Nachweis von DNA-Schäden mittels Analyse von oxidierten Nukleosiden und deren Anwendung als Biomarker
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Übersicht
Nachweis von DNA-Schäden mittels Analyse
von oxidierten Nukleosiden und deren
Anwendung als Biomarker
Andreas Wagner und Gerhard Jahreis, Institut für Ernährungswissenschaften der Friedrich-Schiller-
Universität Jena
Reaktive Sauerstoffradikale und andere freie Radikale, die kontinu- Das Superoxidanionradikal und das
ierlich in vivo gebildet werden, sind Zwischenprodukte endogener Wasserstoffperoxid können auch als
Prozesse bzw. exogen bedingt. Auf Grund ihrer Reaktionsfreudig- Nebenprodukte der Phagozytose von
keit können sie unmittelbar mit den Nukleosiden der DNA, zum Bei- Makrophagen über das NADPH-Oxi-
spiel unter Adduktbildung, reagieren. Durch reaktive Sauerstoffradi- dase-System freigesetzt werden. Dies
kale induzierte Oxidationsvorgänge verursachen Veränderungen an ist besonders beim oxidativen Burst
der Leukozyten der Fall.
den Nukleotiden der DNA, so dass daraus Einzel- und Doppelstrang-
Weiterhin können ROS durch die
brüche sowie Transkriptionsfehler bei der RNA-Synthese resultieren Aktivität von Sauerstoff übertragen-
(Abb. 1). Durch Transkriptionsfehler während der DNA-Replikation den Enzymen, bei der Metabolisie-
kommt es zu Punktmutationen im Einzelstrang. rung von toxischen Fremdstoffen
Diese Prozesse können durch eine Vielzahl von Antioxidanzien ge- durch das Cytochrom P450-System
hemmt werden oder sind durch zelluläre Reparationsmechanismen und bei der Oxidation von Fett- und
reversibel. Ist das Reparaturpotenzial der Zelle jedoch durch erbliche Aminosäuren (z. B. Arachidonsäure)
oder erworbene Faktoren geschädigt oder durch Überschreitung des entstehen [8, 9].
Neben diesen endogen Faktoren,
Schwellenwertes überfordert, wird der DNA-Einzelstrang in der die von der Stoffwechselaktivität ab-
nachfolgenden Replikation fehlerhaft kopiert und dieser Fehler in hängig sind, kann sich der oxidative
die DNA-Sequenz irreversibel integriert. Findet dieser Vorgang in ei- Stress durch exogene Einflüsse, wie
nem sensiblen Teil der DNA, vor allem im Bereich von Schlüsselge- UV- und ionisierende Strahlung, Ozon
nen statt, ist eine maligne Transformation der Zelle möglich. und verschiedene Umweltgifte, er-
höhen [10–13]. Der individuelle Le-
bensstil (Rauchen, Sport, Überge-
Derzeit sind mehr als 20 Oxidations- Transfer entsteht das Superoxida- wicht) ist ein zusätzlicher Parameter,
–
produkte bekannt, die auf direkte nionradikal (•O2 ), das eine geringe Ak- der den oxidativen Stress beeinflusst
oxidative DNA-Schädigung kausal tivität zeigt, aber in Wasserstoffpero- [14–22].
zurückzuführen sind. Eines dieser Re- xid (H2O2) umgewandelt wird. Bei An- Ein weiterer Bildungsweg für Hy-
aktionsprodukte ist 8-Oxo-2´-deoxy- wesenheit von Übergangsmetallen, droxylradikale führt über die Spaltung
–
guanosin (8-OxodG, Tab. 1) [1]. wie Eisen und Kupfer, wird Wasser- des Peroxynitrit-Ions (ONOO ). Das
stoffperoxid (H2O2) zum Hydroxylradi- Peroxynitrit-Ion ist ein reaktives Mo-
Entstehung und Patho- kal (•OH) reduziert [4–7]. lekül, das bei der Reaktion von Stick-
physiologie des 8-OxodG
Um den Energiebedarf zu decken,
werden in aeroben Organismen Oxi-
dationen auf Zellebene durchgeführt.
Die oxidativen Stoffwechselprozesse
führen dabei zwangsläufig zu uner-
wünschten Sauerstoffspezies, wie dem
–
Superoxidanionradikal (•O 2 ), Wasser-
stoffperoxid (H2O2), Hydroxylradikal
(•OH) und Singulettsauerstoff (1O2).
