerdlow, et al. 2). Eine Lymphomerkrankung korreliert
weiterhin für einen Drittel der Patienten mit einer schlechten Prognose (Coiffier, et al.
3
 , Shah and Moskowitz 4, Rodgers and Barr 5). Seit 1997 werden Immuntherapeutika
bereits zusätzlich zur Standardchemotherapie bei NHL eingesetzt. Obwohl sie das
Gesamtüberleben dieser Patienten steigern (Coiffier, et al. 3), können nicht alle
Patienten davon profitieren. Daher werden dringend neue Zielstrukturen gesucht, um
Krebszellen zu eliminieren und das Immunsystem zu stärken bzw. zu fördern
(Hanahan and Weinberg 6, Hanahan and Coussens 7).

1.1. Non-Hodgkin Lymphome

1.1.1. Epidemiologie
Als NHL wird eine heterogene Gruppe von Tumorerkrankungen mit mehr als 30
Subtypen zusammengefasst, die vom lymphatischen System vorwiegend B-
Lymphozyten ausgeht. Die Heterogenität der NHL ist auf die Vielzahl von Lymph- und
Abwehrzellen zurückzuführen, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten in ihrer
Entwicklung entarten können (Seifert, et al. 8, Nogai, et al. 9). Das Robert-Koch-Institut
verzeichnete 2016 eine altersstandardisierte Neuerkrankungsrate bei NHL von 3,7%
bei Frauen und 3,8% bei Männern bezogen auf alle Krebsneuerkrankungen in
Deutschland und zählen damit zu den zehn häufigsten Krebserkrankungen in
Deutschland (Abbildung 1).

 11

Einleitung

Abbildung 1: Häufigste Tumorlokalisationen in Deutschland 2016
Prozentualer Anteil der häufigsten Tumorlokalisationen an allen Krebsneuerkrankungen in Deutschland 2016
(Robert-Koch-Institut 10). NHL sind unter den zehn häufigsten Tumoren in Deutschland vertreten (Frauen: 3,7%;
Männer: 3,8%; grün).

Die Mortalität der Patienten mit NHL ist in den letzten 10 Jahren rückläufig. Mit einer
relativen 5-Jahresüberlebensrate von ca. 70% haben sie eine vergleichsweise gute
Prognose. Sie ist jedoch im Einzelnen von Faktoren wie dem Alter der Patienten, sowie
dem Typ und der Ausbreitung der Erkrankung abhängig. Desweiteren werden
unterschiedliche Risikofaktoren wie eine angeborene oder erworbene
Immunschwäche, seltene Autoimmunerkrankungen, radioaktive Strahlung,
Chemotherapie, Infektionen, Umweltgifte, Lebenswandel und Auftreten von
 11
genetischen Varianten als Risikofaktoren der NHL diskutiert (Chihara, et al. ). NHL
werden aufgrund ihrer Malignität in indolente (niedrigmaligne) und in aggressive
(hochmaligne) Lymphome eingeteilt. Letztere nehmen einen prozentualen Anteil von
ca. 30% aller NHL ein.

1.1.2. Die chronisch lymphatische Leukämie
Die chronische lymphatische Leukämie (CLL) gehört zu den häufigsten indolenten
NHL und ist gleichzeitig die häufigste leukämische Erkrankung bei Erwachsenen in
Mitteleuropa. Hier kommt es zu einer Ansammlung von reifen immun-inkompetenten
B-Lymphozyten (Swerdlow, et al. 2). Diese B-Zellen zeigen einen charakteristischen
 12

Einleitung

Immunphänotyp durch die Koexpression des Oberflächenantigens CD5 mit den
typischen Oberflächenantigenen der B-Zellen CD19, CD20, und CD23.
Charakteristisch für CLL Zellen sind weiterhin die niedrige Expression von
Oberflächenimmunglobulinen (Igk oder Igl), CD20 und CD79b im Vergleich zu
 12
normalen B-Zellen (Hallek, et al. ). Immunologisch ist die CLL charakterisiert durch
eine generalisierte Suppression der Funktion von Immuneffektorzellen (Rebmann, et
 13, 14
al. Riches, et al. ), das den sog. „Immunescape“ erleichtert (s. Kapitel 1.2). Die
lymphatische Mikroumgebung (s. Kapitel 1.3) beeinflusst maßgeblich die Proliferation
und Zirkulation der entarteten Zellen in der CLL und anderen B-Zell Lymphomen
 15
(Burger and Gribben ). Die Einteilung des Krankheitstadiums bei CLL Patienten
erfolgt nach der Binet Klassifikation (Stadium A, B und C), welche eine körperliche
Untersuchung und eine Blutbildanalyse einschließt (Binet, et al. 16; Tabelle 1).
Tabelle 1: Stadieneinteilung nach Binet
Die Stadieneinteilung nach Binet basiert auf einer körperlichen Untersuchung mit Angabe der Anzahl befallener
lymphatischer Regionen an Hals, Achsel, Leiste, Milz und Leber, der Hämoglobinkonzentration und der
Thrombozytenanzahl aus der Blutbildanalyse (Binet, et al. 16).

