Simplexa Flu A/B & RSV Direct
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Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct REF MOL2650 Rev. E Echtzeit-RT-PCR-Test zum qualitativen Nachweis und zur Differenzierung viraler RNA von Influenza A, Influenza B & RSV in vitro In-vitro-Diagnostikum CLIA-Komplexität - Mäßig ANWENDUNGSBEREICH Der Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct-Assay von Focus Diagnostics ist für die Anwendung auf dem Integrated Cycler von 3M bestimmt. Er dient dem qualitativen Nachweis viraler RNA und der In-vitro-Differenzierung zwischen dem Influenza A-, dem Influenza B- und dem Respiratory-Syncytial-Virus (RSV) in Nasenrachenabstrichen menschlicher Patienten mit den Symptomen einer viralen Atemwegsinfektion und ist in Verbindung mit den vorliegenden klinischen und epidemiologischen Risikofaktoren zu beurteilen. Der Test ist als Hilfsmittel zur Differenzialdiagnose von Infektionen mit dem Influenza A-, dem Influenza B- und dem RS-Virus beim Menschen, nicht aber zur Erkennung einer Infektion mit dem Influenza-C-Virus bestimmt. Negative Ergebnisse schließen eine Infektion mit Influenza- oder RS-Virus nicht aus und dürfen nicht als alleinige Grundlage für die Behandlung oder andere Entscheidungen bezüglich der Versorgung des Patienten herangezogen werden. Die Leistungsmerkmale für Influenza A wurden anhand von klinischen Proben erstellt, die in der Grippesaison 2010/2011 gesammelt wurden, als vorwiegend die Influenza-A-Subtypen 2009 H1N1 und H3N2 im Umlauf waren. Wenn andere Influenza-A- Viren auftreten, können sich die Leistungsmerkmale ändern. Wenn basierend auf den von den Gesundheitsbehörden empfohlenen aktuellen klinischen und epidemiologischen Screening- Kriterien eine Infektion mit einem neuartigen Influenza-A-Virus vermutet wird, sollten Proben entnommen und an die lokalen oder nationalen Gesundheitsbehörden zur Untersuchung eingeschickt werden. Die Probenentnahme muss unter Beachtung der für neue, virulente Influenza-Viren geeigneten Infektionsschutzmaßnahmen stattfinden. Falls kein BSL-3-Labor zur Verfügung steht, das die Proben verarbeitet und kultiviert, dürfen in diesen Fällen keine Viruskulturen angelegt werden. ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNG Influenza wird von drei immunologischen Typen (A, B und C) von RNA-Viren aus der Familie der Orthomyxoviridae verursacht. Die weitere Klassifizierung von Influenza A stützt sich auf die Beschreibung von zwei auf der Virusoberfläche exprimierten Virusproteinen, Hämagglutinin und Neuraminidase. Hämagglutinin ermöglicht die Bindung des Virus an die Epithelzellen der Atemwege, während Neuraminidase diese Bindungen an die Wirtszelle löst, sodass neue Virionen freigesetzt werden können. Saisonale Influenza wird üblicherweise durch Viren verursacht, die einen der drei häufigsten Hämagglutinin-Subtypen (H1, H2 und 1 H3) und einen der zwei Neuraminidase-Subtypen (N1 oder N2) enthalten. Influenza B wird nicht nach Subtypen klassifiziert. Influenza äußert sich in der Regel in einer Kombination von Symptomen der oberen und unteren Atemwege, Fieber, Kopfschmerzen, Muskelschmerzen und allgemeinem Unwohlsein. Das Krankheitsbild kann unterschiedlich ausfallen und reicht von isolierten Atemwegsbeschwerden ähnlich einer Erkältung bis hin zu schwerer Lungenentzündung, die stationär behandelt werden muss. Zu den Personen, bei denen ein erhöhtes Risiko für eine stationäre Behandlung aufgrund einer Infektion mit saisonalen Influenzaviren besteht, zählen Kinder unter 2 Jahren, Erwachsene jenseits des 65. Lebensjahres und Patienten mit signifikanten Begleitkrankheiten. Grippe kann zu einer Verschlechterung von Grunderkrankungen wie z. B. Asthma oder Herzinsuffizienz führen. Die Dauer der Krankheit beträgt in der Regel 2–5 Tage, jedoch können die Symptome eine Woche oder länger anhalten. Die Infektion mit dem Respiratory-Syncytial-Virus (RSV) tritt besonders häufig bei Säuglingen und Kleinkindern auf und ist eine führende Ursachen für Krankenhausaufenthalte in dieser Altersgruppe. RSV-Infektionen kommen jedoch auch bei Erwachsenen 2 vor und können in bestimmten Populationen zu schweren Erkrankungen führen. Bei Säuglingen und Kleinkindern reicht das Spektrum der RSV-Erkrankungen von erkältungsartigen Symptomen, Bronchitis oder Krupphusten bis zu Infektionen der unteren Atemwege wie Bronchiolitis und Lungenentzündung. Eine symptomatische Infektion bei Erwachsenen geht in der Regel mit einer Infektion der oberen Atemwege einher und kann sich durch Schnupfen (Rhinorrhö), Halsschmerzen (Pharyngitis) und Husten äußern. Einige Patienten klagen außerdem über Kopfschmerzen, Abgeschlagenheit und Fieber. Bei Erwachsenen mit hohem Risiko, wie beispielsweise Patienten mit bestimmten chronischen Krankheiten oder unter Immunsuppression, kann die 3 Erkrankung schwerer verlaufen und z. B. zu einer Lungenentzündung führen.
Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 2 GRUNDLAGEN DES VERFAHRENS Das Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct-Assay-System ist ein Echtzeit-RT-PCR-System zur direkten Amplifizierung, zum Nachweis und zur Differenzierung von RNA des humanen Influenza-A-Virus (Flu A), RNA des humanen Influenza-B-Virus (Flu B) und RNA des RS-Virus aus unbehandelten Nasenrachenabstrichen (ohne vorherige Nukleinsäure-Extraktion). Das System besteht aus dem Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct-Assay, dem Integrated Cycler von 3M (mit der Integrated Cycler Studio Software), der Direktamplifikationsplatte und dazu benötigtem Zubehör. Im Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct-Assay werden bifunktionelle fluoreszierende Sonden-Primer zusammen mit entsprechenden Rückwärts-Primern verwendet, um RNA von Flu A, Flu B und RSV sowie einer internen Kontrolle zu amplifizieren. Der Assay liefert drei Ergebnisse: zur Identifizierung dieser Viren in den Proben dienen als Zielmoleküle konservierte Regionen der Influenza A-Viren (Matrix-Gen), der Influenza B-Viren (Matrix-Gen) und von RSV (M-Gen). Zur Überprüfung einer Fehlfunktion und/oder Hemmung der RT-PCR wird eine interne RNA-Kontrolle mitgeführt. MITGELIEFERTES MATERIAL Das Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct-Kit von Focus Diagnostics enthält ausreichend Reagenzien für 24 Bestimmungen. Nach Erhalt bei –10 bis –30 ºC aufbewahren (keine Gefriergeräte mit Abtauautomatik verwenden). Jedes Röhrchen enthält genügend Material für eine Anwendung. Innerhalb von 30 Minuten nach der Entnahme aus dem Gefrierschrank verwenden. Beschreibung des Kits Bezeichnung der Komponente Reaktionen Volumen EG-SYMBOL AUF Kurzbezeich