Holz - ein natürlicher Werkstoff mit antibakteriellen Eigenschaften? - Annett Milling
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Holz – ein natürlicher Werkstoff mit
antibakteriellen Eigenschaften?
Vergleichende Untersuchungen zum Überleben von
Bakterien auf Holz und Kunststoff mit
mikrobiologischen und molekularen Methoden
Annett Milling
Roh- und Werkstoff Holz
Holzverwendung:
• Baustoff (Fundamentpfähle,
Bauteile)
• Bauhilfsstoff (Schalungen,
Gerüste)
• Fenster, Türen, Treppen,
Fußböden, Möbel
• Werkstoff (Sperrholz,
Spanplatten)
• Chemierohstoff
• Energieträger
Kernholz
Phloem • Schneidunterlagen,
Splint
Rinde Kambium Küchengeräte
• Verpackungs- und
Aufbau des Stammes Transportmittel (Kisten,
Fässer, Paletten)
Hygienestatus
Holz ist unhygienisch
stets höhere Keimgehalte auf Holzflächen im Vergleich zu Kunststoff und
Metall vor und nach Einsatz von Reinigungs- und Desinfektionsmitteln
Problem: Holz ist porös und hygroskopisch
weitgehendes Verbot von Holz im Lebensmittelsektor
• Fleischhygiene-Verordnung (FlHV)
• Geflügelfleischmindestanforderungen- Verordnung (GFlMindV)
• Fleischerzeugnis-Richtlinie 92/5/EWG vom Februar 1992
Hygienestatus
Holz ist hygienisch
Studie von Ak et al. (1994)
Food Research Inst., University of Wisconsin – Madison
• Geringere Keimbelastung von Holz- im Vergleich zu
Kunststoffbrettchen
• Keimreduktion an Holzoberflächen bereits nach wenigen Minuten
• Gute Reinigung von Holzbrettchen
Fragestellungen 1. Überleben Testbakterien auf und im Holz, und von welchen Parametern ist ihr Überleben auf dem Holz abhängig? 2. Sind die Bakterien auf und im Holz abgestorben oder nur inaktiviert bzw. in ihren Lebensfunktionen eingeschränkt? 3. Wie wird das Überleben bakterieller Gemeinschaften durch Holz beeinflusst? 4. Sind die Laborergebnisse in die Praxis übertragbar?
Experimentelle Herangehensweise
Umfassende systematische Analyse der Interaktionen zwischen
Bakterien und Holz durch völlig neue experimentelle Herangehensweise:
Analyse: kultivierungsabhängig
kultivierungsunabhängig
Material: Holz (Pinus silvestris L., Picea abies Karst., Larix decidua
Mill., Acer pseudoplatanus L., Fagus silvatica L., Quercus
robur L., Populus nigra L.)
Kunststoff (Polyethylen (PE))
Materialzustand: Sägespäne, Sägemehl
Brettchen
Bakterien: Escherichia coli pIE639 (sat3)
Enterococcus faecium (vanA)
Hühnergülle (bakterielle Gemeinschaft)
Experimentelle Herangehensweise
Inokulation mit E. coli Inkubation
oder E. faecium Ablösung
der
Bakterien
durch
Behandlung
im
Stomacher-
Blender
Kultivierungsabhängige
Kultivierungsabhängige Kultivierungsunabhängige
Analyse
Analyse Analyse
Plattierung auf Plate Count Extraktion der Gesamt-DNA aus einem
Agar mit Antibiotika Bakterienpellet (und Aufreinigung)
Bestimmung der Keimzahl PCR-Amplifikation Agarose-Gelelektrophorese
Southern Blot
Hybridisierung
Bakterienverteilung nach Inokulation
Kiefer nach 2 h
Polyethylen nach 2 h
CLSM-Aufnahmen: Dr. Monika Götz
Überleben von E. coli pIE639 auf Holz und Kunststoff
9
8
7
Titer (log10 CFU/g)
6
0h
5 24 h
48 h
4 96 h
216 h
3
2
1
0
Kiefer Fichte Lärche Ahorn Buche Eiche Pappel PE
Überleben von E. coli pIE639
Kiefer Fichte Lärche Pappel Polyethylen
216 h
216 h
216 h
216 h
216 h
48 h
96 h
48 h
96 h
24 h
96 h
48 h
96 h
24 h
48 h
24 h
48 h
96 h
24 h
24 h
0h
0h
0h
0h
0h
M M M M
E.coli
a)
b)
c)