 Stadium Anzahl befallener Hämoglobin Thrombozyten
 lymphatischer [g/dl] [Anzahl/ μl]
 Regionen
 A 10 > 100.000
 B ≥3 > 10 > 100.000
 C irrelevant < 10 < 100.000

Diese Stadieneinteilung korrelliert mit dem Gesamtüberleben und der
 17
Behandlungsbedürftigkeit (Chiorazzi ) zusammen mit folgenden molekularen und
immunologischen Markern: Thymidinkinase, SF3B1-/NOTCH1-Mutationen, TP53-
Aberration, die Expression von ZAP-70 (Durig, et al. 18), CD38 (Durig, et al. 19), CD49d
 20, 21
(Nuckel, et al. Bulian, et al. ), dem Mutationsstatus der Gene für die variable
schwere Kette der Immunglobuline (IGHV), zytogenetische Anomalitäten (SF3B1-
/NOTCH1-Mutationen), und β2-Mikroglobulin, die Expression des nicht-klassischen
 13,
Humanen Leukozyten Antigen (HLA)-Moleküls HLA-G (Rebmann, et al. Nuckel, et
al. 22, Rizzo, et al. 23).
Therapeutisch stellt, neben der Stammzelltransplantation, die Chemoimmuntherapie
(Chemotherapie in Kombination mit monoklonalen Antikörpern) die Standardtherapie
der CLL dar. Zunehmend werden diese Therapien durch Inhibitoren, die die B-Zell-
Rezeptor-Signalwege blockieren (Bruton’s tyrosine kinase Inhibitor) oder in die
Regulation der Apoptose eingreifen (Bcl2 Inhibitor) unterstützt, wobei die
 13

Einleitung

Kombinationstherapien noch nicht vollständig etabliert sind (Clemens-Martin
Wendtner 24).

1.1.3. Die diffus großzelligen B-Zell Lymphome
Die diffus großzelligen B-Zell-Lymphome (DLBCL) ist die häufigste Form der malignen
und zählt zu den aggressiven (hochmalignen) Lymphomen. Zellmorphologisch
umfasst die Bezeichnung diffus großzellige B-Zell-Lymphome die centroblastischen,
immunoblastischen, großzellig-anaplastischen und die T-Zell-reichen B-Zell-
Lymphome. Weiterhin kann nach der Genexpression in GCB (germinal-center B-cell-
like) und ABC (activated B-cell-like; Alizadeh, et al. 25, Rosenwald and Staudt 26), nach
immunhistochemischen Merkmalen (CD5, CD30, MYC, Bcl2, Bcl6) und nach
genetischen Anomalien (Translokation von MYC, BCL2 und/oder BCL6)
unterschieden werden. Zur Einordnung des Krankheitsstadiums wird die Ann-Arbor-
 27
Klassifikation verwendet (Lister, et al. ), die auf Befunde der körperlichen
Untersuchung, Knochenmarkbiopsie und Computertomographie (CT) oder PET/CT
(Positronen-Emissionstomographie/Computertomographie) beruhen (s. Tabelle 2).
Tabelle 2: Ann-Arbor-Klassifikation
IV: mehrere lokale Manifestationen in einer extranodalen Lokalisation sowie eine Beteiligung der Leber und/oder
des Knochenmarks gelten als diffuser Befall (Lister, et al. 27)

 Stadium Definition
 I Nodaler Befall in einer einzigen Lymphknotenregion
 II Befall mehrerer Lymphknotenregionen auf einer Seite des Zwerchfells
 III Befall von Lymphknotenregionen auf beiden Seiten des Zwerchfells
 IV Diffuser Befall eines oder mehrerer extralymphatischer Organe

Zusätzlich wird mit dem Internationalen Prognostischen Index (IPI) die Prognose einer
DLBCL Erkrankung unter Berücksichtigung des Alters des Patienten (≤/> 60 Jahre),
des Allgemeinzustandes (ECOG 0 – 1 vs. 3 - 5), des Ann-Arbor-Stadiums (I, II vs. III,
IV), dem Befall extranodaler Organe (0 - 1 vs. ≥ 2 extranodale Organe) und der
Lactatdehydrogenase (LDH) Werte (≤ vs. > oberer Grenzwert) in günstiger vs.
ungünstiger Ausprägung (0 vs. 1 Punkt) abgeschätzt. Anhand des berechneten IPI-
Scores werden vier Risikogruppen unterschieden: 0 - 1 Punkte: niedriges Risiko
(Gesamtüberleben nach 3 Jahren: 91%); 2 Punkte: niedrig-intermediär (81%); 3
Punkte: hoch-intermediär (65%); 4 - 5 Punkte: hoch (59%) (International Non-
Hodgkin's Lymphoma Prognostic Factors 28, Ziepert, et al. 29).

 14

Einleitung

 30
Unabhängig vom IPI sind eine Infiltration des Knochenmarks (Sehn, et al. ), eine
 31
große Lymphommanifestation als sog. Bulk (Pfreundschuh, et al. ), ein
 32
zytomorphologisch immunoblastisches DLBCL (van Hall, et al. ), eine kombinierte
 33,
MYC- und BCL2 Expression in der Immunhistochemie (Green, et al. Staiger, et al.
34 33,
 ) und das Vorhandensein eines sog. Double-Hit-Lymphoms (Green, et al. Niitsu,
et al. 35) weitere prognostisch ungünstige Risikofaktoren. Die Erstlinientherapie ist eine
Chemotherapie nach dem CHOP Protokoll, bestehend aus Cyclophosphamid,
Doxorubicin, Vincristin und Prednison. CD20 positive DLBCL Patienten bekommen
zusätzlich den monoklonalen Antikörper Rituximab (Handelsname: MabThera®,
Hersteller Roche), der gegen das Oberflächenantigen CD20 auf Lymphomzellen, aber
auch auf gesunden reifen B-Zellen gerichtet ist. Wird CD20 von Rituximab erkannt,
binden an der Fc-Domäne des Antikörpers Immuneffektorzellen aus der
Mikroumgebung, um die Zelle zu lysieren.

