Simplexa Flu A/B & RSV Direct
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Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct
REF MOL2650
Rev. E
Echtzeit-RT-PCR-Test zum qualitativen Nachweis und zur
Differenzierung viraler RNA von Influenza A, Influenza B &
RSV in vitro
In-vitro-Diagnostikum
CLIA-Komplexität - Mäßig
ANWENDUNGSBEREICH
Der Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct-Assay von Focus Diagnostics ist für die Anwendung auf dem Integrated Cycler von 3M
bestimmt. Er dient dem qualitativen Nachweis viraler RNA und der In-vitro-Differenzierung zwischen dem Influenza A-, dem
Influenza B- und dem Respiratory-Syncytial-Virus (RSV) in Nasenrachenabstrichen menschlicher Patienten mit den Symptomen
einer viralen Atemwegsinfektion und ist in Verbindung mit den vorliegenden klinischen und epidemiologischen Risikofaktoren zu
beurteilen. Der Test ist als Hilfsmittel zur Differenzialdiagnose von Infektionen mit dem Influenza A-, dem Influenza B- und dem
RS-Virus beim Menschen, nicht aber zur Erkennung einer Infektion mit dem Influenza-C-Virus bestimmt.
Negative Ergebnisse schließen eine Infektion mit Influenza- oder RS-Virus nicht aus und dürfen nicht als alleinige Grundlage für
die Behandlung oder andere Entscheidungen bezüglich der Versorgung des Patienten herangezogen werden.
Die Leistungsmerkmale für Influenza A wurden anhand von klinischen Proben erstellt, die in der Grippesaison 2010/2011
gesammelt wurden, als vorwiegend die Influenza-A-Subtypen 2009 H1N1 und H3N2 im Umlauf waren. Wenn andere Influenza-A-
Viren auftreten, können sich die Leistungsmerkmale ändern.
Wenn basierend auf den von den Gesundheitsbehörden empfohlenen aktuellen klinischen und epidemiologischen Screening-
Kriterien eine Infektion mit einem neuartigen Influenza-A-Virus vermutet wird, sollten Proben entnommen und an die lokalen oder
nationalen Gesundheitsbehörden zur Untersuchung eingeschickt werden. Die Probenentnahme muss unter Beachtung der für
neue, virulente Influenza-Viren geeigneten Infektionsschutzmaßnahmen stattfinden. Falls kein BSL-3-Labor zur Verfügung steht,
das die Proben verarbeitet und kultiviert, dürfen in diesen Fällen keine Viruskulturen angelegt werden.
ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNG
Influenza wird von drei immunologischen Typen (A, B und C) von RNA-Viren aus der Familie der Orthomyxoviridae verursacht.
Die weitere Klassifizierung von Influenza A stützt sich auf die Beschreibung von zwei auf der Virusoberfläche exprimierten
Virusproteinen, Hämagglutinin und Neuraminidase. Hämagglutinin ermöglicht die Bindung des Virus an die Epithelzellen der
Atemwege, während Neuraminidase diese Bindungen an die Wirtszelle löst, sodass neue Virionen freigesetzt werden können.
Saisonale Influenza wird üblicherweise durch Viren verursacht, die einen der drei häufigsten Hämagglutinin-Subtypen (H1, H2 und
1
H3) und einen der zwei Neuraminidase-Subtypen (N1 oder N2) enthalten. Influenza B wird nicht nach Subtypen klassifiziert.
Influenza äußert sich in der Regel in einer Kombination von Symptomen der oberen und unteren Atemwege, Fieber,
Kopfschmerzen, Muskelschmerzen und allgemeinem Unwohlsein. Das Krankheitsbild kann unterschiedlich ausfallen und reicht
von isolierten Atemwegsbeschwerden ähnlich einer Erkältung bis hin zu schwerer Lungenentzündung, die stationär behandelt
werden muss. Zu den Personen, bei denen ein erhöhtes Risiko für eine stationäre Behandlung aufgrund einer Infektion mit
saisonalen Influenzaviren besteht, zählen Kinder unter 2 Jahren, Erwachsene jenseits des 65. Lebensjahres und Patienten mit
signifikanten Begleitkrankheiten. Grippe kann zu einer Verschlechterung von Grunderkrankungen wie z. B. Asthma oder
Herzinsuffizienz führen. Die Dauer der Krankheit beträgt in der Regel 2–5 Tage, jedoch können die Symptome eine Woche oder
länger anhalten.
Die Infektion mit dem Respiratory-Syncytial-Virus (RSV) tritt besonders häufig bei Säuglingen und Kleinkindern auf und ist eine
führende Ursachen für Krankenhausaufenthalte in dieser Altersgruppe. RSV-Infektionen kommen jedoch auch bei Erwachsenen
2
vor und können in bestimmten Populationen zu schweren Erkrankungen führen. Bei Säuglingen und Kleinkindern reicht das
Spektrum der RSV-Erkrankungen von erkältungsartigen Symptomen, Bronchitis oder Krupphusten bis zu Infektionen der unteren
Atemwege wie Bronchiolitis und Lungenentzündung. Eine symptomatische Infektion bei Erwachsenen geht in der Regel mit einer
Infektion der oberen Atemwege einher und kann sich durch Schnupfen (Rhinorrhö), Halsschmerzen (Pharyngitis) und Husten
äußern. Einige Patienten klagen außerdem über Kopfschmerzen, Abgeschlagenheit und Fieber. Bei Erwachsenen mit hohem
Risiko, wie beispielsweise Patienten mit bestimmten chronischen Krankheiten oder unter Immunsuppression, kann die
3
Erkrankung schwerer verlaufen und z. B. zu einer Lungenentzündung führen.Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 2
GRUNDLAGEN DES VERFAHRENS
Das Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct-Assay-System ist ein Echtzeit-RT-PCR-System zur direkten Amplifizierung, zum Nachweis
und zur Differenzierung von RNA des humanen Influenza-A-Virus (Flu A), RNA des humanen Influenza-B-Virus (Flu B) und RNA
des RS-Virus aus unbehandelten Nasenrachenabstrichen (ohne vorherige Nukleinsäure-Extraktion). Das System besteht aus
dem Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct-Assay, dem Integrated Cycler von 3M (mit der Integrated Cycler Studio Software), der
Direktamplifikationsplatte und dazu benötigtem Zubehör.
Im Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct-Assay werden bifunktionelle fluoreszierende Sonden-Primer zusammen mit entsprechenden
Rückwärts-Primern verwendet, um RNA von Flu A, Flu B und RSV sowie einer internen Kontrolle zu amplifizieren. Der Assay
liefert drei Ergebnisse: zur Identifizierung dieser Viren in den Proben dienen als Zielmoleküle konservierte Regionen der Influenza
A-Viren (Matrix-Gen), der Influenza B-Viren (Matrix-Gen) und von RSV (M-Gen). Zur Überprüfung einer Fehlfunktion und/oder
Hemmung der RT-PCR wird eine interne RNA-Kontrolle mitgeführt.
MITGELIEFERTES MATERIAL
Das Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct-Kit von Focus Diagnostics enthält ausreichend Reagenzien für 24 Bestimmungen. Nach
Erhalt bei –10 bis –30 ºC aufbewahren (keine Gefriergeräte mit Abtauautomatik verwenden). Jedes Röhrchen enthält genügend
Material für eine Anwendung. Innerhalb von 30 Minuten nach der Entnahme aus dem Gefrierschrank verwenden.
Beschreibung des Kits
Bezeichnung der Komponente Reaktionen
Volumen
EG-SYMBOL AUF Kurzbezeich Anzahl pro
REF Deckelfarbe pro
ETIKETT -nung Fläschchen Fläschchen/
Fläschchen
Kit
Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct
MOL2651 REAG A RM Braun 24 1/24 50 µl
Reaction Mix
Beschreibung der Komponenten
Kit-Komponente Inhalt
DNA-Polymerase, reverse Transkriptase, RNase-Inhibitor, Puffer und dNTPs, verkapselte RNA-Matrize, mit
Fluoreszenzfarbstoff markierte Primer, die Influenza A, Influenza B und RSV und die interne Kontrolle spezifisch
erkennen
Sonden-
Ziel Fluorophor Exzitation Emission Zielgen
(Farbstoff)
Simplexa™ Flu A/B & Flu A FAM 495 520 Matrix
RSV Direct Reaction Mix
(RM) (Reaktionsgemisch)
Flu B JOE 520 548 Matrix
RSV CFR610 590 610 M-Gen
Interne Kontrolle
Q670 644 670 n. z.
