Abstammungsuntersuchungen, Chimärismen und Spurenanalytik - Dr. Iris Schulz Institut für Rechtsmedizin

Abstammungsuntersuchungen,
Chimärismen und Spurenanalytik
              Dr. Iris Schulz

         Institut für Rechtsmedizin
der Ludwigs-Maximilians-Universität München

DNA - Aufgabengebiete in der
        Rechtsmedizin
Abstammungsuntersuchungen

Chimärismus-Untersuchungen

Spurenuntersuchungen
 (Einbruchdiebstähle,
 Sexualdelikte und
 Kapitalverbrechen)

Historie der
  Abstammungsuntersuchungen
1900:
Blutgruppen A, B und
O entdeckt durch
Karl Landsteiner

später weitere
Blutgruppen

Historie der
  Abstammungsuntersuchungen
1985:
Satelliten DNA
entdeckt durch
Sir Alec Jeffries

„genetic
fingerprint“

Historie der
 Abstammungsuntersuchungen
mit Einführung der
PCR weltweit
Standard

Kary Mullis
Endecker der PCR
Nobelpreis 1993

Prinzip der Vererbung I
• der Bauplan des Lebens ist im Kern jeder Zelle
  gespeichert

• „Speichermedium“
  = Erbsubstanz DNA

• die ds DNA ist auf 23
  Chromosomen
  aufgewickelt

• genetische Information
  = ein 4 Buchstaben-
  Alphabet

• die DNA ist 3
  Milliarden Basen lang
  99,9 % entschlüsselt

Prinzip der Vererbung II
• jeder Mensch besitzt einen doppelten
  Chromosomensatz
• einer ist vom Vater, einer von der Mutter
         Mutter                  Vater

          Eizelle            Spermium

                          Kind

Prinzip der
     Abstammungsbegutachtung

• Menschen sind ähnlich, aber nicht gleich
• im Bauplan -DNA- existieren kleine Unterschiede
  = Polymorphismen
• diese Unterschiede werden vererbt, man kann mit
  Hilfe dieser Unterschiede Verwandtschaft
  erkennen oder ausschließen
• Im nicht-kodierenden Bereich der DNA (ca. 98 %)

Beispiele für Polymorphismen

Individuum 1: AACGTTACTATTG
Individuum 2: AACGGTACTATTG

      eine Punktmutation

Beispiele für Polymorphismen

Individuum 1: TACC AATG TTTG
Individuum 2: TACC TTTG
Individuum 3: TACC AATG AATG TTTG

    ein Längenpolymorphismus

Short tandem repeats = STR

         Die Nomenklatur

                                           Allel

                                            13
                                            14
                                            15
                                            16
                                            17
                                            18
                                            19
      flankierende Region
      1 Wiederholungseinheit (z.B. AATG)

Allel – Ausprägung eines STRs

                                      AATG
                   Konstante Region

STR1 homozygot

STR2 heterozygot

         Homozygot = beide Allele gleich lang
         Heterozygot = unterschiedlich lange Allele

Short tandem repeats = STR
 > Aktuelle Marker für die Abstammungsanalyse
 > Liegen im nichtcodierenden Bereich
 > Ausprägung eines STRs = Allel
 > Werden nach der Anzahl der Motivwdh bezeichnet
      homozygot = gleiche Anzahl
      heterozygot = unterschiedliche Anzahl
 > Variabel zwischen Menschen

Person A

Person B

DNA in der Zelle
                  Chromosom

Zellkern

 DNA Molekül
 doppelsträngig    Ziel-Region für die PCR

                                einzelnes
                                Basenpaar

DNA Amplifikation mit der
 Polymerase Ketten Reaktion (PCR)

                 5’                             3’
                 5’                             3’
                                                     Start-DNA
                                                     =Template
                 3’                             5’
                 3’                             5’

                            Trennung des
                            Doppelstrangs
                           (Denaturieren)

Forward primer              Zugabe von
5’        3’                  Primern          5’                     3’
                           (“annealing”)
                             “Kopiervorgang”
                           (Primerextension)                               5’
                      5’                                         3’
     3’
                                                            Reverse primer

