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Transgene Strategien bei Labortieren Johannes Schenkel Deutsches Krebsforschungszentrum/ Universität Heidelberg
Grenzen des Tiermodells • Menschliche Krankheit im Tier nie vollständig simulierbar: Ergebnisse müssen auf den Men- schen extrapoliert werden • Tiermodelle zeigen selten den menschlichen Zustand komplett - Sie bieten nur Anhaltspunkte für das Ver- ständnis des Krankheitsmechanismus - Ergebnisse müssen an menschlichen Pro- banden verifiziert werden • Größtmögliche Homologie nötig (entsprechend der Darwinschen Theorien)
Die Übertragbarkeit von Ergebnissen • Wird auch vom Maß des Leidens eines Tieres durch das Experiment beeinflusst • Auch Genotyp, Geschlecht, Alter und physiologischer Zustand spielen eine Rolle
3R-Prinzip • Replacement – Ersatz von Tierversuchen • Reduction – Reduktion der Tierversuche auf die notwendigen Versuche • Refinement – Verbesserung der Versuchstierbedingungen und Versuchstechniken – Größtmöglicher Nutzen mit geringstmöglichem Tierverbrauch – Berücksichtigung der Bedürfnisse der Versuchstiere • Remember • Responsibility • Re-assess Standardisierung
Nutzen von GM Tiere • Stabile Mutanten/Technologie • Genregulation • Entwicklung • Krankheiten (Mechanismen/Therapie/Prophylaxe) • Testsysteme • Produktiver Nutzen
Transgene (GM) Tiere gezielte, einmalige, stabile Mutanten Pronukleus Tg homologe Rekombinanten Ort der Integration zufällig, endogene Ort der Integration gezielt, Beeinflussung der Transgenexpression? targeted mutagenesis - Überexprimierer - knock-out Mutanten - knock-down Mutanten - knock-in Mutanten (gene silencing) konditionale Mutanten Virusinduzierte Mutanten, Enzyminduzierte Mutanten reverse genetics (genotypischer Ansatz) ENU-Mutanten, spontane Mutanten forward genetics (phänotypischer Ansatz)
Pronukleus Transgene Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006
Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 200
Schenkel J Transgene Tiere Springer Verla
Targeting Vektor Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006
ES-Zellen Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006
Homologe Rekombination Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006
Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006
Zusammenfassung Technik Funktion Tg Über- Homol. Gain Loss Change expr. Rekomb. Gain of Knock- Tg over- Knock- Gain of function out express. out function Knock- Knock-in Knock-in Knock- down down
Lentiviraler Vektor Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006
Lentiviraler Gentranfer Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006
Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006
Gentherapie, lokaler Gentransfer, AAV nicht krankheitsassoziiert
Enzymatische Generierung von Mutanten (Genome Editing) • ZINC-finger Nucleasen (ZFN) • Transcription Activator‐Like Effector Nucleases (TALEN) – Sequenzspezifische Strangbrüche – Reparaturmechanismus wird aktiviert – Homologe Rekombination möglich • CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR associated) – Mehrfachmutanten
ZFN Genome Editing
GM Tiere mit ZFN
CRISPR/Cas Genome Editing
CRISPR/Cas Genome Editing
Generierung von GM-Tieren mit CRISPR/Cas9
„Phänotypische Mutanten“: ENU • Ethylnitrosourea • Punktmutation AT, ATGC • Alkylierung des Spermatogoniums • Quantitative IVF oder Direktverpaarung • Identifizierung von Phänotypen • Identifizierung von Kandidatengenen für Phänotyp • z.B German Mouse Clinic (GMC) http://www.mouseclinic.de http://www.mousephenotype.org