a) Agarosegel der Roh-DNA
b) Southern Blot der Roh-DNA nach Hybridisierung mit sat3
c) Southern Blot der PCR-Produkte nach Hybridisierung mit sat3Überleben von E. coli pIE639 auf Kiefernholz
10
9
8
Titer (log10 CFU/g)
0h
7
4h
6
7h
5
12 h
4
24 h
3
48 h
2
1
0
20 50 100 300
300 Ausgangsholzfeuchte (%)
250
Holzfeuchte (%)
0h
200 4h
7h
150
12 h
100 24 h
48 h
50
0
20 50 100 300
Ausgangsholzfeuchte (%)Überleben von E. coli und E. faecium auf Kiefernholz und Kunststoff
9
8
7
Titer (log10 CFU/g)
6 0h
4h
5 8h
11 h
4 24 h
48 h
3 168 h
2
1
0
Kiefer Kiefer PE PE
+ + + +
E. coli E. faecium E. coli E. faeciumExperimentelle Herangehensweise
Inokulation mit Inkubation
Hühnergülle Ablösung
der
Bakterien
durch
Behandlung
im
Stomacher-
Blender
Kultivierungsabhängige Kultivierungsunabhängige
Analyse Analyse
Plattierung auf Universal- und Extraktion der Gesamt-DNA aus einem
Selektivnährmedien Bakterienpellet und Aufreinigung
Bestimmung der Keimzahl PCR-DGGE mit universellen und
gruppenspezifischen Primern
Bandenextraktion, Klonierung, SequenzierungInokulation verschiedener Hölzer und Kunststoff mit Hühnergülle
6
5
Titer (log 10 CFU/g)
0h
4
1h
24 h
3
72 h
144 h
2
192 h
1
0
Kiefer Lärche Ahorn PEInokulation verschiedener Hölzer und Kunststoff mit Hühnergülle
6
5
Titer (log 10 CFU/g)
0h
4
1h
24 h
Kiefer 3
72 h
144 h
2
192 h
1
0
total CFU Enterobakterien Streptokokken Enterokokken
6
5
Titer (log 10 CFU/g)
0h
4
1h
24 h
3
72 h
Polyethylen 144 h
2 192 h
1
0
total CFU Enterobakterien Streptokokken EnterokokkenInokulation verschiedener Hölzer und Kunststoff mit Hühnergülle
Kiefer Lärche Ahorn Polyethylen
216 h
216 h
216 h
216 h
216 h
216 h
216 h
216 h
Gülle
72 h
72 h
72 h
72 h
72 h
72 h
72 h
72 h
1h
1h
1h
1h
1h
1h
1h
1h
M M
A--
C--
B--
DGGE von 16S rDNA-Fragmenten für
A: nicht-kult. Gram-pos. Bakterium aus
Bakterien (E.coli: 968-1401)
dem Hühnerdarm (98,9%)
B: Brachybacterium tyrofermentas (99,7%)
C: Moraxella sp. (100 %)Inokulation verschiedener Hölzer und Kunststoff mit Hühnergülle
40 50 60 70 80 90 100
Lärche 1 – 1 h
PE 1 – 1 h
Lärche 1 – 72 h
Ahorn 2- 1 h
Kiefer 1 – 216 h
Kiefer 2 – 216 h
Kiefer 2 – 72 h
Kiefer 1 – 72 h
Lärche 1 – 216 h
Lärche 2 – 216 h
Lärche 2 – 1 h
Lärche 2 – 72 h
Kiefer 1 – 1 h
Gülle
Ahorn 2 – 72 h
PE 2 – 1 h
Ahorn 1 – 72 h
Ahorn 1 – 1 h
Ahorn 1 – 216 h
Ahorn 2 – 216 h
Kiefer 2 – 1 h
PE 1 – 216 h
PE 2 – 216 h
PE 1 – 72 h
PE 2 – 72 hCharakterisierung der antibakteriellen Wirkung von Holz Physikalische und chemische Erklärungsansätze: Bakterien werden nur durch rein physikalische Kräfte in den Holzporen festgehalten. Ein „scheinbarer Keimabbau“ findet durch eine Verlagerung der Bakterien von der Oberfläche in tiefere Holzschichten statt. Das poröse und hygroskopische Holz entzieht den Bakterien das für ihre Lebensaktivität und Vermehrung benötigte Wasser und tötet diese dadurch ab. Holzinhaltsstoffe wirken antibakteriell.
Überleben von E. coli pIE639 auf Holz und Kunststoff
9
8
7
Titer (log10 CFU/g)
6
0h
5 24 h
48 h
4 96 h
216 h
3
2
1
0
Kiefer Fichte Lärche Ahorn Buche Eiche Pappel PECharakterisierung der antibakteriellen Wirkung von Holz Physikalische und chemische Erklärungsansätze: Das poröse und hygroskopische Holz entzieht den Bakterien das für ihre Lebensaktivität und Vermehrung benötigte Wasser und tötet diese dadurch ab. Holzinhaltsstoffe wirken antibakteriell.
