Philipp Bittner Labor HCI E330 (2 29 29) - H 294 - MALDI-MS Versuch - Analytische Chemie

Praktikum Physikalische und Analytische Chemie

 MALDI-MS Versuch

Kontakt
Adam Pruška HCI E330 (2 29 29) apruska@ethz.ch
Philipp Bittner HCI E330 (2 29 29) pbittner@ethz.ch
Labor H 294

Version 25. Februar 2021

Aufgabe
Dieser Versuch dient der Einführung in die (Matrix-unterstützte) Laser-
Desorption/Ionisation Time-of-Flight Massenspektrometrie (MA)LDI-TOF-MS.
Eigenhändig werden sowohl einige LDI-, als auch MALDI-Proben von einem Set bekannter
Verbindungen vorbereitet und gemessen.
Die erhaltenen Spektren sollen auf dem eigenen Rechner prozessiert und ausgewertet
werden. Die dazu notwendige Software ist als Open Source Software vorhanden (MS
Windows, Mac OS X und Linux). Ziel ist die möglichst vollständige Signalidentifizierung
der Verbindungen durchzuführen und den Einfluss der Messparameter zu erklären.
Pro Gruppe soll ein Bericht abgegeben werden. Die Anforderungen an den Bericht sind
ausführlich am Ende der Versuchsanleitung beschrieben.

Achtung!
Das in diesem Versuch verwendete Spektrometer kostet mehrere Hunderttausend
Franken und wird von allen Forschungsgruppen im LOC genutzt. Das LOC erwartet
darum äusserste Sorgfalt im Umgang mit dem Gerät. Insbesondere sollen die
Vorschriften zu diesem Versuch genau befolgt werden. Jacken, Taschen etc. dürfen
nicht mit in den Raum genommen werden. Mögliche Defekte am Gerät oder
Verschmutzung durch zerbrochene Proben etc. müssen dem zuständigen
Assistenten sofort gemeldet werden.

 2

Version 25. Februar 2021

Hintergrund
Massenspektrometrie beruht auf der Ionisierung von Molekülen, ihrer Trennung durch
elektrische und magnetische Felder sowie zum Teil auch in feldfreien Regionen und ihrer
anschliessenden Detektion.
Für Ionenerzeugung, -trennung und -detektion sind verschiedene Lösungsansätze
entwickelt worden. Klassische Methoden zur Ionenerzeugung (Elektronenstoss) sind
sehr destruktiv und verursachen eine Fragmentierung der Moleküle. Um dies zu
reduzieren, wurden u.a. Elektrospray-Ionisierung (ESI) und MALDI entwickelt.
Wir werden für diesen Versuch MALDI in Kombination mit Time-of-Flight (TOF)
Detektion einsetzen. Bei der Probenvorbereitung der LDI- und MALDI-Messungen wird
die zu analysierende Substanz auf eine Metalloberfläche aufgebracht. Die Ionisierung
erfolgt durch einen Laserpuls auf diese Metalloberfläche. Der genaue
Ionisationsmechanismus ist bis heute noch nicht vollständig aufgeklärt.
LDI und MALDI unterscheiden sich in der Anwesenheit einer Matrix. Diese besteht aus
relativ kleinen Molekülen, die leicht UV-Strahlung absorbieren und dadurch ionisiert
werden. Bei der Bildung von Kationen passiert z. B. folgendes:
 !"#
 "⎯$ $∙ + &
Die resultierenden Matrixionen (M) übermitteln ihre Ladung an die Analytmoleküle (A),
die in verdünnter Form vorliegen.
 $∙ + → + $∙
Die Entstehung der Anionen ist komplizierter zu verstehen. Hier wird ein Elektron
aufgenommen, welches erst anderswo produziert werden muss.
 & + → &∙
 &∙ + → + &∙
Die geringe Menge Analytmoleküle und die relativ niedrige Laserfluenz (Laserpulsenergie
pro Oberfläche; J/m2) im Vergleich zur LDI macht MALDI zu einem sensitiven und
weichen Ionisierungsverfahren.

Abb. 1: Übersicht eines linearen TOF Instruments. Die von einem Laserpuls erzeugten Ionen
werden von einer geerdeten Beschleunigungsplatte in Richtung des Detektors beschleunigt
und in Abhängigkeit ihres Masse-zu-Ladungsverhältnisses (m/z) in der Driftregion des
Gerätes getrennt (bearbeitet von Referenz 4).

 3

Version 25. Februar 2021

Die erzeugten Ionen können jetzt bezüglich ihres Masse-zu-Ladungsverhältnisses (m/z in
Thompson) getrennt und in Richtung des Detektors transportiert werden. Dazu werden
sie in einem MALDI-TOF Instrument erst in einem elektrischen Feld beschleunigt und
anschließend in einer feldfreien Region nach m/z getrennt (siehe Abbildung 1).
Die elektrische Ladung q des Ions mit der Masse mi ist ein Vielfaches z der
Elementarladung e und wird angegeben durch q = ez. Die Energieaufnahme des Ions Eel
durch Passieren eines elektrischen Potentials U wird beschrieben durch:
 Eel = qU = ezU
Die durch das Potential aufgenommene Energie wird umgesetzt in kinetische Energie:
 Eel = ezU = ½miv2 = Ekin
Die Geschwindigkeit des Ions ist dann gegeben durch:
 '()*
 v=) +!

Die benötigte Zeit (t = s/v) des Ions mit der Masse mi und der Ladung z, um die feldfreie
Driftstrecke nach Beschleunigung durch das Potential U zu durchqueren, ist damit
gegeben durch:
 , +
 t=
 √'(*
 ) )!