„RNA IC“
Simplexa™ Flu A/B &
RSV Direct Barcode Card Assayspezifische Parameter, Chargennummer, Verfallsdatum
(Barcode-Karte)
SEPARAT GELIEFERTES MATERIAL
1. Direct Amplification Disc Kit (REF MOL1455)
a) Direktamplifikationsplatten zur Verwendung auf dem Integrated Cycler
ERFORDERLICHES, JEDOCH NICHT MITGELIEFERTES MATERIAL
1. 3M Integrated Cycler mit Integrated Cycler Studio Software, Version 4.2 oder höher
2. Simplexa™ Flu A/B & RSV Positive Control Pack (REF MOL2660)
3. Pipette mit fest eingestelltem Volumen von 50 µl (ergonomischer Hochleistungspipettor Signature™ mit Fixvolumen von
VWR, Modell VWR FE50, oder gleichwertige Pipette)
4. Sterile, nukleasefreie Einwegpipettenspitzen mit Filter (zum Pipettieren aus den primären Abstrichröhrchen werden
extralange Spitzen ≥ 91 mm empfohlen)
5. Gefrierschrank, –10 °C bis –30 °C (mit manueller Abtaufunktion), für die Lagerung der gefrorenen Kit-Komponenten und
Proben
6. Kühlschrank mit 2–8 °C (für Proben)
7. Einweg-Schutzhandschuhe (ungepudert)Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 3
EMPFOHLENES MATERIAL
1. Universal Transport Media (UTM) als Leerwertkontrolle (NTC, No Template Control)
2. Replacement Foil Wedges (REF MOL1550)
HANDHABUNG UND HALTBARKEIT VON REAGENZIEN
1. Reagenzien bei –10 bis –30 °C aufbewahren (keine Gefriergeräte mit Abtauautomatik verwenden).
2. Reagenzien vor Gebrauch bei Raumtemperatur auftauen lassen (Temperaturbereich ca. 18 bis 25 °C).
3. Kits und Reagenzien nach Ablauf des Verfalldatums nicht mehr verwenden.
4. Nach der Entnahme des Reaktionsgemischs aus der Gefrierlagerung den Test innerhalb von 30 Minuten starten.
5. Das Reaktionsgemisch nicht vortexen.
6. Das Reaktionsgemisch nicht wieder einfrieren.
WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN
1. Beim Umgang mit den Kit-Reagenzien persönliche Schutzausrüstung, wie zum Beispiel (aber nicht beschränkt auf)
Handschuhe und Laborkittel, tragen. Hände nach der Durchführung des Tests gründlich waschen.
2. In Bereichen, in denen mit Kit-Reagenzien und/oder Humanproben gearbeitet wird, darf nicht geraucht, gegessen und
getrunken werden. In diesen Bereichen ist auch das Berühren von Kontaktlinsen oder das Auftragen von Make-up nicht
erlaubt.
3. Nicht verwendete Kit-Reagenzien und Humanproben in Übereinstimmung mit den nationalen und regionalen Vorschriften
entsorgen.
4. Die Kontamination von Reagenzien bzw. Patientenproben kann zu einer Verfälschung der Testergebnisse führen. Unter
aseptischen Bedingungen arbeiten.
5. Nur das in dieser Packungsbeilage beschriebene Protokoll verwenden. Bei Nichteinhaltung des Protokolls oder der
angegebenen Zeiten oder Temperaturen kann es zu fehlerhaften Testergebnissen kommen.
6. Der Testansatz sollte bei Raumtemperatur (Temperaturbereich ca. 18 °C bis 25 °C) erfolgen.
7. Zum Überführen von Proben und Reaktionsgemisch Fixvolumenpipetten oder gleichwertige Artikel verwenden.
8. Die Unterseite der Folie, die in Kontakt mit den Kavitäten und der Plattenoberfläche kommt, möglichst nicht berühren.
9. Um potenzielle Fehlergebnisse zu verhindern, ist darauf zu achten, die Proben und Reagenzien in die jeweils korrekten
Kavitäten zu pipettieren.
10. Das Beladen und das Anbringen der Abdeckklebefolie auf einem Keil abschließen, bevor die Folie des nächsten Keils
geöffnet wird.
11. Den Lauf innerhalb von 30 Minuten nach der Entnahme des Fläschchens mit dem Reaktionsgemisch aus der Gefrierlagerung
starten.
12. Nicht versuchen, einen Keil, der in vorherigen Analysen verwendet wurde, erneut zu verwenden oder die Abdeckklebefolie
von einem bereits verwendeten Keil zu entfernen.
13. Die Platten können mehrfach verwendet werden, bis alle 8 Keile benutzt worden sind. Gebrauchte Discs ohne Abnehmen der
Abdeckklebefolie als biologisch gefährlichen Abfall entsorgen.
14. Nach jedem Gebrauch sind die DAD-Discs flach und mit der nummerierten Folienseite nach oben zu lagern.
15. Das Reaktionsgemisch enthält >1 % Glycerin, welches bei Einatmen oder Hautkontakt zu Reizungen führen kann. Nach
Einatmen oder Berührung sollten Erste-Hilfe-Maßnahmen eingeleitet werden.
16. Das Kit nicht verwenden, wenn die Verpackung oder der Inhalt offensichtlich beschädigt ist. Kontaktieren Sie Focus
Diagnostics. Die Kontaktinformationen sind auf der letzten Seite dieses Dokuments zu finden.
17. Die Spektralmatrix muss auf jedem 3M Integrated Cycler installiert sein und darf nicht geändert werden, es sei denn, Focus
Diagnostics stellt einen aktualisierten QR-Code für das Gerät zur Verfügung. Jeder 3M Integrated Cycler hat eine eigene
spezifische Spektralmatrix. Sie finden diese Spektralmatrix auf der vorderen Umschlagseite des 3M Integrated Cycler-
Hardware-Handbuchs. Sollte sich das Matrix-Label nicht scannen bzw. nicht auffinden lassen, wenden Sie sich bitte an
Focus Diagnostics. Kontaktadressen befinden sich auf der letzten Seite dieses Dokuments.
18. Das Nichtinstallieren bzw. die Änderung der Spektralmatrix kann zu falschen Ergebnissen führen.
GEBRAUCHSANWEISUNG
A. PROBENENTNAHME UND HANDHABUNG
Geeignete Probentypen sind Abstriche aus dem Nasenrachenraum in etwa 3 ml Universal Transport Media (UTM). Nur
Abstrichtupfer mit synthetischer Spitze (z. B. Dacron, Nylon oder Rayon) und einem Schaft aus Aluminium oder Kunststoff
verwenden. Keine Kalziumalginattupfer verwenden, da diese Stoffe enthalten können, die den PCR-Test hemmen. Proben
sollten auf Eis transportiert werden und bei 2 bis 8°C aufbewahrt werden. Bei längeren Wartezeiten bis zur Bearbeitung der
Proben können diese bei –70 °C gemäß UTM-Gebrauchsanweisung eingefroren werden.
B. EINSTELLUNG DES GERÄTS FÜR DIE REAL-TIME-PCR
1. Einzelheiten darüber, wie die Integrated Cycler Studio Software zu konfigurieren ist, um eine Assaydefinition
hinzuzufügen, einen Lauf einzustellen und die Läufe auf dem Integrated Cycler zu analysieren, sind der
Bedienungsanleitung des Integrated Cycler zu entnehmen.Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 4
C. LADEN DER DIREKTAMPLIFIKATIONSPLATTE UND AMPLIFIZIERUNG MITTELS ECHTZEIT-PCR
HINWEIS: Vor dem Schritt der PCR-Amplifikation ist keine Probenextraktion erforderlich.
