Die Rolle von PDGF-D in der Nierenfibrose
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Die Rolle von PDGF-D in der Nierenfibrose
Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der RWTH Aachen
University zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften
genehmigte Dissertation
von
Eva Miriam Buhl, M.Sc.
aus
Weener
Berichter: Universitätsprofessor Dr. med. Jürgen Floege
Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Ralph Panstruga
Tag der mündlichen Prüfung: 04.11.2016
Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Universitätsbibliothek online verfügbar.
INHALTSVERZEICHNIS
EINLEITUNG 4
1.1 DIE NIERENFIBROSE 4
1.2 DAS PLATELET-DERIVED GROWTH FACTOR SYSTEM 6
1.3 DAS PLATELET-DERIVED GROWTH FACTOR SYSTEM IN DER NIERE 7
1.4 DAS PLATELET-DERIVED GROWTH FACTOR SYSTEM IN DER NIERENFIBROSE 8
1.5 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 9
MATERIAL 10
1.6 GERÄTE 10
1.7 VERBRAUCHSMATERIALIEN 11
1.8 REAGENZIEN 12
1.9 STIMULANZIEN 14
1.10 REAKTIONSKITS 14
1.11 ANTIKÖRPER 15
1.12 PRIMER UND SONDEN 17
1.13 PUFFER UND LÖSUNGEN 18
1.14 ZELLLINIEN UND MEDIEN 21
1.15 HUMANE NIERENBIOPSIEN 22
1.16 SOFTWARE 22
METHODEN 23
1.17 TIEREXPERIMENTELLE METHODEN 23
1.17.1 Tierhaltung 23
1.17.2 Genotypisierung 23
1.17.3 Unilaterale Ureterobstruktion (UUO) 24
1.17.4 Ischämie-Reperfusion (I/R) 25
1.17.5 Hepatische Überexpressions von PDGF-D 25
1.17.6 Gewinnung von Urinproben 26
1.17.7 Blutdruckmessung 26
1.17.8 Finale Nierenentnahme 26
1.17.9 Blutabnahme 27
1.17.10 Gewebefixierung und Probenlagerung 27
1.17.11 Blutbildbestimmung 28
1.17.12 Urin- und Serumanalysen 28
1.17.13 Berechnung der Kreatinin-Clearance 28
1.18 HISTOLOGISCHE METHODEN 29
1.18.1 Herstellen der Gewebeschnitte 29
1.18.2 Entparaffinieren der Gewebeschnitte 29
1.18.3 Perjodsäure-Schiffsches-Reagenz-(PAS)-Färbung 29
1.18.4 Siriusrot-Färbung 30
1.18.5 Immunhistochemie 30
1.18.6 Morphometrische Auswertung histologischer Färbungen 31
1.18.7 Immunfluoreszenz 32
1.18.8 X-Gal-Färbung 32
1.19 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 33
1.19.1 Proteinlysatherstellung aus Gewebe 33
1.19.2 Proteinkonzentrationsbestimmung mittels BCA-Reaktion 33
1.19.3 SDS-Gelelektrophorese 34
1.19.4 Western Blot 34
1.19.5 Auswertung der Western Blots – Densitometrie 35
1.19.6 Gelatinase-Zymography 35
1.19.7 RNA-Isolation aus Nierenkortexgewebe 36
1.19.8 Herstellung von komplementärer DNA (cDNA) 36
1.19.9 Echtzeit-Polymerase-Ketten-Reaktion (quantitative real time PCR, qRT-PCR) 37
1.20 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 39
1.20.1 Kultivierung eukaryotischer Zellen 39
1.20.2 Überführung von Zellen 39
1.20.3 Zellzählung 39
1.20.4 Isolierung von Tubuluszellen aus murinem Nierengewebe 40
1.20.5 Isolation von RNA aus kultivierten Zellen 41
1.20.6 Zell-Verdopplungs-Assay 41
1.20.7 Stimulation primärer Tubuluszellen 42
ERGEBNISSE 43
1.21 DIE EXPRESSION VON PDGF-D IN DER GESUNDEN UND FIBROTISCHEN NIERE VON MENSCH
UND MAUS 43
1.22 DIE EXPRESSION VON PDGF-D IN VITRO 49
1.23 DIE WIRKUNG VON PDGF-D AUF RENALE ZELLEN IN VITRO 50
2
1.24 DIE ROLLE VON PDGF-D IN DER ENTWICKLUNG UND PHYSIOLOGIE DER NIERE 51
1.25 DIE ROLLE VON PDGF-D IN DER INTERSTITIELLEN NIERENFIBROSE 53
1.25.1 Auswirkung einer PDGF-D-Defizienz im UUO-Modell nach 5 Tagen 53
1.25.2 Auswirkung einer PDGF-D-Defizienz im UUO-Modell nach 10 Tagen 54
1.25.3 Auswirkung einer PDGF-D-Defizienz im Modell der Ischämie/Reperfusion nach
21 Tagen 58
1.26 AUSWIRKUNG EINER ADENOVIRALEN PDGF-D-ÜBEREXPRESSION AUF DAS RENALE INTERSTITIUM 60
DISKUSSION 61
ZUSAMMENFASSUNG 67
LITERATURVERZEICHNIS 68
ANHANG 72
1.27 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 72
1.28 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 73
1.29 LEBENSLAUF 76
1.30 PUBLIKATIONEN 77
1.31 DANKSAGUNG 78
1.32 ERKLÄRUNG ZUR URHEBERSCHAFT 79
3
Einleitung
Einleitung
1.1 Die Nierenfibrose
Etwa 8-16% der Weltbevölkerung sind von einer chronischen Nierenerkrankung betroffen,
Tendenz steigend. Gründe für den Anstieg chronischer Nierenerkrankungen sind die Zunahme
der Risikofaktoren wie Diabtes Mellitus, Bluthochdruck, Übergewicht und Überalterung der
Bevölkerung. Betroffene leiden unter einen zunehmenden Verlust der Nierenfunktion bis hin
zu einer terminalen Niereninsuffizienz. Die Mortalität und Morbitität sind bei einer
Nierenunterfunktion stark erhöht. Die Behandlungsmöglichkeiten sind bisher allerdings noch
begrenzt und kostenintensiv. Nierenerkrankungen stellen somit ein medizinisches und
sozioökonomisches Problem dar1.
Chronische Nierenerkrankungen können unterschiedliche Ursachen und primäre
Krankheitsbilder haben, gemeinsam ist ihnen jedoch, dass sie nahezu alle eine Nierenfibrose
entwickeln. Im Allgemeinen bezeichnet man eine Vermehrung der extrazellulären Matrix als
Fibrose. Dies ist primär ein Prozess der Wundheilungsreaktion. Durch die schnelle Bildung von
Matrixproteinen und Narbengewebe hat die Fibrose zunächst vermutlich einen
stabilisierenden Effekt und unterstützt den Erhalt des Gewebes. Eine andauernde Fibrose
dagegen geht in der Regel mit inflammatorischen Prozessen, phänotypischen Veränderungen
und Verlust renaler Zellen wie z.B. tubulärer Epithelzellen und kapillärer Endothelzellen,
einher2, 3. So zerstört die Fibrose zunehmend die funktionellen Strukturen und behindert die
Regeneration. Dies beschleunigt den Weg in die terminale Niereninsuffizienz zusätzlich.
Die Matrixproteine, welche in der Nierenfibrose im Interstitium verstärkt gebildet werden,
sind hauptsächlich Kollagene (insbesondere Typ I und III), aber auch Glykoproteine wie
Fibronektin2, 4. Als Hauptmatrixproduzenten werden die Myofibroblasten angesehen. Dies
sind Fibroblasten-ähnliche Zellen, die mit Entwicklung der Fibrose im Interstitium auftreten.
Ihren Namen haben sie durch die Bildung kontraktiler Myofilamente aus α-smooth muscle
actin (α-SMA) erhalten. Als Ursprung dieser Zellen werden verschiedene Theorien diskutiert:
gewebsständige Fibroblasten, Perizyten, aus dem Knochenmark stammende Fibrozyten oder
epitheliale Tubuluszellen, die sich zu mesenchymalen Zellen transdifferenzieren.
Möglicherweise treffen alle diese Vorschläge zu einem gewissen Anteil zu 5.
4
Einleitung
Abbildung 1: Die Nierenfibrose
Eine schematische Darstellung sowie lichtmikroskopische Aufnahmen (PAS-Färbung) murinem
Nierengewebes zeigen die strukturellen Veränderungen im Tubulointerstitium einer fibrotischen
Niere. Das gesunde Interstitium zeigt intakte epitheliale Strukturen. Zwischen den Tubuli und
Sammelrohren befinden sich vereinzelte mesenchymale Zellen wie die Fibroblasten sowie die
Kapillaren. In der Fibrose schädigen verschiedene Stressfaktoren das Epithel. Dies zeichnet sich durch
eine Abflachung der Zellen und Erweiterung des Lumens (Dilatation) aus. Die Tubuli verlieren ihren
Bürstensaum. Im interstitiellen Raum kommt es zu einer vermehrten Akkumulation extrazellulärer
Matrix. Als Beispiel ist hier eine immunhistologische Färbung von Kollagen I dargestellt.