Anzahl pro REF Deckelfarbe pro ETIKETT -nung Fläschchen Fläschchen/ Fläschchen Kit Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct MOL2651 REAG A RM Braun 24 1/24 50 µl Reaction Mix Beschreibung der Komponenten Kit-Komponente Inhalt DNA-Polymerase, reverse Transkriptase, RNase-Inhibitor, Puffer und dNTPs, verkapselte RNA-Matrize, mit Fluoreszenzfarbstoff markierte Primer, die Influenza A, Influenza B und RSV und die interne Kontrolle spezifisch erkennen Sonden- Ziel Fluorophor Exzitation Emission Zielgen (Farbstoff) Simplexa™ Flu A/B & Flu A FAM 495 520 Matrix RSV Direct Reaction Mix (RM) (Reaktionsgemisch) Flu B JOE 520 548 Matrix RSV CFR610 590 610 M-Gen Interne Kontrolle Q670 644 670 n. z. „RNA IC“ Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Barcode Card Assayspezifische Parameter, Chargennummer, Verfallsdatum (Barcode-Karte) SEPARAT GELIEFERTES MATERIAL 1. Direct Amplification Disc Kit (REF MOL1455) a) Direktamplifikationsplatten zur Verwendung auf dem Integrated Cycler ERFORDERLICHES, JEDOCH NICHT MITGELIEFERTES MATERIAL 1. 3M Integrated Cycler mit Integrated Cycler Studio Software, Version 4.2 oder höher 2. Simplexa™ Flu A/B & RSV Positive Control Pack (REF MOL2660) 3. Pipette mit fest eingestelltem Volumen von 50 µl (ergonomischer Hochleistungspipettor Signature™ mit Fixvolumen von VWR, Modell VWR FE50, oder gleichwertige Pipette) 4. Sterile, nukleasefreie Einwegpipettenspitzen mit Filter (zum Pipettieren aus den primären Abstrichröhrchen werden extralange Spitzen ≥ 91 mm empfohlen) 5. Gefrierschrank, –10 °C bis –30 °C (mit manueller Abtaufunktion), für die Lagerung der gefrorenen Kit-Komponenten und Proben 6. Kühlschrank mit 2–8 °C (für Proben) 7. Einweg-Schutzhandschuhe (ungepudert)
Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 3 EMPFOHLENES MATERIAL 1. Universal Transport Media (UTM) als Leerwertkontrolle (NTC, No Template Control) 2. Replacement Foil Wedges (REF MOL1550) HANDHABUNG UND HALTBARKEIT VON REAGENZIEN 1. Reagenzien bei –10 bis –30 °C aufbewahren (keine Gefriergeräte mit Abtauautomatik verwenden). 2. Reagenzien vor Gebrauch bei Raumtemperatur auftauen lassen (Temperaturbereich ca. 18 bis 25 °C). 3. Kits und Reagenzien nach Ablauf des Verfalldatums nicht mehr verwenden. 4. Nach der Entnahme des Reaktionsgemischs aus der Gefrierlagerung den Test innerhalb von 30 Minuten starten. 5. Das Reaktionsgemisch nicht vortexen. 6. Das Reaktionsgemisch nicht wieder einfrieren. WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN 1. Beim Umgang mit den Kit-Reagenzien persönliche Schutzausrüstung, wie zum Beispiel (aber nicht beschränkt auf) Handschuhe und Laborkittel, tragen. Hände nach der Durchführung des Tests gründlich waschen. 2. In Bereichen, in denen mit Kit-Reagenzien und/oder Humanproben gearbeitet wird, darf nicht geraucht, gegessen und getrunken werden. In diesen Bereichen ist auch das Berühren von Kontaktlinsen oder das Auftragen von Make-up nicht erlaubt. 3. Nicht verwendete Kit-Reagenzien und Humanproben in Übereinstimmung mit den nationalen und regionalen Vorschriften entsorgen. 4. Die Kontamination von Reagenzien bzw. Patientenproben kann zu einer Verfälschung der Testergebnisse führen. Unter aseptischen Bedingungen arbeiten. 5. Nur das in dieser Packungsbeilage beschriebene Protokoll verwenden. Bei Nichteinhaltung des Protokolls oder der angegebenen Zeiten oder Temperaturen kann es zu fehlerhaften Testergebnissen kommen. 6. Der Testansatz sollte bei Raumtemperatur (Temperaturbereich ca. 18 °C bis 25 °C) erfolgen. 7. Zum Überführen von Proben und Reaktionsgemisch Fixvolumenpipetten oder gleichwertige Artikel verwenden. 8. Die Unterseite der Folie, die in Kontakt mit den Kavitäten und der Plattenoberfläche kommt, möglichst nicht berühren. 9. Um potenzielle Fehlergebnisse zu verhindern, ist darauf zu achten, die Proben und Reagenzien in die jeweils korrekten Kavitäten zu pipettieren. 10. Das Beladen und das Anbringen der Abdeckklebefolie auf einem Keil abschließen, bevor die Folie des nächsten Keils geöffnet wird. 11. Den Lauf innerhalb von 30 Minuten nach der Entnahme des Fläschchens mit dem Reaktionsgemisch aus der Gefrierlagerung starten. 12. Nicht versuchen, einen Keil, der in vorherigen Analysen verwendet wurde, erneut zu verwenden oder die Abdeckklebefolie von einem bereits verwendeten Keil zu entfernen. 13. Die Platten können mehrfach verwendet werden, bis alle 8 Keile benutzt worden sind. Gebrauchte Discs ohne Abnehmen der Abdeckklebefolie als biologisch gefährlichen Abfall entsorgen. 14. Nach jedem Gebrauch sind die DAD-Discs flach und mit der nummerierten Folienseite nach oben zu lagern. 15. Das Reaktionsgemisch enthält >1 % Glycerin, welches bei Einatmen oder Hautkontakt zu Reizungen führen kann. Nach Einatmen oder Berührung sollten Erste-Hilfe-Maßnahmen eingeleitet werden. 16. Das Kit nicht verwenden, wenn die Verpackung oder der Inhalt offensichtlich beschädigt ist. Kontaktieren Sie Focus Diagnostics. Die Kontaktinformationen sind auf der letzten Seite dieses Dokuments zu finden. 17. Die Spektralmatrix muss auf jedem 3M Integrated Cycler installiert sein und darf nicht geändert werden, es sei denn, Focus Diagnostics stellt einen aktualisierten QR-Code für das Gerät zur Verfügung. Jeder 3M Integrated Cycler hat eine eigene spezifische Spektralmatrix. Sie finden diese Spektralmatrix auf der vorderen Umschlagseite des 3M Integrated Cycler- Hardware-Handbuchs. Sollte sich das Matrix-Label nicht scannen bzw. nicht auffinden lassen, wenden Sie sich bitte an Focus Diagnostics. Kontaktadressen befinden sich auf der letzten Seite dieses Dokuments. 18. Das Nichtinstallieren bzw. die Änderung der Spektralmatrix kann zu falschen Ergebnissen führen. GEBRAUCHSANWEISUNG A. PROBENENTNAHME UND HANDHABUNG Geeignete Probentypen sind Abstriche aus dem Nasenrachenraum in etwa 3 ml Universal Transport Media (UTM). Nur Abstrichtupfer mit synthetischer Spitze (z. B. Dacron, Nylon oder Rayon) und einem Schaft aus Aluminium oder Kunststoff verwenden. Keine Kalziumalginattupfer verwenden, da diese Stoffe enthalten können, die den PCR-Test hemmen. Proben sollten auf Eis transportiert werden und bei 2 bis 8°C aufbewahrt werden. Bei längeren Wartezeiten bis zur Bearbeitung der Proben können diese bei –70 °C gemäß UTM-Gebrauchsanweisung eingefroren werden. B. EINSTELLUNG DES GERÄTS FÜR DIE REAL-TIME-PCR 1. Einzelheiten darüber, wie die Integrated Cycler Studio Software zu konfigurieren ist, um eine Assaydefinition hinzuzufügen, einen Lauf einzustellen und die Läufe auf dem Integrated Cycler zu analysieren, sind der Bedienungsanleitung des Integrated Cycler zu entnehmen.
Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 4 C. LADEN DER DIREKTAMPLIFIKATIONSPLATTE UND AMPLIFIZIERUNG MITTELS ECHTZEIT-PCR HINWEIS: Vor dem Schritt der PCR-Amplifikation ist keine Probenextraktion erforderlich. 1. Die zu testenden Proben auswählen. 2. Röhrchen mit Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur (ca. 18 bis 25 °C) auftauen. Für jede zu testende Probe oder Kontrolle ein Reaktionsgemisch-Röhrchen auftauen. 3. Den Barcode auf dem Reaktionsgemisch-Röhrchen oder der Barcode-Karte des Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct- Assays einscannen. 4. Den Platten-Barcode auf der Direct Amplification Disc (DAD) einscannen. 5. Jede Probenkennung einscannen oder eingeben. 6. Jeweils nur von einem Keil die Abdeckklebefolie abziehen, um die Probenkavitäten (SAMPLE) und Reaktionskavitäten (R) zu öffnen, dabei jedoch die Abdeckklebefolie nicht vollständig entfernen (Abbildung 1 & 2). Die Unterseite der Folie, die in Kontakt mit den Kavitäten und der Plattenoberfläche kommt, möglichst nicht berühren. 7. Sicherstellen, dass das Reaktionsgemisch vollständig aufgetaut ist. Die Röhrchen falls notwendig kurz zentrifugieren (das Reaktionsgemisch nicht vortexen). 8. Mit der Festvolumenpipette 50 µl des Reaktionsgemischs in die Reaktionskavität (R) überführen. 9. Mit der Festvolumenpipette 50 µl einer Probe bzw. Kontrolle in die Probenkavität (SAMPLE) überführen. 10. Den Keil mit der abgezogenen Klebefolie abdecken und diese zur Versiegelung der Kavitäten an den Rändern der Platte fest andrücken. Wenn die ursprüngliche Folie eingerissen ist, muss sie durch eine Ersatzkeilfolie ersetzt werden. 11. Den Laschenteil der Abdeckfolie vorsichtig an der Perforierung abtrennen. 12. Für die nächste(n) Probe(n) Schritt 6 bis 11 wiederholen. 13. Die versiegelte Direct Amplification Disc in den Integrated Cycler einsetzen und den Lauf starten. Abbildung 1 – Platte mit abgezogener Folie Abbildung 2 – Probenkavität [Sample] und Von der Proben- und der Reaktionskavität in Keil 3 Reaktionskavität [R] HINWEISE (nur zur Information – keine Maßnahmen/Umsetzung erforderlich): 1. Focus Diagnostics Kits können Versionsnummern für Assay-Definitionen enthalten. Falls eine Versionsnummer vorhanden ist, wird sie an die Assay Definition angehängt, z. B. als ‘Sample IVD Assay.2’. Wenn mehrere Versionen vorhanden sind, verwendet die Software automatisch die mit der eingescannten Chargennummer verknüpfte Assaydefinition. QUALITÄTSKONTROLLE Als externe Kontrolle für die Qualitätskontrolle, zur Einarbeitung oder für Leistungstests kann die Simplexa™ Flu A/B & RSV Positive Control (MOL2660) verwendet werden. Als Leerwertkontrolle (NTC) wird Universal Transport Media empfohlen. Qualitätskontrollbereiche wurden wie in der folgenden Tabelle angegeben ermittelt. Weichen die Kontrollen von diesen Parametern ab, so sollten die Patientenprobenergebnisse als ungültig angesehen und der Test wiederholt werden. Focus empfiehlt die Kontrollen einmal täglich zu testen. Jedes Labor sollte, ausgehend von den vor Ort geltenden Gesetzen, Bestimmungen und der üblichen guten Laborpraxis eigene Qualitätskontrollbereiche wie auch die Häufigkeit der Qualitätskontrollen ermitteln. Anweisungen zur Testung der Positivkontrolle sind der Packungsbeilage der Simplexa™ Flu A/B & RSV Positive Control (PI.MOL2660) zu entnehmen.
Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 5 Erwartete Kontrollergebnisse RNA Internal Control Art der Kontrolle Flu A Flu B RSV (interne RNA- Kontrolle, RNA IC) Simplexa™ Flu A/B & 2 1 Detektiert Detektiert Detektiert Nicht zutreffend RSV Positive Control Leerwertkontrolle (NTC) Nicht detektiert Nicht detektiert Nicht detektiert Valide (Gültig) 1 Typische Ct-Werte für die Positivkontrolle liegen in einem Bereich von 25 bis ≤40. 2 Eine Detektion der Simplexa™ internen RNA-Kontrolle (RNA IC) ist für ein gültiges Ergebnis nicht erforderlich. ERGEBNISSE Nach Beendigung des Laufs werden die Ergebnisse von der Software automatisch ausgewertet und angezeigt. 1. Für jede eingegebene Zugangs-ID (Proben-ID) zeigt die Software ein Ergebnis („Detected“ [Detektiert], „Not Detected“ [Nicht detektiert] oder „Invalid“ (Ungültig) für Flu A, Flu B und RSV an. a. „Detected“ zeigt an, dass Flu A - bzw. Flu B - bzw. RSV-RNA in der Patientenprobe vorhanden ist. b. „Not Detected“ zeigt an, dass Flu A - bzw. Flu B - bzw. RSV-RNA in der Patientenprobe nicht vorhanden ist. c. Als „Invalid“ ausgewiesene Ergebnisse deuten darauf hin, dass kein schlüssiger Nachweis des Vorhandenseins bzw. Nichtvorhandenseins von Flu A - bzw. Flu B - bzw. RSV-RNA in der Patientenprobe möglich ist. Dieses Ergebnis kann folgende Ursachen haben: 1) Fehler der internen Kontrolle (RNA IC) oder 2) unzureichende Probenmenge. Die Probe muss erneut getestet werden. Siehe Abschnitt „Ungültige Ergebnisse“ unten. d. Ein als „EC500“ ausgewiesenes Ergebnis deutet auf das Auftreten eines Datenqualitätsfehlers bei dem/den jeweiligen Virusanalyt(en) hin. Die Software konnte für diese(n) Analyt(en) keine gültige Amplifikation erkennen. Die Probe sollte erneut getestet werden, falls eine Testanforderung für das jeweilige Virus/die jeweiligen Viren vorliegt. 2. Den Bericht ggf. ausdrucken. a. Die Ergebnisse ggf. exportieren. UNGÜLTIGE ERGEBNISSE Bei einem als „Invalid“ angegebenen Ergebnis oder einem Fehlercode muss die Probe mit einem neuen Röhrchen mit Reaktionsgemisch desselben Kits oder aus einem neuen Kit erneut getestet werden. Falls der Fehler weiterhin besteht, wenden Sie sich an den technischen Kundendienst von Focus Diagnostics. EINSCHRÄNKUNGEN 1. In-Vitro-Diagnostikum. 2. In den USA ist dieses Produkt für den Einsatz in Einrichtungen des Gesundheitswesens bestimmt, die mindestens die CLIA- Zertifizierungsstufe „Mäßige Komplexität“ (Moderate Complexity) besitzen. 3. Der Assay ist nicht zum Screening von Spendern vorgesehen. 4. Der Assay ist nur für die Verwendung durch Fachkräfte bestimmt. 5. Rezeptpflichtig. 6. Alle Ergebnisse aus diesen und anderen Tests müssen zusammen mit der klinischen Anamnese, den epidemiologischen Daten und allen anderen Daten, die dem zuständigen Arzt vorliegen, verwendet werden. 7. Die Prävalenz der Virusinfektion beeinflusst den prädiktiven Wert des Assays. 8. Wie bei anderen Testverfahren auch, schließen negative Ergebnisse eine Infektion mit Flu A, Flu B bzw. RSV nicht aus und dürfen nicht als alleinige Grundlage für die Behandlung oder andere Entscheidungen bezüglich der Versorgung des Patienten herangezogen werden. 9. Falls das Virus Genmutationen, Insertionen, Deletionen oder Rearrangements aufweist oder wenn die Testung im Frühstadium der Erkrankung erfolgt, kann es zu falsch negativen Ergebnissen kommen. 10. Der Nachweis viraler Nukleinsäuren ist abhängig vom ordnungsgemäßen Vorgehen bei Probenentnahme, Transport, Handhabung, Aufbewahrung und Vorbereitung der Proben. Mangelnde Beachtung der ordnungsgemäßen Vorgehensweise bei einem dieser Schritte kann zu fehlerhaften Ergebnissen führen. 11. Falsch negative Ergebnisse können auftreten, wenn die Konzentration der vorhandenen Viren unter der analytischen Nachweisgrenze des Assays liegt. 12. Wie bei anderen Testverfahren kann es zu falsch positiven Ergebnissen kommen. Eine Wiederholung des Tests oder die Durchführung des Tests mit einem anderen Gerät kann in manchen Fällen angezeigt sein. 13. Virale Nukleinsäure kann in vivo auch unabhängig von der Lebensfähigkeit der Viren erhalten bleiben. Die Detektion eines Targetanalyten bedeutet nicht, dass die entsprechenden Viren infektiös sind oder dass sie als Krankheitserreger die Ursache für die klinischen Symptome sind. 14. Bei dem Assay handelt es sich um ein qualitatives Testverfahren, es erlaubt keine Aussage über die Gesamtmenge der detektierten Erreger. 15. Dieser Assay kann keine Infektionen ausschließen, die durch andere bakterielle oder virale Erreger verursacht wird. 16. Die Informationen auf dem Kit-Barcode können nur mit einem Barcode-Scanner in die Integrated Cycler Studio-Software übertragen werden. Bei einer Funktionsstörung des Scanners oder wenn die Informationen aus einem anderen Grund nicht übertragbar sind, wenden Sie sich an den technischen Kundendienst von Focus Diagnostics. 17. Die Leistungsfähigkeit dieses Assays für den Nachweis von Influenza A, Influenza B oder RSV in Blut oder Blutprodukten wurde nicht bestimmt.
Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 6 18. Die Leistungsfähigkeit dieses Tests wurde nur mit Humanproben untersucht. 19. Die Leistungsfähigkeit dieses Tests wurde bei Personen mit eingeschränktem Immunsystem nicht untersucht. 20. Die Leistungsfähigkeit dieses Assays wurde nicht für Patienten ermittelt, die keine Symptome einer Virusinfektion der Atemwege aufweisen. 21. Die Leistungsfähigkeit dieses Assays zur Überwachung einer Therapie bei einer Infektion mit Influenza A, Influenza B oder RSV wurde nicht bestimmt. 22. Die Leistungsfähigkeit dieses Assays wurde nicht für Patienten ermittelt, die den inhalativen Influenza-Impfstoff erhalten haben. 23. Die Leistungsfähigkeit dieses Tests wurde für keine anderen Probentypen außer für Nasenrachenabstriche bestimmt. 24. Die Leistungsfähigkeit dieses Tests wurde nicht für Personen ermittelt, die Halstabletten oder mentholhaltige Produkte einnehmen. 25. Wenn sehr hohe Konzentrationen von Influenza A, aber sehr niedrige Konzentrationen von RSV oder Influenza B vorhanden sind, ist das Signal der RSV- bzw. der Influenza B-Reaktion aufgrund kompetitiver Interferenzen unter Umständen für einen Nachweis nicht stark genug. SPEZIFISCHE LEISTUNGSDATEN KLINISCHE ÜBEREINSTIMMUNG – PROSPEKTIVE STUDIE Drei externe Studienzentren und eine interne Stelle nahmen an einer prospektiven klinischen Studie teil. Referenzergebnisse für Influenza A-, Influenza B- und Respiratory-Syncytial-Viren wurden mithilfe von Kulturen erstellt. Die Kultur-Ergebnisse wurden auf die zum Zeitpunkt der Probenentnahme erhaltenen Ergebnissen übertragen. Insgesamt wurden 722 Abstrichproben prospektiv aus dem Nasenrachenraum von Patienten mit Symptomen einer viralen Infektion der Atemwege entnommen. Diese prospektiven Proben wurden in östlichen Bundesstaaten der USA vom 10. November 2010 bis 11. März 2011, im mittleren Westen der USA vom 8. Januar 2011 bis 2. Februar 2011 und in Australien vom 17. August 2010 bis 20. Oktober 2010 gesammelt. 325 der 722 Proben stammten von weiblichen Patienten und 397 Proben von männlichen Patienten. Insgesamt 327 Proben stammten von Patienten unter fünf Jahren, 223 Proben von Patienten im Alter von 5 bis 22 Jahren, 158 von Patienten im Alter von 22 bis 60 Jahren und 14 von Patienten jenseits des 60. Lebensjahres. Von der prospektiven Untersuchung wurden eine (1) Probe aufgrund eines ungültigen Ergebnisses ("Invalid") für Flu A , drei (3) aufgrund eines ungültigen Ergebnisses für Flu B und eine (1) Probe aufgrund eines ungültigen Ergebnisses für RSV ausgeschlossen. Während der Studie lag der Anteil der Proben mit ungültigen Ergebnissen bei 0,4% (3/722) mit einem 95%-Konfidenzintervall von 0,1% bis 1,2%. Klinische Übereinstimmung – Flu A (prospektive Proben – alle Zentren kombiniert) Ergebnis der Kultur Simplexa™ Ergebnisse – Flu A Sensitivität/Spezifität n Detektiert Nicht detektiert 95% CI Sensitivität: 97,1%(66/68) Detektiert 68 66 2 95% CI: 89,9 bis 99,2% Spezifität: 97,9%(639/653) Nicht detektiert 653 14 639 95% CI: 96,4 bis 98,7% Klinische Übereinstimmung – Flu B (prospektive Proben – alle Zentren kombiniert) Ergebnis der Kultur Simplexa™ Ergebnisse – Flu B Sensitivität/Spezifität N Detektiert Nicht detektiert 95% CI Sensitivität: 100,0%(21/21) Detektiert 21 21 0 95% CI: 84,5 bis 100,0% Spezifität: 99,9%(697/698) Nicht detektiert 698 1 697 95% CI: 99,2 bis 100,0% Klinische Übereinstimmung – RSV (prospektive Proben – Zentrum 1) Ergebnis der Kultur Simplexa™ Ergebnisse – RSV Sensitivität/Spezifität N Detektiert Nicht detektiert 95% CI Sensitivität: 100,0%(1/1) Detektiert 1 1 0 95% CI: 20,7 bis 100,0% a Spezifität: 98,2%(323/329) Nicht detektiert 329 6 323 95% CI: 96,1 bis 99,2% a) 4 von 6 Proben wurden mithilfe eines von der FDA freigegebenen Nukleinsäuretests (NAT) als RSV-positiv bestätigt.
Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 7 Klinische Übereinstimmung – RSV (prospektive Proben – Zentrum 2) Ergebnis der Kultur Simplexa™ Ergebnisse – RSV Sensitivität/Spezifität N Detektiert Nicht detektiert 95% CI a Sensitivität: 98,6%(72/73) Detektiert 73 72 1 95% CI: 92,6 bis 99,8% b Spezifität: 89,5%(154/172) Nicht detektiert 172 18 154 95% CI: 84,1 bis 93,3% a) 1 von 1 Probe wurde mithilfe eines von der FDA freigegebenen Nukleinsäuretests (NAT) als RSV-positiv bestätigt. b) 11 von 18 Proben wurde mithilfe eines von der FDA freigegebenen direkten Fluoreszenzantikörper-Tests (DFA) als RSV-positiv bestätigt. Klinische Übereinstimmung – RSV (prospektive Proben – Zentrum 3) Ergebnis der Kultur Simplexa™ Ergebnisse – RSV Sensitivität/Spezifität N Detektiert Nicht detektiert 95% CI Sensitivität: 90,0%(9/10) Detektiert 10 9 1 95% CI: 59,6 bis 98,2% a Spezifität: 84,6%(115/136) Nicht detektiert 136 21 115 95% CI: 77,5 bis 89,7% a) 20 von 21 Proben wurde mithilfe eines von der FDA freigegebenen Nukleinsäuretests als RSV-positiv bestätigt. KLINISCHE ÜBEREINSTIMMUNG – RETROSPEKTIVE STUDIE Drei externe Studienzentren nahmen an einer retrospektiven Studie teil. Referenzergebnisse für Influenza A-, Influenza B- und Respiratory-Syncytial-Virus wurden mithilfe von Kulturen erstellt. Die Kultur-Ergebnisse wurden auf die zum Zeitpunkt der Probenarchivierung erhaltenen Ergebnissen übertragen. Insgesamt wurden 223 Abstrichproben aus dem Nasenrachenraum von Patienten mit Symptomen einer viralen Infektion der Atemwege gewonnen. Klinische Übereinstimmung – Flu A (retrospektive Proben – alle Zentren kombiniert) Ergebnis der Kultur Simplexa™ Ergebnisse – Flu A PPA/NPA* N Detektiert Nicht detektiert 95% CI PPA: 96,2%(76/79) Detektiert 79 76 3 95% CI: 89,4 bis 98,7% NPA: 99,3%(143/144) Nicht detektiert 144 1 143 95% CI: 96,2 bis 99,9% * PPA (Positive Percent Agreement) = prozentuale Positiv-Übereinstimmung, NPA (Negative Percent Agreement) = prozentuale Negativ-Übereinstimmung Klinische Übereinstimmung – Flu B (retrospektive Proben – alle Zentren kombiniert) Ergebnis der Kultur Simplexa™ Ergebnisse – Flu B PPA/NPA* N Detektiert Nicht detektiert 95% CI PPA: 97,6%(40/41) Detektiert 41 40 1 95% CI: 87,4 bis 99,6% NPA: 100,0%(182/182) Nicht detektiert 182 0 182 95% CI: 97,9 bis 100,0% * PPA (Positive Percent Agreement) = prozentuale Positiv-Übereinstimmung, NPA (Negative Percent Agreement) = prozentuale Negativ-Übereinstimmung
Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 8 Klinische Übereinstimmung – RSV (retrospektive Proben – alle Zentren kombiniert) Ergebnis der Kultur Simplexa™ Ergebnisse – RSV PPA/NPA* N Detektiert Nicht detektiert 95% CI PPA: 100,0%(12/12) Detektiert 12 12 0 95% CI: 75,7 bis 100,0% NPA: 98,6%(208/211) Nicht detektiert 211 3 208 95% CI: 95,9 bis 99,5% * PPA (Positive Percent Agreement) = prozentuale Positiv-Übereinstimmung, NPA (Negative Percent Agreement) = prozentuale Negativ-Übereinstimmung REPRODUZIERBARKEIT Drei Prüfzentren beurteilten die Reproduzierbarkeit des Assays zwischen Labors (Inter-Labor-Reproduzierbarkeit) und zwischen Tagen (Inter-Tag) sowie zwischen und innerhalb von Tests (Inter-/Intra-Assay-Reproduzierbarkeit). Jedes Labor untersuchte ein Probenpanel aus sieben zusammengestellten Mischproben, einschließlich einer schwach positiven (ca. 2–4-fache Nachweisgrenze, LoD) und einer mäßig positiven Probe (ca. 20-fache Nachweisgrenze, LoD) für jeden Analyten sowie einer hoch negativen Probe. Die hoch negative Probe enthielt Influenza A, Influenza B und RSV in so geringen Mengen, dass sie zu 95% ein negatives Ergebnis liefern sollte. Die Assays wurden an fünf verschiedenen Tagen im Dreifachansatz durchgeführt. An jedem Prüfzentrum gab es zwei Personen (Bediener), die jeweils einmal pro Tag das gesamte Probenpanel testeten (d. h. insgesamt wurden pro Tag 2 Datensätze erhalten). Die Ergebnisse aller drei Prüfzentren sind in den folgenden Tabellen zusammengefasst. Flu A Prüfzentrum 1 Prüfzentrum 3 Prüfzentrum 4 Gesamtüberein- Überein- Überein- Überein- stimmung Probe stimmung mit Mittel- stimmung Mittel- stimmung Mittel- mit 95% CI wert % wert % wert % den mit den mit den CV CV CV den erwarteten erwarteten Ct* erwarteten Ct* erwarteten Ct* Ergebnissen Ergebnissen Ergebnissen Ergebnissen Flu A 100% (30/30) 34,3 0,9 100% (30/30) 34,4 0,9 100% (30/30) 34,6 1,1 100% (90/90) 95,9 bis 100% Schwach positiv Flu A 100% (30/30) 31,9 0,6 100% (30/30) 32,1 0,4 100% (30/30) 32,3 1,5 100% (90/90) 95,9 bis 100% Mäßig Positiv Flu B 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (90/90) 95,9 bis 100% Schwach positiv Flu B 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (90/90) 95,9 bis 100% Mäßig Positiv RSV 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (90/90) 95,9 bis 100% Schwach positiv RSV 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (90/90) 95,9 bis 100% Mäßig Positiv Hoch negativ 100% (30/30) 40,1 0,0 90% (27/30) 39,7 3,0 100% (30/30) 40,1 0,0 96,7% (87/90) 90,7 bis 98,9% Gesamtüberein- 100% (210/210) 98,6% (207/210) 100% (210/210) 99,5% (627/630) 98,6 bis 99,8% stimmung Für statistische Zwecke wird Proben, die negativ für einen Analyten sind, der Wert 40,1 zugewiesen. Negative Proben haben einen Ct-Wert von Null (0). Flu B Prüfzentrum 1 Prüfzentrum 3 Prüfzentrum 4 Überein- Gesamtüber- Überein- Überein- stimmung einstimmung stimmung mit Mittel- stimmung Mittel- Mittel- % % mit den % mit 95% CI Probe den wert mit den wert wert CV CV erwarteten CV den erwarteten erwarteten erwarteten Ct Ct Ergebnisse Ct Ergebnissen Ergebnissen Ergebnissen n Flu A 100% 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 40,1 0,0 100% (90/90) 95,9 bis 100% Schwach positiv (30/30) Flu A 100% 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 40,1 0,0 100% (90/90) 95,9 bis 100% Mäßig Positiv (30/30) Flu B 100% 100% (30/30) 33,4 0,9 96,7% (29/30) 33,9 3,6 33,6 2,3 98,9% (89/90) 94 bis 99,8% Schwach positiv (30/30)
Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 9 Flu B Prüfzentrum 1 Prüfzentrum 3 Prüfzentrum 4 Überein- Gesamtüber- Überein- Überein- stimmung einstimmung stimmung mit Mittel- stimmung Mittel- Mittel- % % mit den % mit 95% CI Probe den wert mit den wert wert CV CV erwarteten CV den erwarteten erwarteten erwarteten Ct Ct Ergebnisse Ct Ergebnissen Ergebnissen Ergebnissen n Flu B 100% 100% (30/30) 31,1 0,5 100% (30/30) 31,7 0,7 31,2 0,9 100% (90/90) 95,9 bis 100% Mäßig Positiv (30/30) RSV 100% 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 40,1 0,0 100% (90/90) 95,9 bis 100% Schwach positiv (30/30) RSV 100% 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 40,1 0,0 100% (90/90) 95,9 bis 100% Mäßig Positiv (30/30) 96,7% Hoch negativ 96,7% (29/30) 40,0 1,0 93,3% (28/30) 39,9 2,4 40,1 0,0 95,6% (86/90) 89,1 bis 98,3% (29/30) Gesamtüberein 99,5% (209/210) 98,6% (207/210) 99,5% (209/210) 99,2% (625/630) 98,2 bis 99,7% -stimmung Für statistische Zwecke wird Proben, die negativ für einen Analyten sind, der Wert 40,1 zugewiesen. Negative Proben haben einen Ct-Wert von Null (0). RSV Prüfzentrum 1 Prüfzentrum 3 Prüfzentrum 4 Überein- Gesamtüber- Überein- Überein- einstimmung stimmung Probe stimmung mit Mittel- stimmung mit Mittel- Mittel- mit den 95% CI wert % wert % mit den wert % den den erwarteten CV CV erwarteten CV erwarteten Ct erwarteten Ct Ct Ergebnissen Ergebnisse Ergebnissen Ergebnissen n Flu A 100% 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 40,1 0,0 100% (90/90) 95,9 bis 100% Schwach positiv (30/30) Flu A 100% 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 40,1 0,0 100% (90/90) 95,9 bis 100% Mäßig Positiv (30/30) Flu B 100% 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 40,1 0,0 100% (90/90) 95,9 bis 100% Schwach positiv (30/30) Flu B 100% 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 40,1 0,0 100% (90/90) 95,9 bis 100% Mäßig Positiv (30/30) RSV 100% 100% (30/30) 33,4 1,6 100% (30/30) 33,7 1,2 33,8 2,4 100% (90/90) 95,9 bis 100% Schwach positiv (30/30) RSV 100% 100% (30/30) 31,6 1,8 100% (30/30) 32,5 2,9 31,9 3,3 100% (90/90) 95,9 bis 100% Mäßig Positiv (30/30) 96,7% Hoch negativ 100% (30/30) 40,1 0,0 90% (27/30) 39,9 1,7 40,1 0,4 95,6% (86/90) 89,1 bis 98,3% (29/30) Gesamtüberein- 100% (210/210) 98,6% (207/210) 99,5% (209/210) 99,4% (626/630) 98,4 bis99,8% stimmung Für statistische Zwecke wird Proben, die negativ für einen Analyten sind, der Wert 40,1 zugewiesen. Negative Proben haben einen Ct-Wert von Null (0). Es wurden Änderungen am Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct-Assay vorgenommen und die Leistungsfähigkeit dieses Assays wurde validiert. Die Leistung war äquivalent. Es folgen aktualisierte Tabellen für die Analyseempfindlichkeit/Nachweisgrenze, Analytische Reaktivität und die Kreuzreaktivität. ANALYSEEMPFINDLICHKEIT / NACHWEISGRENZE Drei (3) Influenza A-Stämme, zwei (2) Influenza B-Stämme und zwei (2) RSV-Stämme wurden getestet, um die Nachweisgrenze (LoD, Limit of Detection) für den modifizierten Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct-Assay zu bestimmen. Für jedes Virus wurden während der Screening-Phase zur Bestimmung der vorläufigen Nachweisgrenze vier (4) Konzentrationen im Dreifachansatz getestet. Die niedrigste Konzentration, die während der Screening-Phase mit allen Parallelproben nachgewiesen werden konnte, wurde in 32 Parallelansätzen erneut getestet, um einen Nachweis dieser Konzentration zu bestätigen. Die LoD wird festgesetzt, wenn mindestens 31/32 (≥95,%) der Parallelproben nachgewiesen werden. Die nachfolgende Tabelle zeigt einen Vergleich der Nachweisgrenze des originalen Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct-Assays mit der des modifizierten Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct-Assays.
Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 10 Virusstamm LoD-Konzentration (TCID50/ml) Originaler Modifizierter Simplexa™ Flu A/B Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct & RSV Direct Influenza A/ Hong Kong/8/68 (H3N2) 10 0,1 Influenza A/PR/8/34 (H1N1) 0,005 0,05 Influenza A Swine NY/02/2009 (H1N1) 0,1 1 Influenza B/Great Lakes/1739/54 2 20 Influenza B/Malaysia/2506/2004 20 1 RSV-A2 1 2 RSV B CH93-18 (18) 3 2 ANALYTISCHE REAKTIVITÄT / KREUZREAKTIVITÄT Analytische Reaktivität Es wurden verschiedene Stämme von Influenza A, einschließlich der Subtypen H1, H3 und H5, sowie von Influenza B und RSV, einschließlich der Subtypen A und B, untersucht. Gewählt wurden die Stämme, die jüngst im Umlauf waren, sowie geografisch unterschiedliche Stämme. Von quantifiziertem Virusmaterial wurde in einer negativen Abstrichmatrix eine einzige Verdünnung in den unten angegebenen Konzentrationen hergestellt. Diese wurde jeweils in dreifacher Ausführung getestet. Die bei der Untersuchung gewonnenen Ct-Werte zeigen an, dass alle Virenstämme in der Nähe der Nachweisgrenze (LoD) getestet wurden. Alle getesteten Stämme wurden in angemessener Weise nachgewiesen. Analytische Reaktivität mit zusätzlichen Virusstämmen Erreger Testkonzentration Ergebnis Influenza A Taiwan/42/06 H1N1 100 TCID50/ml Flu A detektiert Influenza A/Anhui/1/2013 (H7N9) 25.000 EID50/ml Flu A detektiert Influenza A/Brisbane/10/07 H3 100 TCID50/ml Flu A detektiert Influenza A/Brisbane/59/07 H1 100 TCID50/ml Flu A detektiert Influenza A/California/12/2012 (H1N1) pdm09 100 TCID50/ml Flu A detektiert Influenza A/California/7/2009 NYMC x-179-A 100 IU/ml Flu A detektiert Influenza A/Indiana/08/2011 (H3N2)v 100 TCID50/ml Flu A detektiert Influenza A/Minnesota/11/2010 (H3N2)v 100 CEID50/ml Flu A detektiert Influenza A/New Caledonia/20/99 H1N1 100 TCID50/ml Flu A detektiert Influenza A/Ohio/02/2012 (H3N2) 200 CEID50/ml Flu A detektiert Influenza A/Port Chalmers/1/73 H3N2 100 TCID50/ml Flu A detektiert Influenza A/PR/8/34 (H1N1) 100 TCID50/ml Flu A detektiert Influenza A/Solomon Island/03/06 100 TCID50/ml Flu A detektiert Influenza A/Swine NY/02/2009 H1N1 100 TCID50/ml Flu A detektiert Influenza A/Swine/1976/31 H1N1 100 TCID50/ml Flu A detektiert Influenza A/Swine/Iowa/15/30 H1N1 100 TCID50/ml Flu A detektiert Influenza A/Texas/50/2012 (H3N2) 100 TCID50/ml Flu A detektiert
Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 11 Erreger Testkonzentration Ergebnis Influenza A/Wisconsin/67/05 H3 100 TCID50/ml Flu A detektiert Influenza A/WS/33 H1N1 100 TCID50/ml Flu A detektiert Influenza B/Allen/45 100 TCID50/ml Flu B detektiert Influenza B/Brisbane/60/2008 100 CEID50/ml Flu B detektiert Influenza B/Florida/02/2006 100 TCID50/ml Flu B detektiert Influenza B/Florida/04/2006 100 TCID50/ml Flu B detektiert Influenza B/Florida/07/04 100 TCID50/ml Flu B detektiert Influenza B/Hong Kong/5/72 100 TCID50/ml Flu B detektiert Influenza B/Lee/40 100 TCID50/ml Flu B detektiert Influenza B/Maryland/1/59 100 TCID50/ml Flu B detektiert Influenza B Panama/45/90 100 TCID50/ml Flu B detektiert Influenza B/Taiwan/2/62 100 TCID50/ml Flu B detektiert Influenza B/Wisconsin/01/2010 100 CEID50/ml Flu B detektiert RSV-A Long 100 TCID50/ml RSV detektiert RSV-B 9320 100 TCID50/ml RSV detektiert RSV-B Wash/18537/62 100 TCID50/ml RSV detektiert RSV B WV/14617/85 100 TCID50/ml RSV detektiert HINWEIS: Obwohl dieser Test nachweislich neuartige Vogelgrippeviren des Subtyps Influenza-A H7N9 sowie H3N2v-Viren in Kultur detektieren konnte, wurden die Leistungsmerkmale dieses Kits für klinische Proben, die Influenza-A (H7N9)- und Influenza H3N2v-positiv sind, bisher nicht spezifiziert. Kreuzreaktivität (analytische Spezifität) Die analytische Spezifität des Simplexa™ Assays wurde ermittelt, indem getestet wurde, ob ausschließlich Influenza-A-Virus bzw. Influenza-B-Virus bzw. RSV identifiziert werden, ohne Kreuzreaktivität mit nahe verwandten Keimen oder Keimen, die die gleichen klinischen Symptome verursachen, oder Keimen, die als normale Flora in den zu untersuchenden Proben vorkommen. Zwei und dreißig (32) mögliche Kreuzreagenzien wurde einzeln in klinisch relevanten Konzentrationen in eine Abstrichmatrix geimpft. Die unbeimpfte Matrix wurde ebenfalls getestet, um Ausgangswerte zu erhalten. Die Proben zum Nachweis der Kreuzreaktivität wurden dreifach getestet. Falls in einem der Detektionskanäle (Flu A, Flu B, RSV) in einem der drei Replikate ein Signal detektiert wurde, wurden weitere 5 Replikate zur Bestätigung getestet. Weder für Flu A noch für Flu B oder RSV wurde Kreuzreaktivität festgestellt. ™ Simplexa Flu A/B & RSV Direct – Kreuzreaktivität %Nachweis (Anzahl detektiert/Gesamtanzahl) Getestete Erreger N Flu A Flu B RSV Konzentration IC (Q670) (FAM) (JOE) (CFR610) Ausgangswert n. z. 5 0,0%(0/5) 0,0%(0/5) 0,0%(0/5) 100,0%(5/5) Adenovirus 1 4,17E+05 TCID50/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Adenovirus 7A 5,37E+05 TCID50/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Bordetella pertussis A639 1,88E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Chlamydia pneumoniae 1,00E+06 IFU/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Cytomegalievirus (CMV) 1,04E+05 U/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 12 %Nachweis (Anzahl detektiert/Gesamtanzahl) Getestete Erreger N Flu A Flu B RSV Konzentration IC (Q670) (FAM) (JOE) (CFR610) Coronavirus 229E 5,89E+05 TCID50/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Coronavirus OC43 1,95E+05 TCID50/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Corynebacterium diphtheriae 4,00E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Enterovirus Typ 71 1,10E+05 TCID50/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Epstein-Barr-Virus (EBV) 1,10E+05 Kopien/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Escherichia coli O157:H7 1,10E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Haemophilus