Das Hydroxylradikal ist wegen seines ROS durch:
starken Oxidationspotenzials die reak- Metabolismus, Entzündungsprozesse,
tivste Sauerstoffspezies. Umwelt, Strahlung
Eine Hauptquelle von intrazellu- Präneoplasti-
lären reaktiven Sauerstoffspezies sche Läsion
(ROS) sind die Mitochondrien, in de-
nen fast der gesamte Sauerstoffumsatz
stattfindet. Durch Single-Elektron- Abb. 1: Mögliche Rolle von ROS bei einem Mehrstufenprozess der Kanzerogenese [4]
178 Ernährungs-Umschau 51 (2004) Heft 5Übersicht
oxid (NO) mit dem Superoxidanionra- Tab. 1: Die wichtigsten DNA-Oxidationsprodukte und ihre Bezeichnungen [3]
–
dikal (•O2 ) entsteht und von Phago-
zyten zur Abwehr eingesetzt wird [23, Abkürzung Bezeichnung
24]. Peroxynitrit-Ionen können aber
8-OxodG/ 8-OHdG 8-Oxo-2´-deoxyguanosin/8-Hydroxy-2´-deoxyguanosin
auch direkt mit den Proteinen reagie-
ren und diese nitrieren oder die DNA 8-OxoG 8-Oxo-guanin
deaminieren. In diesen Fällen wird 8-OxodA/8-OHdA 8-Oxo-2´-deoxyadenosin/8-Hydroxy-2´-deoxyadenosin
nicht mehr vom oxidativen, sondern
5-HMUra/ 5-OHmU 5-(Hydroxymethyl)uracil
vom nitrosativen Stress gesprochen
[25]. 5-OHCyt 5-Hydroxycytosin
Im Laufe der Evolution hat die Zelle
einige sehr wirksame protektive Me- Tab. 2: Übersicht der Methoden zur Bestimmung von DNA-Oxidationsaddukten
thoden entwickelt, um zellständige
Makromoleküle vor ROS wirksam zu Marker Methode Vorteile Nachteile
schützen. Trotzdem können Hydroxyl-
radikale wie auch andere ROS wegen 8-OxodG HPLC-ECD Sehr empfindlich und genau; Kann nur elektrochemisch aktive
niedrige Gerätekosten; weit Substanzen detektieren (8-OxodG,
ihrer starken Elektronegativität Ma-
verbreitet 5-OHdCyd, 5-OHdUrd, 8-OxodA)
kromoleküle oxidieren. Das Ausmaß
der Schädigung von zellulären Protei- 8-OxodG GC/MS Mehrzahl der oxidierten Modi- Durch Derivatisierung künstlich
fikationen nachweisbar erhöhte Level an 8-OxodG;
nen, Lipiden und der DNA kann damit relativ teuer
die Reparaturkapazität des Organis-
8-OxodG LC-MS/MS Theoretisch leistungsstärkste In Entwicklung; relativ teuer
mus überschreiten. Dadurch wird die
Methode
Genese zahlreicher Erkrankungen, z.
B. Alzheimer, Parkinson, Krebs, Multi- 8-OxodG Immunologi- Kommerziell verfügbar Nicht validiert;
sche Methoden Spezifitätprobleme
ple Sklerose, Diabetes mellitus Typ 2,
rheumatoide Arthritis und Herzin- Oxidierte Enzymatische Sehr empfindlich; schnelle Benutzt spezifische Reparatur-
farkt, begünstigt [26–32]. Pyrimidine, Methoden und günstige Methode enzyme zur Detektion
8-OxodG
Entstehung von 8-OxodG im Auf Grund der chemischen Reakti- Organismus des Menschen 10 000 Mal
Organismus onsfreudigkeit der DNA, insbesondere pro Zelle und Tag auf. Physiologische
Die ROS können prinzipiell jedes Mo- des Guanosins, und durch die perma- Werte liegen bei einer hydroxylierten
lekül oder jede zelluläre Struktur an- nente Generierung von ROS durch Guanin-Base je 105 Guanin-Basen [2,
greifen, wobei die Schädigung der den natürlichen Zellstoffwechsel ist 8- 32–34]. Dieses steady state wird jedoch
DNA hinsichtlich der Tumorgenese OxodG in der DNA ständig präsent bei Überschreiten einer bestimmten
der entscheidende Aspekt ist [27–29]. und fällt daher nach DNA-Reparatur Exposition gegenüber Schadstoffen
Die oxidative Schädigung der DNA im Zellmetabolismus laufend als en- übersteuert. Es entsteht überpropor-
führt zu einer Vielzahl von modifizier- dogenes Ausscheidungsprodukt an. tional viel 8-OxodG, und der Repara-
ten Purin- und Pyrimidin-Basen [1–3]. Eine Guanosinhydroxylierung tritt un- turmechanismus der Zelle wird da-
Von den DNA-Basen bzw. deren ter physiologischen Bedingungen im durch überfordert. Als mögliche Folge
entsprechenden Nukleosiden ist die
Purinbase Guanin auf Grund ihres
niedrigen Ionisierungspotenzials die
instabilste und damit der Hauptan-
griffspunkt für Sauerstoffradikale [30].
In Gegenwart von ROS wird bevorzugt
das Kohlenstoffatom in der C8-Posi-
tion des Guanins hydroxyliert. Das
entstandene Endprodukt ist 8-Oxo-
guanin (8-OxoG) und das entspre-
chende Nukleosid ist 8-Oxo-2´-deoxy-
guanosin (8-OxodG) [2, 3] (Abb. 2).
8-OxodG kann in verschieden Keto-
Enol-Tautomerieformen existieren.
Die bevorzugte Form ist die 6,8-Dike-
toform. Deshalb wird oft die Bezeich-
nung 8-Oxo-2´-deoxyguanosin für das
entstandene Oxidationsprodukt ver- 8-Hydroxy-2´-deoxy- 8-Oxo-2´-deoxy-
wendet [2] (Abb. 2). Bei der Oxidierung guanosin (8-OHdG) guanosin (8-OxodG)
des Guanosins kann auch eine
(6-Keto-8-Enol-Form) (6-Enol-8-Keto-Form)
Ringöffnung erfolgen, wobei 2,6-Dia-
mino-4-hydroxy-5-formamidopyrimi-
din entsteht. Weitere Oxidationspro- Abb. 2: Entstehung von 8-Oxo-2´-deoxyguanosin und des entsprechenden Tautomers
dukte sind in Abbildung 3 dargestellt durch Angriff eines reaktiven Sauerstoffradikales (ROS) am C8-Atom des Purinringes.