Myofibroblasten, die Hauptmatrixproduzenten, expandieren im Gewebe. Kapillarverlust und
Immunzellinfiltration sind typische Begleiterscheinungen im geschädigten Gewebe.
5
Einleitung
1.2 Das Platelet-derived Growth Factor System
Das Platelet-derived growth factor (PDGF)-System ist ein Rezeptor-Liganden-System, welches
eine zentrale Rolle in der Steuerung von Wachstum und Differenzierung einnimmt. Es ist in
der embryonalen Entwicklung und physiologischen Prozessen des adulten Organismus, aber
auch in vielen pathologischen Prozessen involviert 6, 7.
Das PDGF-System besitzt zwei Tyrosinkinase-Rezeptorketten, PDGFR-α und PDGFR-β, welche
sich im aktiven Zustand zu den drei Kombinationen PDGFR-αα, PDGFR-αβ, PDGFR-ββ
dimerisieren können. Die Liganden sind ebenfalls Dimere und werden aus den vier
verschiedenen Isoformen PDGF-A, -B, -C und –D gebildet. Sie können sich über
Disulfidbrückenbildung zu den fünf Dimeren PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC und
PDGF-DD zusammenlagern. Die Dimere haben verschiedene Bindungsaffinitäten zu den
Rezeptoren. So bindet PDGF-AA an PDGFR-αα, PDGF-AB an PDGFR-αα und –αβ, und PDGF-BB
an alle drei Rezeptorkombinationen. PDGF-C und –D werden als inaktive Formen synthetisiert.
Bevor sie an einen Rezeptor binden können muss zunächst eine CUB-Domäne (complement
C1r/C1s, Uegf, Bmp1 domain) enzymatisch abgespalten werden. PDGF-CC kann nach
Aktivierung durch den gewebespezifischen Plasminogenaktivator (tPA) oder Plasmin an
PDGFR-αα binden sowie mit geringer Affinität an PDGF-αβ, PDGF-DD nach Aktivierung durch
Urokinase (uPA), Plasmin8 oder Matriptase9 an PDGFR-ββ sowie vermutlich mit geringer
Affinität an PDGF-αβ.6-8, 10
Die Ligandenbindung induziert eine Autophosphorylierung der Rezeptoren, woraufhin
zytoplasmatische Adapterproteine rekrutiert werden, vornehmlich jene mit mit Src-homology
Domänen 2 (SH2). Die Weiterleitung der Signale in den Zellkern erfolgt über verschiedene
Kinase-Signalkaskaden. Die Hauptsignalwege verlaufen über Januskinase / STAT-Proteine
(engl: Signal transducers and activators of transcription) (Jak/STAT), Phosphoinosit-3-Kinase
(PI3K), Phospholipase C-γ (PLC-γ) und Ras (engl: Rat sarcoma) MAP-Kinasen (engl: Mitogen-
activated protein) (RAS-MAP-Kinasen)6, 8, 10. Die Signalwege induzieren die Expression von
Genen für die Proliferation, Migration und Überleben der Zelle sowie für die Synthese
extrazellulärer Matrix. Die tatsächliche Wirkung ist dabei Zell- und Kontext-abhängig6-8, 10.
6
Einleitung
Abbildung 2: Das Platelet-derived Growth Factor System
Das PDGF-System besteht aus zwei membranverankerten Rezeptorketten PDGFR-α (grün) und PDGFR -
β (gelb). Die Liganden bilden Dimere in den Kombinationen PDGF-AA, -AB, -BB, -CC und –DD. Die
Bindungsmöglichkeiten der einzelnen Liganden an die Rezeptoren sind durch durchgehende
Verbindungslinien gekennzeichnet. Die gestrichelten Linien weisen auf vermutete, aber nicht
gesicherte Bindungsmöglichkeiten hin. PDGF-CC und –DD besitzen CUB-Domänen, die vor der
Rezeptorbindung durch Plasmin oder tPA bzw. uPA oder Matriptase abgespalten werden müssen. Bei
Aktivierung leiten die Rezeptoren das Signal über die Proteinkinasen PI3K/Akt, Ras-MAPK, PLCγ oder
JAK/STAT in den Zellkern weiter. Dort werden Gene für die Proliferation, Migration und Überleben der
Zelle sowie die Regulation der extrazellulären Matrix exprimiert.
1.3 Das Platelet-derived Growth Factor System in der Niere
Das PDGF-System ist sowohl in der Entwicklung der Niere als auch im Adulten von Bedeutung.
Expressionsstudien in Mensch und Maus konnten zeigen, dass beide Rezeptoren konstitutiv
auf den mesenchymalen Zellen, also z. B. Fibroblasten, Mesangialzellen und glatte
Muskelzellen exprimiert werden8, 11. Eine Deletion der Rezeptoren führt zu schweren
Entwicklungsstörungen der Niere. So bilden PDGFR-α defiziente Mäuse kein intaktes
7
Einleitung
mesenchymales Interstitium aus12, PDGFR-β defiziente Mäuse kein Mesangium in den
Glomeruli13.
Die Expression der Liganden ist zum Teil noch unpräzise aufgrund von
Detektionsschwierigkeiten. Gezeigt werden konnte, dass PDGF-A in den Podozyten der
Glomeruli, distalen Tubuluszellen und Sammelrohren exprimiert wird11. Ein Pdgfa-Knockout
hat allerdings keinen Effekt auf den Phänotyp der Niere 14. PDGF-C ist im Menschen in den
glatten Muskelzellen, Parietalzellen und dem gesamten Tubulus zu finden, wohingegen es in
der Maus im glomerulären Endothel lokalisiert wurde 11. PDGF-C defiziente Mäuse zeigen
keine Abnormalitäten in der Nierenenwicklung14, andere Studien zeigen jedoch eine
Mitwirkung in der Rekrutierung des Interstitiums12 und glomerulärer Angiogenese15.
Kombiniert man einen Knockout von Pdgfc und Pdgfa, zeigt sich ein vergleichbarer Phänotyp
wie der bei einem Knockout des gemeinsamen Rezeptors Pdgfra mit Fehlbildung des
Interstitiums12. PDGF-B wird in der Entwicklung der Niere in den Endothelzellen exprimiert, in
adulten Nieren ist es dagegen kaum detektierbar 11, 16. Pdgfb-Knockout-Mäuse zeigen eine
Fehlentwicklung des Glomerulus17 vergleichbar mit den Pdgfrb-Knockout-Mäusen, woraus
sich schließen lässt, dass endotheliales PDGF-B für die Rekrutierung PDGFR-β-tragender
Mesangialzellen benötigt wird.
PDGF-D konnte im Intersitium in den Fibroblasten und glatten Muskelzellen detektiert
werden. Im Glomerulus konnte ein Unterschied in der Expression zwischen Mensch und Maus
beobachtet werden. Im Menschen wird PDGF-D in den Podozyten exprimiert, in der Maus
dagegen in den Mesangialzellen18. Pdgfd-Knockout-Mäuse wurden bisher noch nicht
beschrieben. Dies wird Gegenstand dieser Arbeit sein.
1.4 Das Platelet-derived Growth Factor System in der Nierenfibrose
Erhöhte Expressionen der PDGFs und der beiden Rezeptoren kann in einer Vielzahl von
chronischen Nierenerkrankungen des Menschen und in deren adäquaten murinen
Mausmodellen beoachtet werden, darunter auch in fibrotischen Erkrankungen8, 11. Es konnte
bereits gezeigt werden, dass PDGF-C, der Ligand von PDGFR-α, einen pro-fibrotischen Einfluss
besitzt. So konnte sowohl eine Pdgfc-Deletion als auch PDGF-C-neutralisierende
Antikörpergabe die interstitielle Nierenfibrose in einem Mausmodell der obstruktiven
8Einleitung
Nephropathie deutlich vermindern8, 19. Des Weiteren konnte eine Studie zeigen, dass PDGFR-
α- und –β-neutralisierende Antikörper sowie Blockierung der Rezeptoren mit dem Tyrosin-
Kinase-Inhibitor Imatinib die tubulointerstitielle Fibrose in zwei unterschiedlichen murinen
Fibrosemodellen reduzieren konnte20. Der Einfluss der Liganden PDGF-A, PDGF-B und PDGF-
D bleibt bisher jedoch unerschlossen.
