Nachweis versteckter Allergene und Strategien zur Risikominimierung - Stefan Vieths
←
→
Transkription von Seiteninhalten
Wenn Ihr Browser die Seite nicht korrekt rendert, bitte, lesen Sie den Inhalt der Seite unten
Nachweis versteckter Allergene
und Strategien
zur Risikominimierung
Stefan Vieths
Paul-Ehrlich-Institut
Abteilung Allergologie
.
Das Team
Paul-Ehrlich-Institut: Bundesverband der deutschen
Martin Röder Süßwarenindustrie e.V.
Annabella Janise – Fachsparte Feine Backwaren (BDSI)
Oliver Stephan Fr. Beate Olzem
Dr. Thomas Holzhauser
Zentralfachschule der deutschen
Projektbegleitender Ausschuss Süßwarenwirtschaft e.V.
Dr.Anja Ibach Dr. Carola Suwelack
Fr. Iris Baltruweit
Herr Helwig Gruyters
Dr. Markus Straubinger
Dr. Ingo Mücke
Prof. Dr. Reinhard Matissek
Fr. Sabine Brandherm
Gefördert mit Mitteln im Rahmen der industriellen Gemeinschaftsforschung
(BMWA /AiF 14362 N / Forschungskreis der Ernährungsindustrie e.V.)
.
Versteckte Allergene in Lebensmitteln
¾ Lebensmittelallergie und versteckte Allergene
¾ Analytik
¾ Modelluntersuchungen und Untersuchungen
in Lebensmittelbetrieben
¾ Schlussfolgerung und Ausblick
.
Allergie
¾ Betrifft ca. 25 % der Bevölkerung in Industrieländern
¾ Sozio-Ökonomische Kosten in der EU geschätzt auf
auf 29 Mrd € p.a.
Weissbuch Allergie in Deutschland 2004 .Mechanismus
Sensibiliserung: Auslösung:
Auslösung:
Prozessierung des Kreuzvernetzung
Kreuzvernetzung
Allergens Stimulation von
vonIgE
IgEauf
aufMastzell-
Mastzell-
von T Zellen Rezeptoren
Rezeptoren
allergen
IL-2
TH1 IFNγ
CD3 IgE
FcεRI
modification
TH0
TCR
MHCII Treg
APC CD4+ ? B cell Mast cell
B7 CD28
TH2
IL-4, IL-13 mediator
release
.Häufigkeit der Lebensmittelallergie
¾ Kinder: 8 %
¾ Erwachsene: 4 %
¾ Birkenpollenallergiker: ~ 50-70%
.Anaphylaxie durch Lebensmittel
¾ Lebensbedrohliche, generalisierte
Überempfindlichkeitsreaktion
¾ 150 Todesfälle p.a. geschätzt für USA
¾ 29,000 Fälle anaphylaktischer Reaktionen p.a.
Bock et al., JACI 2001 .Symptome der Lebensmittelallergie
Haut Atemwege Gastrointestinal Kreislauf
60 % 40 % 60 % (20 %) 10 %
Jäger und Wüthrich, 2002
.Lebensmittelallergie ist dosisabhängig
1.0
0.9
Cumulative proportion of responses 0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
-2 -1 0 1 2 3 4 5 6
Log (threshold dose (mg))
Subjektive Symptome nach Lebensmittelprovokation mit Soja
(Ballmer-Weber et al. JACI 2007)
.“Lowest Provoking Dose”
Milde Reaktion Systemische
Reaktion
0.2mg 0.5mg 1.0mg 5.0mg 50mg 100mg 400mg
¾ 1 Erdnusskern in 2000 Tafeln Schokolade
Nachweis von < 0.001% im Lebensmittel .Wieviel Allergen ist zuviel?
Einschätzung der AG Nahrungsmittelallergie der
Deutschen Gesellschaft für Allergologie und klinische
Immunologie (DGAKI):
Unterschreiten von 1-10 mg Protein aus
allergenem Lebensmittel pro kg Gesamt-LM
Wird die große Mehrzahl der Allergiker vor schweren
Reaktionen schützen.
Vieths et al. Allergo J 2006
.Diskrepanz zwischen Kennzeichnung
und Anwesenheit von Allergenen
Milchschokolade mit Karamel: Karamel, Milch-
schokolade. Kann Nussspuren enthalten.
Analytik: Haselnuss/Erdnuss nicht nachweisbar
Mandel-Nougat Creme: Zucker, Pflanzenöl, Mandel,
Kakaopulver, Laktose, Trockenmilchpulver, Lezithin, Vanillin.
