NAME DER FIRMA / TITEL DER PRÄSENTATION - BFARM IM DIALOG, BONN, 26. APRIL 2016 PYRROLIZIDINALKALOIDE - AKTUELLER STAND ANALYTISCHER METHODEN
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Dr. Bernhard Klier, PhytoLab Name der Firma / Titel der Präsentation BfArM im Dialog, Bonn, 26. April 2016 Pyrrolizidinalkaloide – Aktueller Stand analytischer Methoden
Pyrrolizidinalkaloide –
Aktueller Stand analytischer
Methoden
Inhalt
Einleitung
Anhang Stufenplan 1992
Mitteilung Nr. 002/2016 des BfR
Die BfR Methode
(Durchführung, Prüfumfang, Validierungsdaten)
Anforderungen an die Analytik
Zusammenfassung
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 2
Einleitung
In der Bekanntmachung des BfArM vom 1. März 2016 wird auf die
Verunreinigung von Chargen durch PA-haltige Beikräuter
aufmerksam gemacht, die bei der Ernte als Verunreinigungen in
die jeweiligen Chargen gelangen.
Eine zeitnahe Lösung kann durch landwirtschaftliche Maßnahmen
alleine nicht sichergestellt werden, sondern erfordert eine
verstärkte Kontrolle. Die Pharmazeutischen Unternehmer werden
aufgefordert produktspezifisch Prüfungen durchzuführen.
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 3
Einleitung
Die Prüfhäufigkeiten richten sich nach der Kontaminationsproble-
matik (sehr gering/keine, geringe, relevante).
Der vorläufig akzeptierte Grenzwert liegt bei 1,0 µg PA bezogen
auf die Tagesdosis (Ziel: 0,35 µg/kg).
Bezüglich der analytischen Prüfungen sind der Anhang des
Stufenplans vom 5. Juni 1992 und die Mitteilung Nr. 002/2016
des BfR vom 05.01.2016 zu berücksichtigen.
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 4Anhang Stufenplan vom 5. Juni 1992
Mitteilung Nr. 002/2016 des BfR
Die BfR Methode
(Durchführung, Prüfumfang, Validierungsdaten)
Anforderungen an die Analytik
Zusammenfassung
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 5Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 6
Anhang Stufenplan vom 5. Juni 1992
I. Prüfung
Anforderungen an Prüfverfahren und die Dokumentation der Qualitäts-
sicherung
- Angemessene Probenziehung
- Angemessene Probenvorbereitung
- Exakte Beschreibung und Belege zur Probenaufarbeitung
- Beschreibung des Prinzips der Analysenmethode
- Beschreibung und Belege zur Validierung des Prüfverfahrens einschließlich
Selektivität
Linearität
Präzision
Wiederfindungsrate
- Nachweisgrenze
- Nachweis der Identität, Qualität und Eignung der notwendigen bzw. eingesetzten
Referenzsubstanzen
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 7Anhang Stufenplan vom 5. Juni 1992
„ … Die gewählte Analysenmethode muß a l l e eventuell in
Ausgangsstoff (Droge, Extrakt, Urtinktur etc.) vorkommenden
Pyrrolizidin-Alkaloide mit 1,2-ungesättigtem Necingerüst
einschließlich ihrer N-Oxide erfassen. Dabei muß auch dem
Auftreten chemischer Rassen Rechnung getragen werden.“
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 8Zusammenfassung / Bewertung
die Anforderungen an die Analytik sind klar und ausreichend
definiert
der Fokus ist hier auf die Analytik von PA –haltigen Pflanzen
ausgerichtet
das Erfassen aller vorkommender PA in einer PA-haltigen
Pflanze ist analytisch anspruchsvoll
bei der Analytik von Verunreinigungen durch PA-haltige Bei-
kräuter ist dies nur bedingt möglich bzw. vielleicht auch nicht
unbedingt notwendig (BG)
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 9Anhang Stufenplan vom 5. Juni 1992
Mitteilung Nr. 002/2016 des BfR
Die BfR Methode
(Durchführung, Prüfumfang, Validierungsdaten)
Anforderungen an die Analytik
Zusammenfassung
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 10Vorläufige Empfehlung des BfR zur Analytik von PA in
Kräutertee und Tee
(Analytspektrum und Probenahmeverfahren)
Für die Ermittlung des PA-Summengehaltes empfohlenes
Analytspektrum
- Spektrum richtet sich nach den derzeit verfügbaren Standardsubstanzen (bis zu 35)
- Auswahl ausschließlich auf Basis aktueller Datenbasis (466 Kräutertees und Tees)
mindestens 21 PAs
- toxikologisches Potential der Substanzen wurde nicht berücksichtigt
- potentielle PA-Markersubstanzen aus der Literatur („Scientific Opinion on
Pyrrolizidine alkaloids in food and feed“ der EFSA, 2011)
- Methode BfR-PA-Tee-2.0/2014 (im internationalen Ringversuch validiert)