[3, 31]. Das vorherrschende Tautomer ist die 6-Enol-8-Keto-Form.
Ernährungs-Umschau 51 (2004) Heft 5 179Übersicht
Da sich 8-OxodG jedoch fälschlicher-
Purine Pyrimidine weise mit Adenosin paart, wird die Ba-
Guanin-Derivate: Thymin-Derivate: sensequenz der Nukleinsäurenkette in
der Folge irreversibel verändert.
Durch diesen Vorgang der Guanin-
Thymin-Transversion (G→T-Transver-
sion) kann es zum Funktionsverlust
des Gens und infolge dessen zur mali-
gnen Entartung der Zelle kommen
(Abb. 4) [40–42].
8-Hydroxy-guanin 8-OxodG 5-(Hydroxymethyl)uracil 5-Hydroxyuracil
G→T-Transversionen im Tumorsup-
pressorgen p53 sind die häufigsten
Adenin-Derivate: Cytosin-Derivate: hot-spot-Mutationen in menschlichen
Tumoren. Dies ist kritisch, da sich
die Mutationen auf wenige hot-spot-
Codons konzentrieren und besonders
häufig im Codon 248 auftreten. Muta-
tionen dieses Codons erhöhen die
Kanzerogenese insbesondere im
8-Hydroxy-adenin 8-OxodA 5-Hydroxycytosin Cytosinglykol Darmgewebe [43–45].
Abb. 3: Strukturen der am häufigsten untersuchten DNA-Oxidationsprodukte [3, 31] Reparatur und renale Elimina-
tion der oxidierten Basen
dieser Überlastung kann es zu einer 8-OxodG wird im Organismus kaum DNA-Reparatur-Prozesse sorgen da-
malignen Transformation kommen. metabolisiert und fast ausschließlich für, dass 8-OxodG und andere oxidier-
Nicht reparierte, spontane endogene renal ausgeschieden, daher bietet es te DNA-Addukte kontinuierlich wie-
DNA-Schäden sind nicht nur Ursache sich als Biomarker für Personen mit der aus der DNA entfernt werden. Für
maligner Erkrankungen, sondern Exposition gegenüber oxidativem die Reparatur der DNA-Schäden exi-
auch verantwortlich für den Alte- Stress an. stieren verschiedene Mechanismen.
rungsprozess höherer Organismen. Die Reparatur erfolgt meistens durch
Da es altersabhängig zu einer Akku-
Bedeutung von 8-OxodG den Ausschluss der modifizierten Base
mulation von DNA-Schäden kommt, Wird 8-OxodG nicht entfernt, entste- als solche oder als Nukleotid [46, 47].
steigt mit zunehmendem Alter auch hen im Rahmen der DNA-Replikation Bei der Nukleotidexzisionsreparatur
das Risiko, an Krebs zu erkranken [1, Fehler. Guanosin paart sich regulär wird die geschädigte Base als Teil eines
35–39]. mit Cytosin, Thymidin mit Adenosin. Oligonukleotids aus der DNA entfernt.
Die entstehende Lücke wird durch
anschließende Neusynthese aufge-
füllt. Dieser Mechanismus trägt insbe-
sondere zur Reparatur von Einzel-
strangbrüchen bei und nur zu einem
geringen Teil zur Reparatur oxidativ
geschädigter DNA. Durch spezifische
DNA-Glykosylasen werden bei der Ba-
senexzisionsreparatur die geschädig-
ten, falsch gepaarten oder DNA unüb-
lichen Basen erkannt und als freie Ba-
sen aus der DNA entfernt. Die entste-
henden Fehlstellen werden durch In-
sertion einer Base gefüllt oder in einen
Strangbruch überführt. Dieser kann
durch Neusynthese geschlossen wer-
den. Für oxidative DNA-Schäden und
N
besonders für die Reparatur des 8-
OxoG ist die Formamidopyrimidin-
DNA-Glykosylase (FPG-Protein) von
Bedeutung. Das FPG-Protein entfernt
spezifisch 8-Oxo-guanin, Fapy-guanin
und Fapy-adenin sowie geringe Men-
gen 8-Oxo-adenin aus der DNA
[48–50]. Oxidative Basenschäden wer-
Abb. 4: Bei der DNA-Replikation ist Cytosin das mit Guanosin korrespondierende Nu- den außerdem von der Endonuklease
kleosid. Bei einer oxidativen Schädigung des Guanosins kommt es zu einer fehlerhaften III erkannt und repariert [51].
Paarung mit Adenosin (siehe rechts unten). Da Adenosin bei der DNA-Replikation mit Unter physiologischen Bedingun-
Thymidin korrespondiert, entsteht eine mutagene Guanin-Thymin-Transversion. gen werden pro Tag im Mittel 130–600
180 Ernährungs-Umschau 51 (2004) Heft 5Übersicht
pmol 8-OxodG/kg Körpergewicht mit ECD und der GC/MS verbindet. So angelegten elektrischen Feld als
dem Urin ausgeschieden. Die Gesamt- können mehrere Parameter mit einer Schweif mikroskopisch nachgewiesen
menge beträgt beim Menschen unge- hohen Empfindlichkeit bestimmt wer- werden. Das am häufigsten verwende-
fähr 5,1 x 1015 Moleküle pro Tag [33, 52, den. Eine Derivatisierung wie bei der te Enzym ist das FPG-Protein von E.