1.5 Zielsetzung dieser Arbeit
In dieser Arbeit soll die Rolle von PDGF-D in der tubulointerstitiellen Fibrose aufgedeckt
werden. Mehrere Vorarbeiten weisen darauf hin, dass PDGF-D ein pro-fibrotischer Mediator
in der tubulointerstitiellen Fibrose sein könnte. So ist bekannt, dass PDGF-D einen starken
mitogenen Effekt auf PDGFR-β-tragende Zellen besitzt. In vitro Stimulation von renalen
Rattenfibroblasten21 und Mesangialzellen22 mit aktiviertem PDGF-D förderte die Proliferation
der Zellen. In vivo führten hohe PDGF-D-Serumwerte durch hepatische Überexpression zu
einer starken Expansion des Mesangiums in den Glomeruli 23. Eine Überexpression von PDGF-
D in den Podozyten von transgenen Mäusen verursachte progressive Glomerulonephritis mit
Mesangioproliferation und Glomerulosklerose 24. Eine Inhibierung von PDGF-D durch Gabe
eines neutralisierenden Antikörpers verminderte den Schaden in einem Modell der
progressiven mesangioproliferativen Sklerose in der Ratte 21, 25. Dabei war nicht nur eine
Reduzierung der Sklerose und Mesangioproliferation im Glomerulus zu beobachten, sondern
auch eine geringere tubulointerstitielle Fibrose. Da die interstitielle Fibrose in jenem Modell
jedoch vom glomerulären Schaden abhängig ist, kann aus der Studie nicht erschlossen
werden, inwiefern PDGF-D direkt auf die tubulointerstitielle Fibrose Einfluss nimmt. Um dies
herauszufinden, werden in dieser Arbeit Modelle der direkten tubulointerstitiellen Fibrose,
wie die unilaterale Ureterobstruktion und die Ischämie/Reperfusion, angewendet und auf die
Rolle von PDGF-D analysiert. Hierbei wird erstmalig eine Pdgfd-Knockout-Maus verwendet.
Da es zum Zeitpunkt der Versuchsdurchführung noch keine Beschreibungen zu dieser Maus
gab, schließt die Arbeit eine Analyse des Knockouts auf die Entwicklung und Physiologie der
Niere ein.
9Material
Material
Material und Methoden sind nach Standardprotokollen der Medizinischen Klinik II, RWTH
Aachen, verfasst und entsprechend individueller experimenteller Änderungen modifiziert.
1.6 Geräte
ABI Prism 7400 sequence detection system Life technologies (Darmstadt)
Agarose-Gel-Apparatur Biorad (München)
Agarose-Gel-UV-Auswertungssystem Analytik Jena (Jena)
Apparatur Western Blot Biorad (München)
Blutdruckmesssystem CODA Standard Kent Scientific (Torrington, USA)
Brutschrank Heraeus (Hanau)
Casy® Modell TTC System Roche Diagnostics (Mannheim)
Casyton Roche Diagnostics (Mannheim)
Dampfsterilisator Varioclav H&P Labortechnik (München)
Einbettautomat Digitana AG, Sakura (Horgen, Schweiz)
Einblockautomat Histoembedder Leica Instruments GmbH (Nussloch)
Entwickler Curix 60 Agfa (Mortsel, Belgien)
Homogenisator RZR 2020 Heidolph (Schwabach)
Kauter Erbotom Acc 450 Erbe (Tübingen)
Kochplatte MR 3001 Heidolph (Schwabach)
Kryostat Leica (Wetzlar)
Kühlplatte COP30 Medite (Burgdorf)
Licht- und Fluoreszenzmikroskop BZ-9000 Keyence (Osaka, Japan)
Magnet Dyna Mag™-2 Invitrogen Dynal (Oslo, Schweden)
Metabolischer Käfig (3600M021) Tecniplast (Buguggiate, Italien)
Mikrotitterplatten-Photometer, Tecan Sunrise Tecan (Männedorf, Schweiz)
NanoDrop 2000 Peqlab (Erlangen)
NuPAGE Novex Elektrophorese-System Invitrogen (Carlsbad, USA)
PCR System T3000 Thermocycler Biometra (Göttingen)
Pipetten Eppendorf (Hamburg)
Pipetus-Akku Hirschmann Laborgeräte
Rasierer Favoritta II Aesculap® (Suhl)
Rotationsmikrotom CUT5062 Slee (Mainz)
Schüttler Vortex-Genie2 Scientific Industries, Inc., (New York, USA)
Schwinglmühle MM 400 Retsch (Haan)
Slide Scanner Nanozoomer 2.0-HT Hamamatsu (Osaka, Japan)
Stereoskop Wild M650 Wild Heerbrug (Heerbrug, Schweiz)
Sterile Arbeitsbank (Zellkultur) Hera safe Heraeus (Hanau)
Thermocycler Landgraf (Langenhagen)
10Material
Tischzentrifuge Zentrifuge 5415D Eppendorf (Hamburg)
Ultraschallbad Sonorex RK100H Bandelin electronics (Berlin)
Vaskuläre Klemme Fine Science Tools GmbH (Heidelberg)
Vortex-Genie 2 Scientific Industries, New York
Wärmeplatte TC-1000 Temperature Controller CWE Inc. (Ardmore, USA)
Wasserbad für Paraffinschnitte Barnstead (Electrothermal) (Iowa, USA)
Wasserbad GFL 1083 GFL (Burgwedel)
Zentrifuge 4K15 Sigma Laborzentrifugen (Osterode)
Zentrifuge 5417R Eppendorf (Hamburg)
1.7 Verbrauchsmaterialien
Amersham HyperfilmTM ECL GE Healthcare (Buckinghamshire, UK)
Deckgläser Roth (Karlsruhe)
Einbettkassetten Sakura (Staufen)
Reaktionsgefäße Eppendorf (Hamburg)
Nahtmaterial Mersilene® 5-0 Ethicon (Norderstedt)
Objektträger Superfrost Plus Menzel GmbH (Braunschweig)
Operationsbesteck Fine Scientific Tools (Heidelberg)
Amersham Protran® Nitrozellulosemembran GE Healthcare (Little Chalfont, UK)
0,45µm
Serologische Pipetten Corning (New York, USA)
Pipettenspitzen Eppendorf (Hamburg)
Whatman-Filterpapier Biorad (München)
Zellkulturplatten, 6 Vertiefungen TTP (Trasadingen, Schweiz)
Zellkulturflaschen, 75 cm2 Wachstumsfläche Greiner Bio-one (Frickenhausen)
Zellschaber TTP (Trasadingen, Schweiz)
Zellkulturplatten, 96 Vertiefungen TTP (Trasadingen, Schweiz)
Sieb, BD Falcon™ cell stainer, 100 µm BD Bioscience (Bedford, USA)
Handschuhe, Nitril powder-free Sempercare (Wien, Österreich)
Röhrchen 15ml, 50 ml Greiner Bio-one (Frickenhausen)
Perfusorspritze, Original-Perfusor®, 50 ml B. Braun (Melsungen)
Skalpel, Feather Disposable Scalpel No 15 Feather Safety Razor Co LTD (Osaka, Japan)
Kanüle, 27G ½“ BD Microlance™ (Bedford, USA)
Kanüle, 21G ½“ BD Microlance™ (Bedford, USA)
Spritze, 1 ml BD Plastipak™ Becton Dickinson (Madrid, Spanien)
Serumröhrchen Sarstedt (Nümbrecht)
EDTA-Röhrchen Sarstedt (Nümbrecht)
Kryo-Röhrchen, Cryovial®, 2ml Simport (Saint-Michel-de-Bellechasse, Kanada)
NuPAGE® 12% Bis-Tris Gel Lifetechnologies (Carlsbad, USA)
TissueTek® Einbettkassetten Sakura (Torrance, USA)
11Material
Glaskapillaren, heparinisiert Ø 0,8mm Hilgenberg (Malsfeld)
Novex™ Zymogram-Gel (10% Tris-Glyzin Gel Life Technologies (Carlsbad, USA)
mit 0,1% Gelatine)
1.8 Reagenzien
100bp-ladder Life Technologies (Karlsruhe)
1kb-ladder Life Technologies (Karlsruhe)
Agarose Sigma-Aldrich Chemie (Steinheim)
Beta-Mercaptoethanol Biorad (München)
BSA (bovine serum albumin) Sigma-Aldrich Chemie (Steinheim)
Chloroform VWR (Leuven, Belgien)
DAPI Roche Diagnostics GmbH (Mannheim)
Diaminobenzidin-Substrat (DAB) Sigma-Aldrich Chemie (Steinheim)
Dimethylbutan Roth (Karlsruhe)
Dimethylformamid Merck (Darmstadt)
Dimethylsulfoxid (DMSO) ICN Biochemicals (Cleveland, Ohio, USA)
Dithiothreitol (DTT) Biorad (München)
dNTP Amersham (Braunschweig)
Dulbecco’s Eagle’s (DMEM) Medium Gibco (Paisley, UK)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco (Paisley, UK)
EGTA Sigma-Aldrich (Steinheim)
Eisenoxid, Puder < 5µm Sigma (Steinheim)
Eosin Roth (Karlsruhe)
Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Immuno Tools (Friesoythe)
recombinant murin
Essigsäure Calbiochem (Darmstadt)
Ethanol, 70% Apotheke des Universitätsklinikums der RWTH
Aachen (Aachen)
Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Sigma-Aldrich Chemie (Steinheim)
Fetales Kälberserum (FCS) Life Technologies (Karlsruhe)
First strand buffer Life Technologies (Karlsruhe)
Gelatine (von Schweinehaut Typ A) Sigma (Steinheim)
GelRed™ Nucleic Acid Gel Stain Biotium (Hayward, USA)
Glyzerin Roth (Karlsruhe)
Halt™ Protease & Phosphatase Inhibitor Thermo Scientific (Rockford, USA)
Cocktail, EDTA free
HEPES Gibco (Paisley, UK)
Histokitt Roth (Karlsruhe)
Hydrokortison (Hydrocortison-21- Pfizer Pharma GmbH, Pharmacia GmbH (Berlin)
Hydrogensuccinat Natriumsalz)
12Material
Immu-Mount Shandon (Pittsburgh, USA)
Isofluran Florene Abott (Wiesbaden)
Isotone 0,9% Kochsalzlösung B. Braun (Melsung)
Kaliumchlorid Calbiochem (Darmstadt)
Kaliumferrecyanit Merck (Darmstadt)
Kaliumferrocyanit Merck (Darmstadt)
Ketamin Rompun, 10% Ceva Sante Animale (Düsseldorf)
Kollagenase IV Worthington Biochemical (Lakewood, USA)
L-Glutamin Gibco® lifetechnologies (Paisley, UK)
Magnesiumchlorid Calbiochem (Darmstadt)
Mayers Hämalaun-Färbelösung Calbiochem (Darmstadt)
Methanol Apotheke des Universitätsklinikums der RWTH
Aachen (Aachen)
Methylgrün Sigma-Aldrich Chemie (Steinheim)
Milchpulver, fettarm Roth (Karlsruhe)
Moloney murine leukemia virus-Reverse Life Technologies (Karlsruhe)
Transkriptase (M-MLV RT)
MOPS SDS Running Buffer (20X) NuPAGE® Invitrogen (Carlsbad, USA)
Natriumacetat Calbiochem (Darmstadt)
Natriumchlorid VWR (Leuven, Belgien)
Natriumdeoxycholat Sigma (Steinheim)
Natriumdodecylsulfat (SDS) Biorad (München)
Natrium-Orthovanadat Sigma-Aldrich Chemie (Steinheim)
Natronlauge (10N) Calbiochem (Darmstadt)
Nickelchlorid Sigma-Aldrich Chemie (Steinheim)
Nonidet P-40 Sigma-Aldrich Chemie (Steinheim)
Paraffin Roth (Karlsruhe)
Paraformaldehyd Applichem (Darmstadt)
Penicillin/Streptomycin Gibco® Life Technologies (Paisley, UK)
Perjodsäure Sigma-Aldrich Chemie (Steinheim)
Pierce™ ECL Western Blotting Substrate Thermo Fisher Scientific (Rockford, USA)
Pikrinsäure, 1,2% Waldeck GmbH Chroma (Münster)
Random-primer Roche Diagnostics GmbH (Mannheim)
RNA Lysis Solution R Stratec (Berlin)
RNAlater® Solution Ambion Inc. (Austin, USA)
RNasin Promega (Mannheim)
Salzsäure (HCl) 1N Applichem (Darmstadt)
Schiffs Reagenz Merck (Darmstadt)
Schwefelsäure Roth (Karlsruhe)
SimplyBlue™ SafeStain Life Technologies (Carlsbad, USA)
Siriusred F3BA Waldeck GmbH Chroma (Münster)
SYBR Green I Eurogentec (Seraing, Belgien)
13Material
Temgesic® Reckitt Benckiser Healthcare (Slough, UK)
TissueTek® OCT Sakura (Staufen)
Tris Biorad (München)
Tris-HCl Roth (Karlsruhe)
Triton X-100 Sigma-Aldrich Chemie (Steinheim)
Trypsin-EDTA (0,25%Trypsin, 1mM EDTA) Gibco® Life Technologies (Paisley, UK)
Tween-20 Biorad (München)
Wasserstoffperoxid (H2O2) 30% Calbiochem (Darmstadt)
Xylazin , 2% Medistar GmbH (Bernburg)
Xylol Roth (Karlsruhe)
X-β-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D- Roth (Karlsruhe)
galactopyranosid)
Zymogram-Renaturierungspuffer (10X) Life Technologies (Carlsbad, USA)
1.9 Stimulanzien
PDGF-D, human recombinant R&D systems (Minneapolis, USA)
Angiotensin II, human Sigma (St. Louis, USA)
IL-1β, human Sigma (St. Louis, USA)
1.10 Reaktionskits
RneasyTM Mini Kit Qiagen (Hilden)
Vectastain ABC-Kit Vector Laboratories (Burlingame, USA)
Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Roche Diagnostics GmbH (Mannheim)
Avidin-Biotin-Blocking Kit Vector Laboratories (Burlingame, USA)
MaxBlock™ Autofluorescence Reducing Maxvision Bioscience Inc. (Washington, USA)
Reagent Kit
InviTrap Spin Universal RNA Mini Kit Stratec Biomedical (Berlin)
qPCR kit for SYBR® Green I Eurogentec (Seraing, Belgien)
14Material
1.11 Antikörper
Primärantikörper
Für die Immunhistologie verwendete Primärantikörper:
Blockierung/
Antigen Wirtsspezies Verdünnung Hersteller
Besonderheit
-SMA Maus, 1:500 Dako (Glostrup, Dänemark) IgG2a als
monoklonal Zweitantikörper
F4/80 Ratte 1:600 Serotec GmbH (Düsseldorf)
Kollagen I Ziege, 1:100 SouthernBiotech
polyklonal (Birmingham, USA)
Kollagen III Ziege, 1:100 SouthernBiotech
polyklonal (Birmingham, USA)
PDGF-D Kaninchen, 1:50 Invitrogen (Carlsbad, USA) Ziegen-Normalserum-
polyklonal Block
CD45 Ratte, 1:200 BD Bioscience Pharmingen
(anti-Maus) monoklonal (Frankling Lakes, USA)
CD45 Maus, gebrauchs- Dako (Glostrup, Dänemark)
(anti-human) monoklonal fertig
Aquaporin 1 Kaninchen, 1:100 Abcam (Cambridge, Eselserum-Block
Großbritannien)
polyklonal
THP Kaninchen, 1:100 Santa Cruz Biotechnologies
polyklonal (Dallas, USA)
Für den Western Blot verwendete Primärantikörper:
Antigen Wirtsspezies Hersteller
Fibronektin Kaninchen Merk Millipore (Darmstadt)
Kollagen I Kaninchen Monosan (Uden, Niederlande)
α-SMA Maus Cymbus Biotech (London, Großbritannien)
LCN2 Ziege R&D Systems (Minneapolis, USA)
β-Aktin Maus Sigma (St. Louis, USA)
PDGFR-β Kaninchen Santa Cruz Biotechnologies (Dallas, USA)
p-PDGFR-β Kaninchen Cell Signaling (Danvers, USA)
Akt Kaninchen Cell Signaling (Danvers, USA)
15Material
Antigen Wirtsspezies Hersteller
p-Akt Kaninchen Cell Signaling (Danvers, USA)
p38 Maus BD Biosciences (Frankling Lake, USA)
p-p38 Maus BD Biosciences (Frankling Lake, USA)
ERK1/2 Kaninchen Cell Signaling (Danvers, USA)
p-ERK1/2 Kaninchen Cell Signaling (Danvers, USA)
TIMP-1 Ziege R&D Systems (Minneapolis, USA)
Sekundärantikörper
Für die Immunhistologie verwendete Sekundärantikörper:
Antikörper Verdünnung Hersteller
Biotinyliertes Ziegen Anti-Kaninchen IgG 1:300 Vector laboratories (Burlingame, USA)
Biotinyliertes Kaninchen Anti-Ziegen IgG 1:300 Vector laboratories (Burlingame, USA)
Biotinyliertes Kaninchen Anti-Ratten IgG 1:300 Vector laboratories (Burlingame, USA)
Biotinyliertes Ziegen Anti-Maus IgG2a 1:300 Antibodies-online (Aachen)
Für die Immunfluoreszenz verwendete Sekundärantikörper:
Antikörper Verdünnung Hersteller
Alexa Fluor® 647-konjugierter Esel anti- 1:200 Jackson ImmunoResearch
Kaninchen IgG Fab Fragment Laboratories (West Grove, USA)
Alexa Fluor® 448-konjugierter Ziege anti- 1:200 Molecular Probes® Life
Ratte IgG Technologies (Eugene, USA)
TRITC-konjugierter Ziege anti-Maus IgG 1:200 Dianova (Hamburg)
Alexa Fluor® 647-konjugierter Ziege anti- 1:200 Molecular Probes® Life
Maus IgG Technologies (Eugene, USA)
Alexa Fluor® 448-konjugierter Ziege anti- 1:200 Molecular Probes® Life
Kaninchen IgG Technologies (Eugene, USA)
16Material
Für die Immundetektion (Western Blot) verwendete Sekundärantikörper:
Antikörper Verdünnung Hersteller
Peroxidase-gekoppeltes Ziegen Anti- 1:10000 Santa Cruz Biotechnologies
Kaninchen IgG (Dallas, USA)
Peroxidase-gekoppeltes Kaninchen Anti- 1:10000 Santa Cruz Biotechnologies
Ziegen IgG (Dallas, USA)
Peroxidase-gekoppeltes Anti-Maus IgG 1:10000 Santa Cruz Biotechnologies
(Dallas, USA)
1.12 Primer und Sonden
Die Primer für die Genotypisierungen wurden von der Firma Life Technologies (Carlsbad, USA)
hergestellt.
