Epizootische Hämatopoetische Nekrose - (EHN) Amtliche Methode und Falldefinition - Vollständig überarbeitete Version, Stand 21.04.2021 - OpenAgrar
←
→
Transkription von Seiteninhalten
Wenn Ihr Browser die Seite nicht korrekt rendert, bitte, lesen Sie den Inhalt der Seite unten
Amtliche Methode und Falldefinition Epizootische Hämatopoetische Nekrose (EHN) Vollständig überarbeitete Version, Stand 21.04.2021 Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Vollst. überarb. Version, Stand 21.04.2021
Epizootische Hämatopoetische Nekrose (EHN)
Inhaltsverzeichnis
Amtliche Methode ..................................................................................................... 3
1. Charakterisierung der Infektion .................................................................................. 3
1.1 Erreger ........................................................................................................... 3
1.2 Klinische Symptomatik ........................................................................................ 4
1.3 Differenzialdiagnose ........................................................................................... 4
1.4 Diagnostische Indikation ...................................................................................... 4
1.5 Zuständige Untersuchungseinrichtung ...................................................................... 5
1.6 Rechtsgrundlagen .............................................................................................. 5
2. Untersuchungsmaterial ............................................................................................5
3. Untersuchungsgang ................................................................................................. 7
3.1 Labordiagnostischer Nachweis ............................................................................... 7
3.2 Virusanzucht in der Zellkultur ................................................................................ 9
3.3 Virus-Genomnachweis ....................................................................................... 10
3.4 Virus-Antigennachweis ...................................................................................... 16
Literatur ................................................................................................................... 17
Falldefinition – Epizootische Hämatopoetische Nekrose (EHN) ......................................... 18
2 | Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Vollst. überarb. Version, Stand 21.04.2021Epizootische Hämatopoetische Nekrose (EHN)
Amtliche Methode
1. Charakterisierung der Infektion
1.1 Erreger
Die Epizootische Hämatopoetische Nekrose (EHN) wird durch das Virus der Epizootischen Hämatopoetischen
Nekrose (EHNV) verursacht. Die EHN ist in der Delegierten Verordnung (EU) 2018/1629 als Seuche gelistet.
Bislang wurde dieser Erreger in der Europäischen Union nicht nachgewiesen. Das EHNV wurde erstmals 1984
in Australien (Bundesstaat Victoria) von juvenilen Flussbarschen (Perca fluviatilis) nach akuten Verlusten
isoliert (Langdon et al., 1986). Im Anhang der Durchführungsverordnung (EU) 2018/1882 sind als empfängli
che Arten für die EHN Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) und Flussbarsch (Perca fluviatilis) gelistet.
In derselben Verordnung werden Marmorkarpfen (Aristichthys nobilis), Goldfisch (Carassius auratus), Euro
päische Karausche (Carassius carassius), Karpfen und Japanischer Farbkarpfen (Cyprinus carpio), Silberkarp
fen (Hypophthalmichthys molitrix), Karpfenfische der Gattung Leuciscus (Leuciscus spp.), Rotauge (Rutilus
rutilus), Rothasel (Scardinius erythrophthalmus) und Schleie (Tinca tinca) als Überträgerarten aufgeführt.
Nach Langdon (1989) lassen sich Marquarie-Buntbarsch (Macquaria australasica), Mosquitofisch (Gambusia
affinis), Silberbarsch (Bidyanus bidyanus), Galaxias (Galaxias olidus), Murraydorsch (Maccullochella peelii
peelii) und Atlantischer Lachs (Salmo salar) experimentell infizieren.
Das EHNV ist mit Krankheitserregern der Kröten und Frösche verwandt und wird dem Genus Ranavirus der
Familie Iridoviridae zugeordnet. Infektionen mit dem nah verwandten European Sheatfish Virus (ESV, Wel
siridovirus) wurden beim Europäischen Wels (Silurus glanis) beschrieben. Das European Catfish Virus (ECV),
welches nicht vom ESV unterschieden werden kann, infiziert den Schwarzer Katzenwels (Ameiurus melas),
den Channel Catfish (Ictalurus punctatus), den Goldfisch (Carassius auratus) und den Kurzflossen-Aal (An
guilla australis). ESV und ECV führten in Deutschland bzw. Frankreich und Italien zu Verlusten in der Aqua
kultur. Systemische Infektionen mit nicht näher untersuchten Iridoviren wurden beim Steinbutt (Scophthal
mus maximus) beschrieben.
Die OIE (Aquatic Animal Health Code) führt die EHN als anzeigepflichtige Tierseuche. Seit 2006 ist EHN als
exotische Tierseuche in der EU gelistet und damit anzeigepflichtig (Richtlinie 2006/88/EG Anhang IV Teil II).
Diese Richtlinie wurde mit der Verordnung (EU) 2016/429 zum 21.04.2021 aufgehoben. Auch im Anhang der
entsprechenden nunmehr in der EU geltenden Durchführungsverordnung (EU) 2018/1882 ist EHN gelistet und
als in der EU nicht vorkommende Seuche in die Kategorie A (sowie D und E) eingeordnet.
Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Vollst. überarb. Version, Stand 21.04.2021| 3Epizootische Hämatopoetische Nekrose (EHN) 1.2 Klinische Symptomatik Regenbogenforellen und Flussbarsche aller Altersklassen sind für die EHN empfänglich. Das klinische Bild der EHN ist wenig spezifisch und bei juvenilen Fischen stärker ausgeprägt als bei adulten. Bei Flussbarschen, offenbar dem Hauptwirt in Australien, hat sich die Infektion oft durch plötzliche Todesfälle ohne jegliche äußere und innere Anzeichen geäußert. Bei ausgeprägter Symptomatik können Dunkelfärbung der Haut, Inappetenz, Ataxie, Lethargie, Blutungen an den Flossenrändern, Geschwürbildung, Rötung und/oder Ablö sung der Haut beobachtet werden. Betroffene Organe und Gewebe sind Leber, Kopfniere, Milz und andere Parenchyme. Der Erreger konnte bislang nicht aus Ovarialgewebe oder Brut isoliert werden. Die Inkubati onszeit ist abhängig vom Alter der Fische, von der Wassertemperatur, von der Infektionsdosis sowie von der Virulenz des Erregers und beträgt in der Regel drei bis 32 Tage. Bei experimentell infizierten Regenbogen forellen beträgt die Inkubationszeit drei bis zehn Tage bei 19 bis 21 °C bzw. 14 bis 32 Tage bei 8 bis 10 °C Wassertemperatur. In Flussbarschen werden Todesfälle nach zehn bis elf Tagen bei 19 bis 21 °C und nach zehn bis 28 Tagen bei 12 bis 18 °C beobachtet. 1.3 Differenzialdiagnose Differenzialdiagnostisch sind alle mit erhöhter Sterblichkeit einhergehenden Erkrankungen empfänglicher Arten in Betracht zu ziehen, die eine klinische Erkrankung ausprägen können. Weitere differenzialdiagnos tische Kriterien sind dem "Manual of Diagnotic Tests for Aquatic Animals" der OIE in der jeweiligen aktuellen Fassung zu entnehmen. 1.4 Diagnostische Indikation In Abhängigkeit von der Art der Überwachung oder, wenn als Ergebnis der klinischen und pathologisch- anatomischen Untersuchung oder auf Grund epidemiologischer Erhebungen der Verdacht des Ausbruchs der EHN geäußert wird, sind Fische an die zuständige diagnostische Einrichtung zur virologischen Untersuchung einzusenden. Ein weiterer diagnostischer Indikator kann Tierverkehr sein. Ein Verdacht auf EHN besteht, wenn in scheinbar gesunden, moribunden oder toten Fischen in parenchymat ösen Geweben histologisch fokale, multifokale oder lokal extensiv verflüssigte oder koagulierende Nekrosen mit oder ohne intrazytoplasmatische basophile Einschlusskörper auftreten. Als diagnostische Verfahren werden derzeit die Virusisolierung in Zellkultur, immunologische Verfahren zum Antigennachweis (Immunfluoreszenz) und der Genomnachweis (PCR) mit anschließender Sequenzierung empfohlen. Vorgaben zur Diagnose von EHNV und Ranaviren der Amphibien sind im Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals der OIE sowie im Diagnostic Manual für EHN des EU-Referenzlabors (EURL) für Fisch- und Krebstierkrankheiten aufgelistet. Mit Ausnahme der Gruppe der Iridoviren besitzen Ranaviren gruppenspezifische Antigene. Somit ist eine eindeutige Differenzierung der Ranaviren, d. h. eine Identifizierung des EHNV ausschließlich basierend auf ihrem Antigenprofil, nicht möglich. 4 | Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Vollst. überarb. Version, Stand 21.04.2021
Epizootische Hämatopoetische Nekrose (EHN)
Verschiedene diagnostische PCRs wurden zur Identifizierung von EHNV entwickelt. Diese basieren auf der
Analyse von Genabschnitten, kodierend für das MCP (major capsid protein), die Thymidinkinase, die virale
DNA-Polymerase oder das Neurofilament triplet H1-like Protein (NF-H1). Insgesamt sind die Unterschiede
zwischen den spezifischen genomischen Regionen der Ranaviren gering.
Das MCP-Gen ist hochkonserviert und durch seine Stabilität besonders zur genetischen Differenzierung der
Ranaviren geeignet (Hyatt et al., 2000). Es weist eine Länge von 1392 bp auf und kodiert für ein ca. 49 kDa
großes Protein. Partielle und vollständige MCP-Gensequenzen von Ranaviren sind in der Genbank verfügbar.
1.5 Zuständige Untersuchungseinrichtung
Die Untersuchungen zum Nachweis des EHNV werden im Nationalen Referenzlaboratorium (NRL) für EHN am
Friedrich-Loeffler-Institut auf der Insel Riems (Südufer 10, 17493 Greifswald-Insel Riems, Tel. 038351 7-
1175) durchgeführt. Bei Verdacht auf Vorliegen der EHN ist das NRL zu verständigen und es sind Proben, wie
im Teil „Untersuchungsmaterial“ aufgeführt, zu entnehmen und einzusenden.
1.6 Rechtsgrundlagen
Die EHN ist gemäß Durchführungsverordnung (EU) 2018/1882 eine anzeigepflichtige Tierseuche der Katego
rien A (D und E). Die Diagnose und Bekämpfung der EHN ist in der EU im Anhang XII der Delegierten Verord
nung (EU) 2020/687 geregelt. Die Auswahl der zu beprobenden Organe, die Vorbereitung, die Lagerung und
die Verbringung der Proben in das NRL für EHN müssen unter Einhaltung der Empfehlungen des EURL für
Fisch und Krebstierkrankheiten erfolgen. Die Proben müssen mittels der vom EURL zugelassenen Diagnose
methoden und Verfahren untersucht werden. Eine Anleitung zur Diagnose der EHN ist auch im "Manual of
Diagnostic Tests for Aquatic Animals" der OIE in der jeweils neuesten Fassung zu finden.
▪ Verordnung (EU) 2016/429 des Europäischen Parlaments und des Rates vom 9. März 2016 zu Tierseuchen
und zur Änderung und Aufhebung einiger Rechtsakte im Bereich der Tiergesundheit („Tiergesundheits
recht“)
▪ Delegierte Verordnung (EU) 2018/1629 der Kommission vom 25. Juli 2018 zur Änderung der Liste der
Seuchen in Anhang II der Verordnung (EU) 2016/429 des Europäischen Parlaments und des Rates zu
Tierseuchen und zur Änderung und Aufhebung einiger Rechtsakte im Bereich der Tiergesundheit („Tier
gesundheitsrecht“)
▪ Durchführungsverordnung (EU) 2018/1882 der Kommission vom 3. Dezember 2018 über die Anwendung
bestimmter Bestimmungen zur Seuchenprävention und -bekämpfung auf Kategorien gelisteter Seuchen
und zur Erstellung einer Liste von Arten und Artengruppen, die ein erhebliches Risiko für die Ausbrei
tung dieser gelisteten Seuchen darstellen
Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Vollst. überarb. Version, Stand 21.04.2021| 5Epizootische Hämatopoetische Nekrose (EHN)
▪ Delegierte Verordnung (EU) 2020/687 der Kommission vom 17. Dezember 2019 zur Ergänzung der Ver
ordnung (EU) 2016/429 des Europäischen Parlaments und des Rates hinsichtlich Vorschriften für die
Prävention und Bekämpfung bestimmter gelisteter Seuchen
2. Untersuchungsmaterial
Bei der klinischen Untersuchung und der Gewinnung von Proben für Laboruntersuchungen müssen gemäß
Anhang XII der Delegierten Verordnung (EU) 2020/687 folgende Tiere der unter 1.1. gemäß Durchführungs
verordnung (EU) 2018/1882 gelisteten Arten herangezogen werden:
i) Fische, die klinische Anzeichen der EHN aufweisen;
und
ii) Fische, die wahrscheinlich vor Kurzem an EHN (bei Verdacht und Bestätigung) verendet sind;
und
iii) Aquakulturtiere mit epidemiologischer Verbindung zu einem Verdachtsfall oder einem bestätig
ten Fall von EHN.