53]. Die Generierung und Ausschei- GC ist nicht notwendig. Für 8-OxodG coli, welches auch als Fapy Glykosy-
dung von 8-OxodG ist eine spezifische konnten Nachweisgrenzen von 7,5 lase bekannt ist [69, 70]. Der Comet-
Kenngröße für verschiedene Spezies. und 10 fmol erreicht werden [62, 63]. Assay zeichnet sich durch eine hohe
Es findet sich eine enge negative Kor- Immunologische Methoden geben Empfindlichkeit und kurze Analysen-
relation zur Lebenserwartung, d. h. Information über den Ort und das Vor- zeiten aus. Er ist jedoch weniger spezi-
kurzlebige Säugetiere, wie Maus oder kommen von Schäden im Gewebe. fisch als HPLC-ECD, GC/MS und LC-
Ratte, scheiden höhere Mengen von 8- Die Detektion von 8-OxodG erfolgt in MS/MS, da auch die nicht-oxidativen
OxodG aus (Abb. 5) [32]. situ mittels Antikörpern. Nach der DNA-Schäden nachgewiesen werden.
8-OxodG ist eine chemisch stabile Aufarbeitung wird die Probe mit Anti- Ein weiterer Nachteil ist die mangeln-
Substanz, eine Konzentrationsverän- körpern versetzt, die 8-OxodG in der de Reproduzierbarkeit der Ergebnisse
derung konnte auch nach längerer La- DNA identifizieren. Durch Zugabe ei- [71].
gerung von Urin nicht nachgewiesen nes zweiten Antikörpers können die Untersucht werden leicht zugängli-
werden [53]. Deshalb bietet sich 8- Schäden mikroskopisch lokalisiert che Zellen bzw. Gewebeteile oder Urin
OxodG als sensitiver und einfach zu werden [64–66]. Der Nachteil dieser (Tab. 3 u. 4). Die in Zellen gemessenen
erhebender Parameter für das biologi- Methoden ist, dass nicht alle geschä- 8-OxodG-Gehalte repräsentieren das
sche Monitoring im Bereich der digten Stellen der DNA gefunden wer- Gleichgewicht (steady state) zwischen
Ernährungsforschung an. den und die Antikörper an modifizier- oxidativer Schädigung und Reparatur.
te Basen binden, die dem 8-OxodG Die ermittelten Gehalte sind nur für die
Quantitative ähnlich sind. betrachteten Zellen spezifisch [72, 73].
Im Comet-Assay, auch bezeich- Um 8-OxodG in Zellen zu bestimmen,
8-OxodG-Analyse net als Einzelzell-Gel-Elektrophorese, ist eine Isolation aus der Zelle nötig.
8-OxodG wurde erstmals 1984 von werden oxidierte DNA-Basen mit Hilfe Durch die Aufarbeitung kommt es zur
KASAI und NISHIMURA mittels HPLC und verschiedener Enzyme nachgewiesen. Artefaktbildung und damit zu über-
elektrochemischer Detektion (HPLC- Die Reparaturenzyme entfernen die höhten Werten. Weiterhin existieren
ECD) nachgewiesen [54]. Nachfolgend Schäden aus der DNA, und gleichzei- zwischen den Methoden Diskrepan-
wurde eine Reihe unterschiedlicher tig kommt es zu Strangbrüchen [67, zen, die einen Vergleich erschweren.
Methoden zur Quantifizierung von 68]. Nach Anfärben können die Die im Urin ermittelten Werte spie-
8-OxodG entwickelt (Tab. 2). Strangbrüche durch Wanderung im geln die Ganzkörperbelastung wider.
Am stärksten verbreitet ist die Ana-
lyse mittels HPLC-ECD. Die elektro- Tab. 3: Übersicht zu einigen Untersuchungen in Zellen und Geweben unter Verwen-
chemische Detektion zeichnet sich dung von Biomarkern des oxidativen Stresses
durch eine niedrige Nachweisgrenze
von 2–10 fmol und durch eine hohe
Jahr Gewebe/Zellen Marker Methode Studie Referenz
Richtigkeit aus. Zur Verwendung kom-
men amperometrische und coulome- 1990 Leukozyten 8-OxodG HPLC-ECD Einfluss von Rauchen 84
trische Techniken. Durch Auswahl des 1991 Leukozyten 5-OHmU GC/MS-SIM normale Diät vs. 88
Elektrodenpotenzials kann eine selek- fettreduzierte Diät
tive Detektion erfolgen [55, 56]. Um 1994 Leukozyten 8-OxodG HPLC-ECD Raucher vs. Nichtraucher 86
Koelutionen auszuschließen, ist eine
Aufreinigung der Urinproben notwen- 1994 Gesundes Gewebe 8-OxoG GC/MS-SIM Patienten mit Lungenkrebs 105
vs. Krebsgewebe 5-OHmU vs. gesunde Probanden
dig. FapyGua1
Für die GC/MS ist ein Derivatisie-
1994 Gesundes Gewebe 8-OxodG HPLC-ECD Patienten mit Nierenkrebs 117
rungsschritt notwendig, da in der GC vs. Krebsgewebe vs. gesunde Probanden
nur flüchtige Substanzen untersucht
werden können. Die Nukleoside sind 1994 Lebergewebe 8-OxodG HPLC-ECD Chronische Hepatitis, 110
Leberkrebs
auf Grund des Zuckerrestes schwer
flüchtig. Durch eine Hydrolyse werden 1995 Gesundes Gewebe 8-OxodG HPLC-ECD Patienten mit Brustkrebs 106
vs. Krebsgewebe vs. gesunde Probanden
die Nukleoside in Zucker und Base ge-
spalten und dann derivatisiert. Detek- 1995 Plazenta 8-OxodG HPLC-ECD Einfluss von Rauchen 87
tiert werden nach chromatografischer vs. ELISA während Schwangerschaft,
Methodenvergleich
Trennung nur die oxidierten Basen
[57]. Mit der GC/MS werden oft höhe- 1998 Serum 8-OxodG HPLC-ECD Wirkung von Vitamin C als 116
Plasma vs. ELISA Antioxidans
re Gehalte an 8-OxodG gemessen (10-
Urin
bis 100fach) [58]. Verantwortlich für
die Artefaktbildung von 8-OxodG sind 1999 Urin 8-OxodG HPLC-ECD Einfluss verschiedener 96
Lymphozyten 8-EPG2 ELISA Gemüse- und Obstsorten auf
wahrscheinlich die hohen Temperatu- MDA3 Fluoreszenz die oxidative Schädigung
ren während der Hydrolyse [60, 61].