Multiple PCR-Zyklen –
exponentielle Vermehrung von STRs

          Originale DNA Ziel-Region

                Temperatur Zyklus

  In
   In32
     32cycles
        cyclesatat100%
                  100%efficiency,
                       efficiency,1.07
                                   1.07billion
                                        billion
  copies
   copiesof
          oftargeted
             targetedDNA
                     DNAregion
                           regionare
                                  arecreated
                                      created

Elektrophorese – Sichtbarmachen
       von PCR-Produkten
               1. Extraktion

               2. PCR

               3. Automatisierte
               Elektrophorese

               Vergleich mit Allelstandard
               = häufigsten Allele in einer
               Population

Analyse mittels Kapillarelektrophorese

     Fortschritt durch Multiplex-PCR

Multiplex PCR: Neun STRs gleichzeitig

 XX = Frau

DNA-Analyse
> Extraktion – Aufbrechen der Zelle, DNA in
  Lösung
> PCR – milliardenfache Vervielfältigung von
  STRs
> Elektrophorese – PCR-Produkte der Länge
  und Fluoreszenz nach aufgetrennt
> Analyseergebnis als Elektropherogramm
  mit 9, 12 oder mehr STRs und Amelogenin
> 1 Peak XX = Frau    2 Peaks XY = Mann

Abstammungsuntersuchungen:
    Positiver Test – kein Ausschluss
D3S1358    VWA            FGA

                                Mutter

                                Kind

                                Putativ-
                                Vater

Abstammungsuntersuchungen
    Negativer Test - Ausschluss

So könnte ein Bild/eine Grafik eingefügt
werden.
          Mutter

          Kind

           PV

Beispiel: der Marker D3S1358

    System      Mutter     Kind     Putativvater
   D3S1358      14/14      14/17      16/18

Der Vaterschaftsausschluss

Der Putativvater kann das Allel 17 nicht vererben

Beispiel: der Marker D3S1358

    System     Mutter     Kind     Putativvater
   D3S1358     14/18      14/19      19/19

 Kein Ausschluss

 Der Putativvater kann das Allel 19 vererben

Berechnung der
Vaterschaftswahrscheinlichkeit
   System       Mutter      Kind     Putativvater
   D3S1358      14/18       14/19      19/19

 Hat der Putativvater nur zufällig das Allel 19
 oder ist er der wahre Vater?

STR D3S1358
Häufigkeitsverteilung der Allele 13 bis 19
                     35
                     30
    Häufigkeit [%]

                     25
                     20
                     15
                     10
                      5
                      0
                          13   14   15   16      17   18   19
                                         Allel

Befunde aus einem Gutachten
STR-Systeme Kindsmutter      Kind       Beklagter      2. Mann
  D3S1358     15 / 15       15 / 16       15 / 16       14 / 18
   VWA        17 / 17       17 / 17       16 / 17       16 / 19
   FIBRA      20 / 21       20 / 22       19 / 22       17 / 25
   THO1       9 / 9,3       6 / 9,3       6 / 9,3        6/ 6
   SE33     25,2 / 28,2   25,2 / 30,2    19 / 30,2    19,2 / 33,2
  D8S1179      8 / 11       11 / 12       12 / 14       13 / 14
  D21S11      30 / 30      30 / 31,2    31,2 / 32,2     28 / 29
  D18S51      12 / 17       12 / 14       14 / 14       17 / 18
  D5S818      10 / 12       10 / 12       12 / 12       14 / 15
  D13S317     11 / 13       11 / 11       11 / 14       11 / 11
  D7S820       9 / 10       8 / 10         8 / 12       12 / 13

Vaterschaftsgutachten

Es werden mindestens 12 polymorphe
STR-Systeme untersucht

Im positiven Fall soll die Vaterschafts-
wahrscheinlichkeit über 99,9 % liegen

Im negativen Fall sollen sich mehrere
Ausschlüsse ergeben

Untersuchungsmaterial
   • Speichel       oder        Blutprobe?