Allerdings erhalten nicht alle Ionen der gleichen Ladung und Masse genau dieselbe
kinetische Energie während der Laserablation der Probe, wodurch die Signalauflösung
reduziert wird. Damit die Ionen mit den gleichen m/z Werten gleichzeitig den Detektor
erreichen und somit die Auflösung verbessert wird, sind die „Delayed Extraction“- und
das Reflektronverfahren (siehe Abbildung 2 und 3; Abbildung 4 zeigt die Laser- und
Ionenoptik des verwendeten Massenspektrometers) entwickelt worden.

Abb. 2: „Delayed Extraction“-Verfahren. Unterschiede in der kinetischen Energie am Anfang
des Ionentransports werden durch das Anlegen eines elektrischen Feldes teilweise
aufgehoben.

 4

Version 25. Februar 2021

Abb. 3: Übersicht eines Reflektron TOF Instruments. Die von einem Laserpuls erzeugten
Ionen werden von einer geerdeten Beschleunigungsplatte in Richtung des Detektors
beschleunigt und in der Driftregion des Gerätes hinsichtlich ihres Masse-zu-
Ladungsverhältnisses getrennt. Diesmal werden jedoch unterschiedliche kinetische
Energien der gleichen Ionen durch das elektrische Feld des Reflektors (Ur > U) aufgehoben,
wodurch die Auflösung verbessert wird. (bearbeitet von Referenz 4).

 5

Version 25. Februar 2021

Abb. 4: Übersicht der Ionenoptik des verwendeten Massenspektrometers „AB 4800“.
Zusätzlich hat das Spektrometer noch eine MS-MS-Möglichkeit, wobei ausgewählte Ionen
weiter fragmentiert werden können.
Für eine ausführlichere Erklärung von MALDI-TOF-MS wird auf das Skript zur Vorlesung
Analytische Chemie I & II und insbesondere III (Wahlfach im 5. Semester: Moderne
Massenspektrometrie und Kopplungstechniken in der Analytik) verwiesen.

 6

Version 25. Februar 2021

Versuchsdurchführung
 1. MALDI-Platte putzen
Damit die neue Probe nicht durch Rückstände kontaminiert ist, wird die MALDI-Platte vor
ihrem Einsatz in mehreren Schritten gereinigt:

 • Schalten Sie die Kapelle ein und tragen Sie die erforderliche Schutzkleidung
 (Brille, Handschuhe, Laborkittel).

 • Als erstes werden mit einem Papiertuch und ein wenig Ethanol die Matrix und
 andere Analytreste entfernt.

 • Daraufhin wird die Platte mit dem Poliermittel Elsterglanz poliert.

 • Anschliessend wird die Platte mit Pentan und danach mit Methanol für jeweils 5
 Minuten ins Ultraschallbad gegeben.

 2. Probenpräparation
Zunächst sollen verschiedene Matrix- und Analytlösungen hergestellt werden (siehe
Tabelle 1 und Abbildung 5).
 • Dazu wird die benötigte Menge Substanz in einem 1.5 mL Eppendorfgefäss
 eingewogen. Berechnen Sie im Voraus für jede Substanz wie viel mg Sie davon per
 mL von dem ausgewählten Lösungsmittel lösen müssen:
 o 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) in 30:70 [v/v] Acetonitril : 0.1 % TFA in
 H2O (75.0 mM)
 o 9-Aminoacridin (9AA) in Methanol (75.0 mM)
 o α-Cyano-3-hydroxyzimtsäure (CHCA) in 30:70 [v/v] Acetonitril : 0.1 % TFA
 in H2O (75.0 mM)
 Die Analytlösungen stehen schon als Stammlösungen im Gefrierschrank bereit und
 müssen nur noch im gleichen Lösungsmittel auf 0.1 mM Lösungen verdünnt
 werden:
 o Fulleren-C60 (C60) in Xylol (2.0 mM)
 o Bradykinin (BDK) in 30:70 [v/v] Acetonitril : 0.1 % TFA in H2O (5.0 mM);
 10 µL Aliquots
 Berechnen Sie jeweils den Verdünnungsfaktor und verwenden Sie 10 µL der
 Stammlösung.

 7

Version 25. Februar 2021

 • Die Matrixlösungen werden mit dem Vortex homogenisiert. Die Substanz muss
 sich vollständig im gewählten Lösungsmittel auflösen! Falls der Vortex nicht
 ausreicht, benutzen Sie das Ultraschallbad für wenige Sekunden.
 • Anschließend werden die MALDI-Lösungen durch die Kombinationen von Matrix-
 und verdünnten Analytlösungen im Volumenverhältnis 1:1 in 0.5 mL
 Eppendorfgefässen (jeweils 25 µL) hergestellt. Die Lösungen werden wieder mit
 dem Vortex homogenisiert.
 • Damit die Massenspektren ausgewertet werden können, muss das Gerät kalibriert
 werden. Dazu wird eine Lösung von 50 mM CsI3 in Tetrahydrofuran im
 Volumenverhältnis 1:1 in 0.5 mL Eppendorfgefässen (jeweils 25 µL) mit einer
 Lösung von 100 mM DCTB als Matrix in Tetrahydrofuran vermischt.
 DCTB oder trans-2-(3-(4-tert-Butylphenyl)-2-methylallyliden)propandinitril
 N