Die Nachweisgrenze der GC/MS für 2001 Brustdrüsengewebe 5-OHmdU GC/MS Einfluss der Fettzufuhr auf 89
Epithelzellen oxidative Schäden bei Ratten
8-OxodG beträgt 18 fmol [61].
Die LC-MS/MS ist eine relativ neue 1
FapyGua: 2,6-Diamino-4-hydroxy-5-formamidopyrimidin, 2 8-EPG: 8-Isoprostan-F-2, 3 MDA: Malondialdehyd
Methode, die die Vorteile der HPLC-
Ernährungs-Umschau 51 (2004) Heft 5 181Übersicht
Tab. 4: Übersicht zu einigen Untersuchungen im Urin hinsichtlich Biomarker der oxida- scheidung von 8-OxodG mit dem Urin
tiven Schädigung und ein Abfall der Serumkonzentrati-
on konnten mit Beendigung des Ziga-
Jahr Marker Methode Studie Referenz rettenkonsums erreicht werden [82,
83]. Die Betrachtung des steady state
1
1990 dTg GC/MS Krebspatienten vor und nach 108 lässt keine eindeutige Aussage über
8-OxoG Strahlenbehandlung
die Beziehung zwischen der 8-OxodG-
1994 8-OxodG HPLC-ECD Einfluss von Rauchen 74 Konzentration und dem Rauchen zu.
1995 8-OxodG HPLC-ECD Wirkung von -Karotin bei Rauchern 97 In den zellulären Matrizes konnten
ähnliche Analysenergebnisse ermittelt
1995 8-OxodG HPLC-ECD Wirkung von Rosenkohl auf 92
oxidative Schädigung werden [84, 85], während in einer wei-
teren Studie keine Veränderung der 8-
1998 8-OxodG HPLC-ECD Einfluss unterschiedlicher Fette auf 90
die DNA-Schädigung
OxodG-Konzentration gemessen wur-
de [88]. Eine Untersuchung zur oxida-
1998 8-OxodG HPLC-ECD Einfluss von Rauchen und Entzug 83 tiven Schädigung der DNA aus der
1999 8-OxodG HPLC-ECD Einfluss verschiedener Gemüse- 96 Plazenta von Raucherinnen und
8-EPG ELISA und Obstsorten auf die oxidative Nichtraucherinnen mittels ELISA er-
MDA Fluoreszenz Schädigung
gab eine signifikant höhere 8-OxodG-
2000 8-OxodG HPLC-ECD Einfluss von Vitamin C und E auf 98 Konzentration bei den Raucherinnen
oxidative Schädigung [87].