Die Mindestanzahl der zu ziehenden Proben beträgt bei Post-mortem-Befunden oder klinischen Anzeichen
der EHN zehn Fische und beim Verdacht auf EHN aufgrund anderer Umstände 30 Fische.
Bei der Beprobung gelten folgende zusätzliche Kriterien:
i) sind geschwächte, verhaltensgestörte oder soeben verendete Fische (ohne Anzeichen von Zerset
zung) vorhanden, so sind solche Fische auszuwählen. Sind keine solchen Tiere vorhanden, müssen
die ausgewählten Fische unterschiedlichen Jahrgängen angehören, die dann proportional in der
Probe vertreten sind;
ii) wird mehr als eine Wasserquelle zur Fischproduktion verwendet, müssen Fische aus allen Wasser
quellen beprobt werden, so dass alle Teile des Betriebs proportional in der Probe vertreten sind;
iii) wenn Regenbogenforellen oder Flussbarsche vorhanden sind, werden nur Fische dieser Arten für
die Probenahme ausgewählt. Wenn weder Regenbogenforellen noch Flussbarsche vorhanden sind,
muss die Probe repräsentativ für alle anderen vorhandenen gelisteten Arten sein;
iv) wenn die Entnahme von Proben aus Wildpopulationen gelisteter Arten erforderlich ist, müssen
Anzahl und geografische Verteilung der Probenahmestellen so festgelegt werden, dass eine ange
messene Abdeckung des Gebiets, in dem eine Infektion vermutet wird, sichergestellt ist.
Die Probenahmestellen müssen für die verschiedenen Ökosysteme repräsentativ sein, in denen die Wildpo
pulationen der für EHN empfänglichen Arten leben; dazu gehören Meeres-, Mündungs- und Flusssysteme
sowie Seen.
6 | Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Vollst. überarb. Version, Stand 21.04.2021Epizootische Hämatopoetische Nekrose (EHN)
Auswahl und Entnahme der Proben
Für die Untersuchung gemäß den Vorgaben des EURL und des OIE Manual of Diagnotic Tests for Aquatic
Animals werden Leber, (Kopf-) Niere und Milz entnommen.
Die Probenahme erfolgt entsprechend der Größe der Fische:
Fische > 60 mm: 0,1 g Leber, Kopfniere, Milz und andere betroffene Organe
Fische 30 - 60 mm: alle inneren Organe (Viscera)
Fische < 30 mm: ganze Fische ohne Kopf und Schwanz
Der Effekt von Poolproben verschiedener Fische auf die Sensitivität der diagnostischen Tests ist noch nicht
evaluiert. Laut EURL für Fisch- und Krebstierkrankheiten ist eine Poolgröße von max. zehn Fischen möglich.
Aufbereitung und Einsendung der Proben
Unter sterilen Kautelen entnommene Organe sind in ein steriles Kunststoffröhrchen zu füllen, das steriles
Transportmedium (Zellzuchtmedium für Fischzelllinien mit 10 % Kälberserum und Antibiotika, z. B. 200 I. E.
Penicillin, 200 μg Streptomycin und 200 μg Kanamycin oder 50 μg Enrofloxacin pro ml) enthält.
Die Röhrchen sind in Isolationsbehälter (z. B. dickwandige Styroporkästen mit Eis oder Kühlelementen) zu
verpacken. Es ist zu gewährleisten, dass die Proben beim Transport zum Labor bei einer Temperatur von
0 bis 5 °C gehalten werden. Ein Anfrieren ist zu vermeiden. Während des Transportes darf die Temperatur
zu keiner Zeit mehr als 10 °C betragen. Bei der Ankunft sollten im Transportbehälter noch Eis oder gefrorene
Kühlelemente vorhanden sein.
Ganze Fische können auch unzerteilt zum Labor gesandt werden, sofern die Temperaturanforderungen wäh
rend der Beförderung erfüllt sind. Ganze Fische müssen unter Umständen mit saugfähigem Papier umhüllt
und auslaufsicher verpackt werden.
Verpackung und Beschriftung des zu versendenden Materials müssen mindestens Anforderungen der Verpa
ckungsvorschrift P 650 (Klassifizierung: UN 3373) erfüllen. Sicherer ist es, zusätzlich Biobottles nach Verpa
ckungsvorschrift P 620 zu verwenden.
Entnahme von zusätzlichem Probenmaterial
Im Einvernehmen mit dem NRL für EHN kann weiteres Probenmaterial entnommen und für weitere Untersu
chungen aufbereitet werden.
3. Untersuchungsgang
3.1 Labordiagnostischer Nachweis
Der eindeutige Nachweis von EHNV mit serologischen Methoden (Immunperoxidase-Test, ELISA, Immunfluo
reszenztest) ist nicht möglich, da Ranaviren gruppenspezifische Antigene besitzen.
Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Vollst. überarb. Version, Stand 21.04.2021| 7Epizootische Hämatopoetische Nekrose (EHN)
Deshalb erfolgen der eindeutige Nachweis und die Bestätigung des Verdachtes durch:
▪ Anzucht des Erregers in der Zellkultur nach Ausprägung eines zytopathischen Effektes (CPE) mit
anschließendem Nachweis des Erregergenoms in der PCR gefolgt von Sequenzierung des PCR-Pro
duktes oder Restriktions-Endonuklease-Verdau,
oder
▪ Nachweis des Genoms in der PCR mit anschließender Sequenzierung des PCR-Produktes oder Rest
riktions-Endonuklease-Verdau.
Mit der diagnostischen Untersuchung ist so schnell wie möglich zu beginnen, spätestens jedoch 48 Stunden,
in Ausnahmefällen 72 Stunden nach der Probenahme, sofern das Untersuchungsmaterial durch das Trans
portmedium geschützt war und die Temperaturanforderungen während der Beförderung erfüllt wurden.
Dauert der Transport länger als 48 Stunden, müssen die Proben eingefroren (weniger als -10 °C) transpor
tiert werden. Dabei darf die Kühlkette bis zum Eintreffen im Labor nicht unterbrochen werden. Ist in Aus
nahmefällen eine virologische Untersuchung des Probenmaterials innerhalb von 48 Stunden nach Probe-
nahme nicht möglich, so kann das Material im Transportmedium (Zellkulturmedium mit 10 % Kälberserum
und Antibiotika) bei –20 °C und kälter eingefroren werden. Die nachfolgende Untersuchung sollte dann in
nerhalb von 14 Tagen erfolgen.