Genotypisierungsprimer
Primer Sequenz 5`zu 3`
Pdgfd forward GAATCCACGTCAACCTGTTG
Pdgfd reverse CGCACAGGAGAATGGAGACT
Pdgfd common GTCTGTCCTAGCTTCCTCACTG
Primer für die RT-PCR
Gen Primer forward Primer reverse Sonde
murin
Col1a1 TCGCTTCACCTACAGCACCC TGACTGTCTTGCCCCAAGTTC Sybr Green
Col3a1 TCGCTTCACCTACAGCACCC GCAGTGGTATGTAATGTTCTGGG Sybr Green
AG
Pdgfd GACACTTTTGCGACTCCGC TGTGAGGTGATTGCTCTCATCTC TTGCGCAATGCCAAC
CTCAGGA
Pdgfb CCATCCGCTCCTTTGATGAT AAGTCCAGCTCAGCCCCAT CGCCTGCTGCACAG
AGACTCCGTA
Pdgfrb GAGGCTTATCCGATGCCTTCT AAACTAACTCGCCAGCGCC CCTGTGGCTCAAGG
ACAACCGTACCTT
Ccl2 TGGCTCAGCCAGATGCAGT ATTGGGATCATCTTGCTGGTG Sybr Green
Ccl5 AGTGCTCCAATCTTGCAGTCG CACTTCTTCTCTGGGTTGGCA Sybr Green
Gapdh GGCAAATTCAACGGCACAGT AGATGGTGATGGGCTTCCC Sybr Green
Mmp9 ACGACATAGACGGCATCCA GCTGTGGTTCAGTTGTGGTG Sybr Green
17Material
Gen Primer forward Primer reverse Sonde
Timp1 GCAAAGACGTTTCTCAAAGACC AGGGATAGATAAACAGGGAAAC Sybr Green
ACT
human
PDGFD TCATACCATGACCGGAAGTCAA TGGGAGTGCAACTGTAACGCT TTGACCTGGATAGG
CTCAATGATGATGCC
PDGFRB ATGCCTTACCACATCCGCTC ACATTGCAGGTGTAGGTCCCC Sybr Green
GAPDH AGCCACATCGCTCAGACACC GCGCCCAATACGACCAAA Sybr Green
GAPDH AGCCACATCGCTCAGACACC GCGCCCAATACGACCAAA CCGTTGACTCCGACC
TTCACCTTCC
1.13 Puffer und Lösungen
Methacarn
Chloroform 300 ml
Essigsäure (100%) 100 ml
Methanol 600 ml
PBS (phosphate buffered saline)
Na2HPO4 5,92 g
KH2PO4 1,72 g
NaCl 28,8 g
A. dest. 4l
pH 7,2 einstellen
Methylgrün-Lösung
Methylgrün 2g
Essigsäure (0,1M) 755 ml
Natriumacetat (0,1M) 265 ml
pH 4,2 einstellen
Sirius Rot-Färbeösung
Sirius Rot 0,5 g
Pikrinsäure (1,2% 500 ml
pH 2 einstellen
18Material
Tris-Puffer
Tris 6,1 g
NaCl 11,69 g
A. dest. 500 ml
pH 7,6 einstellen
DAB-Stocklösung
DAB 5g
Tris-Puffer 132 ml
DAB-Arbeitslösung
Tris-Puffer 175 ml
DAB 4 ml
NiCl2 (8%) 1 ml
H2O2 (30%) 0,1 ml
X-Gal-Fixierlösung
Formaldehyd (37%) 540 μL
Glutaraldehyd (25%) 80 μL
Natriumdeoxycholate (10%) 20 μL
NP-40 (10%) 20 μL
PBS 9,340 μL
X-Gal-Färbelösung
Kalium-Ferricyanit (100 mM) 10 μL
Kalium-Ferrocyanit (100 mM) 10 μL
MgCl2 (1 M) 0,4 μL
Natriumdeoxycholate (10%) 0,4 μL
NP-40 (10%) 0,4 μL
X-Gal (20mg/ml in DMF) 10 μL
PBS (pH 7,4) 168,8 μL
19Material
Bokemeyer Lysepuffer
HEPES pH 7,0 50 mM
NaCl 150 mM
MgCl2 1,5 mM
EGTA 1 mM
Glyzerin 10% (v/v)
Triton X-100 1% (v/v)
Na-Orthovanadat 1 mM
Protease-Inhibitor 1% (v/v)
Ladepuffer (4X)
β-Mercaptoethanol 1 ml
EDTA-Lösung (0,5 M) 40 µl
Bromphenolblau (1%) 200 µl
SDS (10%) 2 ml
Tris/HCl (0,5 M; pH 6,8) 2,4 ml
A. dest. 2,4 ml
Transferpuffer
Tris 3,03 g
Glycin 14,4 g
Methanol 200 ml
A. dest. 800 ml
TTBS-Puffer (Tris buffered saline)
NaCl (5M) 60 ml
Tris (1M, pH8) 20 ml
Tween-20 1 ml
A. dest. 2l
20Material
1.14 Zelllinien und Medien
NiH3T3-Zellen
NiH3T3-Zellen sind embryonale Fibroblastenzellen aus der Maus. Es handelt sich um eine
adhärent wachsende, immortalisierte Kultur.
Wachstumsmedium für NiH3T3-Zellen:
Bestandteil Endkonzentration
DMEM (500 ml)
FKS 10%
L-Glutamin 2 mM
Penicillin 100 U/ml
Streptomyzin 100 U/ml
MCT-Zellen
MCT-Zellen sind murine kortikale Tubuluszellen. Es handelt sich um eine adhärent wachsende,
immortalisierte Kultur.
Wachstumsmedium für MCT-Zellen:
Bestandteil Endkonzentration
DMEM (500 ml)
FKS 10%
L-Glutamin 2 mM
Natriumpyruvat 1 mM
Penicillin 100 U/ml
Streptomyzin 100 U/ml
Primäre renale Tubuluszellen
Die renalen Tubuluszellen wurden aus murinen Nieren gewonnen und als adhärente
Primärkultur gezüchtet. Die Isolation wird in 1.20.4 beschrieben.
21Material
Wachtumsmedium für primäre renale Tubuluszellen:
Bestandteil Endkonzentration
DMEM F12 Advanced (500 ml)
Penicillin 100 U/ml
Streptomyzin 100 U/ml
HEPES 1M
Hydrokortison 50 ng/ml
L-Glutamin 2 mM
Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) 100 µg/ml
1.15 Humane Nierenbiopsien
Die humanen Nierenbiopsien wurden von nephrektomierten Nieren von Patienten mit
fortgeschrittener Hydronephrose, chronischer Pyelonephritis oder Transplantatabstoßung
erhalten. Bei den Kontrollnieren handelt es sich um Nephrektomien entweder von
tumorfernen Bereichen von Nierenzellkarzinom-befallenen Nieren oder Trauma-bedingte
Nephrektomien, in beiden Fällen ohne offensichtliche spontane pathologische
Veränderungen. Die Proben wurden unter Genehmigung der lokalen Ethik-Komission der
RWTH Aachen und Einhaltung der Deklaration von Helsinki 1975 und 2000 verwendet. Die
Nephrektomien waren dabei anonymisiert.