2001 8-OxodG HPLC-ECD Einfluss von Rauchen, BMI, 85
ELISA Fleischaufnahme, Arbeitsbedingungen
GC/MS Ernährung und Antioxidanzien
LC-MS/MS
Seit längerem wird vermutet, dass eine
2003 8-OxodG HPLC-ECD Einfluss von Rauchen und Entzug, 82 fettreiche Ernährung mit einem er-
Vitamin-C- Supplementation
höhten Krebsrisiko korreliert. So wur-
2003 8-OxodG HPLC-ECD Einfluss von Kaffee auf die oxidative 101 de in einer Studie mit 21 Frauen, die
Schädigung bei Ratten ein erhöhtes Brustkrebsrisiko auf-
2003 8-OxodG HPLC-ECD Protektive Wirkung von Muttermilch 115 wiesen, der Energieanteil aus Fett von
30 % auf 15 % reduziert. Untersucht
1
dTg: Thymidin-glykol
wurde die Konzentration von 5-Hy-
droxyuracil in der DNA von Lympho-
zyten. In der Gruppe mit der fettredu-
Das mit dem Urin ausgeschiedene 8- trägt etwa 0,04 Modifikationen pro 105 zierten Diät konnten um 68 % nied-
OxodG wird nicht weiter metaboli- Deoxyguanosin-Molekülen im Jahr rigere 5-Hydroxyuracil-Konzentratio-
siert. Da 8-OxodG eine stabile Verbin- oder 2 Schädigungen pro Zelle und nen gegenüber der Kontrollgruppe ge-
dung ist, kommt es während der Pro- Tag [76]. messen werden [88]. Eine vergleichba-
benaufarbeitung nicht zur Artefaktbil- Anhand der erhobenen Daten er- re Studie wurde mit Ratten durchge-
dung [72, 73]. Es erscheint sinnvoll, gibt sich die Aussage, dass die Schädi- führt, wobei die Nahrung im Fettanteil
die Ausscheidungsrate von 8-OxodG gungsrate mit dem Alter zunimmt, bei zwischen 3–20 % variierte. Die Ergeb-
mit der Messung des steady state zu gleichzeitiger Erniedrigung der Meta- nisse des Rattenversuchs stimmten
kombinieren, um die Reparaturrate in bolisierungsrate. Das steady state wird mit denen der Humanstudie überein
Abhängigkeit von der Schädigungsrate auf Grund einer fehlenden Reparatur [89]. Weitere Untersuchungen konn-
zu untersuchen. erhöht. ten einen ähnlichen Effekt für 8-
OxodG nachweisen [90]. Die oxidative
Beispiele für Anwendungen Schädigung scheint dabei vom Sätti-
Rauchen gungsgrad der Fettsäuren unabhängig
Alter In mehreren Untersuchungen konn- zu sein. So war die Ausscheidung von
te nachgewiesen werden, dass Rau- 8-OxodG im Urin der Versuchstiere,
In Studien mit unterschiedlichen Al- chen zu einer Er-
tersgruppen konnte festgestellt wer- höhung der Urin-
den, dass mit zunehmendem Alter die konzentration von
Urinausscheidung 8-OxodG
Maus
Urinkonzentration an Reparaturpro- 8-OxodG um 30–
dukten abnimmt. Für die 8-OxodG- 50 % führt [33,
Konzentration in Leukozyten ergab 77–79]. Kreatinin-
[pmol/kg/d]
sich jedoch eine lineare Zunahme mit korrigierte Werte
dem Alter von jährlich 0,09 ± 0,01 Mo- sowie auf der Ana- Mensch Ratte
difikationen pro 105 Deoxyguanosin- lyse von 8-OxoG
Molekülen [74]. Ähnliche Akkumula- (korrespondieren-
tionen wurden in mitochondrialer de Base) beruhen-
DNA aus Muskeln sowie in der nu- de Messungen be-
kleären und mitochondrialen DNA stätigen die Aus-
des Hirngewebes gefunden [75, 76]. sage [80, 81]. Eine
Die Akkumulation von 8-OxodG in der signifikante Redu- Abb. 5: Vergleich der Urinausscheidung von 8-OxodG gegen-
nukleären DNA von Hirngewebe be- zierung der Aus- über der spezifischen metabolischen Größe für drei Spezies [32]
182 Ernährungs-Umschau 51 (2004) Heft 5die eine Diät mit gesättigten Fettsäu- von Patienten mit Brustkrebs im Ver- wurden. Zur Untersuchung der modi-
ren erhielten, nicht signifikant höher gleich zu gesunden Probanden gefun- fizierten DNA wurden verschiedene
als die von Versuchstieren, die hoch den werden [106]. Im Urin von Krebs- Methoden entwickelt. Sehr viel ver-
ungesättigte Fettsäuren erhielten [90]. Patienten wurden jedoch signifikant sprechend ist die HPLC-MS/MS. Eine
Ein protektiver Effekt auf die DNA erhöhte Werte von 8-OxodG gemes- Validierung der Methoden ist notwen-
konnte durch den Verzehr von Rosen- sen. Unterschiede ergaben sich auch dig. Mit den untersuchten Biomarkern
kohl in Human- und Rattenstudien zwischen den verschiedenen Krebsar- ist eine Aussage über Schädigungsrate
sowie durch Tomaten in Humanstudi- ten. Weiterhin erhöhte sich der oxida- und Reparatur möglich.