 N

 • Für den Versuch wird eine Platte „Opti-TOF™ 96 Well Insert (123 x 81 mm)“
 benutzt (siehe Abbildung 5 und 6). Benutzen Sie die Tabelle im Anhang!
 Im Allgemeinen: Vorsicht beim Auftragen eines apolaren Lösungsmittels mit
 geringer Oberflächenspannung, da das Lösungsmittel dazu neigt, sich auf der
 Metallplatte auszubreiten.
 Auf den grauen Punkten werden 0.5 µL der CsI3/DCTB-Lösung aufgebracht. Stellen
 Sie sicher, dass ausreichend Kalibrierungslösung aufgebracht ist, weil DCTB
 langsam sublimiert und CsI3 in CsI und I2 zerfällt. Von jeder Matrix-Lösung (Reihe
 A) werden jeweils 4 und von jedem Analyten (Reihe B) jeweils 6 Spots auf die
 (MA)LDI-Platte aufgebracht. Von jeder MALDI-Lösung werden pro Reihe (C bis H)
 jetzt noch 12 Spots hergestellt. Notieren Sie im Laborjournal, welche Substanzen
 wo aufgetragen sind und benutzen Sie die Tabelle im Anhang! Dazu wird die
 sogenannte „dried droplet“-Methode eingesetzt: 0.5 µL werden auf die
 Metallplatte aufgebracht und an der Luft getrocknet. Erst wenn alle Tropfen
 getrocknet sind, darf die Platte in das Massenspektrometer eingeführt werden!
Nun sollte von jeder Probe ein Massenspektrum wie im Folgenden beschrieben
aufgenommen werden. Weiterhin sollen alle Signale den entsprechenden Matrix- wie
Analytionen und ihren Fragment- und Adduktionen zugeordnet werden.

 8

Version 25. Februar 2021

Tabelle 1.: Übersicht der zu verwendenden Matrices und Analyten. Beachten Sie, dass die
mittlere Molmasse nicht der monoisotopischen Masse entspricht. Die Ionenmasse hängt von
der Zusammensetzung des Ions ab (z.B. +/-H+, +Na+, +/-e- usw.).
 Matrix Mittlere Molmasse Analyt Mittlere Molmasse
 [g/mol] [g/mol]
 2,5-Dihydroxy- 154.12 Fulleren-C60 720.66
 benzoesäure
 O
 HO
 OH

 OH

 9-Aminoacridin 194.23 Bradykinin 1060.22
 NH 2

 N

 α-Cyano-4- 189.17
 hydroxyzimtsäure
 O

 OH
 CN
 HO

 9

Version 25. Februar 2021

Abb. 5: Übersicht der „96-Well Insert MALDI-Platte“. Reihe A enthält die Matrix-Lösungen,
Reihe B die Analyt-Lösungen und in Reihe C-H ist für jede Reihe eine Matrix-Analyt-Mischung
vorgesehen. Die grauen Punkte entsprechen den Kalibrierungspunkten mit der DCTB/CsI3-
Mischung. Die zu verwendenden Methoden sind angegeben: positive (+), negative (-)
Polarität und Linear- (L) und Reflektron- (R) Modus. Die übrigen, nicht beschrifteten Punkte
können zur Bestimmung der optimalen Laserfluenz und „Extraction delay time“ benutzt
werden.

Abb. 6: Die „Opti-TOF™ 96 Well Insert (123 x 81 mm) MALDI-Platte“. Die Platte ist auf der
Unterseite mit einem Strichcode versehen, woran die Platte erkannt wird und wodurch
wichtige Parameter (Positionierungskoordinaten, Spotidentifizierung etc.) nur einmal
eingestellt werden müssen. Es gibt verschiedene alternative Platten, die es erlauben,
verschiedenste Proben (z.B. Gewebe) zu untersuchen.

 10

Version 25. Februar 2021

 3. Spektrometer-Software Einführung & erste Schritte
Die Proben werden durch ein MALDI-TOF/TOF-Analyzer-Massenspektrometer „Applied
Biosystems/MDS SCIEX 4800“ mithilfe der Software „4000 Series Explorer V3.7.07“
gemessen.
 • Öffnen der Spektrometer-Software: Doppelklick auf das 4000 Series Explorer Icon.

Der Bildschirm sollte nun folgendermassen aussehen:

Abb. 7: Öffnungsfenster des 4000 Series Explorers. Links oben befindet sich das „Manual
Control Fenster“ und darunter der „Video Viewer“. Das grosse Fenster ist der „Spot Set
Window / Method Editor“. Darunter befindet sich der „Spectrum Viewer“ und darunter die
„Status Bar“.

 11

Version 25. Februar 2021

Neues Spot Set öffnen
Jetzt werden Sie ein neues „Spot Set“ erstellen:
 • Auswählen: File > New > Spot Set
 • Ein Fenster öffnet sich und 3 Schritte sollten durchlaufen werden:
 1. Geben Sie dem „Spot Set“ einen Namen: Wählen Sie “96 Opti-TOF 123mm
 x 81mm Rev A3“, ersetzen Sie “A3“ mit „Group#“ und drücken Sie auf
 Create.
 2. Geben Sie Ihrer Platte einen Namen: Wählen Sie „001500000562_spots“
 (dies entspricht dem Strichcode auf der Platte) und drücken Sie auf Yes
 im Pop-up-Fenster.
 3. Auswählen des “Spot Set” Templates: ItemType: “User Defined Spot Set
 Template”, Auswahl: “Analytical Chemistry Practicum\Opti-TOF 96 Well
 Insert with CsI calibration spots” und Klick auf Select.

(MA)LDI-Platte einsetzen
 • Die MALDI-Platte muss erst auf einem Träger platziert werden. Dieser ist mit
 Magneten versehen und sichert die Platte (beachten Sie die abgeschnittene Ecke;
 siehe unten).
 • Der Träger wird jetzt in das Massenspektrometer eingebracht. Dazu muss der
 Deckel geöffnet werden und der Träger an der linken Seite mit der
 abgeschnittenen Ecke links unten platziert werden. Der „Eject pad“ sollte leer sein.
 • Klicken Sie auf Plate > Load Plate. Es öffnet sich die Select „Spot Set Dialog box“.
 • Wählen Sie unter Project das Verzeichnis „Analytical Chemistry Practicum“ aus,
 danach „96 Opti-TOF 123mm x 81mm SS Group#“ und drücken auf Select.
 • Es öffnet sich ein neues Fenster. Wählen Sie Load und die MALDI-Platte wird in die
 „Main Source Chamber“ geladen. Dies nimmt etwa 1-2 Minuten Zeit in Anspruch.
 Das Vakuum in der Source-Region muss wieder erreicht werden (wird im
 „Load/Eject Cycle Status“ Fenster gezeigt). Hinweis: Falls zu Beginn der Druck nicht
 abfällt, hilft es aus Erfahrung hierbei leichten Druck auf den Deckel auszuüben.