Aufarbeitung der Organproben im Labor
Das Probenmaterial wird unabhängig voneinander aufgearbeitet. Nach jeder Probe werden Arbeitsplatz und
Zubehör desinfiziert. Die Untersuchungen werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
Handelt es sich bei den Proben um ganze Fische, die weniger als 4 cm lang sind, sollten diese vorher mit
einer sterilen Schere oder einem Skalpell zerkleinert werden. Wenn eine Probe aus 4 bis 6 cm langen ganzen
Fischen besteht, sollten nach Abtrennen des postanalen Körperteils die Eingeweide einschließlich der Niere
aufgearbeitet werden. Bei noch größeren Fischen werden entsprechende Organproben entnommen. Gege
benenfalls sollten die Proben vor der Homogenisierung mit einer sterilen Schere oder einem Skalpell zer
kleinert werden.
Danach wird das Probenmaterial vollständig homogenisiert (entweder mit einem Homogenisator oder mittels
Mörser, Pistill und sterilem Sand) und anschließend im ursprünglichen Transportmedium suspendiert.
Das endgültige Verhältnis zwischen Gewebematerial und Transportmedium beträgt 1 : 10.
Das Homogenat wird in einer Kühlzentrifuge bei 2 bis 5 °C bei 2000 bis 4000 × g für 15 min zentrifugiert.
Der Überstand wird entweder 4 h bei 15 °C oder über Nacht bei 4 °C mit Antibiotika, z. B. Gentamicin
(1 mg/ml Endkonzentration) oder Enrofloxacin (0,01 % Endkonzentration) behandelt. Wurden dem Trans
portmedium bereits vor dem Transport Antibiotika zugesetzt, kann dieser Schritt entfallen.
8 | Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Vollst. überarb. Version, Stand 21.04.2021Epizootische Hämatopoetische Nekrose (EHN)
Falls es nicht möglich ist, empfängliche Zellen innerhalb von 48 Stunden nach der Entnahme der Gewebe
proben zu inokulieren, kann der Überstand bei -80 °C gelagert werden. Eine virologische Untersuchung muss
innerhalb von 14 Tagen erfolgen, wobei die Probe dann nur einmal aufgetaut werden darf.
Vor der Inokulation der Zellen wird der Überstand mit einer geeigneten Verdünnung von Antiseren gegen die
einheimischen Serotypen des Virus der Infektiösen Pankreasnekrose (IPNV) versetzt und für mindestens eine
Stunde bei 15 °C oder maximal 18 Stunden bei 4 °C inkubiert. Der Titer der Antiseren muss mindestens
1 : 2000 gemäß Neutralisationstest betragen. Die Behandlung mit Antiseren gegen IPNV zielt darauf ab,
einen durch dieses Virus bedingten CPE zu verhindern. Falls die Proben aus Betrieben stammen, die als IPN-
frei gelten, kann die Behandlung der Organhomogenate mit Antiseren gegen IPNV entfallen.
3.2 Virusanzucht in der Zellkultur
Die Virusvermehrung erfolgt bei 20 °C auf den Zelllinien EPC (Zellkultursammlung FLI: 0173) oder FHM (Zell
kultursammlung FLI: 0057) und BF-2 (Zellkultursammlung FLI: 0290) oder RTG-2 (Zellkultursammlung
FLI: 0038).
Vom Organmaterial wird je Probe oder Pool eine 1 : 10 und 1 : 100 Verdünnung unter Verwendung von Zell
kulturmedium angelegt. Jede Zellkultur wird mit 100 µl der entsprechend verdünnten Probe pro ml Kultur
medium inokuliert. Das entspricht einer Endverdünnung von 1 : 100 bzw. 1 : 1000. Ein separater Adsorpti
onsschritt ist nicht erforderlich.
Jede Verdünnung wird auf mindestens zwei Zelllinien in einem 24-well Kulturgefäß oder größer inokuliert.
Alternativ können zwei bis drei Zellkulturen direkt mit 10 µl des homogenisierten Probenmaterials je ml
Zellkulturmedium inokuliert werden.
Die Virusvermehrung erfolgt bei 20 °C für sieben bis zehn Tage.
Die inokulierte Zellkultur wird regelmäßig (mind. 3x wöchentlich) auf die Ausbildung eines CPE kontrolliert.
Nach Ausbildung eines CPE erfolgt der Nachweis des Erregergenoms in der PCR mit anschließender Sequen
zierung oder Restriktions-Endonuklease-Verdau.
Bei Ausbleiben eines CPE nach Primärinkubation von sieben bis zehn Tagen, erfolgt die Subkultivierung auf
frischen Zellkulturen. Homologe Zellkulturen werden mit unverdünntem bzw. 1 : 10 verdünntem Material
der ersten Passage inokuliert. Empfohlen werden Zellkulturgefäße von mind. 24-Well-Format.
Wird nach mindestens zwei Zellkulturpassagen mit jeweils sieben bis zehn Tagen Inkubation bei 20 °C kein
CPE beobachtet, ist die Probe als negativ zu deklarieren.
Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Vollst. überarb. Version, Stand 21.04.2021| 9Epizootische Hämatopoetische Nekrose (EHN) Falls innerhalb der ersten drei Tage nach Inkubation ein toxischer CPE auftritt, kann in diesem Stadium bereits eine Subkultivierung durchgeführt werden. Die Zellen müssen dann sieben Tage lang inkubiert und für weitere sieben Tage erneut subkultiviert werden. Wenn sich nach drei Tagen ein toxischer CPE entwi ckelt, können die Zellen einmal passagiert und für insgesamt 14 Tage, gerechnet ab der primären Inokula tion, inkubiert werden. Innerhalb der letzte sieben Tage sollten dann keine Hinweise auf Toxizität vorliegen. Wenn es trotz Behandlung mit Antibiotika zur einer bakteriellen Kontamination kommt, müssen die Über stände vor der Subkultivierung bei 2000 bis 4000 x g für 15 bis 30 min bei 2 bis 5 °C zentrifugiert und/oder durch einen 0,45 μm Filter (Membran mit geringer Proteinbindung) passiert werden. Die nachfolgende Sub kultivierung erfolgt analog zu der bei Auftreten eines toxischen CPE. Werden in der Zellkultur Hinweise auf CPE beobachtet, wird der entsprechende Überstand mit einer oder mehrerer der folgenden Techniken untersucht: PCR, gefolgt von Sequenzierung und/oder Immunfluores zenz. 3.3 Virus-Genomnachweis Aus der virushaltigen Suspension (Zellkulturüberstand bzw. geklärter Organüberstand) wird die DNA bevor zugt unter Verwendung des QIAamp DNA Kit (Qiagen) bzw. einer vergleichbaren standardisierten Methode nach Vorschrift des Herstellers isoliert (Protokoll: siehe Isolierung viraler DNA). Virales Genom wird in der PCR nach Amplifizierung hochkonservierter Genabschnitte der Iridoviren nachge wiesen. Dazu wird die DNA mit EHNV-spezifischen Primern, dem PCR-Reaktionspuffer einschließlich dNTP’s und Magnesiumchlorid sowie der thermostabilen DNA-Polymerase versetzt. Bevorzugt werden folgende kom merziell erhältliche Kits: HotStar Taq Master Mix Kit, HotStar HiFidelity PCR Kit, Taq PCR Kit von Qiagen. Die Amplifizierung erfolgt nach Angaben des Herstellers. Zur Amplifizierung wird vom EURL und der OIE das Primerpaar EURL EHN f/r empfohlen. Das resultierende Produkt weist eine Länge von 580 bp auf. Das NRL für EHN präferiert die MCP-2-PCR (siehe Tabellen 1 und 2). Anschließend erfolgt die Sequenzierung des PCR-Produkts und der Vergleich mit publizierten Daten. Zur Identifizierung von EHNV und Differenzierung dieses Erregers von anderen Ranaviren, z. B. FV3, ESV, ECV, kann das Amplifikat der MCP-2-PCR mit der Restriktionsendonuklease Acc I verdaut werden. Ein EHNV- spezifisches MCP-2-PCR-Produkt wird nach Acc I-Verdau in Fragmente von 238 bp und 387 bp Größe gespal ten. Das Ergebnis unterscheidet sich eindeutig von entsprechenden Restriktionsmustern für ECV, ESV und FV3 (siehe Tabelle 3). 10 | Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Vollst. überarb. Version, Stand 21.04.2021
Epizootische Hämatopoetische Nekrose (EHN)
Protokoll zur Isolierung viraler DNA
Isolierung viraler DNA aus Zellkulturüberstand mit QIAamp DNA Kit (Qiagen)
Je nach Ausprägung des CPE werden 30 µl bis 300 µl Zellkulturüberstand unter sterilen Bedingungen in ein
1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und für 2 min bei 2.500 U/min (die Umdrehungszahlen gelten jeweils für
Eppendorf-Rotoren) zentrifugiert.
20 µl bis max. 200 µl des geklärten Überstandes werden für die DNA Isolierung in ein neues Reaktionsgefäß
überführt und mit PBS auf insgesamt 200 µl aufgefüllt.
Es erfolgt die Zugabe von 20 µl Proteinase K (Proteinase K solution 600 mAU/ml, Qiagen) und von 4 µl
RNAse A (100 mg/ml, Qiagen). Nach gründlicher Durchmischung mit anschließender Inkubation von 1 min
folgt die Zugabe von 200 µl Puffer AL.
Zur Homogenisierung und vollständigen Lyse wird die Suspension 15 sec im Intervall mit dem Vortexer ge
mischt und anschließend für 10 min bei 56 °C inkubiert.
Nach Zugabe von 200 µl 96 - 98 % Ethanol wird der Reaktionsansatz mit dem Vortexer gemischt, auf die
Säule (QIAamp Spin Column) verbracht und für 1 min bei 8.000 U/min zentrifugiert.
Wichtig ist, dass nach jedem folgenden Zentrifugationsschritt der Säulendurchfluss verworfen und die Säule
in ein sauberes DNAse-freies Reaktionsgefäß verbracht wird.
Die auf der Säule gebundene DNA wird mit 500 µl Puffer AW1 versetzt und 1 min bei 8.000 U/min und mit
500 µl Puffer AW2 für 3 min bei 14.000 U/min gewaschen.
Auf der Säule verbliebene Flüssigkeitsreste werden durch einen Zentrifugationsschritt von 1 min bei
14.000 U/min entfernt.
Die Elution der DNA erfolgt mit 60 µl Puffer AE nach 5-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur und an
schließender Zentrifugation für 1 min bei 8.000 U/min.
Die Lagerung der DNA ist bei -20 °C möglich.
Isolierung viraler DNA aus Organmaterial (Qiagen, QIAamp DNA Mini Kit, Tissue Protokoll)
Zur Gewinnung viraler DNA aus Organen werden diese mittels steriler chirurgischer Instrumente entnommen
und mit Hilfe steriler Scheren fein zerkleinert. Entsprechend den Herstellerangaben werden 25 mg des ho
mogenisierten Materials unter Verwendung des QIAamp DNA Mini Kits (Qiagen) weiterverarbeitet. Zur Ver
meidung im Gefäßdeckel verbliebener Tropfen ist vor jedem erneuten Öffnen des Gefäßes ein kurzer Zent
rifugationsschritt einzuhalten, um die Kontaminationsgefahr zu minimieren. Die Extraktion der viralen DNA
erfolgt nach dem DNA Mini Kit Tissue Protokoll (Qiagen).