en nachgewiesen werden [91–93]. Ver- tive Stress und damit die 8-OxodG- Es existiert eine Vielzahl von Studi-
ursacht werden die verminderten Konzentration durch Chemotherapie en mit zum Teil widersprüchlichen Er-
8-OxodG-Konzentrationen nach Ver- [107, 108]. In einer anderen Untersu- gebnissen. Wegen der inter- und in-
zehr von Kreuzblütlern wie Rosenkohl chung zur Wirkung von Zytostatika traindividuellen Unterschiede sowie
oder Brokkoli durch sekundäre Pflan- konnte eine Erhöhung der Urinkon- der Komplexität der DNA-Schädigung
zenstoffe [94, 95]. Durch die Erhöhung zentration von 8-OxoG um 50 % im sind weitere standardisierte Untersu-
des Konsums verschiedener Obst- und Vergleich zur Kontrollgruppe durch chungen notwendig. Relevante Resul-
Gemüsearten wurde die Urin- sowie Messung mit GC/MS nachgewiesen tate für die Ernährung lassen sich an-
die Serumkonzentration an 8-OxodG werden [109]. hand der gegenwärtigen Daten nur für
signifikant reduziert [96]. Erhöhte Konzentrationen von die gut etablierten protektiven Effekte
Die gegenwärtige Datenlage ermög- 8-OxodG wurden mittels GC/MS im von Obst und Gemüse erkennen. Die-
licht keine eindeutige Aussage, ob die Lebergewebe von Patienten mit chro- se Lebensmittel führen zu einer Ab-
Supplementation mit Antioxidantien nischer Hepatitis gefunden. Die chro- senkung der für die Kanzerogenese
zu einer Verminderung der oxidativen nische Hepatitis wird als ein wichtiger verantwortlichen oxidativen DNA-
Schädigung der DNA beiträgt. So hatte Risikofaktor für die Entwicklung von Schäden. Allerdings sind dafür weder
die tägliche Zufuhr von 20 mg -Karo- Hepato-Karzinomen diskutiert [110]. Vitamin C noch -Karotin und mögli-
tin über einen Zeitraum von 20 Wo- Im Zusammenhang mit verschie- cherweise auch nicht die Flavonoide
chen keinen Einfluss auf die Konzen- den Erkrankungen werden Biomarker oder Vitamin E verantwortlich. Disku-
tration von 8-OxodG im Urin von Rau- der oxidativen DNA-Schädigung tiert wird, ob die protektiven Effekte
chern [97]. Zu ähnlichen Ergebnissen gehäuft untersucht. So wurden erhöh- auf einen Vitaminkomplex und/oder
führte die Supplementation mit Vit- te Gehalte an 8-OxodG in den Lym- auf andere sekundäre Pflanzenstoffe
amin C und Tocopherol [98–100]. phozyten und im Urin von Patienten zurückzuführen sind.
Kaffee ist eines der am häufigsten mit rheumatoider Arthritis festgestellt
konsumierten psychoaktiven Geträn- [111]. In klinischen Studien konnten
ke. In einer Untersuchung erhielten bei Patienten mit Nierenerkrankungen Literatur:
Ratten mit der Nahrung Kaffeepulver durch Diabetes mellitus signifikant 1. Marnett, L.J.: Oxyradicals and DNA damage.
in unterschiedlichen Mengen. Nach höhere Werte von 8-OxodG gemessen Carcinogenesis 21: 361-370 (2000).
2. Halliwell, B.: Can oxidative DNA damage be
130 Tagen war die Urinkonzentration werden als in der Kontrollgruppe used as a biomarker of cancer risk in hu-
an 8-OxodG bei Ratten mit der kaffee- [112–114]. mans? Problems, resolution and preliminary
haltigen Diät signifikant erhöht ge- results from nutritional supplementation
genüber der Kontrollgruppe. Dieser studies. Free Radical Res 29: 469-486 (1998).
Schlussbemerkungen 3. Dizdaroglu, M.: Chemical determination of
Effekt könnte durch Chlorogensäure, free radical-induced damage to DNA. Free
einem Kaffeebestandteil, entstehen. Der Zusammenhang zwischen Exposi- Radical Bio Med 10: 225-242 (1992).
Es wird diskutiert, dass Chlorogensäu- tion mit reaktiven Sauerstoffspezies 4. Loft, S.; Poulsen, H.E.: Cancer risk and oxida-
re eine prooxidative Wirkung in An- und oxidativer Schädigung der DNA tive DNA damage in man. J Mol Med 74: 297-
312 (1996).
wesenheit von CuCl2 besitzt [101], gilt als gesichert. Reaktive Sauer- 5. Boveris, A.; Chance, B.: The mitochondrial ge-
während ihr in Abwesenheit von stoffspezies werden durch endogene neration of hydrogen peroxide. General pro-
Übergangsmetall-Ionen eine antioxi- und exogene Prozesse gebildet. Trotz perties and effect of hyperbaric oxygen. Bio-
dative Kapazität zugeschrieben wird verschiedener Schutzmechanismen, chem J 134: 707-716 (1973).
6. Sohal, R.S.: Aging, cytochrome oxidase ac-
[118]. wie Reparaturprozesse oder Antioxi- tivity, and hydrogen peroxide release by mit-
danzien, kommt es zu einer Schädi- ochondria. Free Radical Bio Med 14: 583-588
gung der DNA. Die Oxidation der DNA (1993).
Krankheiten führt zu Zellschädigungen, die für de- 7. Wallace, D.C.: Mitochondrial diseases in man
and mouse. Science 283: 1482-1488 (1999).
Oxidative DNA-Schäden wurden im generative Erkrankungen und Krebs 8. Wei, Y.H.; Lu, C.Y.; Lee, H.C.; Pang, C.Y.; Ma,
Zusammenhang mit einer Vielzahl verantwortlich sind. Y.S.: Oxidative damage and mutation to mit-
von immunologischen und kanzero- Oxidative DNA-Addukte können als ochondrial DNA and age-dependent decline
gen Erkrankungen untersucht. So Marker für die Schädigung des Orga- of mitochondrial respiratory function. Ann
NY Acad Sci 854: 155-170 (1998).
wurden Lungen-, Darm- und Brust- nismus durch mutagene und kanzero- 9. Ames, B.N.; Shigenaga, M.K.; Hagen, T.M.:
krebs unter Verwendung verschiede- gene Substanzen verwendet werden. Oxidants, antioxidants, and the degenerative
ner DNA-Modifikationen mittels Das am besten untersuchte oxidative diseases of aging. P Natl Acad Sci USA 90:
GC/MS untersucht. Dabei lagen die DNA-Addukt ist 8-OxodG. 8-OxodG 7915-7922 (1993).