German Mouse Clinic - Overview • High-throughput primary phenotyping of mouse models since 2001 • Offers phenotyping platform for the scientific community on collaborative basis • Systemic primary screening of mouse models for human diseases covering 14 different disease areas • Mouse models from 172 partners from 19 countries analyzed • Unique feature – Live import and analysis of mutant mouse lines from external partners (logistics for import of up to 2 lines/week) • Mouse line: cohort of 60 animals (30 mutants – 15 males/15 females, littermate controls)
Spontane Mutanten • Häufig durch Zufall entdeckt • Häufig Punktmutation • i.A. auffälliger Phänotyp • Oft ähnlich einer humanen Krankheit, z.B. – gld: generalized lymphoproliferative disease (FasL) – lpr: lymphoproliferation (Fas) – spa: glycine receptor, beta subunit; spastic (Startle Syndrome)
Zuchtschema (Mendel Gesetze) tg+/- x tg-/- 50% tg+/- 50% tg-/- 25% tg+/+ 50% tg+/- 25% tg-/- Cave: 1 von 25.000 Genen Ausgehend von einem mutanten Tier
Charakterisierung transgener Founder • Charakterisierung von mehr als einer „Founder Line“ • tg DNA nachweisbar? Sehr wichtig!! • mRNA Muster (Northern Blot/RT-PCR) • Proteinexpressionsmuster mit brauchbaren Techniken • Phänotyp
Regulatives Element Founderlinie
Transgensexpression in parallelen Founderlinien (WAP-Bcl2) Bcl2 Jäger et al. 1997
Gewebsspezifität des WAP- Promotors in parallelen Linien Western Blot: protein of lactating mammary glands lines 965 and 1182 Jäger 2011
Zygotie • Hemizygotie • Heterozygotie • Homozygotie
Ko-Mutanten (c-Fos) Heterozygot mutiert Homozygot mutiert Grigoriadis et al 1994
Spielt der genetische Hintergrund eine Rolle? Beispiel: MCAo
Modell der MCA Okklusion CCA: arteria carotis communis; ECA: arteria carotis externa; ICA: arteria carotis interna; MCA: arteria cerebri media
Neuronaler Schaden nach Ischämie: Genetischer Hintergrund Martin-Villalba et al. (1999) Fujii et al 1997
Modell der MCA Okklusion CCA: arteria carotis communis; ECA: arteria carotis externa; ICA: arteria carotis interna; MCA: arteria cerebri media
Wichtigste Stammkategorien • Inzuchten • Hybride • Auszuchten • Spontane Mutanten • Gentechnisch veränderte (GM) Tiere • (Genetisch veränderte Tiere) • Congene Tiere • (Coisogene Tiere)
Inzuchten • Homogener genetischer Hintergrund (>99.98%) • Versuchstierkundlich wichtig für standardisierte Versuchsbedingungen • Ergebnis von mindestens 20 Generation Bruder x Schwesterverpaarungen • Gefahr der Generierung von Sublinien
Warum Inzucht? • Große Homologie • Genau definierter genetischer Hintergrund • Einheitliche Reaktionsweise • Statistisch signifikante Aussage wird mit relativ wenigen Tieren erreicht • Wegen des Tiermodellcharakters ist die Inzucht unproblematisch
Fox & Witham 1997
Auszucht • Genetisch heterogen • Für Modelle, die eine statistische Signifikanz benötigen, eher ungeeignet • Für das Tierexperiment unterstützende Verfahren, z.B. Ammen, sehr gut geeignet, da vitale Linien • Inzucht muss vermieden werden
Hybride • F1 Hybride – Nachkommen zweier Inzuchtstämme D2B6F1 DBA/2 Mutter x C57BL/6 Vater B6D2F1 C57BL/6 Mutter x DBA/2 Vater • Inzucht und Vitalität verbunden • Relativ leicht rückkreuzbar auf congenen genetischen Hintergrund
Cave: Geschlechtsreife (Maus) 4 – 5 Wochen Zuchtreife (Maus) 8 – 10 Wochen
Rückkreuzung / Congene Tiere Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006
Substrains Genetische Drift
Undefinierte Substrains: Genetische Drift
Bourdi et al 2011
Konditionale / Induzierbare Mutagenese • knock-outs können zur Letalität führen • knock-outs können zu unerwarteten Reak- tionen führen, vor allem bei Expression des Wildtypgens in verschiedenen Zellen • für das Gene Targeting benötigte Selektionsmarker können den Wirt und den Phänotyp der Mutante beeinflussen • Konditionale / Induzierbare Mutagenese?