1.16 Software
ABI Prism 7300 Sequence Detection Applied Biosystems (Darmstadt)
BZ-II Analyzer Keyence (Osaka, Japan)
BZ-II Viewer Keyence (Osaka, Japan)
Geldokumenationssoftware Gelstudio SA Analytik Jena (Jena)
GIMP Version 2.8.10 GNU Image Manipulation Program
GraphPad Prism Version 6.0.1 GraphPad Software Inc. (La Jolla, USA)
ImageJ, Version 1.44p National Instituts of Health (USA)
Magellan Version 6 Tecan (Newcastle, UK)
Microsoft Office 2010 Microsoft Corporation (Redmond, USA)
NDPview Hamamatsu Photonics (Hamamatsu, Japan)
22Methoden
Methoden
1.17 Tierexperimentelle Methoden
1.17.1 Tierhaltung
Die Mäuse wurden den Tierschutzgesetzen und Richtlinien der FELASA (Federation of
European Laboratory Animal Science Association) entsprechend in der Tierversuchsanstalt des
Uniklinikums Aachen gehalten. Sie wurden in Kunststoffkäfigen auf Weichholzgranulat
gehalten und erhielten Trockenfutter und Wasser ad libidum. Die Tierhaltung erfolgt in einem
12 Stunden-Tag-/Nachtzyklus bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 40-60 % und einer
Raumtemperatur von 20 ± 2 °C.
Alle durchgeführten Tierversuche wurden vom Landesamt für Natur, Umwelt und
Verbraucherschutz Nordrhein-Westfahlen (LANUV NRW) genehmigt.
1.17.2 Genotypisierung
Die Genotypisierung der Mäuse erfolgte mittels PCR. Die dafür benötigte DNA wurde aus
Schwanzbiopsien erhalten. Die DNA-Extraktion und anschließende DNA-Amplifizierung wurde
mit dem KAPA Mouse Genotyping Hot Start Kit der Firma Peqlab durchgeführt.
Hierbei wurde zunächst die Schwanzbiopsie mit dem Kit-eigenem Lysepuffer 10 min in einem
Thermocycler bei 75°C lysiert. Das Lysat wurde direkt für die PCR eingesetzt. Für den PCR-
Ansatz wurde zunächst ein PCR-Mix aus dem KAPA2G Genotypisierungsmix, den jeweiligen
passenden Primern, dem DNA-Lysat und A. dest. hergestellt. Der KAPA2G
Genotypisierungsmix enthielt dabei die Polymerase in einem passenden Puffer sowie einen
DNA-Farbstoff. Die PCR-Reaktion erfolgte im Thermocycler nach dem unten aufgeführten
PCR-Programm. Die PCR-Produkte wurden anschließend auf einem 2%igen Agarosegel
aufgetrennt. Mit einem Geldokumentationsgerät konnten die Banden unter UV-Licht
detektiert werden. Anhand der Bandenhöhe wurde der Genotyp der Tiere abgeleitet. Die
23Methoden
Bandenhöhe der Wildtyp-Bande beträgt 289 bp, die Bandenhöhe des Pdgfd-Knockouts
387 bp.
Mengenangaben für den PCR-Mix je Probe: PCR-Programm
2x Genotyping Mix (grün) 12,5 µl 1. 3 min @ 95°C
Primer (1:10) je 1,25 µl 2. 15 s @ 95°C
A. dest. ad 24 µl 3. 15 s @ 60°C
DNA -Lysat 1 µl 4. 10 s @ 72°C
5. Wdh. 2-4 35x
6. 8°C ∞
1.17.3 Unilaterale Ureterobstruktion (UUO)
Die Unilaterale Ureterobstruktion ist ein gängiges Fibrosemodell, bei dem durch Obstruktion
des ableitenden Harnweges der Urin in der Niere aufgestaut wird und so eine Hydronephrose
induziert wird. Bereits nach 5 Tagen entwickelt sich eine deutliche tubulointerstitielle
Schädigung der Niere mit einer Fibrose, die sich mit fortschreitender Zeit aggraviert. Bereits
nach 10 Tagen hat sich eine stark fortgeschrittene Fibrose entwickelt.
Für die UUO wurde das Tier mittels intraperitoneale Injektion von Ketamin/Xylazin (90 mg/kg
Körpergewicht + 10 mg/kg Körpergewicht) in Vollnarkose gelegt. Anschließend wurde der
Bauch durch eine mediane Längslaparatomie geöffnet. Der Ureter der linken Niere wurde
präpariert und mit einem Elektrokauter kauterisiert, sodass er durchtrennt und an den Enden
verschlossen war. Anschließend wurde die Bauchdecke in zwei Schichten (Muskulatur und
Haut) mit einer Naht verschlossen. Die Analgesie erfolgte durch eine subcutane Gabe von
Buprenorphin (0,05 mg/kg Körpergewicht; Temgesik) alle 8 Stunden über einen Zeitraum von
72 Stunden.
Das Modell wurde in verschiedenen genetischen Hintergründen und Zeitdauern durchgeführt.
Dabei wurden stets 11-12 Wochen alte Pdgfd-Knockout-Tiere (Pdgfd-/-) mit Wildtyp-
Geschwistertieren (WT) verglichen. Die Tierzahlen pro Gruppe waren wie folgt:
Model Stammeshintergrund n Pdgfd-/- n WT
UUO Tag 5 C57BL/6 9 10
UUO Tag 5 Sv129 7 8
UUO Tag 10 C57BL/6 7 10
24Methoden
1.17.4 Ischämie-Reperfusion (I/R)
Bei dem Modell der einseitigen Ischämie/Reperfusion wird ein Nierenschaden durch das
vorübergehende Abklemmen der Niere von der Blutversorgung und anschließender
Reperfusion induziert. Innerhalb von 21 Tagen entwickelt sich eine progressive
tubulointerstitielle Fibrose.
Für die Operation wurde das Tier durch intraperitoneale Injektion von Ketamin/Xylazin (90
mg/kg Körpergewicht + 10 mg/kg Körpergewicht) anästhesiert. Die linke Niere wurde durch
Inzission der Haut- und Muskelschicht an der Flanke an der Position oberhalb der Niere
freigelegt. Die Gefäße am renalen Hili der linken Niere wurde identifiziert und mit einer feinen
vaskulären Klemme für 30 min vom Blutstrom abgeklemmt. Über diesen Zeitraum wurde die
Temperatur des Tieres mittels eines Wärmeplattensystems mit rektaler Temperatursonde auf
ca. 37°C gehalten. Anschließend wurde die Klemme wieder gelöst und die Reperfusion der
Niere mit Blut optisch überprüft. Die Wunde wurde durch eine zweischichtige Naht wieder
verschlossen. Die Analgesie erfolgte durch eine subcutane Gabe von Buprenorphin (0,05
mg/kg Körpergewicht; Temgesic) alle 8 Stunden über einen Zeitraum von 72 Stunden.
Die Ischämie/Reperfusion wurde in 11-12 Wochen alten Pdgfd-Knockout-Mäusen (n=9) sowie
in Wildtyp-Geschwistertieren (n=6) des genetischen Hintergrundes C57BL/6 durchgeführt.
1.17.5 Hepatische Überexpressions von PDGF-D
Die Adenovirale Überexpression wurde von der Arbeitsgruppe von C. Alpers durchgeführt.
Hierbei wurde eine Überexpression von PDGF-D in der Leber durch einen hepatischen
adenoviralen Expressionsvektors erzeugt. Dies führte zu hohen sytemischen Konzentrationen
von PDGF-D in diesen Mäusen. Im Detail wurden C57BL/6 Mäusen (n=4) 1,0x1011 Partikel des
adenoviralen Vektors, welcher eine Kodierung für PDGF-D enthält, intravenös verabreicht. Der
Kontrollgruppe (n=4) wurde ein GFP-Leervektor in der selben Konzentration injiziert. 2
Wochen nach der Injektion wurden die Tiere getötet und die Nieren entnommen. Ergebnisse
der Untersuchungen bezüglich mesangialer Expansion von der Arbeitsgruppe von C. Alpers
wurden 2004 publiziert23. In dieser Arbeit wurden Methacarn-fixierte Gewebeproben dieser
Mäuse auf einen neuen Aspekt hin (interstitielle Veränderungen) reanalysiert.
25Methoden
1.17.6 Gewinnung von Urinproben
Zur Gewinnung von Urinproben wurden die Mäuse 17 Stunden einzeln in metabolische Käfige
gesetzt, die den Urin abfingen und getrennt vom Kot sammelten. Dabei waren die Tiere stets
mit ausreichend Wasser versorgt.