Analytik: ~1 % Haselnuss
.Deklarationspflicht für allergene Zutaten Glutenhaltiges Getreide (Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Dinkel)* Krebstiere* Eier* Fisch* Erdnüsse* Soja* Milch Schalenfrüchte (Mandel, Haselnuss, Walnuss, Kaschunuss, Pecannuss, Paranuss, Pistazie, Macadamianuss, Queenslandnuss)* Sellerie* Senf* Sesam* Lupine* Weichtiere* *und Erzeugnisse daraus (sowie Schwefeldioxid und Sulfite >10 ppm) Anhang IIIa: EU-Richtlinie 2003/89/EG zur Änderung 2000/13/EG und 2006/142/EG .
Notwendigkeit des Allergennachweises in
Lebensmitteln
· Überprüfung der Kennzeichnung
· Nachweis von unbeabsichtigten Einträgen
(Cross-Contact, Rohstoffe).
· QM: Entwicklung und Überwachung von
Allergen Management Plänen.
.Versteckte Allergene in Lebensmitteln
¾ Lebensmittelallergie und versteckte Allergene
¾ Analytik
¾ Modelluntersuchungen und Untersuchungen
in Lebensmittelbetrieben
¾ Schlussfolgerung und Ausblick
.Spurenanalytik „versteckter Allergene“
¾ PROTEIN-Nachweis
Immunologische Methoden
Proteomics
¾ DNA-Nachweis
Polymerase Kettenreaktion (PCR)
Stephan & Vieths, J Agric Food Chem 2004, 52: 3754-3760
Holzhauser & Vieths, J Agric Food Chem 2002, 50:5808-5815
Holzhauser & Vieths, J Agric Food Chem 1999, 47: 4209-4218
Holzhauser & Vieths, J Agric Food Chem 1999, 47: 603-611
.Immunologische Methoden: Sandwich ELISA
P S T
Antigen
Allergen
Microtiter plate-
format
OD
OD
Lateral flow
Log
log Conc.
[Antigen]
Dipstick-format .Dipstick-Test zum Nachweis von Erdnuss
Roasted at 140 °C Roasted at 160 °C
% Peanut in
chocolate
min: 0 40 45 50 min: 10 20 30 40
No. 1 2 3
raw nuts 1 0.1 %
1- China
2- China/Jumbo 2 0.01 %
3- Nicaragua (Leon) 3 0.001 %
4- U.S. Giant
1 2 3 4 5 6 7 5- U.S.(New
Orleans)/Virginia
6- U.S. (Virginia)/Jumbo
7- U.S. (Virginia)/Giant
Stephan et al., Eur Food Res Technol 2002, 215: 431-436 .Methode: Enzyme-linked Immunosorbent Assay
P S T OD
OD
Antigen
Allergen
Log Konz.
log [Antigen]
ERDNUSS:
•Hefle et al., J Food Protection 1994; 57:419-23
Eigenschaften:
•Koppelman et al., World of Ingredients 1996; 19:35-8
•Yeung & Collins; Food Composition and Additives 1996; • LOD < 10 ppm
JAOAC 79:1411-6
•Holzhauser & Vieths; J Agric Food Chem 1999; 47:603-11 • quantitativ
HASELNUSS:
•Holzhauser & Vieths, J Agric Food Chem 1999; 47:4209-18 • schnell
•Koppelman et al., J Immunol Methods 1999; 229:107-20
MANDEL:
• HTP-Technologie
•Hlywka et al., J Food Protection 2000; 63:252-7 • standardisierbar
EI:
Yeung et al., JAOAC 2000; 83:139-43 • für Routine geeignet
MILCH, SOJA, LUPINE, ZEREALIEN,
CRUSTACEEN, NÜSSE, diverse
.Polymerase Kettenreaktion (PCR)
1. DNA-Extraktion 2. PCR Amplifikation 3. Detektion
Agarosegel
PCR-ELISA
40 12
10
cycles
copies
real-time
PCR
Sequenzverifizierung des Amplifikats erforderlich
DIN 2001; 589667-60
CEN 2002; prEN ISO 21569
.DNA-Sequenz des Hauptallergens Cor a 1.0401 aus
Haselnuss
rCor a 1.0401:
483 bp
160 AA (ohne Met)
berechneter pI 6,1
berechn. MW 17,45 kDa
(Lüttkopf et al., 2002)
Intron: Codon 62
5' ag:gt - ag:gc 3''
(Hoffmann-Sommergruber et al., 1997)
(Lüttkopf et al., Mol Immunol 2002) .Prinzip eines PCR-ELISA
A) Binding of Product B) Denaturing
biotinylated
PCR products
DNA single
Streptavidin strand bound
to solid phase
ELISA-well ELISA-well
C) Hybridization D) Color reaction
Sequence Enzyme-
specific antibody-
probe conjugate
substrate
ELISA-well ELISA-well
.Haselnuss: Vergleich von PCR-ELISA mit Protein
Sandwich ELISA
Accuracy
Mg/kg protein DNA/protein
Samples Detected
30
25 total
20 PCR-ELISA >1000 7/7 +
Protein-ELISA
15 100-1000 4/4 +
10 10-100 8/8 +
5 4 mg/kg Haselnuss.