1. Die zu testenden Proben auswählen.
2. Röhrchen mit Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur (ca. 18 bis 25 °C) auftauen. Für jede zu testende Probe oder
Kontrolle ein Reaktionsgemisch-Röhrchen auftauen.
3. Den Barcode auf dem Reaktionsgemisch-Röhrchen oder der Barcode-Karte des Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct-
Assays einscannen.
4. Den Platten-Barcode auf der Direct Amplification Disc (DAD) einscannen.
5. Jede Probenkennung einscannen oder eingeben.
6. Jeweils nur von einem Keil die Abdeckklebefolie abziehen, um die Probenkavitäten (SAMPLE) und Reaktionskavitäten
(R) zu öffnen, dabei jedoch die Abdeckklebefolie nicht vollständig entfernen (Abbildung 1 & 2). Die Unterseite der Folie,
die in Kontakt mit den Kavitäten und der Plattenoberfläche kommt, möglichst nicht berühren.
7. Sicherstellen, dass das Reaktionsgemisch vollständig aufgetaut ist. Die Röhrchen falls notwendig kurz zentrifugieren
(das Reaktionsgemisch nicht vortexen).
8. Mit der Festvolumenpipette 50 µl des Reaktionsgemischs in die Reaktionskavität (R) überführen.
9. Mit der Festvolumenpipette 50 µl einer Probe bzw. Kontrolle in die Probenkavität (SAMPLE) überführen.
10. Den Keil mit der abgezogenen Klebefolie abdecken und diese zur Versiegelung der Kavitäten an den Rändern der Platte
fest andrücken. Wenn die ursprüngliche Folie eingerissen ist, muss sie durch eine Ersatzkeilfolie ersetzt werden.
11. Den Laschenteil der Abdeckfolie vorsichtig an der Perforierung abtrennen.
12. Für die nächste(n) Probe(n) Schritt 6 bis 11 wiederholen.
13. Die versiegelte Direct Amplification Disc in den Integrated Cycler einsetzen und den Lauf starten.
Abbildung 1 – Platte mit abgezogener Folie Abbildung 2 – Probenkavität [Sample] und
Von der Proben- und der Reaktionskavität in Keil 3 Reaktionskavität [R]
HINWEISE (nur zur Information – keine Maßnahmen/Umsetzung erforderlich):
1. Focus Diagnostics Kits können Versionsnummern für Assay-Definitionen enthalten. Falls eine Versionsnummer
vorhanden ist, wird sie an die Assay Definition angehängt, z. B. als ‘Sample IVD Assay.2’. Wenn mehrere Versionen
vorhanden sind, verwendet die Software automatisch die mit der eingescannten Chargennummer verknüpfte
Assaydefinition.
QUALITÄTSKONTROLLE
Als externe Kontrolle für die Qualitätskontrolle, zur Einarbeitung oder für Leistungstests kann die Simplexa™ Flu A/B & RSV
Positive Control (MOL2660) verwendet werden. Als Leerwertkontrolle (NTC) wird Universal Transport Media empfohlen.
Qualitätskontrollbereiche wurden wie in der folgenden Tabelle angegeben ermittelt. Weichen die Kontrollen von diesen
Parametern ab, so sollten die Patientenprobenergebnisse als ungültig angesehen und der Test wiederholt werden. Focus
empfiehlt die Kontrollen einmal täglich zu testen. Jedes Labor sollte, ausgehend von den vor Ort geltenden Gesetzen,
Bestimmungen und der üblichen guten Laborpraxis eigene Qualitätskontrollbereiche wie auch die Häufigkeit der
Qualitätskontrollen ermitteln. Anweisungen zur Testung der Positivkontrolle sind der Packungsbeilage der Simplexa™ Flu A/B &
RSV Positive Control (PI.MOL2660) zu entnehmen.Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 5
Erwartete Kontrollergebnisse
RNA Internal Control
Art der Kontrolle Flu A Flu B RSV (interne RNA-
Kontrolle, RNA IC)
Simplexa™ Flu A/B & 2
1 Detektiert Detektiert Detektiert Nicht zutreffend
RSV Positive Control
Leerwertkontrolle (NTC) Nicht detektiert Nicht detektiert Nicht detektiert Valide (Gültig)
1
Typische Ct-Werte für die Positivkontrolle liegen in einem Bereich von 25 bis ≤40.
2
Eine Detektion der Simplexa™ internen RNA-Kontrolle (RNA IC) ist für ein gültiges Ergebnis nicht erforderlich.
ERGEBNISSE
Nach Beendigung des Laufs werden die Ergebnisse von der Software automatisch ausgewertet und angezeigt.
1. Für jede eingegebene Zugangs-ID (Proben-ID) zeigt die Software ein Ergebnis („Detected“ [Detektiert], „Not Detected“
[Nicht detektiert] oder „Invalid“ (Ungültig) für Flu A, Flu B und RSV an.
a. „Detected“ zeigt an, dass Flu A - bzw. Flu B - bzw. RSV-RNA in der Patientenprobe vorhanden ist.
b. „Not Detected“ zeigt an, dass Flu A - bzw. Flu B - bzw. RSV-RNA in der Patientenprobe nicht vorhanden ist.
c. Als „Invalid“ ausgewiesene Ergebnisse deuten darauf hin, dass kein schlüssiger Nachweis des
Vorhandenseins bzw. Nichtvorhandenseins von Flu A - bzw. Flu B - bzw. RSV-RNA in der Patientenprobe
möglich ist. Dieses Ergebnis kann folgende Ursachen haben: 1) Fehler der internen Kontrolle (RNA IC) oder 2)
unzureichende Probenmenge. Die Probe muss erneut getestet werden. Siehe Abschnitt „Ungültige Ergebnisse“
unten.
d. Ein als „EC500“ ausgewiesenes Ergebnis deutet auf das Auftreten eines Datenqualitätsfehlers bei dem/den
jeweiligen Virusanalyt(en) hin. Die Software konnte für diese(n) Analyt(en) keine gültige Amplifikation erkennen.
Die Probe sollte erneut getestet werden, falls eine Testanforderung für das jeweilige Virus/die jeweiligen Viren
vorliegt.
2. Den Bericht ggf. ausdrucken.
a. Die Ergebnisse ggf. exportieren.
UNGÜLTIGE ERGEBNISSE
Bei einem als „Invalid“ angegebenen Ergebnis oder einem Fehlercode muss die Probe mit einem neuen Röhrchen mit
Reaktionsgemisch desselben Kits oder aus einem neuen Kit erneut getestet werden. Falls der Fehler weiterhin besteht, wenden
Sie sich an den technischen Kundendienst von Focus Diagnostics.
EINSCHRÄNKUNGEN
1. In-Vitro-Diagnostikum.
2. In den USA ist dieses Produkt für den Einsatz in Einrichtungen des Gesundheitswesens bestimmt, die mindestens die CLIA-
Zertifizierungsstufe „Mäßige Komplexität“ (Moderate Complexity) besitzen.
3. Der Assay ist nicht zum Screening von Spendern vorgesehen.
4. Der Assay ist nur für die Verwendung durch Fachkräfte bestimmt.
5. Rezeptpflichtig.
6. Alle Ergebnisse aus diesen und anderen Tests müssen zusammen mit der klinischen Anamnese, den epidemiologischen
Daten und allen anderen Daten, die dem zuständigen Arzt vorliegen, verwendet werden.
7. Die Prävalenz der Virusinfektion beeinflusst den prädiktiven Wert des Assays.
8. Wie bei anderen Testverfahren auch, schließen negative Ergebnisse eine Infektion mit Flu A, Flu B bzw. RSV nicht aus und
dürfen nicht als alleinige Grundlage für die Behandlung oder andere Entscheidungen bezüglich der Versorgung des Patienten
herangezogen werden.
9. Falls das Virus Genmutationen, Insertionen, Deletionen oder Rearrangements aufweist oder wenn die Testung im
Frühstadium der Erkrankung erfolgt, kann es zu falsch negativen Ergebnissen kommen.
10. Der Nachweis viraler Nukleinsäuren ist abhängig vom ordnungsgemäßen Vorgehen bei Probenentnahme, Transport,
Handhabung, Aufbewahrung und Vorbereitung der Proben. Mangelnde Beachtung der ordnungsgemäßen Vorgehensweise
bei einem dieser Schritte kann zu fehlerhaften Ergebnissen führen.