Zunächst erfolgt die Zugabe von 180 µl Puffer ATL sowie 20 µl Proteinase K (Proteinase K solution
600 mAU/ml, Qiagen). Zur gründlichen Durchmischung wird die Suspension mit Hilfe des Vortexers 15 sec
gemischt. Es folgt eine Inkubationsphase bei 56 °C bis zur vollständigen Lyse des Organmaterials. Die Lyse
wird durch regelmäßiges Vortexen der Suspension unterstützt. Enthaltene RNA wird durch Zugabe von 4 µl
Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Vollst. überarb. Version, Stand 21.04.2021| 11Epizootische Hämatopoetische Nekrose (EHN) RNAse A (100 mg/ml, Qiagen) mit anschließender Inkubation bei Raumtemperatur für 2 min eliminiert. Nach Zugabe von 200 µl Lysispuffer AL wird die Suspension erneut mit Hilfe des Vortexers gründlich durchmischt und anschließend bei 70 °C für 10 min inkubiert. Durch Zugabe von 200 µl 99,8 % Ethanol wird die DNA präzipitiert. Nach gründlicher Durchmischung mittels Vortexer wird der Reaktionsansatz auf die Säule (QIAamp Spin Column) gegeben. Durch Zentrifugation bei 8000 U/min für 1 min wird die präzipitierte DNA auf der Säule adsorbiert. Nach Zugabe von 500 µl Waschpuffer AW1 wird die DNA durch Zentrifugation bei 8000 UpM für 1 min gewaschen. Es folgt ein zweiter Waschschritt durch Zugabe von 500 µl Waschpuffer AW2 und anschließender Zentrifugation bei 14.000 UpM für 3 min. Zur Entfernung enthaltener Alkoholreste wird ein zusätzlicher Zentrifugationsschritt bei 14.000 UpM für 1 min durchgeführt. Durch Zugabe von 60 µl Elu tionspuffer AE, Inkubation bei Raumtemperatur für 1 min und Zentrifugation der Probe bei 8000 UpM für 1 min wird die DNA von der Säule eluiert. Die DNA wird bei -20 °C gelagert. Isolierung viraler DNA aus Organüberstand (Qiagen, QIAamp DNA Mini Kit) Zur Extraktion viraler DNA aus Organüberstand werden zunächst die entsprechenden Organe steril entnom men und mittels steriler Scheren fein zerkleinert. 300 mg des homogenisierten Organmaterials werden in 1 ml Zellkulturmedium (ZB5) mit einem effektiven Enrofloxacingehalt von 0,01 % aufgenommen, mittels Vortexer gründlich durchmischt und anschließend über Nacht bei 10 °C im Intervallschüttler mit 30-sekun digem Schütteln im Intervall von 5 min inkubiert. Nach Zentrifugation der Probe bei 3500 UpM für 5 min werden 200 µl des Überstandes für die DNA-Extraktion entnommen. Es wird empfohlen, die Extraktion mit Hilfe des QIAamp DNA Mini Kits (Qiagen) nach Herstellerangaben durchzuführen. Nach Zugabe von 20 µl Proteinase K (Proteinase K solution 600 mAU/ml, Qiagen) und 4 µl RNAse A (100 mg/ml, Qiagen) erfolgt eine gründliche Durchmischung mittels Vortexer und anschließender Inkubation bei Raumtemperatur für 1 min. Zur Homogenisierung und vollständigen Lyse wird die Suspension nach Zu gabe von 200 µl Lysispuffer AL für 15 sec mit Hilfe des Vortexers gemischt und anschließend für 10 min bei 56 °C inkubiert. Nach Zugabe von 230 µl 96 - 98 % Ethanol wird die DNA präzipitiert. Nach gründlicher Durchmischung mittels Vortexer wird die gesamte Probe auf die Säule (QIAamp Spin Column) gegeben. Nach Zentrifugation bei 8000 UpM für 1 min wird der Durchfluss verworfen und die Säule in ein neues Tube über führt. Die auf der Säule adsorbierte DNA wird mit 500 µl Puffer AW1 bei 8000 UpM für 1 min und mit 500 µl Puffer AW2 bei 14.000 UpM für 3 min gewaschen. Zur Entfernung von Alkoholrückständen der Waschpuffer wird ein zusätzlicher Zentrifugationsschritt bei 14.000 UpM für 1 min durchgeführt. Durch die Zugabe von 60 µl Elutionspuffer AE und einer Inkubationszeit von 5 min bei Raumtemperatur sowie einem letzten Zent rifugationsschritt bei 8000 UpM für 1 min wird die DNA von der Säule eluiert. Die DNA wird bei -20 °C gela gert. Protokoll zur Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 12 | Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Vollst. überarb. Version, Stand 21.04.2021
Epizootische Hämatopoetische Nekrose (EHN)
Die Amplifizierung von DNA-Fragmenten erfolgt unter Verwendung des HotStarTaq Master Mix Kits (Qiagen)
oder einer vergleichbaren standardisierten Methode nach Vorschrift des Herstellers. Folgende kommerziell
erhältlichen Kits sind ebenfalls geeignet: HotStar HiFidelity PCR Kit, Taq PCR Kit von Qiagen. Das verwen
dete Protokoll wurde gemäß den Angaben des HotStarTaq PCR Handbuchs etabliert.
In einem 25 µl Ansatz werden 12,5 µl HotStarTaq Master Mix, 10,5 µl steriles Wasser und jeweils 0,5 µl der
spezifischen Primer (10 pmol/µl) sowie 1 µl der entsprechenden DNA gemischt.
Vom EURL und der OIE wird das Primerpaar EURL EHN f/r mit anschließender Sequenzierung des PCR-Pro
dukts empfohlen. Das amplifizierte Produkt hat eine Größe von 580 bp.
Das NRL für EHN führt grundsätzlich die MSP-2-PCR durch, aus der ein Produkt mit einer Größe von 625 bp
resultiert. Anschließend erfolgen sowohl eine Sequenzierung des PCR-Produkts als auch die Restriktions
enzymanalyse, um zwischen EHNV und anderen Iridoviren zu unterscheiden (siehe Protokoll: Restriktions
endonuklease-Test). Zusätzlich wird die Qualität der aus dem diagnostischen Originalmaterial extrahierten
DNA mittels Aldolase-PCR (Primerpaar Ald-1/-2, siehe Tabellen 1 und 2) überprüft.
Die Notwendigkeit, das Amplikon zu sequenzieren und mit der DNA-Sequenz unter der GenBank-Nummer
AY187045.1 zu vergleichen, ergibt sich aus der Tatsache, dass keine der aufgeführten PCR-Primer spezifisch
für EHNV sind.
PCR: HotStar Taq Master Mix Kit (Qiagen)
25 µl Ansatz: X µl Wasser
12,5 µl HotStar Taq Master Mix
0,5 µl Primer 1 (10 pmol/µl)
0,5 µl Primer 1 (10 pmol/µl)
Y µl DNA (i. d. R. 1 µl; < 1 µg Gesamt-DNA)
PCR: HotStar HiFidelity PCR Kit (Qiagen)
25 µl Ansatz: X µl Wasser
5,0 µl 5 x HotStar HiFidelity PCR Puffer
0,5 µl Primer 1 (10 pmol/µl)
0,5 µl Primer 1 (10 pmol/µl)
1,0 µl HotStar HiFidelity DNA Polymerase (2,5 Einheiten/µl)
Y µl DNA (i. d. R. 2 µl; < 1 µg Gesamt-DNA)
Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Vollst. überarb. Version, Stand 21.04.2021| 13Epizootische Hämatopoetische Nekrose (EHN)
PCR: Taq PCR Kit (Qiagen)
50 µl Ansatz: X µl Wasser
5,0 µl 10 x PCR Puffer
2,0 µl dNTP mix (jeweils 10 mM)
1,0 µl Primer 1 (10 pmol/µl)
1,0 µl Primer 1 (10 pmol/µl)
0,5 µl Taq DNA Polymerase (5 Einheiten/µl)
Y µl DNA (i. d. R. 2 µl; < 1 µg Gesamt-DNA)
Tabelle 1: Vom EURL, OIE und NRL empfohlene Primer für die PCR zum Genomnachweis von EHNV.