Negativ: 14 Lebensmittel ohne Haselnuss.
Holzhauser et al. J Agric Food Chem 2002, 50: 5808-5815
.Erdnuss: Vergleich von Real-Time PCR mit
Sandwich- ELISA
Stephan and Vieths, J Agric Food Chem 2004, 52: 3754-60 .Schlussfolgerung
• Sicherer Allergennachweis im Spurenbereich
ist möglich.
• Sowohl Protein- als auch DNA-basierte
Methoden einsetzbar.
• Dringende Notwendigkeit für Standardisierung
und Entwicklung allergener Referenzmaterialien.
• Regelung für allergene Kontaminationen notwendig.
.Versteckte Allergene in Lebensmitteln
¾ Lebensmittelallergie und versteckte Allergene
¾ Analytik
¾ Modelluntersuchungen und Untersuchungen
in Lebensmittelbetrieben
¾ Schlussfolgerung und Ausblick
.Erfassung und Management von unbeabsichtigten
Einträgen von allergenen Lebensmitteln am Beispiel
Feiner Backwaren
Forschungskreis der Ernährungsindustrie AiF-FV 14362N
.Modelluntersuchungen im Technikum
• Industrielle Ausstattung im
Kleinmaßstab verfügbar
• Überprüfung des
Haselnusseintrags durch
verschiedene Gerätschaften
• Untersuchung verschiedener
Reinigungsverfahren
• Separate Untersuchungen
für gemahlene und stückige
Haselnüsse
• Produkt mit 10 % Haselnuss
gefolgt von Produkt ohne
Haselnuss
.Reinigungsprozeduren
1. Mechanisches Auskratzen als übliche industrielle
Prozedur
2. Auskratzen plus Heißwasserreinigung
3. Auskratzen plus Heißwasserreinigung plus Spülen
4. 3. mit zusätzlicher Verwendung von Detergens
5. Worst case – Keine Reinigung
Insgesamt >1500 Proben genommen und mittels
Haselnuss-spezifischem ELISA analysiert.
.Zusammenfassung (gemahlene Haselnuss)
Untersuchtes Reinigungsprotokoll Haselnussprotein im
Gerät Folgeprodukt (mg/kg)
Ohne Reinigung 5-70
Auskratzen 1-20
Kneter Auskratzen plus Heißwasser < 1-2
Auskratzen plus Heißwasser < 1-3
plus Detergenz
Schnitt- und Form- Auskratzen 1-150
maschinen Auskratzen plus Heißwasser < 1-3
Auskratzen < Nachweisgrenze
Stahlbandofen Auskratzen plus Heißwasser < Nachweisgrenze
.Reduziert Erhitzung die Detektion von Haselnuss?
baking test 10% HN dough
12000
mg/kg hazelnut protein
10000
8000
6000
4000
2000
0
before baking after baking
10% hn-dough
.Schlussfolgerungen
• Allergeneintrag durch Kreuzkontakt stellt ein Risiko für
allergische Verbraucher dar.
• Die übliche industrielle Reinigungspraxis ist nicht effizient
genug um empfindliche Allergiker zu schützen.
• Einfaches Auskratzen kombiniert mit Heißwasserreinigung
genügt um Kontaminationen in den Bereich von 1mg/kg
Haselnussprotein zu reduzieren.
• Stückige Haselnussanteile können mit den angewandten
Methoden nicht erfasst werden.
• Keine Kontamination durch Staub detektierbar
• Sehr gute Übereinstimmung zwischen Technikum und
Betrieb
.Sie können auch lesen