11. Falsch negative Ergebnisse können auftreten, wenn die Konzentration der vorhandenen Viren unter der analytischen
Nachweisgrenze des Assays liegt.
12. Wie bei anderen Testverfahren kann es zu falsch positiven Ergebnissen kommen. Eine Wiederholung des Tests oder die
Durchführung des Tests mit einem anderen Gerät kann in manchen Fällen angezeigt sein.
13. Virale Nukleinsäure kann in vivo auch unabhängig von der Lebensfähigkeit der Viren erhalten bleiben. Die Detektion eines
Targetanalyten bedeutet nicht, dass die entsprechenden Viren infektiös sind oder dass sie als Krankheitserreger die Ursache
für die klinischen Symptome sind.
14. Bei dem Assay handelt es sich um ein qualitatives Testverfahren, es erlaubt keine Aussage über die Gesamtmenge der
detektierten Erreger.
15. Dieser Assay kann keine Infektionen ausschließen, die durch andere bakterielle oder virale Erreger verursacht wird.
16. Die Informationen auf dem Kit-Barcode können nur mit einem Barcode-Scanner in die Integrated Cycler Studio-Software
übertragen werden. Bei einer Funktionsstörung des Scanners oder wenn die Informationen aus einem anderen Grund nicht
übertragbar sind, wenden Sie sich an den technischen Kundendienst von Focus Diagnostics.
17. Die Leistungsfähigkeit dieses Assays für den Nachweis von Influenza A, Influenza B oder RSV in Blut oder Blutprodukten
wurde nicht bestimmt.Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 6
18. Die Leistungsfähigkeit dieses Tests wurde nur mit Humanproben untersucht.
19. Die Leistungsfähigkeit dieses Tests wurde bei Personen mit eingeschränktem Immunsystem nicht untersucht.
20. Die Leistungsfähigkeit dieses Assays wurde nicht für Patienten ermittelt, die keine Symptome einer Virusinfektion der
Atemwege aufweisen.
21. Die Leistungsfähigkeit dieses Assays zur Überwachung einer Therapie bei einer Infektion mit Influenza A, Influenza B oder
RSV wurde nicht bestimmt.
22. Die Leistungsfähigkeit dieses Assays wurde nicht für Patienten ermittelt, die den inhalativen Influenza-Impfstoff erhalten
haben.
23. Die Leistungsfähigkeit dieses Tests wurde für keine anderen Probentypen außer für Nasenrachenabstriche bestimmt.
24. Die Leistungsfähigkeit dieses Tests wurde nicht für Personen ermittelt, die Halstabletten oder mentholhaltige Produkte
einnehmen.
25. Wenn sehr hohe Konzentrationen von Influenza A, aber sehr niedrige Konzentrationen von RSV oder Influenza B vorhanden
sind, ist das Signal der RSV- bzw. der Influenza B-Reaktion aufgrund kompetitiver Interferenzen unter Umständen für einen
Nachweis nicht stark genug.
SPEZIFISCHE LEISTUNGSDATEN
KLINISCHE ÜBEREINSTIMMUNG – PROSPEKTIVE STUDIE
Drei externe Studienzentren und eine interne Stelle nahmen an einer prospektiven klinischen Studie teil. Referenzergebnisse für
Influenza A-, Influenza B- und Respiratory-Syncytial-Viren wurden mithilfe von Kulturen erstellt. Die Kultur-Ergebnisse wurden auf
die zum Zeitpunkt der Probenentnahme erhaltenen Ergebnissen übertragen. Insgesamt wurden 722 Abstrichproben prospektiv
aus dem Nasenrachenraum von Patienten mit Symptomen einer viralen Infektion der Atemwege entnommen. Diese prospektiven
Proben wurden in östlichen Bundesstaaten der USA vom 10. November 2010 bis 11. März 2011, im mittleren Westen der USA
vom 8. Januar 2011 bis 2. Februar 2011 und in Australien vom 17. August 2010 bis 20. Oktober 2010 gesammelt. 325 der 722
Proben stammten von weiblichen Patienten und 397 Proben von männlichen Patienten. Insgesamt 327 Proben stammten von
Patienten unter fünf Jahren, 223 Proben von Patienten im Alter von 5 bis 22 Jahren, 158 von Patienten im Alter von 22 bis 60
Jahren und 14 von Patienten jenseits des 60. Lebensjahres. Von der prospektiven Untersuchung wurden eine (1) Probe aufgrund
eines ungültigen Ergebnisses ("Invalid") für Flu A , drei (3) aufgrund eines ungültigen Ergebnisses für Flu B und eine (1) Probe
aufgrund eines ungültigen Ergebnisses für RSV ausgeschlossen. Während der Studie lag der Anteil der Proben mit ungültigen
Ergebnissen bei 0,4% (3/722) mit einem 95%-Konfidenzintervall von 0,1% bis 1,2%.
Klinische Übereinstimmung – Flu A (prospektive Proben – alle Zentren kombiniert)
Ergebnis der Kultur Simplexa™ Ergebnisse – Flu A Sensitivität/Spezifität
n Detektiert Nicht detektiert 95% CI
Sensitivität: 97,1%(66/68)
Detektiert 68 66 2
95% CI: 89,9 bis 99,2%
Spezifität: 97,9%(639/653)
Nicht detektiert 653 14 639
95% CI: 96,4 bis 98,7%
Klinische Übereinstimmung – Flu B (prospektive Proben – alle Zentren kombiniert)
Ergebnis der Kultur Simplexa™ Ergebnisse – Flu B Sensitivität/Spezifität
N Detektiert Nicht detektiert 95% CI
Sensitivität: 100,0%(21/21)
Detektiert 21 21 0
95% CI: 84,5 bis 100,0%
Spezifität: 99,9%(697/698)
Nicht detektiert 698 1 697
95% CI: 99,2 bis 100,0%
Klinische Übereinstimmung – RSV (prospektive Proben – Zentrum 1)
Ergebnis der Kultur Simplexa™ Ergebnisse – RSV Sensitivität/Spezifität
N Detektiert Nicht detektiert 95% CI
Sensitivität: 100,0%(1/1)
Detektiert 1 1 0
95% CI: 20,7 bis 100,0%
a Spezifität: 98,2%(323/329)
Nicht detektiert 329 6 323
95% CI: 96,1 bis 99,2%
a) 4 von 6 Proben wurden mithilfe eines von der FDA freigegebenen Nukleinsäuretests (NAT) als RSV-positiv bestätigt.Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 7
Klinische Übereinstimmung – RSV (prospektive Proben – Zentrum 2)
Ergebnis der Kultur Simplexa™ Ergebnisse – RSV Sensitivität/Spezifität
N Detektiert Nicht detektiert 95% CI
a Sensitivität: 98,6%(72/73)
Detektiert 73 72 1
95% CI: 92,6 bis 99,8%
b Spezifität: 89,5%(154/172)
Nicht detektiert 172 18 154
95% CI: 84,1 bis 93,3%
a) 1 von 1 Probe wurde mithilfe eines von der FDA freigegebenen Nukleinsäuretests (NAT) als RSV-positiv bestätigt.
b) 11 von 18 Proben wurde mithilfe eines von der FDA freigegebenen direkten Fluoreszenzantikörper-Tests (DFA) als RSV-positiv bestätigt.
Klinische Übereinstimmung – RSV (prospektive Proben – Zentrum 3)
Ergebnis der Kultur Simplexa™ Ergebnisse – RSV Sensitivität/Spezifität
N Detektiert Nicht detektiert 95% CI
Sensitivität: 90,0%(9/10)
Detektiert 10 9 1
95% CI: 59,6 bis 98,2%
a Spezifität: 84,6%(115/136)
Nicht detektiert 136 21 115
95% CI: 77,5 bis 89,7%
a) 20 von 21 Proben wurde mithilfe eines von der FDA freigegebenen Nukleinsäuretests als RSV-positiv bestätigt.