1.17.7 Blutdruckmessung
Der Blutdruck der Tiere wird mit einem nicht invasiven Blutdruckmesssystem der Firma CODA
Scientific gemessen. Die Ermittlung des Blutdrucks erfolgte hierbei über die Messung des
Schwanzblut-Volumenstroms mit einem Volumen-Druck-Sensor und einer Schwanz-
manschette. Die Tiere waren während der Messung in einer Röhre fixiert und wurden durch
eine Wärmeplatte mit 38°C angewärmt.
1.17.8 Finale Nierenentnahme
Die finale Nierenentnahme erfolgte unter Vollnarkose des Tiers mittels Ketamin/Xylazin (90
mg/kg Körpergewicht + 10 mg/kg Körpergewicht). Zunächst wurde dem narkotisierten Tier für
Blutbild- und Serumanalysen Blut abgenommen (siehe 1.17.9).
Da die Blutkörperchen bei einigen Untersuchungen stören können, wurde das Blut mit einer
isotonen Natriumchloridlösung ausgespült. Hierzu wurde zunächst der Abdomen und Thorax
geöffnet. Dann wurde die Bauchaorta unterhalb der Abzweigung der renalen Aorten geöffnet
und die linke Herzkammer kanüliert. Über die Kanüle wurde das Tier mit einer sterilen
0,9%igen Natriumchloridlösung perfundiert, bis das Blut vollständig aus dem Körper
ausgespült wurde. Dabei tratt der Tod des Tieres durch vollständige Ausblutung ein. Dann
wurden die Nieren entnommen und weiterverarbeitet.
26Methoden
1.17.9 Blutabnahme
Die Blutabnahme erfolgte am narkotisierten Tier. Das Blut wurde mittels einer heparinisierten
Glaskapillare aus dem retroorbitalem Venenplexus entnommen. Für die Bestimmung eines
Blutbildes wurde das Blut in EDTA-haltigen Plasmaröhrchen, welche die Gerinnung des Blutes
verhindern, aufgenommen. Für den Erhalt von Serum wurde das Blut in speziellen
Serumröhrchen aufgefangen und bei 3500 rpm bei 4°C für 10 min zentrifugiert. Das Serum
wurde vorsichtig von den pelletierten Blutzellen getrennt abgenommen und bei -80°C
gelagert.
1.17.10 Gewebefixierung und Probenlagerung
Um das Gewebe für möglichst viele Untersuchungen nutzen zu können wurde jede Niere
zerteilt und die Stücke auf verschiedene Arten konserviert. Für histologische Untersuchungen
wurde der größte Teil der Niere in Methacarn fixiert, ein weiterer Teil wurde für
Gefrierschnitte verarbeitet.
Die in Methacarn fixierten Gewebestücke wurden nach einer Fixationszeit von mindestens
24h in Paraffin eingebettet. Hierzu wurden sie zunächst in einem Entwässerungsautomaten
dehydriert, indem sie in einer aufsteigenden Alkoholreihe und anschließend durch Xylol
durchwirkt wurden. Nach anschließender Paraffineinbettung konnten die Gewebe-
Paraffinblöckchen bei Raumtemperatur gelagert werden. Der Prozess lief unter einem
Vakuum ab. Jeder Schritt hatte eine Dauer von 1h.
Programm des Entwässerungsautomaten
Lösung Temperatur Wiederholung
70% Ethanol 40°C 2x
96% Ethanol 40°C 2x
100% Ethanol 40°C 3x
Xylol 40°C 3x
Paraffin 60°C 4x
27Methoden
Für die Gefrierschnitte wurde das Gewebe in TissueTek® OCT eingebettet und in –80°C kaltem
Methylbutan eingefroren.
Für Protein- und Genexpressionsanalysen wurde zusätzlich die Medulla der Niere entfernt,
sodass in den Analysen stets nur der kortikale Bereich der Niere betrachtet wurde. Die
Proteinprobe wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert. Die Proben
für Genexpressionsanalysen wurden in einer mRNA-Later Lösung für 24 h bei 4°C fixiert und
anschließend bei -80°C gelagert.
1.17.11 Blutbildbestimmung
Die Blutbildbestimmung wurde im Zentrallabor des Instituts für Versuchstierkunde im
Uniklinikum Aachen durchgeführt. Sie bestand zum einen aus einer manuellen Auszählung der
Zelltypen anhand eines Blutausstrichs und zum anderen aus einer maschinellen
Differenzialdiagnostik.
1.17.12 Urin- und Serumanalysen
Die Bestimmung von Urinwerten (Kreatinin, Protein) und Serumwerten (Blut-Harnstickstoff,
Kreatinin) wurde im Zentrallabor des Instituts für Versuchstierkunde im Uniklinikum Aachen
durchgeführt. Die Messungen basieren auf einer colorimetrischen Messmethode mit einem
Auto-Analyser.
1.17.13 Berechnung der Kreatinin-Clearance
Die Kreatinin-Clearance ist ein Maß für die Funktionsfähigkeit der Niere. Sie gibt die
Filtrationsrate von Kreatinin aus dem Serum in den Urin über einen Zeitraum von 24 h an.
( 24 ℎ) ∗ − ( )
=
− ( )
Das Volumen für 24 h wurde anhand des Volumens von 17 h hochgerechnet.
28Methoden
1.18 Histologische Methoden
1.18.1 Herstellen der Gewebeschnitte
Zur Herstellung von Gewebeschnitten wurden 1µm dünne Schnitte von den Gewebe-
Paraffinblöckchen auf einem Rotationsmikrotom angefertigt. Die Schnitte wurden auf der
Oberfläche eines Wasserbades (42°C) abgelegt und von dort auf Superfrost Objektträger
überführt. Dann wurden sie über Nacht bei 50°C im Wärmeschrank getrocknet und
anschließend bei Raumtemperatur gelagert.
1.18.2 Entparaffinieren der Gewebeschnitte
Zur Vorbereitung der Paraffinschnitte für histologische Färbungen wurden sie zunächst
entparaffiniert indem sie dreimal für jeweils 10 Minuten in Xylol gegeben wurden.
Anschließend wurden die Schnitte langsam gewässert, indem sie in eine absteigende
Alkoholreihe und zuletzt in Wasser getaucht wurden.
Absteigende Alkoholreihe
Ethanol, 100 % 3x 2 Minuten
Ethanol, 96 % 2x 2 Minuten
Ethanol, 70 % 2x 2 Minuten
A. dest. 1x 5 Minuten
1.18.3 Perjodsäure-Schiffsches-Reagenz-(PAS)-Färbung
Die Perjodsäure-Schiffsches-Reagenz-Färbung (PAS) ist eine zytochemische Färbung, die
durch eine magentarote Anfärbung von Glykolgruppen eine gute Übersicht über
Gewebestrukturen verleiht. Hierbei werden die Glykolgruppen zunächst durch Perjodsäure zu
Aldehydgruppen oxidiert. Die magentarote Farbe entsteht durch Bindung fuchsinschwefeliger
29Methoden
Säure des Schiffschen Reagenz an die Aldehydgruppen. Hämatoxylin sorgt durch Bindung an
die Phosphatgruppen von Nukleinsäuren für eine blaue Kontrastfärbung der Zellkerne.
Die Gewebeschnitte wurden zunächst wie beschrieben entparaffiniert. Dann wurden sie
zunächst 30 min mit 2%iger Perjodsäure behandelt, drei Mal für 2 min mit A. dest. gewaschen
und anschließend 1 h in der Schiffschen-Reagenz-Lösung im Dunkeln inkubiert. Anschließend
wurden die Schnitte für 5 min unter lauwarmen fließendem Leitungswasser gespült, 5 min in
Hämatoxylin inkubiert und schließlich erneut 5 min unter fließendem Leitungswasser gespült.
Durch zehnmaliges tauchen der Schnitte in TBS [pH 8,3] wurde die Kernfärbung differenziert.
Anschließend wurden die Schnitte durch kurzes Eintauchen in eine aufsteigende Alkoholreihe
(2x 96% Ethanol, 3x 100% Ethanol) sowie 3x 5 min in Xylol entwässert.
Die Schnitte wurden mit Histokitt eingedeckt.
1.18.4 Siriusrot-Färbung
Siriusrot wird zum Anfärben von Kollagen im Gewebe genutzt. Der Farbstoff reagiert über
seine sulfonischen Säuregruppen mit den basischen Gruppen des Kollagens.
Nach Entparaffinierung der Schnitte wurden diese in der Sirius Rot-Färbelösung für 10 min
inkubiert. Anschließend wurden sie für 2 min in 0,01 N HCl eingetaucht. Nach 2 min Waschen
in A. dest. wurden die Präparate mittels aufsteigender Alkoholreihe und Xylol dehydriert
(siehe 1.18.3) und mit Histokitt eingedeckt.