 12

Version 25. Februar 2021

13

Version 25. Februar 2021

Spektrenaufnahme vorbereiten
Bevor man ein Spektrum aufnehmen kann, müssen noch einige Schritte absolviert
werden.
Acquisition Methode auswählen
Weil die Optimierung einer Methode viel Zeit in Anspruch nehmen kann, sind alle zu
verwendenden Methoden (abgesehen von der Laserfluenz, weil diese stark vom Analyten
und der Matrix abhängt) schon optimiert worden und im System abgespeichert:
 • Linear neg mode
 • Linear pos mode
 • Reflector neg mode
 • Reflector pos mode
Öffnen Sie alle Methoden: File > Open > Acquisition Method
 • Wählen Sie im Project Ordner „Analytical Chemistry Practicum“ die „Acquisition
 Method“, die der richtigen Methode entspricht, im Reiter unten im Method Editor
 • Wählen Sie im Anschluss daran File > Set as Active Acquisition Method oder
 klicken Sie auf . Die aktive Methode erscheint jetzt in grün im „Method Editor“.
Jetzt sollte die Hochspannung eingeschaltet werden, mindestens 30 Minuten vor
Spektrenaufnahme ergibt die besten Ergebnisse. Dazu wird Instrument > Turn on High
Voltage oder ausgewählt. Öffnen Sie nun das „Manual Control Panel“ (damit kann
jeder Spot angefahren werden) falls es noch nicht geöffnet ist: View > Manual Control.
Um die Kamera zu öffnen wird hier statt des internen „Video Viewer“ eine externe
Software genutzt. Öffnen Sie dazu auf dem Desktop das Programm „WinTV2000“:

Processing Methode auswählen
Auch alle zu verwendenden Spektrum-Verarbeitungsmethoden sind schon optimiert
(aber noch nicht kalibriert!) worden und im System abgespeichert:
 • Linear neg mode
 • Linear pos mode
 • Reflector neg mode
 • Reflector pos mode
Öffnen Sie wiederum alle Methoden: File > Open > Processing Method
 • Wählen Sie die aktive Processing Method, die der richtigen Methode entspricht, im
 Reiter unten im Method Editor.
 • Wählen Sie im Anschluss darauf File > Set as Active Processing Method oder
 klicken Sie auf . Die aktive Methode erscheint jetzt in grün im „Method Editor“.
 • Jetzt sind sowohl eine „Acquisition Method“, als auch eine „Processing Method“ mit
 der nächsten Kalibrierung oder Messung verknüpft.

 14

Version 25. Februar 2021

 4. Kalibrierung

Intern und extern kalibrieren
Die „Processing Method“ kalibriert die Messungen, aber sollte erst selber noch kalibriert
werden. Es gibt zwei Möglichkeiten zu kalibrieren:
Die interne Kalibrierung basiert auf den beobachteten Flugzeiten der Ionen der Standards
im selben Sample Spot. Interne Kalibrierung bietet in der Regel im Linear-Modus 0.02 %
(200 ppm) und im Reflektron-Modus 0.0005 % (5 ppm) Massengenauigkeit.
Externe Kalibrierung basiert auf den beobachteten Flugzeiten der Ionen der Standards in
einem anderen intern kalibrierten Sample Spot. Externe Kalibrierung bietet in der Regel
im Linear-Modus 0.05 % (500 ppm) und im Reflektron-Modus 0.0025 % (25 ppm) oder
weniger Massengenauigkeit.

Intern kalibrieren der Processing Methoden mit CsI3 und DCTB
In Prinzip kann man jede Mischung verschiedener, bekannter und relativ stabiler
Substanzen für eine Kalibrierung nutzen. Cäsium und Iod haben allerdings jeweils nur ein
Isotop und eignen sich dadurch optimal für Kalibrierzwecke. Ausserdem bildet CsI für
beide Messpolaritäten geladene Salzcluster mit bekannten Massen (siehe Tabelle 2 und
Referenz 1).

Tabelle 2: Übersicht der (Cluster-) Ionen und ihre m/z für Kalibrierung mit CsI3 und DCTB
als Matrix im positiv und negativ Modus. Die Massen sind schon in den Kalibrierungsdateien
„CsI pos./neg. mode“ abgespeichert.
 (Cluster)ion m/z
 Neg. Modus
 I- 126.905026
 [(CsI)I]- 386.714936
 [(CsI)2I]- 646.524846
 [(CsI)3I]- 906.334756
 [(CsI)4I]- 1166.144666
 [(CsI)5I]- 1425.954576
 Pos. Modus
 Cs+ 132.904884
 [(CsI)Cs]+ 392.714794
 [(CsI)2Cs]+ 652.524704
 [(CsI)3Cs]+ 912.334614
 [(CsI)4Cs]+ 1172.144524
 [(CsI)5Cs]+ 1431.954434
 • Für die Kalibrierung der „Processing“ Methoden wählt man einen der CsI3/DCTB-
 spots aus und wählt die Kalibrierungsdatei des CsI3’s, die der richtigen Polarität