Primer Sequenz Referenz
EURL EHN f 5‘-CGCAGTCAAGGCCTTGATGT-3‘
von EURL und OIE empfohlen
EURL EHN r 5‘-AAAGACCCGTTTTGCAGCAAAC-3‘
EHN MCP-1 M151 5‘-AACCCGGCTTTCGGGCAGCA-3‘
von OIE empfohlen
EHN MCP-1 M152 5‘-CGGGGCGGGGTTGATGAGAT-3‘
EHN MCP-2 M153 5‘-ATGACCGTCGCCCTCATCAC-3‘
von OIE und NRL empfohlen
EHN MCP-2 M154 5‘-CCATCGAGCCGTTCATGATG-3‘
Interne Kontrolle
Ald-1 5‘-TGTGCCCAGTATAAGAAGGATGG-3‘ Lessa und Applebaum (1993)
Ald-2 5‘-CCCATCAGGGAGAATTTCAGGCTCCACAA-3‘
Tabelle 2: Vom EURL, OIE und NRL empfohlene PCR-Protokolle zum Genomnachweis von EHNV.
Primer Reaktionsbedingungen PCR-Produkt
EURL EHN f 1. 95 °C 15 min 580 bp
EURL EHN r 2. 95 °C 1 min
3. 55 °C 1 min
4. 72 °C 1 min zu Schritt 2 35 Zyklen
5. 72 °C 15 min
8 °C HOLD
EHN MCP-1 M151 1. 95 °C 15 min 321 bp
EHN MCP-1 M152 2. 94 °C 30 s
3. 60 °C 30 s
4. 72 °C 1 min zu Schritt 2 35 Zyklen
5. 72 °C 5 min
8 °C HOLD
EHN MCP-2 M153 1. 95 °C 15 min 625 bp
EHN MCP-2 M154 2. 94 °C 30 s
3. 60 °C 30 s
4. 72 °C 1 min zu Schritt 2 35 Zyklen
5. 72 °C 10 min
6. 8 °C HOLD
14 | Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Vollst. überarb. Version, Stand 21.04.2021Epizootische Hämatopoetische Nekrose (EHN)
EHNV fwd 1. 95 °C 15 min 516 bp
EHNV rev 2. 94 °C 1 min
3. 58 °C 1 min
4. 72 °C 45 s zu Schritt 2 40 Zyklen
5. 72 °C 10 min
8 °C HOLD
Ald-1 1. 95 °C 15 min ca. 740 bp
Ald-2 2. 94 °C 1 min für
3. 57 °C 1 min Elritze
4. 72 °C 1 min 30 s zu Schritt 2 40 Zyklen
5. 72 °C 10 min
6. 8 °C HOLD
Die PCR kann je nach den Bedingungen, unter denen sie durchgeführt wird, variieren. In Abhängigkeit vom
verwendeten Thermocycler müssen möglicherweise Optimierungen im Temperaturprofil durchgeführt wer
den. Darüber hinaus können falsch positive Ergebnisse auftreten, wenn unspezifische Primerbindungen oder
Laborkontaminationen vorliegen. Es ist deshalb wichtig, geeignete Positiv- und Negativkontrollen mitzufüh
ren. Empfohlen werden als Positivkontrolle EHNV und als Negativkontrolle ESV bzw. ECV sowie eine DNA-
negative Probe.
Andere PCR-Versionen mit nachgewiesener Effizienz können ebenfalls verwendet werden.
Protokoll für den Restriktionsendonuklease-Test
In einem Gesamtansatz von 10 µl werden 2 µl der isolierten Gesamt-DNA unter Verwendung eines geeigneten
Spaltpuffers mit 1 bis 2 Einheiten der Restriktionsendonuklease Acc I (New England Biolabs) bei 37 °C für
1 bis 2 h inkubiert. Nach Zugabe von 2 µl DNA Gel Ladepuffer (50 % Glyzerin, 1mM EDTA pH 8,0 bzw.
Blue/Orange Loading dye Promega) werden die Spaltprodukte elektrophoretisch im Agarosegel aufgetrennt.
10 µl-Ansatz: 6,8 µl H2O (variabel)
2 µl DNA (hier Rana MCP-2-PCR-Produkt)
1 µl 10x Spaltpuffer (Cut Smart buffer, New Englang Biolabs)
0,2 µl Enzym Acc I (New England Biolabs, 2 Einheiten)
▪ vorsichtig mischen, kurz anzentrifugieren
▪ Inkubation 1 - 2 h entsprechend des Reaktionsoptimums des Enzyms
− siehe Herstellerangaben
− i. d. R. bei 37 °C
▪ abzentrifugieren
▪ Zugabe von 2 µl DNA Gel Ladepuffer (50 % Glyzerin, 1 mM EDTA pH 8,0 bzw. Blue/Orange Loading dye
Promega)
▪ elektrophoretische Auftrennung der Spaltprodukte im 2,5 % Agarose Gel
▪ Mitführen eines 100 bp Markers (Promega)
Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Vollst. überarb. Version, Stand 21.04.2021| 15Epizootische Hämatopoetische Nekrose (EHN) Protokoll: Agarosegel Elektrophorese Die Auftrennung der DNA-Fragmente erfolgt in 2,5 % Agarosegelen in Tris-Acetat-EDTA (TAE) Puffer bzw. TBE-Puffer. Tabelle 3: Spaltanalyse der MCP-2-PCR (laut OIE-Vorgaben) Virus Acc I EHNV 238 / 387 BIV, ESV, ECV, WV 625 FV3, GV 164 / 461 3.4 Virus-Antigennachweis Für jedes zu identifizierende Virusisolat werden Zellen auf mindestens acht Deckgläschen (oder ähnlich) mit einer Dichte ausgesät, die nach 24 Stunden Kultivierung zu einer Konfluenz von etwa 60 % bis 90 % führt. Es wird eine der o. g. Zelllinien empfohlen, insbesondere jedoch EPC. Nachdem sich die Zellen auf der Glasoberfläche abgesetzt haben (etwa 1 Stunde nach dem Aussäen) oder nach bis zu 24 Stunden Inkubation wird das zu identifizierende Virus inokuliert. Es werden vier Replikate bei einem Volumen-zu-Volumen-Verhältnis von 1 : 10 und vier Replikate bei einem Verhältnis von 1 : 1000 be- impft. Die Zellen werden dann für weitere 20 bis 30 Stunden bei einer Temperatur zwischen 15 und 22 °C inkubiert. Nach der Inkubation werden die Kulturen zweimal in Zellkulturmedium ohne Serumzusatz gewa schen, getrocknet, bei -20 °C gekühlt in mit in 80%igem eiskaltem Aceton fixiert. Danach wird ein indirekter Immunfluoreszenzantikörpertest (IFAT) durchgeführt. Zuerst wird mit polyklona len Antikörpern nachgewiesener Sensitivität und Spezifität und dann mit einem Fluorochrom-konjugierten Antiserum gegen das Immunglobulin des Primärantikörpers inkubiert. Für jedes der getesteten Antiseren wurde mindestens eine mit hoher und eine mit niedriger Dosis beimpfte Zellkultur gefärbt. Entsprechende Negativ- und Positivkontrollen müssen in den Test einbezogen werden. Es ist jedoch zu beachten, dass die verfügbaren Antikörper EHNV nicht von anderen Ranaviren unterscheiden können. 16 | Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Vollst. überarb. Version, Stand 21.04.2021
Epizootische Hämatopoetische Nekrose (EHN)
Literatur
Lessa, E.P., Applebaum, G., 1993. Screening techniques for detectingallelic variation in DNA sequences.