1.18.5 Immunhistochemie
Mit der immunhistochemischen Methode werden Proteine direkt auf den Gewebeschnitten
mittels spezifischen Antikörpern detektiert. Um eine hohe Sensitivität in der Proteindetektion
zu erreichen, wurde hier die Avidin-Biotin-Komplex (ABC)-Methode verwendet.
Die Gewebeschnitte wurden zunächst entparaffiniert und rehydriert. Durch 10 min Inkubation
in 0,3% H2O2 wurden die endogenen Peroxidasen blockiert. Einige Färbungen benötigten
weitere Blockierschritte (siehe 1.11). Zwischen allen Schritten wurden die Schnitte gründlich
durch Waschschritte von 5 min in PBS gewaschen.
30Methoden
Zur Proteindetektion wurde ein spezifischer Primärantikörper verwendet. Dieser wurde in
einer entsprechenden Verdünnung (Verdünnungen siehe 1.11) in PBS mit 1% BSA verdünnt
und für 1 h auf den Gewebeschnitt gegeben. Nach 3 maligem Waschen wurde ein
biotinylierter Sekundärantikörper auf den Schnitt gegeben, der gegen die wirtsspezifische Fc-
Komponente des Primärantikörpers gerichtet war. Der Sekundärantikörper wurde in einer
Verdünnung von 1:300 in PBS mit 1% BSA verdünnt. Nach 30 min Inkubation wurde 3-mal
gewaschen. Es folgt eine 30 min Inkubation mit einer Avidin-Biotin-Komplex-Lösung. An das
Avidin ist eine Meerrettichperoxidase (HRP) gekoppelt. Avidin besitzt eine starke
Bindungsaffinität zu Biotin und bindet daher an das Biotin des Sekundärantikörpers sowie an
weitere in der Lösung befindlichen Biotin- und HRP-Avidin-Komplexe. Dies führte zu einer
Verstärkung des Signals in der folgenden Substratumsetzungreaktion. Diese erfolgte nach 3
gründlichen Waschschritten für 10 min in einer DAB-Lösung bei 37°C in einem Wasserbad. Die
Reaktion wurde durch 2 maliges Waschen in A. dest. abgestoppt. Anschließend wurden die
Zellkerne durch Färbung in Methylgrün für 3 min gegengefärbt. Die Schnitte wurden in einer
aufsteigenden Alkoholreihe und Xylol dehydriert (siehe 1.18.3) und mit Histokitt eingedeckt.
1.18.6 Morphometrische Auswertung histologischer Färbungen
Die immunhistologisch gefärbten Nierenschnitte wurden mit dem Bildverarbeitungs-
programm ImageJ morphomometrisch ausgewertet. Hierzu wurden die gefärbten
Gewebeschnitte zunächst mit einem Schnittscanner digitalisiert. Von den digitalen Schnitten
wurden mit der zugehörigen Betrachtungssoftware NDPview (digitales Mikroskop) einzelne
Auschnitte in 20- oder 40-facher Vergrößerung als jpg-Dateien aufgenommen. Bei der Analyse
der fibrotischen Nieren (UUO und I/R) wurden jeweils 16 Bilder aus dem Kortexbereich
aufgenommen, bei den kontralateralen Nieren jeweils 8. Die Bilder wurden anschließend mit
ImageJ analysiert. Hierbei wurde der prozentuale Anteil der angefärbten Fläche zur
Gesamtfläche des Ausschnittes bestimmt.
31Methoden
1.18.7 Immunfluoreszenz
Für die Visualisierung verschiedener Proteine auf einem Gewebeschnitt wurden
Immunfluoreszenzfärbungen verwendet.
Die Gewebeschnitte wurden entparaffiniert und rehydriert. Der Primärantikörper wurde in
PBS mit 1% BSA verdünnt (Verdünnungen siehe 1.11) und für 1 h auf dem Schnitt inkubiert.
Einige Antikörperfärbungen benötigten zuvor einen Blockierschritt (Verdünnungen siehe
1.11). Nach einer Inkubationszeit von 1 h wurde 3 mal 5 min in PBS gewaschen und der
fluoreszenz-markierte Sekundärantikörper aufgegeben. Dieser wurde 1:200 in PBS mit 1% BSA
verdünnt. Nach anschließendem 3 maligen Waschen wurden die Zellkerne mit 4',6-Diamidin-
2-Phenylindol (DAPI) für 10 min gegengefärbt, erneut gewaschen und mit Immumount
eingedeckt.
Soweit die Primärantikörper unterschiedlicher Wirtsspezien entstammten, wurden die
Antikörper gleichzeitig auf dem selben Schnitt verwendet. Bei gleicher Wirtsspezies wurden
Einzelfärbungen auf seriellen Schnitten durchgeführt und anschließend mit einer
Fotobearbeitungssoftware übereinandergelegt.
1.18.8 X-Gal-Färbung
Die X-Gal-Färbung dient zum Nachweis der β-Galaktosidase im Gewebe. Die β-Galaktosidase
ist ein bakterielles Enzym, welches das gelbliche X-Gal-Substrat (5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-
D-galactopyranosid) in einen blauen Niederschlag umsetzt. Die Pdgfd-Knockout-Mäuse
exprimieren die β-Galaktosidase anstelle von PDGF-D, sodass eine β-Galaktosidase-Expression
als Reporter für eine eigentliche PDGF-D-Expression verwendet werden kann.
Die X-Gal-Färbung wurde auf Gefrierschnitten durchgeführt. Hierfür wurden am Kryotom
7 µm dünne Schnitte von den Gefrierblöcken angefertigt und auf Objektträger übertragen. Die
Gewebeschnitte wurden für 30 min bei Raumtemperatur getrocknet. Anschließend wurden
sie mit der Fixierlösung für 7 min fixiert. Nach 2 maligem Waschen in PBS wurde die X-Gal-
Lösung auf das Gewebe gegeben und die Schnitte in einer feuchten Kammer über Nacht bei
37°C inkubiert. Nach 2 maligem Waschen in A. dest. wurde zur besseren Ansicht des Gewebes
eine Eosinfärbung durchgeführt. Hierzu wurden die Schnitte 15-mal in die Eosinlösung
32Methoden
getaucht. Anschließend wurden die Schnitte zum Dehydrieren durch eine aufsteigende
Alkoholreihe getaucht, 3-mal 5 min in Xylol inkubiert und mit Histokitt eingedeckt.
1.19 Molekularbiologische Methoden
1.19.1 Proteinlysatherstellung aus Gewebe
Zur Proteinlysatherstellung wurden ca. 3 mm2 große, schockgefrorene Gewebestücke des
Nierenkortex verwendet. Diese wurden auf Eis aufgetaut und mit 500 µl Bokemeyer-
Lysepuffer versetzt. Anschließend erfolgte der Zellaufschluss in einer Kugel-Schwingmühle.
Die Nierenlysate wurden anschließend 3-mal für jeweils 10 s mit Ultraschall (im
Ultraschallbad) behandelt. Die Proben wurden in einem letzten Schritt bei 14000 rpm bei 4° C
für 10 min zentrifugiert und die Überstände in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Nach der
Proteinkonzentrationsbestimmung mittels BC-Assay wurden die Lysate bei -80° C eingefroren.
1.19.2 Proteinkonzentrationsbestimmung mittels BCA-Reaktion
Der Proteingehalt in den Zelllysaten wurde mittels einer BCA-Reaktion ermittelt. Hierfür
wurde das BC-Assay Protein Quantitation Kit von Uptima verwendet. Die BCA-Reaktion ist eine
colorimetrische Methode, die darauf beruht, dass Cu 2+-Ionen im alkalischen Milieu an die
Proteine binden und einen violetten Farbkomplex bilden.
Von jeder Probe und der Standardreihe wurde jeweils eine Doppelbestimmung durchgeführt.
Die Standardreihe wurde durch Verdünnung von BSA mit A. dest. in den Protein-
konzentrationen 2 mg/ml, 1 mg/ml, 750 µg/ml, 500 µg/ml, 250 µg/ml, 100 µg/ml, 20 µg/ml
und 0 µg/ml hergestellt. Die Proben wurden so verdünnt, dass sie in den Bereich der
Standardreihe liegen würden. Von jeder Probe bzw. Standard wurde 25 µl in eine 96-Well-
Mikrotitterplatte gegeben. Das BCA-Assay-Reagenz wurde hergestellt, indem 1 Teil von
Reagenz B (Kupferlösung) zu 50 Teilen von Reagenz A (Puffer) gegeben wurde. Pro Well wurde
200 µl des Reagenz zugegeben und 30 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die
Absorption des Farbkomplexes bei 562 nm gemessen. Sie ist proportional zu der
33Sie können auch lesen