1.2. Tumorerkennung, Eliminierung und „Escape“

Das Immunsystem ist in der Lage körpereigene entartete Zellen zu entfernen, wenn
 36
sie als fremd erkannt werden können (Dunn, et al. ). Folglich kann eine klinisch
manifestierte Tumorerkrankung als Konsequenz einer defekten Überwachung durch
das Immunsystem betrachtet werden. Belegt werden kann diese Hypothese durch
zahlreiche Studien in Mausmodellen aber auch in klinischen Beobachtungen von
spontanen Remissionen, prognostischer Bedeutung von Immunzellinfiltraten im
Tumorgewebe, aber auch durch das erhöhte Risiko für eine Tumorentstehung bei
immunsuppremierten Patienten nach Transplantation (Pham, et al. 37, Birkeland, et al.
38
 ). Allerdings wirkt das Immunsystem im Tumorgeschehen nicht nur
immunsuppressiv, sondern kann bei chronischen Entzündungsreaktionen sogar das
 39, 40
Tumorwachstum fördern (Coussens and Werb Philip, et al. ). Diese duale Rolle
des Immunsystems im Tumorgeschehen wird in den drei Entwicklungsphasen
„Eliminierung, Equilibrium und Escape“ des Tumor-Immuneditings beschrieben (Dunn,
et al. 41, Swann and Smyth 42; Abbildung 2).

 15

Einleitung

Abbildung 2: Tumor-Immun-Editing
Das Tumor-Immun-Editing besteht aus drei Phasen Eliminierung, Equilibrium und „Escape“ (Swann and Smyth 42
modifiziert). In der Eliminierungsphase ist das Immunsystem in der Lage Tumorzellen als fremd zu erkennen und
zu eliminieren. In der Phase des Equilibriums entsteht ein Gleichgewicht zwischen der Elimination von Tumorzellen
und Selektion von Tumorzellen mit erworbenen Überlebenseigenschaften. Im „Escape“ Phase entgehen die
Tumorzellen der Kontrolle durch das Immunsystem.

Gesundes Gewebe hat die Fähigkeit sich selbst zu reparieren, wenn es durch
Karzinogene, chronische Entzündung, genetische Mutationen, Strahlung oder
Infektionen beschädigt wird. Wenn eine Reparatur nicht möglich ist, werden von den
transformierten Zellen ausgehend ungerichtet lösliche Stressmoleküle ausgeschüttet,
aber auch gerichtet Tumorantigene über Humane Leukozyten Antigene (HLA) und
Stressantigene wie NKG2D Liganden auf der Zelloberfläche präsentiert, die von
Immunzellen erkannt werden. In der ersten Phase des Tumor-Immuneditings ist das
Immunsystem noch in der Lage die Tumorzellen als fremd zu erkennen und zu
eliminieren (Eliminierung). Wenn klassische HLA-Moleküle (s. Kapitel 1.4)
herunterreguliert werden, können Natürliche Killer (NK)-Zellen aktiviert werden, um
Tumorzellen zu eliminieren. In der zweiten Phase kommt es zu einem Gleichgewicht
(Equilibrium) zwischen der Elimination von Tumorzellen, aber auch zur Anreicherung
von Tumorzellen mit erworbenen Überlebenseigenschaften. Erwerben diese
Tumorklone weitere Mutationen, die eine ungehinderte Proliferation begünstigen, wird

 16

Einleitung

die nächste Phase („Escape“) erreicht, in der eine Tumorkontrolle nicht mehr möglich
ist.

1.3. Die Tumor-Mikroumgebung

Zusätzlich zu Mutationen trägt eine immunsuppressive Mikroumgebung zu einem
unkontrollierten Tumorwachstum bei. In der Mikroumgebung finden komplexe
Interaktionen zwischen den Tumorzellen und Immunzellen, Stromazellen, Blutgefäßen
und ggf. Mikroorganismen, sowie löslichen Faktoren Zytokinen bzw. extrazellulären
Vesikeln (Kapitel 1.3.1) statt. Hier werden u.a. Stressmoleküle und lösliche nicht-
klassische HLA-G und HLA-E Moleküle freigesetzt (Rebmann, et al. 13, Wagner, et al.
43
 ). Durch die immunsuppressive Eigenschaften dieser Moleküle wird die angeborene
bzw. erworbene Immunkompetenz eingeschränkt, wodurch das Potenzial der
immunologischen Abwehr von Tumorzellen abgesenkt wird (Hanahan and Coussens
7,
 Swann and Smyth 42).

Abbildung 3: Einfluss der Mikroumgebung auf zentralen Eigenschaften eines Tumors
Die Tumormikroumgebung beeinflusst zelluläre Prozesse, die Tumorzellen einen Vorteil im Überleben, Proliferation
und Invasion gegenüber normalen Zellen verschafft (Hanahan and Coussens 7).