Charakterisierung der antibakteriellen Wirkung von Holz
Holzart Alkohol- Ether- Holzart Ethanol-
Benzol- Extrakte Extrakt
Extrakte [%] [%]
[%]
Europ. 2,34 0,78 Tanne 2
Fichte
Kiefer 3,32 1,92 Fichte 2,5
Kiefer-Splint 3,47 - Lärche 4,5
Kiefer-Kern 5,88 - Kiefer 9
Hainbuche 1,99 - Rotbuche 1,5
Gemeine 1,20 0,31 Esche 3
Buche
Spitzahorn 2,02 0,45 Ahorn 3
Bergahorn 2,45 - Pappel 3,5
Eiche - 0,72 Birke 3,5
Eiche-Splint 2,4 - Erle 5
Eiche-Kern 4,4 - Nussbaum 5
Linde 10
Robinie 11
Eiche 12
Extraktstoffgehalte einiger Laub- und Nadelholzarten (Fengel und Grosser 1975,
Dix und Marutzky 1987, Kubel et al. 1988, Lange et al. 1989, Lange 1995)Charakterisierung der antibakteriellen Wirkung von Holz
ÜN–Kultur + Extrakt
Holzspäne Inkubation, ÜN, 37°C
+
Wasser + Tetrazoliumchlorid
Inkubation, 30 min, 37°C
Heißwasser-
extraktion OD-Messung
(2 h, 80°C)
TA
K F L B P E
W 1 5 10
109 CFU/ml
108 CFU/mlWirkung von Heißwasserextrakten auf E. coli pIE639
1,2
1
0,8
OD595nm
0,6
0,4
0,2
0
te
he
he
el
e
re
r
r
z
se
fe
ol
ur
pp
ch
äu
rc
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B
W
er
in
i
nn
nn
K
r-
Ta
Ta
fe
ie
%
%
K
10
5
Inokulation: 109 CFU/mlWirkung von Heißwasserextrakten auf E. faecium
0,12
0,1
0,08
OD595nm
0,06
0,04
0,02
0
te
he
he
el
e
re
r
r
z
se
fe
ol
ur
pp
ch
äu
rc
uc
ie
nh
as
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Fi
Lä
ns
K
B
W
er
in
i
nn
nn
K
r-
Ta
Ta
fe
ie
%
%
K
10
5
Inokulation: 106 CFU/mlCharakterisierung der antibakteriellen Wirkung
10
9
8
7
Titer (log10 CFU/g)
6 0h
24 h
5
48 h
4 72 h
3
2
1
0
Kiefer Kiefer nach Buche Buche nach
Leaching LeachingZusammenfassung Die hygienischen Eigenschaften von Holz können nicht universell eingeschätzt, sondern müssen differenziert beurteilt werden. Die hygienischen Eigenschaften von Holz hängen hauptsächlich von der Holzart selbst ab, aber auch von anderen Faktoren wie der Art und Konzentration der Bakterien, der Holzfeuchte, den Umgebungstemperaturen und der relativen Luftfeuchte. Für Kiefern- und Eichenholz konnten eindeutig antibakterielle Eigenschaften nachgewiesen werden hygienischer Vorteil gegenüber anderen Holzarten und Kunststoff. Die Entwicklung der DNA-Gehalte auf den Holz- und Kunststoffspänen korrelierte mit den ermittelten Keimzahlen. Die antibakterielle Wirkung von Kiefernholz wurde kultivierungs- unabhängig bestätigt.
Zusammenfassung Die DGGE-Profile machten eine Dynamik in der Struktur der bakteriellen Gemeinschaft der Hühnergülle besonders auf Kiefernholz- und Kunststoffspänen während der Inkubation deutlich. Die Ergebnisse, die in den Untersuchungen zum Überleben von Bakterien auf Holzspänen gewonnen wurden, waren tendenziell auf das Überleben von Bakterien auf kompakten Flächen übertragbar. Neben der hygroskopischen Wirkung von Holz konnte auch die Beteiligung von Holzinhaltsstoffen an der antibakteriellen Wirkung nachgewiesen werden.
Ausblick Auch in der Praxis konnten die guten hygienischen Eigenschaften von Produkten aus Kiefernholz bestätigt werden.
Danksagung Heinrich Wilms Fa. Gustav Wilms Holzverpackungen, Bad Essen-Barkhausen Dr. Helmut Steinkamp Deutsches Institut für Lebensmitteltechnik e.V., Quakenbrück PD Dr. Kornelia Smalla, BBA, Braunschweig Dr. Rolf Kehr, BBA, Braunschweig Arbeitsgruppe Smalla
Pinus sylvestris L. (Gemeine Kiefer)
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