KLINISCHE ÜBEREINSTIMMUNG – RETROSPEKTIVE STUDIE
Drei externe Studienzentren nahmen an einer retrospektiven Studie teil. Referenzergebnisse für Influenza A-, Influenza B- und
Respiratory-Syncytial-Virus wurden mithilfe von Kulturen erstellt. Die Kultur-Ergebnisse wurden auf die zum Zeitpunkt der
Probenarchivierung erhaltenen Ergebnissen übertragen. Insgesamt wurden 223 Abstrichproben aus dem Nasenrachenraum von
Patienten mit Symptomen einer viralen Infektion der Atemwege gewonnen.
Klinische Übereinstimmung – Flu A (retrospektive Proben – alle Zentren kombiniert)
Ergebnis der Kultur Simplexa™ Ergebnisse – Flu A PPA/NPA*
N Detektiert Nicht detektiert 95% CI
PPA: 96,2%(76/79)
Detektiert 79 76 3
95% CI: 89,4 bis 98,7%
NPA: 99,3%(143/144)
Nicht detektiert 144 1 143
95% CI: 96,2 bis 99,9%
* PPA (Positive Percent Agreement) = prozentuale Positiv-Übereinstimmung, NPA (Negative Percent Agreement) = prozentuale
Negativ-Übereinstimmung
Klinische Übereinstimmung – Flu B (retrospektive Proben – alle Zentren kombiniert)
Ergebnis der Kultur Simplexa™ Ergebnisse – Flu B PPA/NPA*
N Detektiert Nicht detektiert 95% CI
PPA: 97,6%(40/41)
Detektiert 41 40 1
95% CI: 87,4 bis 99,6%
NPA: 100,0%(182/182)
Nicht detektiert 182 0 182
95% CI: 97,9 bis 100,0%
* PPA (Positive Percent Agreement) = prozentuale Positiv-Übereinstimmung, NPA (Negative Percent Agreement) = prozentuale
Negativ-ÜbereinstimmungSimplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 8
Klinische Übereinstimmung – RSV (retrospektive Proben – alle Zentren kombiniert)
Ergebnis der Kultur Simplexa™ Ergebnisse – RSV PPA/NPA*
N Detektiert Nicht detektiert 95% CI
PPA: 100,0%(12/12)
Detektiert 12 12 0
95% CI: 75,7 bis 100,0%
NPA: 98,6%(208/211)
Nicht detektiert 211 3 208
95% CI: 95,9 bis 99,5%
* PPA (Positive Percent Agreement) = prozentuale Positiv-Übereinstimmung, NPA (Negative Percent Agreement) = prozentuale
Negativ-Übereinstimmung
REPRODUZIERBARKEIT
Drei Prüfzentren beurteilten die Reproduzierbarkeit des Assays zwischen Labors (Inter-Labor-Reproduzierbarkeit) und zwischen
Tagen (Inter-Tag) sowie zwischen und innerhalb von Tests (Inter-/Intra-Assay-Reproduzierbarkeit). Jedes Labor untersuchte ein
Probenpanel aus sieben zusammengestellten Mischproben, einschließlich einer schwach positiven (ca. 2–4-fache
Nachweisgrenze, LoD) und einer mäßig positiven Probe (ca. 20-fache Nachweisgrenze, LoD) für jeden Analyten sowie einer hoch
negativen Probe. Die hoch negative Probe enthielt Influenza A, Influenza B und RSV in so geringen Mengen, dass sie zu 95% ein
negatives Ergebnis liefern sollte. Die Assays wurden an fünf verschiedenen Tagen im Dreifachansatz durchgeführt. An jedem
Prüfzentrum gab es zwei Personen (Bediener), die jeweils einmal pro Tag das gesamte Probenpanel testeten (d. h. insgesamt
wurden pro Tag 2 Datensätze erhalten). Die Ergebnisse aller drei Prüfzentren sind in den folgenden Tabellen zusammengefasst.
Flu A
Prüfzentrum 1 Prüfzentrum 3 Prüfzentrum 4
Gesamtüberein-
Überein- Überein- Überein- stimmung
Probe stimmung mit Mittel- stimmung Mittel- stimmung Mittel- mit 95% CI
wert % wert % wert %
den mit den mit den
CV CV CV den erwarteten
erwarteten Ct* erwarteten Ct* erwarteten Ct* Ergebnissen
Ergebnissen Ergebnissen Ergebnissen
Flu A
100% (30/30) 34,3 0,9 100% (30/30) 34,4 0,9 100% (30/30) 34,6 1,1 100% (90/90) 95,9 bis 100%
Schwach positiv
Flu A
100% (30/30) 31,9 0,6 100% (30/30) 32,1 0,4 100% (30/30) 32,3 1,5 100% (90/90) 95,9 bis 100%
Mäßig Positiv
Flu B
100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (90/90) 95,9 bis 100%
Schwach positiv
Flu B
100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (90/90) 95,9 bis 100%
Mäßig Positiv
RSV
100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (90/90) 95,9 bis 100%
Schwach positiv
RSV
100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 100% (90/90) 95,9 bis 100%
Mäßig Positiv
Hoch negativ 100% (30/30) 40,1 0,0 90% (27/30) 39,7 3,0 100% (30/30) 40,1 0,0 96,7% (87/90) 90,7 bis 98,9%
Gesamtüberein-
100% (210/210) 98,6% (207/210) 100% (210/210) 99,5% (627/630) 98,6 bis 99,8%
stimmung
Für statistische Zwecke wird Proben, die negativ für einen Analyten sind, der Wert 40,1 zugewiesen. Negative Proben haben einen Ct-Wert von Null
(0).
Flu B
Prüfzentrum 1 Prüfzentrum 3 Prüfzentrum 4
Überein- Gesamtüber-
Überein- Überein-
stimmung einstimmung
stimmung mit Mittel- stimmung Mittel- Mittel-
% % mit den % mit 95% CI
Probe den wert mit den wert wert
CV CV erwarteten CV den erwarteten
erwarteten erwarteten
Ct Ct Ergebnisse Ct Ergebnissen
Ergebnissen Ergebnissen
n
Flu A 100%
100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 40,1 0,0 100% (90/90) 95,9 bis 100%
Schwach positiv (30/30)
Flu A 100%
100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 40,1 0,0 100% (90/90) 95,9 bis 100%
Mäßig Positiv (30/30)
Flu B 100%
100% (30/30) 33,4 0,9 96,7% (29/30) 33,9 3,6 33,6 2,3 98,9% (89/90) 94 bis 99,8%
Schwach positiv (30/30)Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 9
Flu B
Prüfzentrum 1 Prüfzentrum 3 Prüfzentrum 4
Überein- Gesamtüber-
Überein- Überein-
stimmung einstimmung
stimmung mit Mittel- stimmung Mittel- Mittel-
% % mit den % mit 95% CI
Probe den wert mit den wert wert
CV CV erwarteten CV den erwarteten
erwarteten erwarteten
Ct Ct Ergebnisse Ct Ergebnissen
Ergebnissen Ergebnissen
n
Flu B 100%
100% (30/30) 31,1 0,5 100% (30/30) 31,7 0,7 31,2 0,9 100% (90/90) 95,9 bis 100%
Mäßig Positiv (30/30)
RSV 100%
100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 40,1 0,0 100% (90/90) 95,9 bis 100%
Schwach positiv (30/30)
RSV 100%
100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 40,1 0,0 100% (90/90) 95,9 bis 100%
Mäßig Positiv (30/30)
96,7%
Hoch negativ 96,7% (29/30) 40,0 1,0 93,3% (28/30) 39,9 2,4 40,1 0,0 95,6% (86/90) 89,1 bis 98,3%
(29/30)
Gesamtüberein
99,5% (209/210) 98,6% (207/210) 99,5% (209/210) 99,2% (625/630) 98,2 bis 99,7%
-stimmung
Für statistische Zwecke wird Proben, die negativ für einen Analyten sind, der Wert 40,1 zugewiesen. Negative Proben haben einen Ct-Wert von Null
(0).