Bei NHL beeinflusst die Mikroumgebung, die Proliferation und Zirkulation der
 15
entarteten Zellen (Burger and Gribben ). Die Tumorimmunzellen mit genetischen
Aberrationen interagieren mit Stroma- und Immunzellen und/oder zirkulieren
 17

Einleitung

zusammen mit ihnen und unterschiedlichen löslichen Mediatoren wie Interleukin-10
 44, 45 46
(IL-10; Cha, et al. Beguelin, et al. ), IL-6 (Voorzanger, et al. ), IL-8 (Gregoire, et
 47
al. ) und den Wachstumsfaktoren, vesikuläres endothelialen Wachstumsfaktor
 48
(VEGF; Tzankov, et al. ) und Transforming Growth Factor (TGF-b; de Charette and
Houot 49), lösliche HLA-G Moleküle (Rebmann, et al. 13) und extrazelluläre Vesikel (s.
Kapitel 1.3.1). Diese Interaktionen haben Einfluss auf die Proliferation der NHL Zellen,
Therapieresistenz und dem Verbleiben von residualen Tumorzellen nach
konventioneller Therapie und schließlich auf das Gesamtüberleben der Patienten
(Rebmann, et al. 13, Riches, et al. 14, Burger and Gribben 15).
Auf zellulärer Ebene spielen in der Mikroumgebung der NHL, mesenchymale
Stromazellen (MSC; Kurtova, et al. 50, Ding, et al. 51, Crompot, et al. 52), Makrophagen
 53
(Boissard, et al. ) und T-Zellen eine herausragende Rolle. Schon früh wurde
beobachtet, dass Patienten mit CLL eine gesteigerte Anzahl von peripheren CD8
positiven T-Zellen und damit eine dementsprechende reduzierte CD4:CD8 Ratio
aufwiesen (Catovsky, et al. 54, Platsoucas, et al. 55, Herrmann, et al. 56). Auf lange Sicht
gelingt es den tumorspezifischen CD8 positiven T-Zellen aber nicht, die malignen B-
Zellen vollständig zu vernichten. Die Einschränkungen der Funktion von T-Helfer
Zellen und zytotoxischen T-Zellen könnte die verminderte Antikörperproduktion der
 57, 58
Patienten mit CLL erklären (Foa, et al. Lauria, et al. ). Desweiteren trägt eine
erhöhte Anzahl CD4+CD25+ regulatorischer T-Zellen (Treg) zu dem Immundefekt von
 59,
Patienten mit fortgeschrittener CLL Erkrankung bei (Beyer, et al. Giannopoulos, et
 60, 61
al. D'Arena, et al. ), indem sie die Proliferation und Differenzierung von T-Zellen
hemmen (Lindqvist, et al. 62).
Genetisch zeigten die T-Zellen von NHL Patienten ein differenziertes Expressionsprofil
 63, 64,
im Vergleich zu gesunden Personen (Gorgun, et al. Gorgun, et al. Hofbauer, et
al. 65) mit funktionell negativen Auswirkungen auf die Aktinpolymerisierung in T-Zellen,
das zu einer fehlerhaften Formation der immunologischen Synapse in Kontakt mit
antigenpräsentierenden Zellen führt und den Transport extrazellulärer Vesikel
beeinträchtigt (Ramsay, et al. 66).

1.3.1. Extrazelluläre Vesikel
Extrazelluläre Vesikel (EV) sind wichtige Mediatoren in der Kommunikation zwischen
direkt benachbarten und weit entfernten Zellen bei physiologischen Zellprozessen,
sowie in pathologischen Situationen wie hämatologischen Malignitäten (Boyiadzis and

 18

Einleitung

Whiteside 67, Tetta, et al. 68). EV leisten einen wichtigen Beitrag im Signalnetzwerk der
Tumor-Mikroumgebung, in der sie die Tumorprogression, den „Immunescape“ und die
Chemotherapie-Resistenz fördern können (Rackov, et al. 69).
EV werden generell in die zwei Hauptgruppen Ektosomen und Exosomen eingeordnet.
Ektosomen gehören zu Vesikeln, die direkt durch das Abschnüren der
Plasmamembran entstehen. Hierzu gehören Mikrovesikel, Mikropartikel und große
Vesikel in einem Durchmesser von ca. 50 nm bis 1 µm. Im Gegensatz dazu stammen
Exosomen aus dem edosomalen Zellkompartiment und haben im Durchschnitt einen
Durchmesser von ca. 100 nm (Kalluri and LeBleu 70).
Der Mechanismus der EV-Bildung ist nicht vollständig verstanden. Nichtsdestotrotz,
scheint der endosomale Sortierungskomplex (ESCRT) für die Entstehung und den
Transport der EV notwendig zu sein (Trajkovic, et al. 71). Nach der Freisetzung der EV
können sie durch verschiedene Mechanismen von der Zielzelle aufgenommen werden:
 72
durch Membranfusion (Tian, et al. ), Ligand-Rezeptor-Interaktion (Miyanishi, et al.
73 74 75
 ), Phagozytose (Feng, et al. ), Clathrin-abhängige (Tian, et al. ) und Clathrin-
 76
unabhängige Endozytose (Damke, et al. ). Nach Aufnahme der EVs entlassen sie
abhängig vom Calciumeinstrom, der Zytoskelett Reorganisation und der Umverteilung
von Phospholipiden in der Plasmamembran ihren Inhalt in die Zielzelle und induzieren
damit eine Reihe von biologischen Prozessen (Greening and Simpson 77).
Die Zusammensetzung der EV spiegelt die Zusammensetzung der Ursprungszelle
wieder. Als Marker für Exosomen werden CD9, CD63, CD81, Flotillin, TSG101 (tumor
susceptibility gene 101), Ceramide und ALIX (apoptosis-linked gene 2-interacting
protein X) verwendet. Darüber hinaus enthalten Exosomen auf ihrer Oberfläche Lipide,
Proteine der exosomalen Biogenese, Tetraspanine, Membrantransportproteine,
Integrine, Immunmodulatorische Proteine und Proteine der Antigenpräsentation.
Innerhalb der Exosomen finden sich intrazelluläre Proteine, RNA, DNA, Aminosäuren
und Metabolite (Kalluri and LeBleu 70, Subra, et al. 78; s. Abbildung 4).

