Praktikum Biophysik Studiengang Medizintechnik Versuch: BP04: DNS-Schmelzkurve
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Fachhochschule Gießen-Friedberg
Praktikum Biophysik Versuch BP04: DNA-Schmelzkurve
Prof. Dr. K. Zink / C. Müller Stand: WS06
Praktikum Biophysik
Studiengang Medizintechnik
Versuch:
BP04: DNS-Schmelzkurve
Fachhochschule Gießen-Friedberg
Fachbereich KMUB
Prof. Dr. Heimrich / Prof. Dr. Zink
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Praktikum Biophysik Versuch BP04: DNA-Schmelzkurve
Prof. Dr. K. Zink / C. Müller Stand: WS06
Inhaltsverzeichnis
1. Zielsetzung ........................................................................................................................... 2
2. Grundlagen........................................................................................................................... 2
2.1 DNS-Molekül.................................................................................................................. 2
2.2 Fluoreszenzeigenschaften der DNS beim Schmelzvorgang ................................. 3
2.3 Bouguer-Lambert-Beer-Gesetz .................................................................................. 4
3. Experimenteller Aufbau...................................................................................................... 6
3.1 Monochromator ............................................................................................................. 7
4. Versuchsdurchführung ....................................................................................................... 8
5. Auswertung .......................................................................................................................... 9
6. Fragen zu Vorbereitung ..................................................................................................... 9
7. Literatur............................................................................................................................... 10
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1. Zielsetzung
Die Bestimmung der DNS-Schmelzkurve ist in der Analytik eine Möglichkeit auf die
Zusammensetzung sowie auf die Stabilität der DNS zu schließen. Dabei ist eine di-
rekte Bestimmung des Guanin-Cytosin-Gehaltes möglich.
Mit diesem Versuch soll die photometrische Bestimmung des GC-Gehaltes kennen
gelernt und die dazugehörigen physikalischen Effekte verstanden werden.
2. Grundlagen
2.1 DNS-Molekül
Die Desoxyribonukleinsäure (DNS) ist nach Watson und Crick ein langes, fadenför-
miges Makromolekül mit einer Doppelhelix-Struktur und besteht aus zwei komple-
mentären Strängen, die aus Desoxyribonucleotiden aufgebaut sind. Diese sind aus
einer Base, einem Zucker und einer Phosphatgruppe aufgebaut.
Die Basen sind die Träger der genetischen Information und sind jeweils paarweise
angeordnet. Ein Basenpaar wird aus einer der Purinbase Adenin (A) und Guanin (G)
und einer der Pyrimidinbasen Thymin (T) und Cytosin (C) gebildet, wobei immer nur
Adenin mit Thymin und Cytosin mit Guanin eine Bindung eingeht. Die jeweils kom-
plementären Basen sind über Wasserstoffbrückenbindungen miteinander verknüpft.
Die AT-Paarung verfügt über zwei Wasserstoffbrücken, während die GC-Paarung
drei Wasserstoffbrücken aufweist.
Die Stabilität der DNS in Querrichtung erhöht sich mit dem prozentualen Anteil an
GC-Nukleotidpaaren. Die Zucker- und Phosphatgruppen stabilisieren in Längs-
richtung.
Abbildung 1: DNS-Modell [2]
Der prozentuale Anteil von Thymin einer gegebenen DNS ist aufgrund der Basen-
paarungsregeln gleich dem Gehalt an Adenin und der Prozentgehalt an Guanin ist
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gleich dem an Cytosin. Nach der so genannten Chargaff-Regel1 kann die prozentuale
Basenzusammensetzung jeder DNS eindeutig bestimmt werden, wenn der prozentu-
ale Anteil einer der Basen bekannt ist. Der GC-Gehalt ist eine charakteristische Grö-
ße und dient als ein Kriterium für die Einordnung von Organismen (Taxonomie). Ein
hoher GC-Gehalt ist eine Eigenschaft mikrobiologischer DNS.
2.2 Fluoreszenzeigenschaften der DNS beim Schmelzvorgang
Die DNS-Schmelzkurve dient zur Analyse des Mengenverhältnisses der vier Basen
mit Hilfe der Absorptionsspektroskopie. Dabei wird die Eigenschaft, dass sich die
Basenpaare bei unterschiedlichen Temperaturen unterschiedlich stark anziehen,
ausgenutzt. Der Bereich, in dem mehr AT-Gehalt vorhanden ist, löst schneller seine
Verbindung als der Bereich mit einem höheren Gehalt an GC-Verbindungen.