 15

Version 25. Februar 2021

 entspricht. Die Kalibrierungsdateien sind schon in der Methode aufgenommen.
 Aus Tabelle 2 kann man ableiten, dass entsprechend der Polarität des
 Massenspektrometers bestimmte Massen für die Kalibrierung gebraucht werden.
 • Wählen Sie die richtige Set-„Acquisition“- und „Processing“-Methoden für die
 Kalibrierung aus und aktivieren Sie sie wie oben beschrieben. Wählen Sie bei der
 „Processing Method“ den Reiter „Calibration“ aus und wähle „Internal“.
 • Wählen Sie im „Manual Control Manager“ einen Kalibrierungsspot. Drücken Sie zur
 Aufnahme eines Spektrums auf Interactive > Start Active Aquisition Method
 oder auf das Symbol:
 Am Ende der Messung wird das Kalibrierungspektrum gezeigt. Falls die
 Kalibrierung scheitert, einfach nochmal versuchen, bis die Signale für eine
 Kalibrierung intensiv genug sind. Eventuell kann man bei der „Acquisition Method“
 unter dem Reiter „Automatic Control“ noch den Laserfluenz erhöhen: „Laser
 Intensity Mode“: „Fixed laser intensity“. Siehe Seite 20 für eine ausführlichere
 Beschreibung. Ansonsten kann man die Voraussetzungen einer erfolgreichen
 Kalibrierung weniger strikt machen (siehe Abb. 8).

Abb. 8: Beispiel einer Kalibrierung mit einer Mischung bekannter Standards. „Min S/N“,
„Mass Tolerance“ (in ppm oder m/z), „Min Peaks to Match“ und „Max Outlier Error“ (in ppm
oder m/z) können nach Belieben geändert werden. Falls die Kalibrierung scheitert, kann
man die Bedingungen auflockern und bei einer erfolgreichen Kalibrierung schrittweise
optimieren.

 16

Version 25. Februar 2021

Abb. 9: Beispiel eines AB 4800 MALDI-Kalibrierungsspektrums im positiven Reflektron
Modus mit CsI3 und DCTB (1:2 molares Verhältnis vermischt).
 • Speichern Sie die Kalibrierung ab mit: Interactive > Save Spot. Wechseln Sie in
 der „Processing Method“ im Reiter „Calibration“ auf „External“ und speichern Sie
 die „Processing Method“ ab: File > Save Processing Method. Jetzt kann der
 abgespeicherte intern kalibrierte Punkt für die externe Kalibrierung der anderen
 Sample Spots für diese Set-„Acquisition“- und „Processing“-Methoden verwendet
 werden.
 • Wiederholen Sie diesen Vorgang für die restlichen drei „Acquisition“- und
 „Processing“-Methoden. Das Wechseln der Polarität kann ein wenig Zeit in
 Anspruch nehmen. Damit ist die Kalibrierung für diese Messungen vollständig.

 17

Version 25. Februar 2021

 5. Hintergrund zur Spektrenaufnahme
Nachdem alle Methoden für die Spektrenaufnahme bereit sind, werden noch kurz die
wichtigen Parameter für die Aufnahme eines Massenspektrums erklärt:

Positiver und negativer Modus
Der Massenspektrometeraufbau erlaubt nur eine einzige Polarität einzustellen. Die Ionen,
die nicht der Polarität der Messmethode entsprechen, werden wieder auf der MALDI-
Platte landen und dort neutralisiert. Die anderen Ionen werden mit dem elektrischen
Beschleunigungspotential aus der MALDI-Wolke extrahiert und in Richtung des
Detektors beschleunigt.
Linear- und Reflektron-Modus
Die Ionen werden hinsichtlich ihrer unterschiedlichen Flugzeiten durch das erzeugte
Vakuum getrennt. Notieren Sie den Enddruck in mBar der Messungen: Instrument >
Hardware Monitor; oder schauen Sie unten im Fenster: Source 1 und Source 2.

Abb. 10: Der Enddruck des Instruments wird sowohl in der „Vacuum Table“ unter „Source 1“
und “Source 2“ angezeigt als auch unten im Fenster in grün.
Die Ionen bekommen bei der Ablation durch den Laserpuls nicht alle die gleiche Menge
an kinetischer Energie und sind deshalb auch nicht alle gleich schnell. Um diese
unterschiedlichen kinetischen Energien zu reduzieren und damit die Auflösung zu
erhöhen, ist ein Reflektor eingebaut. Dieser erzeugt ein elektrisches Feld, in das schnellere
Ionen tiefer eindringen als langsamere. Sobald die kinetische Energie durch den Reflektor
ausgeglichen ist, werden die Ionen in Richtung des Reflektor-Detektors umgelenkt und

 18

Version 25. Februar 2021

kommen nun mit weitaus geringeren Zeitdifferenzen (im Vergleich zum Linear-Modus)
beim Detektor an. (Siehe Abbildungen 3 und 4)
Extraction delay time und Potentiale
Die optimale „Extraction delay time“ (die Zeit zwischen Laserpuls und Senken des
Extraktorpotentials) wird automatisch, abhängig von den ausgewählten
Beschleunigungspotentialen, durch die Software des AB4800 bestimmt. Aber das
Massenspektrometer erlaubt es dem Benutzer auch, diesen Wert selber zu bestimmen
und zu optimieren. Die „Extraction delay time“ hängt vor allem von den ausgewählten
Beschleunigungspotentialen und vom m/z der zu untersuchenden Analyten ab und ist
damit besonders wichtig für die Auflösung der Analyten.
Laserenergie
Die „Laserenergie“, genau genommen Fluenz und ausgedrückt in Laserpulsenergie pro
Oberfläche (J/m2) bestimmt, wie viele Photonen das MALDI Target erreichen und von der
Matrix/Analytmischung maximal absorbiert werden können und damit die Menge
Moleküle, die ablatiert und ionisiert werden. Falls die Laserenergie zu niedrig ist, wird
keine Ablation und Ionisierung stattfinden. Wenn sie zu hoch ist, fragmentieren Matrix-
und Analytmoleküle oder bilden Cluster. Deshalb ist es notwendig bei jedem (MA)LDI-
Versuch die optimale Laserenergie in Kombination mit den oben angegebenen
Parametern festzustellen.
Salzkonzentration
Die Anwesenheit von Salzen ist im Allgemeinen in der Massenspektrometrie eher
unerwünscht. Vor allem bei Elektrospray Ionisation kann es zu Problemen führen. Im
Vergleich dazu ist MALDI noch sehr robust. Manchmal wird die Präsenz von Salzen sogar
ausgenutzt für sehr apolare Moleküle, die schwierig zu ionisieren sind. Dabei bilden sich
bei Anwesenheit von Metallkationen Addukte, die man mit MS beobachten kann. Aber
meistens machen die Kationaddukte die Interpretierung der Spektren eher schwierig
oder führen zu Artefakten.