 19

Einleitung

Abbildung 4: Inhalt der Exosomen
Exosomen enthalten auf ihrer Oberfläche Lipide, Proteine der exosomalen Biogenese, Tetraspanine,
Membrantransportproteine, Integrine, Immunmodulatorische Proteine und Proteine der Antigenpräsentation.
Innerhalb der Exosomen finden sich intrazelluläre Proteine, RNA, DNA, Aminosäuren und Metabolite (modifiziert
Kalluri and LeBleu 70).

Wie in Abbildung 4 dargestellt sind Proteine der Antigenpräsentation wie HLA Proteine,
(s. Kapitel 1.4) zentraler Bestandteil der Exosomen (Kalluri and LeBleu 70, Buschow, et
 79
al. ). Vor allem antigenpräsentierende Zellen (APC) wie Dendritische Zellen und B-
Zellen produzieren HLA-Klasse II positive Exosomen und aktivieren damit Effektor T-
Zellen, wenn gleich eine Stimulation durch den exosomale HLA-Klasse II/Peptid
Komplex weniger effektiv war, als die zelluläre Aktivierung durch die APC selbst
 80, 81
(Raposo, et al. Vincent-Schneider, et al. ). Unter den nicht-klassischen HLA-
Klasse I Molekülen wurden bereits HLA-G positive EV bei Patienten mit Melanom,
Ovarialkarzinom und Brustkrebs gefunden und als Biomarker diskutiert (Riteau, et al.
82, 83, 84
 Schwich, et al. Konig, et al. ). Daten zu HLA-E positiven Exosomen sind nicht
vorhanden, sie werden in dieser Arbeit zum ersten Mal untersucht.
Bei NHL nimmt die Mikroumgebung und darin enthaltenen EV eine zunehmend
wichtige Rolle ein (Burger and Gribben 15, Navarro-Tableros, et al. 85 Xu and Wang 86).
Sie werden generell als CD19, CD20 und CD22 positiv charakterisiert, wenn gleich sie
 87,
eine große Anzahl an zusätzlichen Proteinen enthalten (Yao, et al. Oksvold, et al.
88
 ). Zur Funktion von EV in der Lymphommikroumgebung ist wenig bekannt. Eine
Studie berichtet, dass EV bei Ebstein-Barr-Virus (EBV)-assoziierten Lymphomen
vornehmlich in Monozyten/Makrophagen inkorporieren und das Tumorwachstum
durch Induktion eines regulatorischen Phänotyps in Makrophagen fördern (Higuchi, et

 20

Einleitung

 89
al. ). Desweiteren sollen Lymphom-EV Apoptose induzieren, das in Studien von
 90
Ahmed, et al. untersucht wurde. EV von EBV Zellen waren in der Lage den
programmierten Zelltod in verschiedenen Zelltypen, wie B-Zellen, T-Zellen und
 91
Epithelzellen zu induzieren. In Zellkulturexperimenten von Hedlund, et al. haben
NKG2DL positive Lymphom-EV die NKG2D Rezeptor vermittelte Zytotoxizität
unterdrückt und somit die NK-Zell Funktion eingeschränkt.

1.4. Humane Leukozyten Antigene

Wie bereits erwähnt (s. Kapitel 1.2) können HLA-Merkmale in klassische und nicht-
klassische HLA-Moleküle eingeteilt werden. Alle HLA Klasse I, II und III Merkmale
werden auf dem kurzen Arm von Chromosom 6 (6p21.1-21.3) kodiert (Abbildung 5).

Abbildung 5: Schematische Darstellung der Humanen Leukozytenantigene
Die HLA sind auf dem kurzen Arm von Chromosom 6 (6p21.1-21.3) kodiert. Die HLA-Klasse I Gene sind in blau,
die HLA-Klasse II Gene in rot und die HLA Klasse III und nicht-HLA Gene sind in grün markiert. HLA-E ist in rot
umkreist (Iwaszko and Bogunia-Kubik 92, modifiziert).

Zu den klassischen HLA Klasse I Merkmalen gehören die HLA-A, -B und -C Moleküle,
während HLA-G, -E und -F zur Familie der nicht-klassischen HLA-Merkmale zählen.
Diese zwei Gruppen unterscheiden sich dadurch, dass die klassichen HLA-Merkmale
hoch polymorph in den kodierenden Regionen sind und mit Außnahme von
Trophozytoblasten ubiquitär exprimiert werden. Obwohl nicht-klassische HLA
Moleküle strukturelle Gemeinsamkeiten mit den klassischen HLA-Merkmalen
aufweisen, unterscheiden sie sich in einigen wichtigen Eigenschaften: Sie zeigen auf
genetischer Ebene eine nur geringe allelische Variation, präsentieren ihren Zielzellen
 93
ein nur begrenztes Peptidrepertoire (Lee, et al. ) und werden unter physiologischen
Bedingungen in preferenziell in immunpriviligierten Regionen (Trophoblasten, Zellen
des Auges) exprimiert. Unter pathologischen Bedingungen, wie Infektionen und

 21

Einleitung

malignen Transformationen, können sie hochreguliert werden. Funktionell
unterscheiden sich diese zwei Gruppen von Molekülen darin, dass klassische
Merkmale mit der Präsentation von nonameren Alloantigenen bzw. Tumorantigenen
und ihre Interaktion mit dem T-Zell-Rezeptor eine Immunantwort auslösen. Im
Gegensatz dazu, schränken nicht-klassische HLA Moleküle die T-Zell Antwort ein,
indem sie mit diversen inhibitorischen Rezeptoren interagieren.