• Speichel für Kinder weniger belastend
• Informationsgehalt identisch
• Manipulation der Speichelprobe durch Küssen
  oder Stillen ausgeschlossen

Defizienzfälle
Vaterschaftsfeststellungen sind auch
möglich:

• ohne Mutter
• bei verstorbenem Vater

Warum die Mutter mittesten?
        W-Wert mit Mutter
DNA-Systeme   Kindsmutter   Kind        Putativvater
D3S1358       15 / 17       15 / 17     15 / 17
VWA           18 / 18       17 / 18     17 / 19
FIBRA         22 / 23       22 / 25     20 / 25
THO1          8/ 9          8 / 10      7 / 10
SE33          15 / 16       15 / 28,2   17 / 28,2
D8S1179       8 / 14        14 / 15     13 / 15
D21S11        29 / 30       30 / 31,2   31 / 31,2
D18S51        18 / 19       16 / 19     14 / 16
D5S818        12 / 12       12 / 12     12 / 12
D13S317       8 / 12        10 / 12     10 / 12

       W = 99,9998 %

Warum die Mutter mittesten?
       W-Wert ohne Mutter
DNA-Systeme Kindsmutter     Kind      Putativvater
 D3S1358         -         15 / 17      15 / 17
   VWA           -         17 / 18      17 / 19
  FIBRA          -         22 / 25      20 / 25
   THO1          -          8 / 10       7 / 10
   SE33          -        15 / 28,2    17 / 28,2
 D8S1179         -         14 / 15      13 / 15
  D21S11         -        30 / 31,2    31 / 31,2
  D18S51         -         16 / 19      14 / 16
  D5S818         -         12 / 12      12 / 12
 D13S317         -         10 / 12      10 / 12

             W = 99,96 %

Defizienzfälle ohne Vater
Bei verstorbenen Putativvater können
Exhumierungen meist vermieden werden...
…indem z.B. Gewebepräparate aus einem
 Krankenhaus/Pathologie zur Verfügung stehen

Defizienzfälle
…indem andere Materialien untersucht werden

  Für gerichtliche Gutachten eventuell problematisch
  (Identität?)

Defizienzfälle
…indem lebende Verwandte untersucht
 werden, um die väterlichen Allele zu
 rekonstruieren

                 ?

        Untersuchung der Großeltern

Defizienzfälle
…indem lebende Verwandte untersucht
 werden, um die väterlichen Allele zu
 rekonstruieren

              ?

Untersuchung von Ehefrau und Halbgeschwistern

Abstammungsuntersuchungen

> Positiv: mind. 12 STRs, W-Wert > 99,9 %

> Negativ: mind. 3 Ausschlüsse

> Mit Speichel, Blut etc möglich

> Höhere Aussagekraft mit Mutter

> Defizienzfälle analysierbar
    Gewebepräparate / Verwandte

Juristischen Grundlagen

BGB §§1591-1600 e :

Bei Kindern, die in eine Ehe hineingeboren
werden, ist der Ehemann auch juristisch der
Vater.

Gerichtsverfahren zur Klärung der
Vaterschaft gibt es dann in zwei
Konstellation:

Juristische Grundlagen

1. Feststellung der Vaterschaft

  freiwillige Anerkennung der Vaterschaft

  sonst: gerichtlichen Feststellung

  vom Gericht wird ein Gutachten in Auftrag
  gegeben, und im positiven Fall wird der
  untersuchte Mann als Vater festgestellt.

Juristischen Grundlagen

2. Anfechtung der Vaterschaft

  Falsche Zuordnung eines Kindes kann
  korrigiert werden

  Anfechten darf:
    • die Mutter
    • das Kind
    • der „juristische“ Vater
    • der „biologische“ Vater

Juristischen Grundlagen

Um eine Vaterschaft anfechten zu können

muss bei Gericht vom juristischen Vater ein
schlüssiger Grund vorgelegt werden, warum
er glaubt, nicht der biologische Vater des
Kindes zu sein.