 19

Version 25. Februar 2021

 6. Spektrenaufnahme
Die Platte ist verknüpft mit einem Spot Set, wobei jeder Punkt mit einer Acquisition
Method und Processing Method versehen ist.
Für jeden Punkt auf der MALDI-Platte ist jetzt eine „Acquisition Method“ bestimmt. Jede
Methode bezieht sich auf eine bestimmte Polarität (positiv oder negativ) und entweder
den Linear- oder Reflektron-Modus.
Bestimmen Sie für jede Matrix/Analytkombination zuerst in beiden Reflektron-Modi die
optimale Laserfluenz und „Extraction delay time“ und verwenden Sie diese dann auch für
die Linear-Modi. Verwenden Sie dazu die übrigen Punkte auf der MALDI-Platte. Notieren
Sie die Werte im Laborjournal.
Laserfluenzbestimmung
Die Laserfluenz kann man im „Manual Control Fenster“ ändern:

oder im „Method Editor“: Wählen Sie die aktive „Acquisition Method“ aus, klicken Sie auf
den Reiter „Automatic Control“ und geben Sie im Bereich “Laser Intensity Mode“ den
Laserfluenzwert bei „Fixed laser intensity“ ein.

Fangen Sie bei niedriger (ca. 4000) Laserfluenz an und messen Sie die übrigen Punkte auf
der MALDI-Platte. Erhöhen Sie den Laserfluenzwert bis max. 7500. Bestimmen Sie für
jede Matrix die optimale Laserfluenz im positiven und negativen Reflektron-Modus und
benutzen Sie die Werte für die Linear-Modi. Achtung: Nicht jede Substanz ist leicht
ionisierbar und nicht jede Matrix-Analyt-Kombination erzeugt Analytionen. Eigentlich
wird Laserfluenz ausgedrückt in J/m2, aber weil die Laserleistung langsam abnimmt, ist
die Bestimmung der Laserfluenz eine Momentaufnahme und der benötigte arbiträre Wert
wird daher im Laufe der Zeit höher.

 20

Version 25. Februar 2021

Extraction delay time-Bestimmung
Um die „Extraction delay time“ zu ändern, selektieren Sie die aktive „Acquisition Method“.
Wählen Sie den „Instrument“-Reiter und klicken Sie auf „Open“ im „Operating Mode“-
Bereich. Unterstehender Reiter öffnet sich, wo im „Delay Times (ns)“-Bereich die
„Extraction delay time“ in Nanosekunden eingegeben werden können. Die besten
Ergebnisse werden, abhängig von der Masse des Ions, zwischen 500-800 ns erreicht.
Ändern Sie diesen Wert, bis Sie zufrieden sind mit der Signalform und der Signal-to-Noise-
Ratio (S/N) für jeden Analyten im positiven und negativen Reflektron-Modus, und
benutzen Sie die Werte für die Linear-Modi. Den „Operating Mode“ der „Acquisition
Method“ können Sie abspeichern und schließen, indem sie den grünen Reiter auswählen
und dann File > Save / Close Operating Mode auswählen.

Eine wichtige Regel bei der Optimierung: Nur 1 Parameter gleichzeitig ändern!!!
Sobald Sie die Parameter ausreichend optimiert haben, speichern Sie das Spektrum ab
mit: Interactive > Save Spot. Notieren Sie die optimierten Werte der Parameter
(Laserfluenz und „Extraction delay time“) in Ihr Laborjournal. Wiederholen Sie dieses
Vorgehen für das Vermessen aller Spots.

Reihenfolge Spektrenaufnahme
Messen Sie jetzt erst alle Spots, die im Reflektron-Positiv-Modus gemessen werden sollen
und danach im Linear-Positiv-Modus. Verwenden Sie für jede MALDI-Kombination die
gleichen optimierten Werte für Laserfluenz und „Extraction delay time“ wie im
Reflektron-Modus. Vermessen Sie anschliessend die Spots im Reflektron-Negativ Modus
und anschließend Linear-Negativ-Modus.

 21

Version 25. Februar 2021

Beispielspektrum:
Ein MALDI-Spektrum auf dem „AB 4800“ aufgenommen sieht folgendermaßen aus:

Abb. 11: Beispiel eines „AB 4800“-MALDI-Spektrums vom Bradykinin und α-Cyano-4-
hydroxyzimtsäure im positiven Reflektron-Modus (oben: ganzes Spektrum; unten:
Vergrößerung).
In der „4000 Series Explorer“-Software können Sie mithilfe der Zoomknöpfe die
Spektren genauer ansehen. Um das ganze Spektrum wieder anzuzeigen, klicken Sie auf
.

Peak List anschauen
 • Wählen Sie View > Output > Window, um das Outputfenster zu öffnen.
 • Wählen Sie den Reiter Peak List aus. Die Auflösung der Peaks (siehe unten) wird
 automatisch berechnet. Notieren Sie für jede Messung die Auflösung der
 wichtigsten Peaks im Laborjournal. Um Auflösung und Signal-to-Noise-Ratio
 automatisch zu zeigen, wählt man Spectrum > Peak Label aus, wählt unter Other
 Label Attributes Resolution und Signal to Noise aus und drückt auf OK.
 (Ansonsten kann man auch nachher in der Verarbeitungssoftware mMass die
 Auflösung noch berechnen.)