1.4.1. HLA-E als mögliches Zielmolekül bei NHL
Das Humane Leukozyten Antigen-E (HLA-E) gehört zu der Familie der nicht-
 94
klassischen HLA Klasse I Moleküle und wurde zum ersten Mal von Koller, et al. im
Jahre 1988 beschrieben. Obwohl die mRNA von HLA-E in vielen, aber nicht allen
humanen Geweben exprimiert wird, ist ihre Oberflächenexpression schwach oder fehlt
unter physiologischen Bedingungen (Ulbrecht, et al. 95). Eine basale HLA-E Expression
kann auf B- und T-Zellen, NK-Zellen und Makrophagen detektiert werden. In nicht-
lymphatischen Geweben ist die HLA-E Expression auf Endothelzellen beschränkt. In
diesem Fall kann die HLA-E Oberflächenexpression oder Ablösung von löslichen HLA-
E Molekülen durch Tumornekrosefaktor-alpha (TNFα), Interleukin-1 beta (IL-1β) und
Interferon-gamma (IFN-γ) hochreguliert werden (Coupel, et al. 96).
Die Expression von HLA-E wird situationsabhängig reguliert. Unter physiologischen
Bedingungen werden beide Moleküle auf einem niedrigen Level von nahezu allen
Zellen exprimiert. Eine erhöhte Expression findet in der Schwangerschaft statt (King,
 97
et al. ). In Zellen des Trophoblasten oder des Plazentagewebes trägt HLA-E zur
maternalen Tolerenz gegenüber dem Fötus bei (Ishitani, et al. 98).
In pathologischen Situationen sind die funktionellen Konsequenzen der HLA-E
Expression wenig verstanden. Eine Rolle von HLA-E in der Kontrolle des
Immunsystems und/oder dem „Immunescape“ infizierter, gestresster oder maligner
 32,
Zellen vor dem Immunsystems wird kontrovers diskutiert (van Hall, et al. Iwaszko
and Bogunia-Kubik 92, Marin, et al. 99, Cohen, et al. 100, Rodgers and Cook 101, Bossard,
 102
et al. ). Bei Patienten mit Darmkrebs wurde eine Überexpression von HLA-E
detektiert. Zusammen mit b2m wurde HLA-E als Marker für eine schlechte Prognose
beschrieben und als neuer Mechanismus des „Immunescape“ bezeichnet (Bossard, et
 102
al. ), wobei eine andere Studie eine hohe HLA-E Expression mit dem Langzeit-
Überleben von Adenokarzinomen der Zervix in Verbindung gebracht hat (Spaans, et
 103
al. ). Zwei voneinander unabhängige Gruppen haben eine HLA-E
Oberflächenexpression auf malignen Melanomzellen gefunden, aber nicht auf der
 22

Einleitung

 104, 105
Oberfläche von gesunden Hautzellen (Derre, et al. Tremante, et al. ). Erhöhte
Konzentrationen von löslichen HLA-E (sHLA-E) Molekülen wurden in der
Blutzirkulation von Melanom Patienten gefunden (Allard, et al. 106). Diese Studie führte
sHLA-E als potentiellen Biomarker des Immunsystems bei Krebserkrankungen ein.
Mechanistisch ist sHLA-E in der Lage Apoptose in T- und NK-Zellen durch einen
Fas/Fas Liganden vermittelten Signalweg zu induzieren (Puppo, et al. 107, Spaggiari, et
al. 108). Ob HLA-E wie andere klassische und nicht-klassische HLA-Klasse I Moleküle
von EV exprimiert werden, ist anzunehmen, aber bisher nicht beschrieben
(Abbildung 4).
HLA-E weist als nicht-klassisches HLA-Klasse I Merkmal eine geringe Variabilität in
den kodierenden Regionen des HLA-E Gens auf. Die häufigsten Allele weltweit
 109
(98,2%) sind HLA-E*01:01 und HLA-E*01:03 (Felicio, et al. ). Die Proteinprodukte
von HLA-E*01:01 und HLA-E*01:03 unterscheiden sich nur in einer Aminosäure an
Position 107 in der alpha2-Domäne, wo ein Arginin in HLA-E*01:01 gegen ein Glycin
in HLA-E*01:03 ausgetauscht ist. Das Expressionslevel von HLA-E*01:03 ist generell
höher als das Expressionslevel von HLA-E*01:01, das zum Teil auf höhere Affinität
 110
und thermische Stabilität von Peptiden zurückzuführen ist (Strong, et al. ), die von
HLA-E*01:03 präsentiert werden. Interessanterweise sind die genannten Allele mit
einem Transplantationserfolg (Hosseini, et al. 111, Ludajic, et al. 112), dem Schweregrad
 113
einer Psoriasis (Zeng, et al. ) und HIV/Hepatitis C Infektionen (Guzman-Fulgencio,
et al. 114), aber auch mit der Progression solider Tumoren (Zhang, et al. 115) assoziiert.
Dementsprechend werden HLA-E*01:01 und HLA-E*01:03 als Biomarker bei
Infektionen, soliden Tumoren und hämatologischen Malignitäten, diskutiert (Wagner,
et al. 43, Guberina, et al. 116, Xu, et al. 117, Zheng, et al. 118, Hirankarn, et al. 119, Martin, et
al. 120).
Funktionell präsentiert HLA-E unter physiologischen Bedingungen Peptide, die von
Leitsequenzen klassischer HLA-Moleküle wie HLA-A, HLA-B, HLA-C und dem nicht
 92, 96
klassischen HLA-G abstammen (Iwaszko and Bogunia-Kubik Coupel, et al. ).
Zusätzlich ist HLA-E in der Lage fremde oder stress-bedingte Antigene nach einer
 121,
Infektion, Immunisierung und Transplantation zu präsentieren (Tomasec, et al.
Romagnani, et al. 122, Pietra, et al. 123, Bottger, et al. 124, Heinzel, et al. 125, Gross, et al.
126
 ). Hierbei wird berichtet, dass insbesondere Viruspeptid-beladenene HLA-E eine
konventionelle via der Interaktion mit dem T-Zell Rezeptor eine zytotoxische T-Zell
Antwort auslösen kann (Tomasec, et al. 121, Li, et al. 127).
 23