RSV
Prüfzentrum 1 Prüfzentrum 3 Prüfzentrum 4
Überein- Gesamtüber-
Überein- Überein- einstimmung
stimmung
Probe stimmung mit Mittel- stimmung mit Mittel- Mittel- mit den 95% CI
wert % wert % mit den wert %
den den erwarteten
CV CV erwarteten CV
erwarteten Ct erwarteten Ct Ct Ergebnissen
Ergebnisse
Ergebnissen Ergebnissen
n
Flu A 100%
100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 40,1 0,0 100% (90/90) 95,9 bis 100%
Schwach positiv (30/30)
Flu A 100%
100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 40,1 0,0 100% (90/90) 95,9 bis 100%
Mäßig Positiv (30/30)
Flu B 100%
100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 40,1 0,0 100% (90/90) 95,9 bis 100%
Schwach positiv (30/30)
Flu B 100%
100% (30/30) 40,1 0,0 100% (30/30) 40,1 0,0 40,1 0,0 100% (90/90) 95,9 bis 100%
Mäßig Positiv (30/30)
RSV 100%
100% (30/30) 33,4 1,6 100% (30/30) 33,7 1,2 33,8 2,4 100% (90/90) 95,9 bis 100%
Schwach positiv (30/30)
RSV 100%
100% (30/30) 31,6 1,8 100% (30/30) 32,5 2,9 31,9 3,3 100% (90/90) 95,9 bis 100%
Mäßig Positiv (30/30)
96,7%
Hoch negativ 100% (30/30) 40,1 0,0 90% (27/30) 39,9 1,7 40,1 0,4 95,6% (86/90) 89,1 bis 98,3%
(29/30)
Gesamtüberein-
100% (210/210) 98,6% (207/210) 99,5% (209/210) 99,4% (626/630) 98,4 bis99,8%
stimmung
Für statistische Zwecke wird Proben, die negativ für einen Analyten sind, der Wert 40,1 zugewiesen. Negative Proben haben einen Ct-Wert von Null
(0).
Es wurden Änderungen am Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct-Assay vorgenommen und die Leistungsfähigkeit dieses Assays wurde
validiert. Die Leistung war äquivalent. Es folgen aktualisierte Tabellen für die Analyseempfindlichkeit/Nachweisgrenze, Analytische
Reaktivität und die Kreuzreaktivität.
ANALYSEEMPFINDLICHKEIT / NACHWEISGRENZE
Drei (3) Influenza A-Stämme, zwei (2) Influenza B-Stämme und zwei (2) RSV-Stämme wurden getestet, um die Nachweisgrenze
(LoD, Limit of Detection) für den modifizierten Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct-Assay zu bestimmen. Für jedes Virus wurden
während der Screening-Phase zur Bestimmung der vorläufigen Nachweisgrenze vier (4) Konzentrationen im Dreifachansatz
getestet. Die niedrigste Konzentration, die während der Screening-Phase mit allen Parallelproben nachgewiesen werden konnte,
wurde in 32 Parallelansätzen erneut getestet, um einen Nachweis dieser Konzentration zu bestätigen. Die LoD wird festgesetzt,
wenn mindestens 31/32 (≥95,%) der Parallelproben nachgewiesen werden. Die nachfolgende Tabelle zeigt einen Vergleich der
Nachweisgrenze des originalen Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct-Assays mit der des modifizierten Simplexa™ Flu A/B & RSV
Direct-Assays.Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 10
Virusstamm LoD-Konzentration (TCID50/ml)
Originaler Modifizierter
Simplexa™ Flu A/B Simplexa™ Flu A/B
& RSV Direct & RSV Direct
Influenza A/ Hong Kong/8/68 (H3N2) 10 0,1
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) 0,005 0,05
Influenza A Swine NY/02/2009 (H1N1) 0,1 1
Influenza B/Great Lakes/1739/54 2 20
Influenza B/Malaysia/2506/2004 20 1
RSV-A2 1 2
RSV B CH93-18 (18) 3 2
ANALYTISCHE REAKTIVITÄT / KREUZREAKTIVITÄT
Analytische Reaktivität
Es wurden verschiedene Stämme von Influenza A, einschließlich der Subtypen H1, H3 und H5, sowie von Influenza B und RSV,
einschließlich der Subtypen A und B, untersucht. Gewählt wurden die Stämme, die jüngst im Umlauf waren, sowie geografisch
unterschiedliche Stämme. Von quantifiziertem Virusmaterial wurde in einer negativen Abstrichmatrix eine einzige Verdünnung in
den unten angegebenen Konzentrationen hergestellt. Diese wurde jeweils in dreifacher Ausführung getestet. Die bei der
Untersuchung gewonnenen Ct-Werte zeigen an, dass alle Virenstämme in der Nähe der Nachweisgrenze (LoD) getestet wurden.
Alle getesteten Stämme wurden in angemessener Weise nachgewiesen.
Analytische Reaktivität mit zusätzlichen Virusstämmen
Erreger Testkonzentration Ergebnis
Influenza A Taiwan/42/06 H1N1 100 TCID50/ml Flu A detektiert
Influenza A/Anhui/1/2013 (H7N9) 25.000 EID50/ml Flu A detektiert
Influenza A/Brisbane/10/07 H3 100 TCID50/ml Flu A detektiert
Influenza A/Brisbane/59/07 H1 100 TCID50/ml Flu A detektiert
Influenza A/California/12/2012 (H1N1) pdm09 100 TCID50/ml Flu A detektiert
Influenza A/California/7/2009 NYMC x-179-A 100 IU/ml Flu A detektiert
Influenza A/Indiana/08/2011 (H3N2)v 100 TCID50/ml Flu A detektiert
Influenza A/Minnesota/11/2010 (H3N2)v 100 CEID50/ml Flu A detektiert
Influenza A/New Caledonia/20/99 H1N1 100 TCID50/ml Flu A detektiert
Influenza A/Ohio/02/2012 (H3N2) 200 CEID50/ml Flu A detektiert
Influenza A/Port Chalmers/1/73 H3N2 100 TCID50/ml Flu A detektiert
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) 100 TCID50/ml Flu A detektiert
Influenza A/Solomon Island/03/06 100 TCID50/ml Flu A detektiert
Influenza A/Swine NY/02/2009 H1N1 100 TCID50/ml Flu A detektiert
Influenza A/Swine/1976/31 H1N1 100 TCID50/ml Flu A detektiert
Influenza A/Swine/Iowa/15/30 H1N1 100 TCID50/ml Flu A detektiert
Influenza A/Texas/50/2012 (H3N2) 100 TCID50/ml Flu A detektiertSimplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 11
Erreger Testkonzentration Ergebnis
Influenza A/Wisconsin/67/05 H3 100 TCID50/ml Flu A detektiert
Influenza A/WS/33 H1N1 100 TCID50/ml Flu A detektiert
Influenza B/Allen/45 100 TCID50/ml Flu B detektiert
Influenza B/Brisbane/60/2008 100 CEID50/ml Flu B detektiert
Influenza B/Florida/02/2006 100 TCID50/ml Flu B detektiert
Influenza B/Florida/04/2006 100 TCID50/ml Flu B detektiert
Influenza B/Florida/07/04 100 TCID50/ml Flu B detektiert
Influenza B/Hong Kong/5/72 100 TCID50/ml Flu B detektiert
Influenza B/Lee/40 100 TCID50/ml Flu B detektiert
Influenza B/Maryland/1/59 100 TCID50/ml Flu B detektiert
Influenza B Panama/45/90 100 TCID50/ml Flu B detektiert
Influenza B/Taiwan/2/62 100 TCID50/ml Flu B detektiert
Influenza B/Wisconsin/01/2010 100 CEID50/ml Flu B detektiert
RSV-A Long 100 TCID50/ml RSV detektiert
RSV-B 9320 100 TCID50/ml RSV detektiert
RSV-B Wash/18537/62 100 TCID50/ml RSV detektiert
RSV B WV/14617/85 100 TCID50/ml RSV detektiert
HINWEIS: Obwohl dieser Test nachweislich neuartige Vogelgrippeviren des Subtyps Influenza-A H7N9 sowie H3N2v-Viren in
Kultur detektieren konnte, wurden die Leistungsmerkmale dieses Kits für klinische Proben, die Influenza-A (H7N9)- und Influenza
H3N2v-positiv sind, bisher nicht spezifiziert.