10. Davies, K.J.A.: Oxidative stress: the paradox
Konzentrationen im kanzerogenen führt zu einer G→T-Transversion und of aerobic life. In: Rice-Evans C., Halliwell B.,
Gewebe für die meisten Marker höher ist dadurch die stärkste mutagene Lunt G.G. (eds.): Free Radicals and Oxidative
als in gesundem Gewebe [102–105]. Base, die besonders in tumorrelevan- Stress: Environment, Drugs and Food Additi-
Dagegen konnten mit HPLC-ECD kei- ten Genen gefunden wird. Es existie- ves, Portland Press, London 1-31 (1995).
11. Ji, L.L.; Leeuwenburgh, C.; Leichtweis, S.;
ne signifikanten Unterschiede der ren noch weitere DNA-Modifikatio- Gore, M.; Fiebig, R.; Hollander, J.; Bejma, J.:
8-OxodG-Konzentration in Geweben nen, die aber bisher kaum untersucht Oxidative stress and aging. Role of exercise
Ernährungs-Umschau 51 (2004) Heft 5 183Übersicht
smoking, gender and body mass index. Car-
Zusammenfassung cinogenesis 13: 2241-2247 (1992).
34. Loft, S.; Poulsen, H.E.: Markers of oxidative
Nachweis von DNA-Schäden mittels Analyse von oxidierten Nukleosiden und damage to DNA: antioxidants and molecular
deren Anwendung als Biomarker damage. Method Enzymol 300: 166-184
A. Wagner, G. Jahreis, Jena (1999).
35. Croteau, D.L.; Bohr, V.A.: Repair of oxidative
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) werden kontinuierlich in den Zellen durch en- damage to nuclear and mitochondrial DNA
dogene und exogene Prozesse gebildet. Die reaktivste Sauerstoffspezies ist das in mammalian cells. J Biol Chem 272: 25409-
25412 (1997).
Hydroxyl-Radikal. Infolge einer unzureichenden antioxidativen Abwehr der ROS 36. Floyd, R.A.: Antioxidants, oxidative stress,
kommt es zur Schädigung der DNA. Im Tierexperiment wurde die oxidative and degenerative neurological disorders.
Schädigung der DNA als ein wichtiger Faktor in der Kanzerogenese nachgewie- Proc Soc Exp Biol Med 222: 236-245 (1999).
sen. Da nicht alle oxidativen Schäden beseitigt werden, kommt es altersabhän- 37. Kasai, H.: Analysis of a form of oxidative DNA
gig zur Akkumulation der geschädigten Nukleoside. Die Reparaturprodukte der damage, 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine, as a
marker of cellular oxidative stress during car-
oxidativen Schädigung werden renal ausgeschieden. Die in diesem Zusammen- cinogenesis. Mutat Res 387: 146-163 (1997).
hang häufigste DNA-Modifikation betrifft die Bildung von 8-Oxo-2’-deoxygua- 38. Ottender, M.; Lutz, W.K.: Correlation of DNA
nosin (8-OxodG). Sie ist auch die am stärksten mutagene DNA-Schädigung. Die adduct levels with tumor incidence: carcino-
oxidierten DNA-Basen und Nukleoside dienen als Biomarker für das Ausmaß der genic potency of DNA adducts. Mutat Res
DNA-Schädigung. Die Biomarker reflektieren die Schädigungsrate in bestimm- 424: 237-247 (1999).
39. Wang, D.; Kreutzer, D.A.; Essigmann, J.M.:
ten Zielorganen oder die Reparaturrate der mit dem Urin ausgeschiedenen Mutagenicity and repair of oxidative DNA
DNA-Modifikationen. Es besteht eine direkte Korrelation der Ausscheidungsra- damage: insights from studies using defined
te von 8-OxodG mit der Stoffwechselaktivität, einer Hauptquelle des endoge- lesions. Mutat Res 400: 99-115 (1998).
nen oxidativen Stresses. In verschiedenen Studien wurden widersprüchliche Er- 40. Shibutani, S.; Takeshita, M.; Grollman, A.P.:
gebnisse in Bezug auf eine Energiereduzierung bzw. eine Nahrungs-Supplemen- Insertion of specific bases during DNA syn-
thesis past the oxidation damaged base 8-
tation mit Antioxidantien erzielt. Anhand der Datenlage gilt als gesichert, dass oxod G. Nature 349: 431-434 (1991).
eine Ernährung mit Obst und Gemüse zu einer Konzentrationsminderung von 41. Kuchino, Y.; Mori, F.; Kasai, H.; Inoue, H.; Iwai,
8-OxodG im Urin führt. Eine fettarme Ernährung reduziert in den Leukozyten S.; Miura, K.; Ohtsuka, E.; Nishimura, S.: Mis-
die Konzentration von 5-Hydroxymethyl-Uracil, einem weiteren Biomarker des reading of DNA templates containing 8-hy-
oxidativen Stresses. Die oxidativen DNA-Modifkationen werden außerdem als droxydeoxyguanosine at the modified base
and at adjacent residues. Nature 327: 77-79
Biomarker im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheiten und Krebsarten (1987).
untersucht. 42. Kamiya, H.; Murata-Kamiya, N.; Fujimuro,
M.; Kido, K.; Inoue, H.; Nishimura, S.; Masuta-
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186 Ernährungs-Umschau 51 (2004) Heft 5Sie können auch lesen