Mol. Ecol. 2, 119–129.
OIE Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals in der jeweils gültigen Fassung
EURL for Fish and Crustacean Diseases: Diagnostic manual (https://www.eurl-fish-crustacean.eu/fish/diag
nostic-manuals)
Verordnung (EU) 2016/429 des Europäischen Parlaments und des Rates vom 9. März 2016 zu Tierseuchen und
zur Änderung und Aufhebung einiger Rechtsakte im Bereich der Tiergesundheit („Tiergesundheitsrecht“)
Delegierte Verordnung (EU) 2018/1629 der Kommission vom 25. Juli 2018 zur Änderung der Liste der Seuchen
in Anhang II der Verordnung (EU) 2016/429 des Europäischen Parlaments und des Rates zu Tierseuchen und
zur Änderung und Aufhebung einiger Rechtsakte im Bereich der Tiergesundheit („Tiergesundheitsrecht“)
Durchführungsverordnung (EU) 2018/1882 der Kommission vom 3. Dezember 2018 über die Anwendung be
stimmter Bestimmungen zur Seuchenprävention und -bekämpfung auf Kategorien gelisteter Seuchen und zur
Erstellung einer Liste von Arten und Artengruppen, die ein erhebliches Risiko für die Ausbreitung dieser
gelisteten Seuchen darstellen
Delegierten Verordnung (EU) 2020/687 der Kommission vom 17. Dezember 2019 zur Ergänzung der Verord
nung (EU) 2016/429 des Europäischen Parlaments und des Rates hinsichtlich Vorschriften für die Prävention
und Bekämpfung bestimmter gelisteter Seuchen
Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Vollst. überarb. Version, Stand 21.04.2021| 17Falldefinition – Epizootische Hämatopoetische Nekrose (EHN)
Klinisches Bild
Das klinische Bild der EHN ist unspezifisch. Bei Flussbarschen (Perca fluviatilis), offenbar dem Hauptwirt in
Australien, kann die Infektion durch plötzliche Todesfälle ohne jegliche äußere und innere Anzeichen auf
treten. Symptome können Dunkelfärbung der Haut, Inappetenz, Ataxie, Lethargie, Blutungen an den Flos
senrändern, Geschwürbildung, Rötung und/oder Ablösung der Haut sein.
Inkubationszeit: abhängig vom Alter der Fische, der Wassertemperatur, der Infektionsdosis und der Virulenz
des Erregers, in der Regel drei bis 32 Tage.
Labordiagnostischer Nachweis
Erregernachweis:
▪ Virusanzucht in Zellkulturen und Identifizierung mittels Immunfluoreszenztest
▪ Genomnachweis mittels PCR und anschließende Sequenzierung des PCR-Produktes und/oder Rest
riktions-Endonuklease-Verdau zur Unterscheidung des EHNV von anderen Ranaviren
Zusatzinformation
Bei der EHN-Diagnostik ist Folgendes zu beachten:
▪ Der eindeutige Nachweis von EHNV durch Virusisolierung mit anschließendem serologischen Nach
weis (z. B. Antigen-ELISA oder Immunfluoreszenztest) ist nicht möglich.
▪ Die PCR ergibt ohne nachfolgende Sequenzierung (oder Restriktionsenzymanalyse) kein EHNV-spezi
fisches Ergebnis
▪ Nach Untersuchungen des OIE-Referenzlabors zur EHN bilden infizierte Tiere keine neutralisierenden
Antikörper
Epidemiologischer Zusammenhang
▪ Lebendfischbewegungen
▪ Kontakte (Personen, Geräte, Wasser) zu anderen Betrieben
▪ Aussetzen infizierter Fische in Gewässer
Voraussetzung für den Verdacht
▪ Vorliegen klinischer Symptome oder
▪ Vorliegen pathologisch-anatomischer bzw. histologischer Hinweise oder
▪ Gehäufte Todesfälle in Verbindung mit epidemiologischen Zusammenhängen zu einem labordiagnos
tisch bestätigten EHN-Fall
18 | Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Vollst. überarb. Version, Stand 21.04.2021Epizootische Hämatopoetische Nekrose (EHN)
Durch TSN zu übermittelnder Fall
Voraussetzungen für die Feststellung eines EHN-Falles:
▪ Positiver Befund mit mindestens einer der o. g. Methoden und
▪ Genomische Differenzierung des EHNV von ESV/ECV und anderen Ranaviren mittels Sequenzierung
des PCR-Produkts
Rechtsvorschriften
Verordnung (EU) 2016/429 des Europäischen Parlaments und des Rates vom 9. März 2016 zu Tierseuchen und
zur Änderung und Aufhebung einiger Rechtsakte im Bereich der Tiergesundheit („Tiergesundheitsrecht“)
Delegierte Verordnung (EU) 2018/1629 der Kommission vom 25. Juli 2018 zur Änderung der Liste der Seuchen
in Anhang II der Verordnung (EU) 2016/429 des Europäischen Parlaments und des Rates zu Tierseuchen und
zur Änderung und Aufhebung einiger Rechtsakte im Bereich der Tiergesundheit („Tiergesundheitsrecht“)
Durchführungsverordnung (EU) 2018/1882 der Kommission vom 3. Dezember 2018 über die Anwendung be
stimmter Bestimmungen zur Seuchenprävention und -bekämpfung auf Kategorien gelisteter Seuchen und zur
Erstellung einer Liste von Arten und Artengruppen, die ein erhebliches Risiko für die Ausbreitung dieser
gelisteten Seuchen darstellen
Delegierte Verordnung (EU) 2020/687 der Kommission vom 17. Dezember 2019 zur Ergänzung der Verordnung
(EU) 2016/429 des Europäischen Parlaments und des Rates hinsichtlich Vorschriften für die Prävention und
Bekämpfung bestimmter gelisteter Seuchen
Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit
Südufer 10, D-17493 Greifswald – Insel Riems, www.fli.de
Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Vollst. überarb. Version, Stand 21.04.2021| 19Sie können auch lesen