Konditionale Mutagenese (cre/loxP, Flp/FRT) • Maus 1: Flankierung des Gens von Interesse: loxP (Locus of cross over (X) in Bakteriophage P1) – durch Sequenzen anderer Spezies – Flankierung homozygot • Maus 2 : Rekombinase (site spe-cific): cre (causes recombination) – Expression im Gewebe des Interesses • Maus 1 x Maus 2: – Inaktivierung des Gens von Interesse in den Rekombinase exprimierenden Zellen • Homöostase bei 37°C • Verlust des Resistenzgens • Effizienz? • Konditionaler knock-in / Aktivierung möglich Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006
cre-Expression cre-Expression häufig schwer regulierbar Rajewsky et al. (1996) J. Clin. Invest 98, 600-603
Reporter-Maus Rosa26 loxP-neomycin-loxP-lacZ ist innerhalb des ubiqiutär exprimierten Locus ROSA26 homolog rekombiniert • Soriano P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Crereporter strain. Nat Genet 1999;21:70-71 Tannour-Louet al. Hepatology 2002 35(5):1072-81
Verpaarungsschema P loxP+/+ cre-/- loxP -/- cre+/- F1 loxP+/- cre+/- loxP+/- cre-/- loxP+/- cre+/- loxP+/- cre-/- F2 loxP-/- cre+/- loxP+/- cre-/- loxP+/- cre+/- loxP+/- cre+/- loxP+/- cre-/- loxP+/+ cre-/- loxP+/- cre+/- loxP+/+ cre+/- loxP-/- cre+/- loxP+/- cre+/- loxP-/- cre+/+ loxP+/- cre+/+ loxP+/+ cre+/- loxP+/- cre+/- loxP+/- cre+/+ loxP+/+ cre+/+ Genetischer Hintergrund wichtig!!
Induzierbare Systeme • Grosse Expressionsveränderungen möglich • Viele Ansätze • Endogene Einflüsse • Anschalten – Stärke? • Ausschalten – Nachweisbarkeitsgrenze? – Restaktivitäten?
Induzierbare Systeme: Tet-on/Tet-off cave: Licht Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006
Induzierbare Systeme: ERT2 cave: Phytooestrogene Masahira et al 2006
Woher Mutanten?
Optimierung der Ausbeuten Importe
No. Embryos/Donor 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 all L=125 E=70629 D=9727 7,26 Iso L=9 E=4037 D=570 7,08 SPF 1 L=21 E=11877 D=1297 9,16 SPF 2 L=2 E=794 D=112 7,09 SPF 3 L=12 E=6302 D=1021 6,17 Facility SPF 4 L=44 E=25334 D=3135 8,08 Conv. 1 L=19 E=11389 D=1757 6,48 Conv. 2 L=4 E=2732 D=335 8,16 Conv. 3 L=14 E=8164 D=1500 5,44 Haltung Andauernder Frühling, strikter Tag-/Nachtrhythmus Wayss et al 2005, Ramin et al 2015
Umwelt Schwab and Schenkel 2008; Diercks et al. 2010
No. Embryos/Donor 0 2 4 6 8 10 12 all L=125 E=70629 D=9727 7,26 BDFn L=18 E=9579 D=1031 9,29 NMRI L=6 E=4835 D=1031 9,12 C57BL/6 L=46 E=26606 D=4408 6,04 Biologische Parameter FVB/N L=8 E=5501 D=783 7,03 Genetic Background CBA L=7 E=4501 D=446 10,09 C3H L=5 E=3086 D=392 7,87 Wayss et al. 2005; Schwab and Schenkel 2008 not known/mixed L=35 E=16521 D=21237 7,73
“Klassische” Haltung Züchter 1 Haltung A Züchter 2 Haltung B Hygienischer Zustand bekannt
Transgene Haltung Haltung 1 Haltung 2 Haltung 3 Haltung 4 Hygienischer Zustand unbekannt Eigenzucht
Sanierung Quarantäne- Zwischen- Zielhaltung bereich haltung Zucht und Haltung der kontaminierten Linie Superovulation und Zucht der Ammen Verpaarung Entnahme von Embryonen aus VP+- Embryotransfer Tieren Bielanski 2014 Austragen und Auf- Kryokonservierte zucht der transferierten Aufbau einer Zucht Embryonen Embryonen