T / °C
Abbildung 2: Schmelzvorgang bei der DNS [3]
Bei Raumtemperatur bzw. Körpertemperatur liegen die Basenpaare eng beieinander
und können wenig Licht absorbieren (so genannter Hypochromieeffekt). Der Grund
hierfür ist die Wechselwirkung der π-Elektronen zwischen den einzelnen Ebenen.
Diese Elektronenwolken hindern sich gegenseitig, Photonen zu absorbieren. Durch
Erhitzen einer DNS-Probe, lösen sich die Wasserstoffbrücken und die beiden Strän-
ge der DNS-Doppelhelix trennen sich voneinander, wobei die AT-Bindungen auf
Grund der schwächeren Bindung zuerst aufbrechen. Der Schmelzpunkt der DNS
wird also durch den GC-Gehalt bestimmt. Die Basenpaare bilden somit eine größere
Absorptionsfläche für das einfallende Licht (Hyperchromie).
1
Chargaff-Regel: Die Gesamtmenge der Pyrimidin-Nukleotide ist immer gleich der Gesamtmenge der
Purin-Nukleotide: T + C = A + G
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Abbildung 3: Hypochromieeffekt beim Denaturieren einer Nukleotid-Doppelhelix [4]. Das Auf-
brechen der Wasserstoffbrücken zwischen den Basenpaaren führt zu einer verstärkten Absorp-
tion im nahen UV-Bereich.
Trägt man die Absorption gegenüber der Temperatur graphisch in einem Koordina-
tensystem auf, erhält man die Schmelzkurve, aus der der Schmelzpunkt Tm bestimmt
werden kann. Der Wert Tm ist charakteristisch für die Mengenverhältnisse der Ba-
senpaare in der DNS-Probe.
2.3 Bouguer-Lambert-Beer-Gesetz
In der Absorptionsspektroskopie wird das Transmissionsvermögen einer Probe un-
tersucht, d.h. es wird der Anteil des Lichts nach durchqueren der Probe detektiert.
Bei zu vernachlässigender Streuung ergibt sie die spektrale Absorption A(λ) aus der
spektralen Transmission T(λ) aus:
A(λ) = 1 – T(λ)
Abbildung 4: Beziehung zwischen Transmission und Absorption [5]
Als Grundlage der Berechnung dient das Gesetz von Bouguer-Lambert-Beer [1].
Darin enthalten ist die Proportionalität der Schwächung des Lichtstroms -dI zur Ein-
strahlintensität I und der Schichtdicke dx des durchlaufenden Mediums:
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− dI ~ I ⋅ dx
Als Proportionalitätsfaktor dient hierbei der Absorptions- bzw. Extinktionskoeffizient2
α (λ ) . Damit ergibt sich:
− dI = α ( λ ) ⋅ I ⋅ dx
Beer bewies zu einem späteren Zeitpunkt die Proportionalität zwischen dem Faktor
α und der Konzentration c. Mit dem Proportionalitätsfaktor α’(λ) so dass gilt:
dI = −α ' ( λ ) ⋅ c ⋅ I ⋅ dx
Nach Integration dieser Gleichung über die Schichtdicke x ergibt sich
I = I 0 ⋅ e −α '( λ )⋅c⋅I ⋅ x
wobei I0 den einfallenden Lichtstrom beschreibt. Konventionellerweise wird die Glei-
chung in dekadischer Form geschrieben. Es folg:
I
log = − log(e) ⋅ α '(λ ) ⋅ c ⋅ x
I0
Aus α’(λ) und log (e) folgt der so genannte molare Extintionskoeffizient ε(λ). Nun er-
gibt sich für die Absorption A(λ):
I0
A(λ ) = log = ε (λ ) ⋅ c ⋅ x
I
Abbildung 5: Schwächung des Lichtstromes I0 durch Materie [1]
2
Extinktion: Strahlungsschwächung
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Für diese Gesetzmäßigkeit gelten drei Vorraussetzungen:
1. Das eingestrahlte Licht muss monochromatisch sein
2. Die absorbierenden Moleküle müssen homogen verteilt sein und zeigen keine
Wechselwirkungen untereinander
3. Streuung und Reflexion sind auszuschließen
3. Experimenteller Aufbau
Die untere Abbildung zeigt einen Ausschnitt des verwendeten
Zwei-Strahl-Photometers. Monochromatisches Licht wird durch Spiegel und einen
klappbaren Spiegel (Chopper) so abgelenkt, dass es nacheinander die beiden Küvet-
ten (zu untersuchende Probe und Referenzlösung) durchquert. Am Ende des Strah-
lengangs befindet sich ein Photomultiplier, der aus dem einfallenden Lichtstrom ei-
nen elektrischen Srom erzeugt. Der Vorteil von Zweistrahlphotometern ist die Mög-
lichkeit der sofortigen Korrektur des Spektrums mit der Referenzprobe.