- weitere PA, die derzeit noch nicht als Standardsubstanzen verfügbar sind und
möglicherweise große Bedeutung bzgl. des Gesamt-PA-Gehaltes in Proben
bestimmter Teesorten haben können
Anpassung des PA-Analytspektrums
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 11Vorläufige Empfehlung des BfR zur Analytik von PA in
Kräutertee und Tee
(Analytspektrum und Probenahmeverfahren)
Empfehlung des Probenahmeverfahrens für die Bestimmung von PA in
Kräutertee und Tee
- Probenahme-Empfehlung der EFSA für Monitoring von PA in Lebensmitteln
- Probenahme nach den Kriterien der Probenahme für die amtliche Kontrolle von
Aflatoxinen in Gewürzen
Verordnung (EG) Nr. 401/2006, Anhang I, E.4
- Analogie in der ungleichmäßigen Verteilung (Spotkontamination)
- Optimierung der vorläufigen Vorgehensweise, wenn Repräsentativität der Probe
für die zugehörige Charge mit experimentellen Daten belegt wurde
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 12Anhang Stufenplan vom 5. Juni 1992
Mitteilung Nr. 002/2016 des BfR
Die BfR Methode
(Durchführung, Prüfumfang, Validierungsdaten)
Anforderungen an die Analytik
Zusammenfassung
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 13Methode BfR-PA-Tee-2.0/2014
http://www.bfr.bund.de/cm/343/bestimmung-
von-pyrrolizidinalkaloiden.pdf
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 14Methode BfR-PA-Tee-2.0/2014
- Probenzerkleinerung auf mindestens 0,5 mm (0,25 mm, wenn möglich)
- Einwaage 2,0 g
- doppelte saure Extraktion (0,05 M Schwefelsäure)
- cleanup mit SPE
- chromatographische Trennung mit RP18-HPLC-Säule
chromatographische Bedingungen (Geräte, Säulen, Gradienten)
können frei gewählt werden
- Detektion mittels Triple Stage Quadrupole Massenspektrometrie
(HPLC-ESI-MS/MS mit scheduled Multi-Reaction-Monitoring = sMRM)
Die Messungen können mit MS/MS-Geräten verschiedener Hersteller
durchgeführt werden
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 15Methode BfR-PA-Tee-2.0/2014
- Kalibrierung über eine Matrix-Standardreihe (Matrix matched standard)
- Mindestretentionszeit beträgt das doppelte der RT für das Totvolumen der
Säule
- Analyten, die nicht massenspektrometrisch unterschieden werden können,
müssen chromatographisch getrennt vorliegen
- für den qualitativen Nachweis sowie für die Quantifizierung ist es erforderlich,
daß pro Analyt mindestens zwei substanzspezifische Übergänge detektiert
und ausgegeben werden können (Quantifier, Qualifier)
- Gerätespezifische Bedingungen und substanzspezifische Parameter (28
Substanzen) sind beispielhaft angegeben
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 16Tandem - Massenspektrometrie
M. Hesse, H. Meier,
B. Zeeh,
Spektroskopische
Methoden in der
organischen Chemie
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 17Triple-Quadrupole
Multiple Reaction Monitoring (MRM)
(2) (3) (4)
(1)
HPLC ESI Quad 1 Quad 2 Quad 3
SIM Fragmentierung SIM
(1) Electrospray Ionisation
(2) nur Ionen mit bestimmen m/z passieren Quad 1
(3) alle Ionen werden in Quad 2 fragmentiert
(4) nur bestimmte Tochterionen werden isoliert und detektiert (Quad 3)
sehr hohe Selektivität und Empflindlichkeit
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 18Methode BfR-PA-Tee-
2.0/2014
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 19Methode BfR-PA-Tee-2.0/2014
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 20Methode BfR-PA-Tee-2.0/2014
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 21Anhang Stufenplan vom 5. Juni 1992
Mitteilung Nr. 002/2016 des BfR
Die BfR Methode
(Durchführung, Prüfumfang, Validierungsdaten)
Anforderungen an die Analytik
Zusammenfassung
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 22Anforderungen an die Analytik
Für die Rückstandsanalytik von Pestiziden sind die Kriterien für eine
valide Analytik definiert (Bezug s. Ph.Eur. 2.8.13):
Guidance document on analytical quality control and validation
procedures for pesticide residues analysis in food and feed
SANTE 11945/2015
implemented by 01/01/2016
Die Vorgehensweise bei der Validierung sowie die Akzeptanzkriterien
für die Validierung wurden festgelegt und können auch auf die
Rückstandsanalytik von Pyrrolizidinalkaloiden angewendet werden.