Einleitung

Neben der Interaktion mit dem T-Zell Rezeptor, kann HLA-E auch mit dem
inhibitorischen CD94/NKG2A oder mit dem aktivierenden CD94/NKG2C
Rezeptordimer auf NK-Zellen und T-Zell Subpopulationen wechselwirken (Braud, et
 128, 129, 130
al. Lee, et al. Borrego, et al. ). Hierbei ist die Affinität von HLA-E zu den
inhibitorischen Rezeptorpaar 6-fach höher als ihre Affinität zum aktivierenden
Rezeptorpaar (Kaiser, et al. 131; Abbildung 6).

Abbildung 6: HLA-E Signalweiterleitung
Die Interaktion von HLA-E mit dem CD94/NKG2A Rezeptordimer führt zu einer Inhibition der NK-Zellen oder
zytotoxischen T-Zellen über ITIM und SHP-1 vermittelte inhibitorische Signale. Die Interaktion von HLA-E mit
NKG2C resultiert über die positiv geladene Transmembran-Domäne, ITAM, DAP-12 und Syk in einer Aktivierung
der Effektorzellen (Farag, et al. 132 modifiziert).

Die Interaktion von peptidpräsentierenden HLA-E (p-HLA-E) mit dem Rezeptor NKG2A
führt zur Phosphorylierung des ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibition motifs)
und zur Rekrutierung von SHP-1 Protein, das zu einer Inhibition der NK- und T-Zell
Aktivität führt. Die Interaktion von p-HLA-E mit dem Rezeptor NKG2C führt zur Bindung
des Adapterproteins DAP-12, das ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation
motif) enthält und eine Aktivierung der Effektorzellen zur Folge hat. Weiterhin wird
berichtet, dass eine erhöhte HLA-E Expression auf der Oberfläche von CD4 positiven
T-Zellen, die Differenzierung von CD8 positiven T-Zellen zu CD8 positiven
regulatorischen T-Zellen fördert (Jiang, et al. 133). Dementsprechend moduliert HLA-E
die Immunreaktion durch eine kontextabhängige Interaktion mit beiden Rezeptortypen
des adaptiven und angeborenen Immunsystems.
 24

Einleitung

Die Blockierung der HLA-E/NKG2A Interaktion über monoklonale Antikörper wird
bereits in mehreren klinischen Studien (NCT02459301; NCT02331875;
NCT02643550; NCT02557516; NCT02671435) als therapeutische Option bei soliden
Tumoren und der CLL angewendet mit dem Ziel, eine durch Immunzellen vermittelte
anti-Tumor-Antwort wiederherzustellen.

 25

Zielsetzung

2. Zielsetzung
In der Tumorbiologie gibt es vermehrt Hinweise darauf, dass HLA-E die Progression
von soliden Tumoren begünstigt, indem es das Unterwandern des Immunsystems
fördert, so dass HLA-E als prognostischer Marker für den Krankheitsverlauf von
Tumorerkrankungen diskutiert wird. Bei hämatologischen Malignitäten, wie dem NHL,
ist die immunbiologische Bedeutung von HLA-E/sHLA-E zur Zeit noch unzureichend
untersucht.
Jedoch sind wegen der heterogenen klinischen Ausprägung der NHL prognostische
Zielmoleküle, die das Voranschreiten der Erkrankung vorhersagen und einen
therapeutischen Nutzen haben, dringend gewünscht. Aufgrund der funktionellen
Bedeutung von HLA-E/sHLA-E und in Analogie zu soliden Tumoren könnten HLA-
E/sHLA-E als Biomarker und als Zielmoleküle in der NHL dienen und für zusätzliche
immuntherapeutische Optionen infrage kommen.
Das Ziel dieser Arbeit ist daher, das Potenzial von HLA-E/sHLA-E als prognostisches
und potentiell therapeutisch relevantes Zielmolekül in der NHL zu untersuchen. Hierzu
gehört die Evaluation des expressionsrelevanten HLA-E*01:01/HLA-E*01:03
Polymorphismus, die Analyse der HLA-E Oberflächenexpression, sowie die Analyse
der freigesetzten löslichen HLA-E Moleküle bei Patienten mit NHL. Eingeschlossen
werden Patienten mit dem indolenten NHL CLL und den aggressiven NHL aus der
multizentrischen PETAL (Positronen-Emissionstomographie-gesteuerte Therapie
aggressiver Non-Hodgkin-Lymphome) Studie, im Vergleich zueinander und zu
gesunden Kontrollpersonen. Die Ergebnisse sollen mit bereits etablierten
Prognosemarkern korreliert werden.