Abbildung 6: Ausschnitt des Strahlengangs eines Zwei-Strahl-Photometers
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3.1 Monochromator
Um Licht einer bestimmten Wellenlänge zu erhalten, wird in der Regel einen Mo-
nochromator verwendet. Dabei kommt es durch ein Dispersionselement zu einer
spektralen Zerlegung des Lichtes und weiter zu einer Isolierung der gewünschten
Wellenlänge.
Abbildung 7: Monochromator nach Czerny und Turner [6]
Prinzipiell besteht ein Monochromator aus den folgenden Elementen:
• Eintritts- und Austrittsspalt
• Abbildende Elemente (Spiegel oder Linsen), die den Eintritts- auf den Aus-
trittsspalt abbilden;
• Dispersives optisches Element (Gitter oder Prisma)
Der beleuchtete Eintrittsspalt dient als Lichtquelle, die auf den Austrittsspalt abgebil-
det wird. In den meisten Fällen wird die Abbildung so aufgebaut, dass paralleles Licht
auf das Gitter oder das Prisma trifft.
Grundlage für die Dispersion an einem Gitter ist die Welleneigenschaft des Lichts.
Jeder Punkt des beleuchteten Gitters ist Ausgangspunkt von Kugelwellen, die mit-
einander interferieren und zu den bekannten Interferenzmaxima und –minima führen.
Optische Gitter moderner Monochromatoren sind in aller Regel Reflexionsgitter, die
aus einer Glas- oder Metalloberfläche bestehen, in die in gleichmäßigen Abständen
parallele „Gitterfurchen“ eingeritzt sind.
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Abbildung 8: Darstellung der Funktionsweise eines Reflexionsgitters [7]
Die lichtdurchlässigen Zwischenräume auf der Oberfläche des Gitters wirken für die
Primärwelle als Spalte. Die nach dem Huygens’schen Prinzip entstehenden Elemen-
tar- oder Kugelwellen interferieren miteinander, wobei diese sich nur in bestimmten
Raumrichtungen verstärken. Interferenzmaxima entstehen dann, wenn der Gangun-
terschied zwischen den einzelnen Wellen einem ganzzahligen Vielfachen der Wel-
lenlänge entspricht.
4. Versuchsdurchführung
Die Extinktion wird mit einem Perkin-Elmer-Photometer gemessen. Ein temperierba-
rer Küvettenhalter wird mit einem Schnellthermostat über ein Schlauchsystem be-
heizt (bis max. 92°C). Die Temperatur in den Küvetten wird mittels eines Thermo-
elements bestimmt. Die Temperatur kann direkt digital an einem Anzeigegerät abge-
lesen werden.
Es werden zwei DNS-Lösungen hergestellt, eine mit 0,1molarem SSC-Puffer3 und
eine mit 0,01molarem SSC-Puffer. Bei ca. 25°C wird der Anfangswert der Extinktion
genau abgelesen. Zuvor wird das Gerät gegen den Leerpuffer (SSC ohne DNS) ka-
libriert.
Der Leerwert wird während der Messung nicht nachkontrolliert (Es wäre sonst unbe-
dingt darauf zu achten, dass der Küvettenhalter nur dann verschoben wird, wenn
vorher der Thermofühler verschoben wurde). Anschließend wird bis 50°C schnell
erhitzt (Einstellung der Thermostatheizleistung: 1000 Watt). Bei ca. 50°C wird die
Küvette entfernt, vorsichtig umgedreht und etwa entstandene Gasblasen durch Klop-
fen entfernt. Dann wird langsamer (mit ca. 300 Watt) weiter erhitzt, bis der Extinkti-
onsanstieg erfolgt. Dabei wird bei jeder Erhöhung der Temperatur um 1°C abgele-
sen, bis die Extinktion ihr Maximum erreicht hat. Die Kurven werden dann normiert,
und die Extinktion wird gegen die Temperatur aufgetragen.