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 23Mögliche Akzeptanzkriterien für die Validierung
angelehnt an SANTE 11945/2015: Guidance document on analytical quality control and validation procedures
for pesticide residues analysis in food and feed
• In einer „Erstvalidierung“ (initial full validation, vollumfängliche
Validierung) werden an einer repräsentativen Matrix aus jeder
relevanten Matrixgruppe die Validierungskriterien überprüft.
• In „fortlaufenden Leistungsüberprüfungen“ (on-going validation,
extended validation) wird die Robustheit und Zuverlässigkeit der
Methode belegt. Es wird nachgewiesen, daß die Methode auf andere
Matrices der gleichen Matrixgruppe übertragen werden kann.
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 24Initial full
validation
Guidance document on analytical quality control and validation proceduresfor pesticide residues analysis in food and feed
SANTE 11945/2015
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 25extended
validation,
on-going
validation
(z.B. Spezifität
und Richtigkeit
an der BG)
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 26Anhang Stufenplan vom 5. Juni 1992
Mitteilung Nr. 002/2016 des BfR
Die BfR Methode
(Durchführung, Prüfumfang, Validierungsdaten)
Anforderungen an die Analytik
Zusammenfassung
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 27Anforderungen an die Rückstandsanalyse
von Pyrrolizinalkaloiden
• die Analytik soll für sehr viele unterschiedliche Matrices geeignet sein
Matrixeffekte müssen ausgeglichen werden (schwierige Matrix)
• die Methode soll sehr empfindlich sein
• die Methode soll für Routineanalyse geeignet sein
• für eine sichere Quantifizierung werden Referenzsubstanzen benötigt
(es gibt mehr als 660 bekannte PA (Diastereomere, isobare Verbindungen); neben den
Alkaloiden kommen auch sehr viele N-Oxide vor)
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 28Zusammenfassung
Die LC-MS/MS Targetmethode ist eine in der Rückstandsanalytik
etablierte Routinemethode und auch für die Analytik von PA sehr gut
geeignet (Strukturinformation, Empfindlichkeit, reproduzierbare
Ergebnisse)
Die vom BfR publizierte Methode ist eine mögliche Ausprägung der
Methode, die im internationalen Ringversuch validiert wurde. In einem
zweiten Ringversuch werden weitere Optimierungen der Methode
ermittelt.
Neben der vom BfR vorgeschlagenen Methode sind in der Praxis
auch andere, validierte LC-MS/MS Methoden geeignet (z. B. andere
Probenvorbereitung und/oder andere Messbedingungen).
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 29Zusammenfassung
Es werden nur Substanzen quantitativ sicher erfaßt, für die auch
Referenzstandards vorliegen.
Der Prüfumfang deckt nach den heutigen Kenntnissen viele für die
Verunreinigungsthematik relevante Substanzen ab. Weitere
Kenntnisse über Beikräuter und weitere relevante PA sind trotzdem
erforderlich.
Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 30Vielen Dank!
Vielen Dank!
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Dutendorfer Straße 5-7
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Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 31Copyright and liability
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Dr. Bernhard Klier, Pyrrolizidin Alkaloide 26.04.2016 32Sie können auch lesen