Kreuzreaktivität (analytische Spezifität)
Die analytische Spezifität des Simplexa™ Assays wurde ermittelt, indem getestet wurde, ob ausschließlich Influenza-A-Virus bzw.
Influenza-B-Virus bzw. RSV identifiziert werden, ohne Kreuzreaktivität mit nahe verwandten Keimen oder Keimen, die die gleichen
klinischen Symptome verursachen, oder Keimen, die als normale Flora in den zu untersuchenden Proben vorkommen.
Zwei und dreißig (32) mögliche Kreuzreagenzien wurde einzeln in klinisch relevanten Konzentrationen in eine Abstrichmatrix
geimpft. Die unbeimpfte Matrix wurde ebenfalls getestet, um Ausgangswerte zu erhalten. Die Proben zum Nachweis der
Kreuzreaktivität wurden dreifach getestet. Falls in einem der Detektionskanäle (Flu A, Flu B, RSV) in einem der drei Replikate ein
Signal detektiert wurde, wurden weitere 5 Replikate zur Bestätigung getestet.
Weder für Flu A noch für Flu B oder RSV wurde Kreuzreaktivität festgestellt.
™
Simplexa Flu A/B & RSV Direct – Kreuzreaktivität
%Nachweis (Anzahl detektiert/Gesamtanzahl)
Getestete
Erreger N Flu A Flu B RSV
Konzentration IC (Q670)
(FAM) (JOE) (CFR610)
Ausgangswert n. z. 5 0,0%(0/5) 0,0%(0/5) 0,0%(0/5) 100,0%(5/5)
Adenovirus 1 4,17E+05 TCID50/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Adenovirus 7A 5,37E+05 TCID50/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Bordetella pertussis A639 1,88E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Chlamydia pneumoniae 1,00E+06 IFU/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Cytomegalievirus (CMV) 1,04E+05 U/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 12
%Nachweis (Anzahl detektiert/Gesamtanzahl)
Getestete
Erreger N Flu A Flu B RSV
Konzentration IC (Q670)
(FAM) (JOE) (CFR610)
Coronavirus 229E 5,89E+05 TCID50/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Coronavirus OC43 1,95E+05 TCID50/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Corynebacterium diphtheriae 4,00E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Enterovirus Typ 71 1,10E+05 TCID50/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Epstein-Barr-Virus (EBV) 1,10E+05 Kopien/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Escherichia coli O157:H7 1,10E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Haemophilus influenzae 1,1E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Lactobacillus plantarum, 17-5 7,97E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Legionella longbeachae 8,3E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Masern 1,95E+05 TCID50/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Metapneumovirus 9 1,58E+05 TCID50/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Moraxella catarrhalis, NE1 1,49E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Mumps 8,51E+05 TCID50/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Mycobacterium tuberculosis (genomische DNA) 6,54E+06 c/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Mycoplasma pneumoniae, M129 3,16E+06 ccu/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Neisseria elongata 2,05E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Neisseria meningitides 7,07E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Parainfluenza 1 1,15E+05 TCID50/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Parainfluenza 2 3,80E+05 IU/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Parainfluenza 3 1,95E+05 TCID50/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Pseudomonas aeruginosa 3,93E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Rhinovirus 1A 1,26E+05 TCID50/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Staphylococcus aureus, COL 1,42E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Staphylococcus epidermidis 9,23E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Streptococcus pneumoniae 9,20E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Streptococcus pyogenes, M1 1,36E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
Streptococcus salivarius 2,12E+06 KBE/ml 3 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 0,0%(0/3) 100,0%(3/3)
INTERFERENZ
Die Leistung dieses Assays wurde mit möglicherweise interferierenden und im Nasenrachenraum ggf. vorhandenen Substanzen
bewertet. Die potenziellen Interferenzen wurden in einer künstlichen Probe untersucht, die Influenza A (Influenza A/PR/8/34
H1N1) in einer Konzentration von 0,01 TCID50/ml, Influenza B (Influenza B/Malaysia/2506/2004) in einer Konzentration von 40
TCID50/ml und RSV A2 in einer Konzentration von 4 TCID 50/ml enthielt. Alle Stämme wurden bei der 2 bis 4-fachen
Nachweisgrenze (LoD) getestet. Es ergaben sich keine Hinweise auf eine Interferenz aufgrund der in den angegebenen
Konzentrationen getesteten Substanzen.
Konzentration der
Potenziell interferierende Substanz Wirkstoff interferierenden Substanz
Afrin (Nasenspray) Oxymetazolin 15% (Vol./Vol.)
Antibiotikum, systemisch Tobramycin 4 µg/ml
Antibiotikum, Nasensalbe Mupirocin 6,6 mg/ml
Blut n. z. 2% (Vol./Vol.)
aus der Unterkieferspeicheldrüse vom
Gereinigtes Mucin-Protein 60 µg/ml
Rind, Typ I-SSimplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 13
Konzentration der
Potenziell interferierende Substanz Wirkstoff interferierenden Substanz
Nasales Corticosteroid – Beconase AQ Beclomethason 5% (Vol./Vol.)
Nasales Corticosteroid – Fluticason Fluticason 5% (Vol./Vol.)
Relenza, Virustatikum Zanamivir 3,3 mg/ml
Tamiflu, Virustatikum Oseltamivir 1 µM
Luffa opperculata, Galphimia glauca,
Zicam Nasengel 5% (Vol./Vol.)
Histaminum hydrochloricum
KOMPETITIVE INTERFERENZ
Die Studie zur kompetitiven Interferenz untersuchte die Auswirkungen klinisch relevanter Begleitinfektionen auf jeden der vom
Assay nachgewiesenen Analyten. Es wurde geprüft, ob eine hohe Konzentration eines Virus in der Probe die Leistung des
Simplexa™-Assays hinsichtlich eines anderen, niedrig konzentrierten Targets im Multiplex-Assay potenziell beeinflussen könnte.
Für jedes Target (Influenza A, Influenza B und RSV) wurde eine schwach positive Baseline-Probe (“Baseline-Stamm") mit einer
Konzentration von etwa dem 2- bis 4-Fachen der Nachweisgrenze (LoD) hergestellt und für jede Probe wurde ein Ct-Baseline-
Wert ermittelt. Die schwach konzentrierte Probe wurde mit jedem der bei einer Begleitinfektion potenziell vorhandenen Viren
beimpft (siehe nachstehende Tabelle). Bei Anwesenheit von zwei Viren gab es keine Interferenzen hoher Konzentrationen von
RSV oder Influenza B mit dem Nachweis von Influenza A. Hohe Konzentrationen von Influenza A können jedoch mit dem
Nachweis sehr geringer Konzentrationen von Influenza B oder RSV interferieren.
Kompetitive Interferenz - Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct
Kompetitive Ergebnis (Anzahl
Baseline-
Kompetitiver interferierende detektiert/Gesamtanzahl)
Baseline-Stamm Konzentration
interferierender Stamm Konzentration
[TCID50/ml] Flu A Flu B RSV
[TCID50/ml]
0,01 Influenza B/GL/1739/54 19566,3 3/3 3/3 0/3
Influenza A/PR/8/34
0,01 RSV A2 806 8/8 0/8 8/8
(H1N1)
0,01 RSV B Ch93-18(18) 10659 6/8 0/8 8/8
Influenza A/PR/8/34
8 0,174 3/3 3/3 0/3
(H1N1)
Influenza B/GL/1739/54 8 RSV A2 80,6 0/3 3/3 3/3
8 RSV B Ch93-18(18) 1065,9 0/3 3/3 3/3
Influenza A/PR/8/34
4 0,174 3/3 0/3 3/3
(H1N1)
RSV A2
4 Influenza B/GL/1739/54 19566,3 0/3 3/3 3/3
Influenza A/PR/8/34
6 0,174 3/3 0/3 3/3
(H1N1)
RSV B Ch93-18(18)
6 Influenza B/GL/1739/54 19566,3 0/8 8/8 7/8
HEMMUNG DURCH ANDERE MIKROORGANISMEN
Der Simplexa™-Assay wurde auf seine Fähigkeit zur Erkennung von Influenza A-Virus, Influenza B-Virus und RSV im Beisein
potenziell inhibitorischer Organismen untersucht.