Bitte bringen Sie eine Diskette zum Versuch mit!!!
3
SSC: Gemisch aus NaCl und Na-Citrat im Verhältnis 10:1 mit einem pH-Wert von 7.
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5. Auswertung
Bestimmen Sie den Gehalt von Guanin-Cytosin in der DNS anhand der
DNS-Schmelzkurve. Für die Berechnung können Sie folgende Gleichung anwenden:
TM = 81,5°C + 16,6 ⋅ log([Na + ]) + 0,41 ⋅ %GC [8]
Beachten Sie hierbei, dass Sie die Na+-Konzentrationen beider SSC-Pufferlösungen
benötigen! In dem Zusammenhang überlegen Sie sich die Form der
DNS-Schmelzkurve und welche Effekte dazu beitragen. Untersuchen Sie den Ein-
fluss verschiedener SSC-Pufferlösungen auf das Schmelzen der DNS. Was fällt auf
und erklären Sie die ablaufenden Prozesse! Wie groß ist die thermische Energie
ausgedrückt in eV, die in dem Versuch der DNA zugeführt wird? Wie groß ist sie im
Vergleich zur Bindungsenergie einer kovalenten chemischen Bindung?
Gehen Sie nach folgendem Ablaufplan vor:
1. Mit einem registrierenden Spektralphotometer wird das UV-Absorptions-
spektrum der vorliegenden DNS-Probe (Kalbsthymus DNS) in 0,1 M
SSC-Puffer im Bereich von 300 bis 230 nm aufgenommen. Das relative Ab-
sorptionsmaximum ist zu bestimmen (λmax).
2. Bei Messung im rel. Absorptionsmaximum λmax (aus 1.) wird die Schmelzkur-
ve der DNS aufgenommen. Der TM -Punkt wird ermittelt.
3. Wiederholen Sie diese Messung für den 0,01 M SSC-Puffer.
6. Fragen zu Vorbereitung
• Wie ist die DNS aufgebaut?
• Überlegen Sie, aus welchem Material die Küvette bestehen muss und warum?
• Welche Rolle spielt der TM-Wert bei der DNS-Schmelzkurve?
• Was besagt das Bouguer-Lambert-Beer’sche Gesetz?
• Was ist der Hypochromieeffekt?
• Wie funktioniert ein Monochromator?
• Erklären sie den Aufbau und die Funktionsweise eines Dispersionselementes.
• Was ist ein Sinustrieb?
• Wie wird die thermische Energie bestimmt?
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7. Literatur
[1] Schmidt, Werner: Optische Spektroskopie, WILEY-VCH Verlag GmbH, 2. Auflage,
Weinheim 2000
[2] University of Wisconsin, Genomic DNS Graphic.
http://whyfiles.org/075genome/index.html (Stand 19.09.2006)
[3] Winter, Roland; Noll Frank: Methoden der Biophysikalischen Chemie, Teubner
Studienbücher Chemie, 1. Auflage, Stuttgart 1998
[4] TU Darmstadt, Praktikum Thermodynamik.
http://www.chemie.tu-darmstadt.de/Fachgebiete/BC/AKDencher/praktikum/thermody
namische_untersuchung.pdf#search=%22Hypochromie%20effekt%22
(Stand 24.09.2006)
[5] Universität Gießen, Übungen und Seminaren in Biochemie.
http://www.vetmed.uni-giessen.de/biochem/Folien/Folie1-11.png
(Stand 9.11.2006)
[6] Chemi Cool, Definition of Wevelength selectors.
http://www.chemicool.com/definition/wavelength_selectors.html
(Stand 10.10.2006)
[7] Kottan-Labs, Measuring Techniques in Optoelectronics.
http://kottan-labs.bgsu.edu/teaching/workshop2001/chapter2.htm
(Stand 10.10.2006)
[8] Lottspeich F., Engels J.W.: Bioanalytik, Elsevier GmbH – Spektrumverlag, 2. Auf-
lage München 2006
Weiterführende Literatur
[9] Tipler, Paul A.: Physik, Spektrum Akademischer Verlag, 2. deutsche Auflage, Hei-
delberg 2004
[10] Zink, Klemens: Script Biophysik Teil 1: Spektroskopische Verfahren in der
Biophysik
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