influenzae 1,1E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Lactobacillus plantarum, 17-5 7,97E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Legionella longbeachae 8,3E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Masern 1,95E+05 TCID50/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Metapneumovirus 9 1,58E+05 TCID50/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Moraxella catarrhalis, NE1 1,49E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Mumps 8,51E+05 TCID50/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Mycobacterium tuberculosis (genomische DNA) 6,54E+06 c/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Mycoplasma pneumoniae, M129 3,16E+06 ccu/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Neisseria elongata 2,05E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Neisseria meningitides 7,07E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Parainfluenza 1 1,15E+05 TCID50/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Parainfluenza 2 3,80E+05 IU/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Parainfluenza 3 1,95E+05 TCID50/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Pseudomonas aeruginosa 3,93E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Rhinovirus 1A 1,26E+05 TCID50/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Staphylococcus aureus, COL 1,42E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Staphylococcus epidermidis 9,23E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Streptococcus pneumoniae 9,20E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Streptococcus pyogenes, M1 1,36E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) Streptococcus salivarius 2,12E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3) INTERFERENZ Die Leistung dieses Assays wurde mit möglicherweise interferierenden und im Nasenrachenraum ggf. vorhandenen Substanzen bewertet. Die potenziellen Interferenzen wurden in einer künstlichen Probe untersucht, die Influenza A (Influenza A/PR/8/34 H1N1) in einer Konzentration von 0,01 TCID50/ml, Influenza B (Influenza B/Malaysia/2506/2004) in einer Konzentration von 40 TCID50/ml und RSV A2 in einer Konzentration von 4 TCID 50/ml enthielt. Alle Stämme wurden bei der 2 bis 4-fachen Nachweisgrenze (LoD) getestet. Es ergaben sich keine Hinweise auf eine Interferenz aufgrund der in den angegebenen Konzentrationen getesteten Substanzen. Konzentration der Potenziell interferierende Substanz Wirkstoff interferierenden Substanz Afrin (Nasenspray) Oxymetazolin 15% (Vol./Vol.) Antibiotikum, systemisch Tobramycin 4 µg/ml Antibiotikum, Nasensalbe Mupirocin 6,6 mg/ml Blut n. z. 2% (Vol./Vol.) aus der Unterkieferspeicheldrüse vom Gereinigtes Mucin-Protein 60 µg/ml Rind, Typ I-S
Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 13 Konzentration der Potenziell interferierende Substanz Wirkstoff interferierenden Substanz Nasales Corticosteroid – Beconase AQ Beclomethason 5% (Vol./Vol.) Nasales Corticosteroid – Fluticason Fluticason 5% (Vol./Vol.) Relenza, Virustatikum Zanamivir 3,3 mg/ml Tamiflu, Virustatikum Oseltamivir 1 µM Luffa opperculata, Galphimia glauca, Zicam Nasengel 5% (Vol./Vol.) Histaminum hydrochloricum KOMPETITIVE INTERFERENZ Die Studie zur kompetitiven Interferenz untersuchte die Auswirkungen klinisch relevanter Begleitinfektionen auf jeden der vom Assay nachgewiesenen Analyten. Es wurde geprüft, ob eine hohe Konzentration eines Virus in der Probe die Leistung des Simplexa™-Assays hinsichtlich eines anderen, niedrig konzentrierten Targets im Multiplex-Assay potenziell beeinflussen könnte. Für jedes Target (Influenza A, Influenza B und RSV) wurde eine schwach positive Baseline-Probe (“Baseline-Stamm") mit einer Konzentration von etwa dem 2- bis 4-Fachen der Nachweisgrenze (LoD) hergestellt und für jede Probe wurde ein Ct-Baseline- Wert ermittelt. Die schwach konzentrierte Probe wurde mit jedem der bei einer Begleitinfektion potenziell vorhandenen Viren beimpft (siehe nachstehende Tabelle). Bei Anwesenheit von zwei Viren gab es keine Interferenzen hoher Konzentrationen von RSV oder Influenza B mit dem Nachweis von Influenza A. Hohe Konzentrationen von Influenza A können jedoch mit dem Nachweis sehr geringer Konzentrationen von Influenza B oder RSV interferieren. Kompetitive Interferenz - Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Kompetitive Ergebnis (Anzahl Baseline- Kompetitiver interferierende detektiert/Gesamtanzahl) Baseline-Stamm Konzentration interferierender Stamm Konzentration [TCID50/ml] Flu A Flu B RSV [TCID50/ml] 0,01 Influenza B/GL/1739/54 19566,3 3/3 3/3 0/3 Influenza A/PR/8/34 0,01 RSV A2 806 8/8 0/8 8/8 (H1N1) 0,01 RSV B Ch93-18(18) 10659 6/8 0/8 8/8 Influenza A/PR/8/34 8 0,174 3/3 3/3 0/3 (H1N1) Influenza B/GL/1739/54 8 RSV A2 80,6 0/3 3/3 3/3 8 RSV B Ch93-18(18) 1065,9 0/3 3/3 3/3 Influenza A/PR/8/34 4 0,174 3/3 0/3 3/3 (H1N1) RSV A2 4 Influenza B/GL/1739/54 19566,3 0/3 3/3 3/3 Influenza A/PR/8/34 6 0,174 3/3 0/3 3/3 (H1N1) RSV B Ch93-18(18) 6 Influenza B/GL/1739/54 19566,3 0/8 8/8 7/8 HEMMUNG DURCH ANDERE MIKROORGANISMEN Der Simplexa™-Assay wurde auf seine Fähigkeit zur Erkennung von Influenza A-Virus, Influenza B-Virus und RSV im Beisein potenziell inhibitorischer Organismen untersucht. Das Panel von 32 potenziell inhibitorischen Organismen wurde einzeln in eine Mischprobe mit einer niedrigen Konzentration (etwa zweifache Nachweisgrenze, LoD) von Influenza A (Influenza A/PR/8/34 H1N1), Influenza B (Influenza B/Malaysia/2506/2004) und RSV (A2) geimpft. Die Proben zum Nachweis der Hemmung wurden dreifach getestet. Falls in einem der Detektionskanäle (Flu A, Flu B, RSV) in einem der drei Replikate kein Signal detektiert wurde, wurden weitere fünf Replikate zur Bestätigung getestet. Weder für Influenza A noch für Influenza B oder RSV wurde mit den getesteten Konzentrationen eine hemmende Wirkung festgestellt.
Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 14 Hemmung durch andere Erreger - Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Konzentration des Mikroorganismus Konzentrationseinheiten Flu A Flu B RSV Mikroorganismus 5 Adenovirus 1 1,1 x10 TCID50/ml + + + 5 Adenovirus 7A 1,1 x10 TCID50/ml + + + 6 Bordetella pertussis 1,1 x10 KBE/ml + + + 6 1 Chlamydia pneumoniae 1,1 x10 Kopien/ml + + + 5 Cytomegalievirus (CMV) 1,1 x10 TCID50/ml + + + 5 Coronavirus 229E 1,1 x10 TCID50/ml + + + 1 5 Coronavirus OC43 1,1 x10 TCID50/ml + + + 6 Corynebacterium diphtheriae 1,1 x10 KBE/ml + + + 6 E. coli O157 1,1 x10 KBE/ml + + + 5 2 Epstein-Barr-Virus (EBV) 1,1 x10 Kopien/mL + + + 1 5 Enterovirus 71 1,1 x10 TCID50/ml + + + 6 Haemophilus influenzae 1,1 x10 KBE/ml + + + 6 Lactobacillus plantarum, 17-5 1,1 x10 KBE/ml + + + 6 Legionella longbeachae 1,1 x10 KBE/ml + + + 5 Masernvirus 1,1 x10 TCID50/ml + + + 5 Metapneumovirus 1,1 x10 TCID50/ml + + + 6 Moraxella catarrhalis Ne11 1,1 x10 KBE/ml + + + 5 Mumpsvirus 1,1 x10 TCID50/ml + + + 6 Mycobacterium tuberculosis 1,1 x10 KBE/ml + + + 6 Mycoplasma pneumoniae M129 1,1 x10 TCID50/ml + + + 6 Neisseria elongata 1,1 x10 KBE/ml + + + 6 Neisseria meningitidis 1,1 x10 KBE/ml + + + 5 Parainfluenza Typ 1 1,1 x10 TCID50/ml + + + 5 Parainfluenza Typ 2 1,1 x10 TCID50/ml + + + 5 Parainfluenza Typ 3 1,1 x10 TCID50/ml + + + 6 Pseudomonas aeruginosa 1,1 x10 KBE/ml + + + 5 Rhinovirus 1A 1,1 x10 TCID50/ml + + + 6 Staphylococcus aureus, COL 1,1 x10 KBE/ml + + + 6 Staphylococcus epidermidis 1,1 x10 KBE/ml + + + 6 Streptococcus pneumoniae 1,1 x10 KBE/ml + + + 6 Streptococcus pyogenes 1,1 x10 KBE/ml + + + 6 Streptococcus salivarius 1,1 x10 KBE/ml + + + 1) Die Ersttestungen schienen auf eine mögliche Hemmung hinzudeuten, was sich bei Testwiederholung nicht bestätigte. C. pneumoniae hatte einen Titer von 1,52 x 105 IFU/ml, der mit einem quantitativen Echtzeit-PCR-Assay weiter quantifiziert wurde. 2) EBV wurde vom Anbieter mit einem quantitativen Echtzeit-PCR-Assay quantifiziert. KONTAMINATION DURCH VERSCHLEPPUNG Eine interne Studie zu Verschleppungen zielte darauf ab, Kontaminationen in negativen Proben festzustellen. Die Studie bestand darin, hoch positive und hoch negative Proben abwechselnd auf jeder Platte zu platzieren. Der Verschleppungseffekt wurde durch Vergleich der beobachteten Negativrate für die negative Probe mit der erwarteten Rate unter normalen Bedingungen der Testwiederholung bestimmt. Weder für Flu A, noch für Flu B oder RSV wurde eine Kontamination durch Verschleppung festgestellt.
Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 15 ERWARTETE WERTE Die Prävalenz der Influenza ändert sich jedes Jahr mit der im Herbst und Winter in den USA auftretenden Grippesaison. Zu den Variablen, die die Anzahl der positiven Fälle aus Atemwegsproben beeinflussen, gehören: die Effizienz und die Auswahl des Zeitpunktes der Probenentnahme, die Handhabung und der Transport der Proben, die Jahreszeit, das Alter der Patienten und die lokale Krankheitsprävalenz. Die prospektiven Proben, die wir in unserer klinischen Studie verwendeten, stammten aus den 4 USA und aus Australien. Die Prävalenz aller Influenzaviren in den USA lag während des Probennahmezeitraums von September 2010 bis März 2011 im Bereich von 2,1 bis 35,5%. Während der Saison waren von den Influenza-positiven Proben 72,9% positiv für Influenza A und 27,1% positiv für Influenza B. In jedem Jahr treten im Herbst, Winter und/oder in den Frühlingsmonaten RSV-Epidemien auf, die in der Regel 3–4 Monate 4 anhalten. Wann genau die RSV-Epidemien jeweils auftreten, kann je nach Region verschieden sein . Der Anteil der positiven RSV-Proben betrug in den USA während der Zeitspanne, die den Probennahmezeitraum vom September 2010 bis März 2011 5 6 einschließt, 15,9% . In Australien testeten während der Grippesaison 2010 9% der Proben positiv für Influenza ; der Anteil der positiven RSV-Proben wurde nicht gemeldet. Die während unserer prospektiven klinischen Studie beobachtete Prävalenz (durch Referenzmethoden ermittelte positive Proben) ist in den nachstehenden Tabellen angegeben. Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct – Stratifiziert nach Orten der Probenentnahme Australien (n=330) Gesamt < 5 Jahre 5–21 Jahre 22–60 Jahre > 60 Jahre Analyt (Prävalenz) (n=63) (n=106) (n=147) (n=14) Influenza A 2,7% (9/330) 0 5 4 0 Influenza B 2,9% (7/330) 3 2 2 0 Respiratory-Syncytial-Virus 0,7% (1/330) 0 0 1 0 Ohio (n=245) Gesamt < 5 Jahre 5–21 Jahre 22–60 Jahre > 60 Jahre Analyt (Prävalenz) (n=195) (n=48) (n=2) (n=0) Influenza A 11,4% (28/245) 14 14 0 0 Influenza B 1,2% (3/245) 1 2 0 0 Respiratory-Syncytial-Virus 29,8% (73/245) 70 3 0 0 Virginia (n=147) Gesamt < 5 Jahre 5–21 Jahre 22–60 Jahre > 60 Jahre Analyt (Prävalenz) (n=69) (n=69) (n=9) (n=0) Influenza A 21% (31/147) 10 20 1 0 Influenza B 7,5% (11/147) 1 10 0 0 Respiratory-Syncytial-Virus 7,5% (11/147) 9 2 0 0 LITERATUR 1. http://www.cdc.gov/flu/about/viruses/types.htm 2. http://www.cdc.gov/rsv/clinical/description.html 3. http://www.cdc.gov/Features/dsRSV/ 4. http://www.cdc.gov/flu/weekly/pastreports.htm 5. http://www.cdc.gov/surveillance/nrevss/rsv/state.html 6. http://www.health.gov.au/internet/main/publishing.nsf/Content/cda-ozflu-no44-10.htm
® Die Verwendung von Scorpions -Sonden für Zwecke der In-Vitro-Diagnostik beim Menschen ist durch eine Lizenz geschützt, die Focus Diagnostics, Inc. von DxS, Ltd. erhalten hat. Die Farbstoffe Black Hole Quencher™, CAL Fluor™ und Quasar™ sind Marken der Biosearch Technologies, Inc. („BTI“). Die entsprechende Farbstofftechnologie ist im Rahmen eines Vertrags mit BTI lizenziert und diese Produkte werden ausschließlich für klinische, diagnostische oder Forschungs- und Entwicklungszwecke verkauft. VERTRIEB DURCH: mdi Europa GmbH, Langenhagener Str. 171 30855, Langenhagen-Hannover, Deutschland PI.MOL2650.IVD.DE BESTELLINFORMATIONEN Rev. E Erstellt: 2. Dezember 2014 Telefon: (800) 838-4548 (nur USA) (562) 240-6500 (International) Fax: (714) 243-4703 TECHNISCHE HILFE Telefon: (800) 838-4548 (nur USA) (562) 240-6500 (International) Fax: (562) 240-6526 Besuchen Sie unsere Webseite: www.focusdx.com Cypress, California 90630 USA
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