Das Panel von 32 potenziell inhibitorischen Organismen wurde einzeln in eine Mischprobe mit einer niedrigen Konzentration (etwa
zweifache Nachweisgrenze, LoD) von Influenza A (Influenza A/PR/8/34 H1N1), Influenza B (Influenza B/Malaysia/2506/2004) und
RSV (A2) geimpft. Die Proben zum Nachweis der Hemmung wurden dreifach getestet. Falls in einem der Detektionskanäle (Flu A,
Flu B, RSV) in einem der drei Replikate kein Signal detektiert wurde, wurden weitere fünf Replikate zur Bestätigung getestet.
Weder für Influenza A noch für Influenza B oder RSV wurde mit den getesteten Konzentrationen eine hemmende Wirkung
festgestellt.Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 14
Hemmung durch andere Erreger - Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct
Konzentration des
Mikroorganismus Konzentrationseinheiten Flu A Flu B RSV
Mikroorganismus
5
Adenovirus 1 1,1 x10 TCID50/ml + + +
5
Adenovirus 7A 1,1 x10 TCID50/ml + + +
6
Bordetella pertussis 1,1 x10 KBE/ml + + +
6 1
Chlamydia pneumoniae 1,1 x10 Kopien/ml + + +
5
Cytomegalievirus (CMV) 1,1 x10 TCID50/ml + + +
5
Coronavirus 229E 1,1 x10 TCID50/ml + + +
1 5
Coronavirus OC43 1,1 x10 TCID50/ml + + +
6
Corynebacterium diphtheriae 1,1 x10 KBE/ml + + +
6
E. coli O157 1,1 x10 KBE/ml + + +
5 2
Epstein-Barr-Virus (EBV) 1,1 x10 Kopien/mL + + +
1 5
Enterovirus 71 1,1 x10 TCID50/ml + + +
6
Haemophilus influenzae 1,1 x10 KBE/ml + + +
6
Lactobacillus plantarum, 17-5 1,1 x10 KBE/ml + + +
6
Legionella longbeachae 1,1 x10 KBE/ml + + +
5
Masernvirus 1,1 x10 TCID50/ml + + +
5
Metapneumovirus 1,1 x10 TCID50/ml + + +
6
Moraxella catarrhalis Ne11 1,1 x10 KBE/ml + + +
5
Mumpsvirus 1,1 x10 TCID50/ml + + +
6
Mycobacterium tuberculosis 1,1 x10 KBE/ml + + +
6
Mycoplasma pneumoniae M129 1,1 x10 TCID50/ml + + +
6
Neisseria elongata 1,1 x10 KBE/ml + + +
6
Neisseria meningitidis 1,1 x10 KBE/ml + + +
5
Parainfluenza Typ 1 1,1 x10 TCID50/ml + + +
5
Parainfluenza Typ 2 1,1 x10 TCID50/ml + + +
5
Parainfluenza Typ 3 1,1 x10 TCID50/ml + + +
6
Pseudomonas aeruginosa 1,1 x10 KBE/ml + + +
5
Rhinovirus 1A 1,1 x10 TCID50/ml + + +
6
Staphylococcus aureus, COL 1,1 x10 KBE/ml + + +
6
Staphylococcus epidermidis 1,1 x10 KBE/ml + + +
6
Streptococcus pneumoniae 1,1 x10 KBE/ml + + +
6
Streptococcus pyogenes 1,1 x10 KBE/ml + + +
6
Streptococcus salivarius 1,1 x10 KBE/ml + + +
1) Die Ersttestungen schienen auf eine mögliche Hemmung hinzudeuten, was sich bei Testwiederholung nicht bestätigte. C. pneumoniae hatte
einen Titer von 1,52 x 105 IFU/ml, der mit einem quantitativen Echtzeit-PCR-Assay weiter quantifiziert wurde.
2) EBV wurde vom Anbieter mit einem quantitativen Echtzeit-PCR-Assay quantifiziert.
KONTAMINATION DURCH VERSCHLEPPUNG
Eine interne Studie zu Verschleppungen zielte darauf ab, Kontaminationen in negativen Proben festzustellen. Die Studie bestand
darin, hoch positive und hoch negative Proben abwechselnd auf jeder Platte zu platzieren. Der Verschleppungseffekt wurde
durch Vergleich der beobachteten Negativrate für die negative Probe mit der erwarteten Rate unter normalen Bedingungen der
Testwiederholung bestimmt. Weder für Flu A, noch für Flu B oder RSV wurde eine Kontamination durch Verschleppung
festgestellt.Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct Seite 15
ERWARTETE WERTE
Die Prävalenz der Influenza ändert sich jedes Jahr mit der im Herbst und Winter in den USA auftretenden Grippesaison. Zu den
Variablen, die die Anzahl der positiven Fälle aus Atemwegsproben beeinflussen, gehören: die Effizienz und die Auswahl des
Zeitpunktes der Probenentnahme, die Handhabung und der Transport der Proben, die Jahreszeit, das Alter der Patienten und
die lokale Krankheitsprävalenz. Die prospektiven Proben, die wir in unserer klinischen Studie verwendeten, stammten aus den
4
USA und aus Australien. Die Prävalenz aller Influenzaviren in den USA lag während des Probennahmezeitraums von
September 2010 bis März 2011 im Bereich von 2,1 bis 35,5%. Während der Saison waren von den Influenza-positiven Proben
72,9% positiv für Influenza A und 27,1% positiv für Influenza B.
In jedem Jahr treten im Herbst, Winter und/oder in den Frühlingsmonaten RSV-Epidemien auf, die in der Regel 3–4 Monate
4
anhalten. Wann genau die RSV-Epidemien jeweils auftreten, kann je nach Region verschieden sein . Der Anteil der positiven
RSV-Proben betrug in den USA während der Zeitspanne, die den Probennahmezeitraum vom September 2010 bis März 2011
5 6
einschließt, 15,9% . In Australien testeten während der Grippesaison 2010 9% der Proben positiv für Influenza ; der Anteil der
positiven RSV-Proben wurde nicht gemeldet. Die während unserer prospektiven klinischen Studie beobachtete Prävalenz (durch
Referenzmethoden ermittelte positive Proben) ist in den nachstehenden Tabellen angegeben.
Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct – Stratifiziert nach Orten der Probenentnahme
Australien (n=330)
Gesamt < 5 Jahre 5–21 Jahre 22–60 Jahre > 60 Jahre
Analyt
(Prävalenz) (n=63) (n=106) (n=147) (n=14)
Influenza A 2,7% (9/330) 0 5 4 0
Influenza B 2,9% (7/330) 3 2 2 0
Respiratory-Syncytial-Virus 0,7% (1/330) 0 0 1 0
Ohio (n=245)
Gesamt < 5 Jahre 5–21 Jahre 22–60 Jahre > 60 Jahre
Analyt
(Prävalenz) (n=195) (n=48) (n=2) (n=0)
Influenza A 11,4% (28/245) 14 14 0 0
Influenza B 1,2% (3/245) 1 2 0 0
Respiratory-Syncytial-Virus 29,8% (73/245) 70 3 0 0
Virginia (n=147)
Gesamt < 5 Jahre 5–21 Jahre 22–60 Jahre > 60 Jahre
Analyt
(Prävalenz) (n=69) (n=69) (n=9) (n=0)
Influenza A 21% (31/147) 10 20 1 0
Influenza B 7,5% (11/147) 1 10 0 0
Respiratory-Syncytial-Virus 7,5% (11/147) 9 2 0 0
LITERATUR
1. http://www.cdc.gov/flu/about/viruses/types.htm
2. http://www.cdc.gov/rsv/clinical/description.html
3. http://www.cdc.gov/Features/dsRSV/
4. http://www.cdc.gov/flu/weekly/pastreports.htm
5. http://www.cdc.gov/surveillance/nrevss/rsv/state.html
6. http://www.health.gov.au/internet/main/publishing.nsf/Content/cda-ozflu-no44-10.htm®
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