Nomenklatur von Mutanten www.informatics.jax.org http://www.gv-solas.de/ fileadmin/user_upload/pdf_publik ation/Genetik/2018- 10gen_nomenklatur_Ratte- Maus.pdf
Arbeiten mit GM Tieren.... • Gezielte Mutanten von enormen wissenschaftlichem Wert • Sehr aufwändige Generierung und Charakterisierung • Erhebliche Zunahme von genetisch/gentechnisch modifizierten (GM) Mauslinien • Kleine Populationen sehr wertvoller, ingezüchteter Linien • Linien müssen weitergezüchtet werden, auch wenn sie aktuell nicht benötigt werden, sonst: Verlust • Reine Erhaltungszucht aus vielen Gründen nicht vertretbar • Schutz vor unerwartetem Verlust (Unfall, Hygieneeinbruch) • Austausch von Mutanten zwischen verschiedenen Haltungen • Kryokonservierung • Stabile Lagerung und hygienisch einwandfreie Revitalisierung nach Jahren/Jahrzehnten
Kryokonservierung von Embryonen Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006
Revitalisierung Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006 Ramin et al, 2014 and 2015
Kryokonservierung/Spermatozoen Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006
Diercks et al J Vet Sci 2012
Kontaminationsgefahr bei Kryokonservierung Umweltkeime (Maus-) Pathogene verwendete Medien - - LN2 Behälter, oben n=20 + nd LN2 Behälter, Boden n=20 + nd Dryshipper + nd Gasphase Behälter nd nd Raumluft + nd Spermatozoen n=80 - - Embryonen n=28 - - ES-Zellen n=12 - - Kreuzkontamination nd - Wurf nach Embryotransfer - +
Dry shipper Cave: Zoll, Veterinärinspektion, Röntgen
Beispiele transgene Tiermodelle
Startle Syndrom / Hypereclplexie • Neuromotor Krankheit • Postsynaptischer GlyR-beta Gendefekt • Spontane Mausmutante verfügbar (spa) • Rescue experiment verfiziert Mutation • Einfügen des Humanen Homologs in spa/spa Mäuse muittels Transgenese • Phenotyp?
Experimentelles Vorgehen Hartenstein et al. 1996, Becker et al. 2000
Rescue des spa-Phenotyps Hartenstein et al. 1996, Becker et al. 2000
Regulation der Erythropoese: Erythropoetin (EPO) Gassmann Schweiz Arch Tierheilkd. 2001 143(9):455
Leistungsfähigkeit EPO- überexprimierender Mäuse (hohe O2-Transportkapazität) Gassmann Schweiz Arch Tierheilkd. 2001 143(9):455
Transgene Bioreaktoren Jährlicher Bedarf an humanen Proteinen in USA De Boer 1993
Ausbeuten zur Generierung transgener Rinder Krimpenfort et al 1991
Lentiviraler Gentransfer im Rind Hofmann et al Biol Reprod. 2004 71(2):405
Acknowledgements • Anna Schwab, Heidelberg • Heiner Bürgers, Heidelberg/Wien • Ann-Kathrin Diercks, Heidelberg • Michael Staudt, Heidelberg • Michael Ramin, Heidelberg • Theresa Voggenreiter, Heidelberg • Marie Schubert, Heidelberg • Andrea Rausch, Heidelberg • Helmut Eskerski, Heidelberg • Beatrix Imkeit, Heidelberg • Heinrich Steinbauer, Heidelberg • Gefördert durch BfR/ZEBET, BMBF und GDK
Vielen Dank!
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