 26

Material und Methoden

3. Material und Methoden
3.1. Material
Tabelle 3: Liste der Geräte

 Bezeichnung Hersteller/Lieferant (Sitz)
 Durchflusszytometer CytoFlex, Beckman Coulter (Krefeld)
 Drucker Geldokumentation P93 Mitsubishi Electric (Ratingen)
 PowerWave HT Microplate BIOTEK (Bad
 Spektrophotometer
 Friedrichshall)
 Gasbrenner Flammy S, Schuett Biotec (Göttingen)
 Gefrierschrank Liebherr (Bulle, FR, Schweiz)
 Geldokumentation GDS Touch INTAS Science (Göttingen)
 Kühlschränke Liebherr (Bulle, FR, Schweiz)
 Elektrophoresekammer Kunststofftechnik (Kassel)
 Inkubator für die Zellkultur Heracell 240, Thermo Sc. (Langenselbold)
 Inkubator für die Zellkultur WTB, Binder (Tuttlingen)
 Laborwecker Digi-Lock Timer Carl Roth (Karlsruhe)
 Magnetrührer Combimag-REO IKA (Staufen)
 Magnetrührer IKAMAG RET-G IKA (Staufen)
 Axio Observer. Z.1, Zeiss (Oberkochen)
 Axio Vert. A1, Zeiss (Oberkochen)
 Mikroskope
 CKX41, Olympus (Hamburg)
 Zeiss 471202, Zeiss (Oberkochen)
 Mikrowelle Severin (Sundern)
 ®
 Milli-Q Millipore (Seattle, USA)
 Nanodrop ND-1000 Peqlab GmbH (Erlangen)
 Neubauer Zählkammer E. Hartnack, Roth (Karlsruhe)
 pH-Meter pH526 Wtw, Xylem (Rye Brook, USA)
 PCR Maschine GeneAmp PCR S 9700 Applied Biosystems (Foster City, USA)
 Pipetten
 100 µl – 1200 µl Starlab (Hamburg)
 1 – 10 µl, 5 – 50 µl, 20 – 200 µl, Thermo Sc. (Langenselbold)
 100 – 1000 µl
 Multipipette 30 µl Thermo Sc. (Langenselbold)
 Pipettierhelfer Pipetus Hirschmann (Eberstadt)
 Pipettierhelfer Peleusball Labotics (Burcht, Belgien)

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Material und Methoden

 Power Supply Power Pac 3000 BioRad (Hercules, USA)
 Sicherheitswerkbank MSC Advantage Thermo Sc. (Langenselbold)
 Thermal Cycler GeneAmp PS 9700 AB, Thermo Sc. (Langenselbold)
 Vortexmischer Grant-bio PV-1 Grant Instruments (Shepreth, GB)
 AJ H220, Vibra, Shinko Denshi (Tokyo, Japan)
 Waagen
 572, Kern (Balingen-Frommern)
 Wasserbad GFL (Burgwedel)
 Varifuge 3.OR , Heraeus Sepatech (Hanau)
 Zentrifugen Micro 200, Hettich (Kirchlengern)
 Centrifuge 5810R, Eppendorf (Hamburg)

Tabelle 4: Liste des Verbrauchsmaterials

 Bezeichnung Hersteller/Lieferant (Sitz)
 Aufsatzfilter (0,22 µm) TPP (Trasadingen, CH)
 Zellfilter (70 µm, 100 µm) BD Falcon
 Einfrierröhrchen Greiner (Frickenhausen)
 Einmalspritzen (1 ml, 5 ml, 20 ml, 40 ml) Braun (Melsungen)
 Flachbodenplatten („6-, 12-, 48-, 96 Well“) Greiner (Frickenhausen)
 Flachbodenplatten („24 Well“) Costar (Tewksbury, MA, USA)
 Flachbodenplatte („384 Well“) Corning (NY, USA)
 Handschuhe Abena Classic Nitrile Abena GmbH (Norderstedt)
 Mediumflaschen (100 ml, 500 ml) Greiner (Frickenhausen)
 Pasteurpipetten Brand (Wertheim)
 Petrischalen (145/20 mm) Greiner (Frickenhausen)
 PCR-Platten BioRad (Hercules, CA, USA)
 PCR-Folie BioRad (Hercules, CA, USA)
 Pipettenspitzen
 Peqlab (Erlangen), Starlab (Ahrensburg)
 (1000 µl, 200 µl, 100 µl, 20 µl, 10 µl)
 Polypropylen-Röhrchen (15 ml, 50 ml) BD Biosciences (San Jose, CA, USA)
 Polypropylen-Rundbodenröhrchen (5 ml) BD Biosciences (San Jose, CA, USA)
 Reaktionsgefäße (0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml, 5 ml) Eppendorf (Hamburg)
 Stabpipetten (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml,
 Greiner (Frickenhausen)
 50 ml)
 Spritzen (1 ml, 10 ml, 20 ml) Becton Dickinson (Madrid, Spanien)
 Spritzenfilter (0,2 µm, 0,45 µm) Sartorius (Göttingen)

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