Einzelne Spektren und Spot Set abspeichern
Das Abspeichern einzelner kalibrierter Spektren geschieht durch Auswahl von Spectrum
> Save Spectrum To File ... . Dann das Verzeichnis C: \Documents and Settings\All Users
Desktop\Analytical Chemistry Practicum\2019\Gruppe# auswählen und auf Save klicken.
Der Name des Spektrums sollte dem Muster „Gruppe#_Spot#“ (z.B. Group3_B11) folgen.
Das kalibrierte Spektrum und die „Peak List“ sind jetzt in dem „Spot Set“ zusammen mit
Kopien der „Acquisition Methods“ und „Processing Methods“ als „.t2d“-Datei
abgespeichert.

 22

Version 25. Februar 2021

Das ganze „Spot Set“ mit allen aufgenommenen Spektren abspeichern geschieht durch
File > Save Spot Set.
Dateiformat: t2d > ASCII
Damit die Dateien weiterverarbeitet werden können, müssen sie erst in ASCII-
Textdateien umgewandelt werden. Dazu wird die „Data Explorer Software“ (Version 3.7;
build 126) verwendet.

Die Spektren werden geöffnet mit File > Open ... Wählen Sie alle Punkte (halten Sie die
Shift-Taste gedrückt), klicken Sie auf Add All und anschließend auf Finish. (Alternativ
klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Nummer vor dem Spot von Interesse im
„Spot Set Manager“ und wählen Sie View Spectrum in Data Explorer).
Mit File > Export > ASCII Spectrum oder File > Convert All Spectra > ASCII Text
exportieren Sie das Spektrum im aktiven Fenster als ASCII-„.txt“-Datei. Der Name des
Spektrums sollte wiederum dem Muster „Gruppe#_Spot#“ (z.B. Group3_B11) folgen.
Nehmen Sie sicherheitshalber schon am 2. Praktikumstag einen Laptop mit der
installierten „mMass“-Software (siehe unten) mit und überprüfen Sie gleich, ob der
Datentransfer erfolgreich war.
Datentransfer
Die Daten sind bis jetzt nur auf dem Computer des Spektrometers gespeichert. Für den
weiteren Gebrauch werden Ihnen die ASCII-„.txt“-Dateien vom Assistenten per Email
zugeschickt und können dann auf dem eigenen Computer heruntergeladen werden.

Sample aus dem Massenspektrometer nehmen
 • Hochspannung abschalten (Instrument > Turn off High Voltage oder selektieren
 Sie ) und warten Sie einige Sekunden.
 • Wählen Sie Plate > Eject Plate ... und warten 1-2 Minuten.
 • Öffnen Sie den Deckel und entfernen Sie den Träger.

 23

Version 25. Februar 2021

 7. Prozessieren und Auswerten der Spektren in mMass
Installation
Auf der „mMass“-Website http://www.mmass.org/download/ kann das Open-Source
„Mass Spectrometry Tool“ heruntergeladen werden. Installieren und starten Sie die
Software.

Öffnen eines Spektrums
Wenn die obige Vorschrift befolgt worden ist, sollten alle Spektren als ASCII-„.txt“-Datei
in einem Ordner mit Namen gespeichert sein.
Öffnen Sie die „.txt“-Dateien in einem Text-Editor und entfernen Sie die ersten zwei Zeilen,
z.B.: „SPEC#: 1, SIZE: 106853, TIME: 0.000000“. Speichern Sie die “.txt“-Datei wieder ab.
Nach dem Start von „mMass“ müssen jetzt die Dateien nur noch auf die Arbeitsfläche des
Programms gezogen werden: File > Open >.
Nach dem Öffnen eines Spektrums sieht der Bildschirm so aus:

Abb. 12: Beispiel eines „AB 4800“-MALDI-Spektrums vom Bradykinin und α-Cyano-4-
hydroxyzimtsäure im positiven Reflektron-Modus.

 24

Version 25. Februar 2021

Peak-Markierung

Mit Processing oder Processing > Peak Picking... können die wichtigsten Signale
annotiert werden. Rechts im Bild erscheint die „Peak List“ mit der FWHM. Die „mMass“-
Software zeigt auch die Auflösung, wenn man in View > Peak List Columns das Feld
‚Resolution’ markiert.

Mit View > Notations können Sie die Peaks mit einer m/z und einem Label versehen.
Labels können Sie eintragen, indem sie im „Peak List“ auf der entsprechenden m/z
doppelklicken. Tragen Sie das Label ein und drücken Sie auf Add.

 25

Version 25. Februar 2021

Spektrum abspeichern
Die verarbeiteten Spektren können mit File > Export... in verschiedenen Formaten
abgespeichert werden.

Bestimmung der Signalauflösung
Die Signalauflösung („mass resolution“, R) wird angegeben durch den kleinsten Abstand
(„resolving power“) in m/z (Δm/z), der für einen bestimmten m/z-Bereich aufgetrennt
werden kann:
 + +/)
 R = ∆+ = ∆+/)

Die Auflösung ist damit dimensionslos und wird durch die Signalbreite bei einer
definierten Signalhöhe bestimmt. Sie wird als eine Funktion der Masse ausgedrückt (siehe
Abbildung 13).

Abb. 13.: Signalhöhe ist nicht skaliert. Definition des FWHM und R10% (bearbeitet von
Referenz 4).

 26

Version 25. Februar 2021

Die „10 % Tal“-Definition der Auflösung (R10%) wird erfüllt, wenn die Signalbreite bei 5 %
der relativen Signalhöhen (∆m1) gleich ist wie die Distanz zwischen den beiden
Signalmaxima (∆m2). Desto kleiner ∆m1 im Vergleich zu ∆m2 ist, desto höher ist die
Auflösung. Die Signalbreite bei 50 % der Signalhöhe definiert die Full Width at Half
Maximum (FWHM). Die davon abgeleitete R50% verhält sich mit einem Faktor 1.8 zu der
R10% bei einer gaussschen Signalverteilung.
Die Spektren oder Ausschnitte aus den Spektren können nach dem Bearbeiten direkt
gedruckt oder als PNG, TIFF oder JPEG für die weitere Verwendung im Bericht exportiert
werden: File > Export > (wähle Format, etc.) > Export. Die bearbeiteten Spektren
können separat abgespeichert werden: File > Save As... > .