     „Anfangsverdacht“

     Frist 2 Jahren

Heimliche Vaterschaftstests
Immer dann gefragt, wenn die Mutter nichts vom
Zweifel wissen soll

Untersuchungsmaterial:
Schnuller, Zahnbürsten etc.

Im Internet leicht in Auftrag zu
geben

Die Zweifel werden durch
Medien entsprechend geschürt

Heimliche Vaterschaftstests

Bundesärztekammer Richtlinien für die
Erstattung von Abstammungsgutachten:

"Ohne richterlichen Beschluss darf die
Abstammung eines Menschen nur mit
seiner Einwilligung oder bei Geschäfts-
unfähigkeit der seines Sorgeberechtigten
untersucht und festgestellt werden."

Was kostet ein Vaterschaftstest?

• Für ein Gericht durchgeführte DNA-
  Abstammungsgutachten kosten ca. 1000,- €

• „Internet“-Test
  ab 139,- €
  (Stand 24.11.06)

Aussehen und Abstammung

Aussehen und Abstammung

Aussehen und Abstammung

  Ist er der Vater des Kindes?

Abstammungsuntersuchungen
> Juristische Grundlagen:
  Feststellung bzw.
  Anfechtung der Vaterschaft
> Heimliche Vaterschaftstest
  Grauzone
> Gutachten nach Richtlinien der
  Bundesärztekammer
> Aussehen und Abstammung Spekulation
> Eindeutige Klärung nur durch DNA-Analyse

Chimärismus-Kontrollen
Indikation für eine Knochenmarktransplantation
> Angeborene Störung des Immunsystems:
  (z.B. SCID: Severe Combined Immunodeficiency)
> Angeborene oder erworbene Störung des
  blutbildenden Systems bei intakter Immunabwehr:
  (z.B. Fanconi-Anämie)
> maligne systematische Erkrankung – Leukämien:
  ALL: akute lymphatische Leukämie
  CML: chronisch myeloische Leukämie
  Lymphome: Lymphknotenbefall

Therapiemöglichkeiten
> Strahlentherapie
> Chemotherapie
> Knochenmarktransplantation
  Kriterien: Übereinstimmung der HLA-Merkmale
  an den Genorten A, B und DR
  - syngen: monozygote Zwillinge
  - allogen: verwandte Spender (Geschwister/
  Eltern)
  - autolog: Transplantation eigener Stammzellen
  - Fremdspender: bestmögliche Übereinstimmung
  der HLA-Merkmale

Verlaufskontrolle

> Kompletter Chimärismus: nur
  Spendermerkmale im Blut und
  Knochenmark

Verlaufskontrolle
> Partieller Chimärismus: Spender- und
  Empfängermerkmale in einigen oder allen
  Zellpopulationen nachweisbar

Chimärismusanalysen

> mittels STRs
> Semiquanititative Auswertung durch
  Berücksichtigung der Peak-Flächen nach
  Fragmentanalyse
> prozentuale Anteile von Spender- und
  Empfängerzellen
wichtig: Vergleichsproben von Spendern und
  Empfängern vor Transplantation

Spurenuntersuchungen:

 Organe/Gewebe           Körpersekrete
     Knochen                Speichel
       Zähne
                          Nasensekret
       Haare
                         Schweiß/Tränen
    Fingernägel

                         Sexualsekrete
Körperflüssigkeiten
                            Ejakulat
        Blut
                          Vaginalsekret
        Urin

geeignete Asservate:
      Kleidung                 Zahnbürste
(insbes. Unterwäsche)
Schuhe (Mikrospuren)         Kamm, Bürste
                                  Oropax...

                        Trinkgefäße, ~löffel

                                  Flaschen,
                                   Dosen,
  Drosselwerkzeug                  Kippen
    (Hautabrieb)

Blutspur ?

Blutspur ?

Vortest auf Blut:

Mikrospuren aus Blut:

Blut aber von wem?

Menschenhaut?