 27

Version 25. Februar 2021

Bericht zum MS-Versuch
Generelles
Es wird ein kurzer, präzise geschriebener Bericht erwartet. Englisch wird bevorzugt, aber
Deutsch ist auch erlaubt. Damit genügend Platz für Korrekturen bleibt, sollte ein
Zeilenabstand von 1.5 verwendet werden. Inhalt des Berichts betrifft nur eine kurze
Erklärung des Ablaufs der Ionisierung für LDI und MALDI und die Spektrenaufklärung der
gemessenen Substanzen.
Ausschlaggebend für die Bewertung der Berichte ist die ausreichende Beschreibung der
Resultate sowie deren Diskussion in Bezug auf die verwendete Messmethode (positiv
/negativ, Linear-/Reflektron-Modus, Matrix, Laserfluenz, „Extraction delay time“).

Aufbau
Der Bericht sollte in folgende Teile gegliedert sein:

Titelblatt:
 • Praktikum Physikalische und Analytische Chemie / Massenspektrometrie
 • Assistent: Adam Pruška oder Philipp Bittner
 • Titel
 • Gruppen Nr.
 • Namen (alphabetisch) und E-Mail-Adressen aller Personen
 • Version Nr., Ort, Datum
 • kurzes Abstract

A Einleitung:
Geben Sie eine kurze Einführung in die Theorie der Massenspektrometrie und
beschreiben Sie die Aufgabenstellung.

B Materialien und Methoden:
Verwendete Messinstrumente (inklusive Software) und eine kurze Beschreibung der
durchgeführten Experimente werden aufgeführt.

C Ergebnisse und Diskussion:
Abbildungen der LDI und MALDI-Spektren aller Substanzkombinationen, so dass alle
Signale gut sichtbar sind (falls nötig, bestimmte Ausschnitte als Vergrösserungen separat
darstellen). Im Spektrum sind alle Peaks mit dem vorgeschlagenen Fragment und der
Masse zu beschriften. Die Auflösung des Precursorsignals (Matrix und Analyt bei MALDI)
sollte für jedes aufgenommene Spektrum berechnet werden. Auch sollte für jedes
Spektrum berechnet werden, wieviel von den Substanzen (in pmol) maximal aufgetragen
worden ist.

 28

Version 25. Februar 2021

Diskussion der Vorgehensweise zur Spektrumaufklärung (Precursorsignal und
Fragment- und Adduktsignale). Die Argumente sollen dabei durch Ausschnitte der
gemessenen Spektren und der darin enthaltenen Massenverschiebungen unterstützt
werden.
Am Ende sollen die Unterschiede zwischen LDI und MALDI und der verschiedenen
Matrices sowie experimentellen Parametern für die gemessenen Verbindungen
besprochen werden.

C Literatur:
Angabe der verwendeten oder zitierten Literatur: Referenzen in der Reihenfolge
auflisten, in welcher diese im Text zitiert werden. Die Namen aller Autoren der zitierten
Publikation sollen aufgeführt werden. Die Namen der Zeitschriften und die Nummern der
Bände werden kursiv geschrieben.
Beispiele von Referenzen zu Artikeln in Zeitschriften [1], Buchkapiteln [2], Büchern [3],
Patenten [4], Computerprogrammen [5] und Dissertationen [6].

[1] X. W., Lou, J. L. J. van Dongen, E. W. Meijer, ‘Generation of CsI Cluster Ions for Mass
 Calibration in Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry’,
 Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2010, 21, 7, 1223-1226.
[2] H. A. Krässig, in 'Cellulose Structure, Accessibility and Reactivity', Ed. M. B. Huglin,
 Gordon and Breach Science Publishers, Yverdon, 1992, Vol. 11, p. 6
[3] J. H. Gross, ‘Mass Spectrometry – A Textbook’, 2nd Edition, Springer-Verlag Berlin
 Heidelberg, 2011.
[4] T. Kamata, N. Wasada, Jap. Pat. 2-204469, 1990, p. 381-384.
[5] G. M. Sheldrick, SHELXL97, Program for the Refinement of Crystal Structures,
 University of Göttingen, Germany, 1997.
[6] B. R. Peterson, Ph.D. Thesis, University of California at Los Angeles, 1994.

D Anhang:
Spektren, Liste der verwendeten Abkürzungen und Berechnungen sowie ein Scan des
Laborjournals.

Kontakt
Adam Pruška HCI E330 (2 29 29) apruska@ethz.ch
Philipp Bittner HCI E330 (2 29 29) pbittner@ethz.ch

 29

Version 25. Februar 2021

Appendix I
 Punkt Matrix Analyt Polarität Linear/Reflektron
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
A9
A10
A11
A12
B1
B2
B3
B4
B5
B6
B7
B8
B9
B10
B11
B12
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
C11
C12

 30

Version 25. Februar 2021

 Punkt Matrix Analyt Polarität Linear/Reflektron
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
D10
D11
D12
E1
E2
E3
E4
E5
E6
E7
E8
E9
E10
E11
E12
F1
F2
F3
F4
F5
F6
F7
F8
F9
F10
F11
F12

 31

Version 25. Februar 2021

 Punkt Matrix Analyt Polarität Linear/Reflektron
G1
G2
G3
G4
G5
G6
G7
G8
G9
G10
G11
G12
H1
H2
H3
H4
H5
H6
H7
H8
H9
H10
H11
H12

 32