12S-rRNA der mtDNA
Species      Sequence
Human        TTAGCCCTAAACCTCAACAG
Rabbit       TTAGCCCTAAACTTTGATAA
Sheep        TTAGCCCTAAACACAAATAATTA
Hare         TTAGCCTTAAACCTAAATAATTT
Cow          TTAGCCCTAAACACAGATAATTA
Horse        TTAGCCCTAAACTAAAATAGCTTA
Pig          CTAGCCCTAAACCCAAATAGTT
Salmon       CTAGCCGTAAACTTTGATGGAA
Turkey       CTGGCCCTAAATCTTGATACTAA
Duck         CTGGCCCTAAATCTTGATACTTAC
Chicken      CTAGCCCTAAATCTAGATACCTCCC

Speichelnachweis

Vortest auf die im Speichel enthaltene Amylase

                      negativ         positiv

Spermanachweis
    Vortest auf Ejakulatbestandteile

saure Phosphatase:             PSA:

Spermanachweis
  mikroskopisch

DNA in der Zelle
                     Chromosom

Zellkern

    DNA Molekül
    doppelstrangig     Ziel-Region für die PCR

                                    einzelnes
                                    Basenpaar

DNA-Profil einer Frau

Statistische Auswertung:

• Genotyp:           Häufigkeit
  16 /17             = 2ab
  16/16              = a²

Beispiel: f(a) = 10 %, f(b) = 20 %
            2 x 0,1 x 0,2 = 4 %
            oder einer von 25

Statistische Auswertung:
DNA-             Spur      Vergleichsperson   Häufigkeit
  Systeme
D3S1358        15 / 15         15 / 15             1 von 25
VWA            16 / 18         16 / 18             1 von 30
FIBRA          23 / 25         23 / 25             1 von 15
THO1             6/8            6/8                1 von 36
D8S1179        13 / 13         13 / 13             1 von 8
D21S11         28 / 29         28 / 29             1 von 16
D18S51         14 / 16         14 / 16             1 von 18
SE33           16 / 28,2      16 / 28,2           1 von 110

                               Gesamt:             einer von
                                                  102 Milliarden

Fall: Schneestangenmord

•   1986: Mord an einem 18 jährigem Mädchen
•   erschlagen mit einer Schneestange
•   erste Ermittlungen führen zu keinem Täter
•   2001: Wiederaufnahme des Falles

       jetzt: DNA-Untersuchung der
       Fingernägelabschnitte des Opfers

Fall: Schneestangenmord
Mischspur Opfer und Tatverdächtiger

                             TV
               Opfer

Fall: Schneestangenmord

• Massengentest der männlichen
  Bevölkerung in Tatortnähe
• 400 Personen sollten untersucht werden
• Täter war unter den ersten 13
  Vergleichspersonen
• Verurteilt in 2002

DNA-Analyse Datei
         beim BKA Wiesbaden

Einstellung der DNA-Profile von:

•Tatverdächtigen
•verurteilten Straftätern
•unbekannten Proben
•bei Straftaten von erheblicher Bedeutung
(> 1 Jahr Haftstrafe)
•nach Gerichtsbeschluss

DNA - Analyse - Datei
              Stand: 31.12.2004

Datensätze    Gesamt   Personen        Spuren
             386.899    320.101        66.796

Treffer       Gesamt   Person - Spur   Spur - Spur
              26.037      18.565          7.472

Mitochondriale DNA

•degradationsunempfindlich
(ringförmig, supercoiled)
•größere Kopienzahl
•Vererbung in rein
maternaler Linie
•Untersuchung durch
Sequenzierung zweier
hochvariabler Regionen
des D-Loops

Identifizierungen:
Der Fall Bormann

Identifizierungen:
Der Fall Bormann

Identifizierungen:
Der Fall Bormann

Identifizierungen:
Der Fall Bormann

Identifizierungen:
      Der Fall Bormann

     ?
Martin Bormann             Cousine

Identifizierungen:
            Der Fall Bormann

Übereinstimmung der mtDNA-Sequenz
zwischen Knochen und Vergleichsperson

Seltenheit der mtDNA-Sequenz:
•insgesamt keine Übereinstimmung mit 1552 Personen
europäischen Ursprunges
(alle Angaben Stand Juni 1998)

Vielen Dank für
Ihre Aufmerksamkeit