Transgene Strategien bei Labortieren - Johannes Schenkel Deutsches Krebsforschungszentrum/ - Tübingen2019 Kompatibilitätsmodus
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Transgene Strategien bei
Labortieren
Johannes Schenkel
Deutsches Krebsforschungszentrum/
Universität Heidelberg
Grenzen des Tiermodells
• Menschliche Krankheit im Tier nie vollständig
simulierbar: Ergebnisse müssen auf den Men-
schen extrapoliert werden
• Tiermodelle zeigen selten den menschlichen
Zustand komplett
- Sie bieten nur Anhaltspunkte für das Ver-
ständnis des Krankheitsmechanismus
- Ergebnisse müssen an menschlichen Pro-
banden verifiziert werden
• Größtmögliche Homologie nötig (entsprechend
der Darwinschen Theorien)
Die Übertragbarkeit von
Ergebnissen
• Wird auch vom Maß des Leidens eines
Tieres durch das Experiment beeinflusst
• Auch Genotyp, Geschlecht, Alter und
physiologischer Zustand spielen eine Rolle
3R-Prinzip
• Replacement
– Ersatz von Tierversuchen
• Reduction
– Reduktion der Tierversuche auf die
notwendigen Versuche
• Refinement
– Verbesserung der
Versuchstierbedingungen und
Versuchstechniken
– Größtmöglicher Nutzen mit
geringstmöglichem Tierverbrauch
– Berücksichtigung der Bedürfnisse der
Versuchstiere
• Remember
• Responsibility
• Re-assess
Standardisierung
Nutzen von GM Tiere • Stabile Mutanten/Technologie • Genregulation • Entwicklung • Krankheiten (Mechanismen/Therapie/Prophylaxe) • Testsysteme • Produktiver Nutzen
Transgene (GM) Tiere
gezielte, einmalige, stabile Mutanten
Pronukleus Tg homologe Rekombinanten
Ort der Integration zufällig, endogene Ort der Integration gezielt,
Beeinflussung der Transgenexpression? targeted mutagenesis
- Überexprimierer - knock-out Mutanten
- knock-down Mutanten - knock-in Mutanten
(gene silencing)
konditionale Mutanten
Virusinduzierte Mutanten, Enzyminduzierte Mutanten
reverse genetics (genotypischer Ansatz)
ENU-Mutanten, spontane Mutanten
forward genetics (phänotypischer Ansatz)
Frühe Embryonalentwicklung
Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006
Genkonstrukt
Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006Pronukleus Transgene
Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 200
Schenkel J Transgene Tiere Springer Verla
Targeting Vektor
Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006ES-Zellen
Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006Homologe Rekombination
Schenkel J Transgene Tiere
Springer Verlag 2006Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006
Zusammenfassung Technik Funktion Tg Über- Homol. Gain Loss Change expr. Rekomb. Gain of Knock- Tg over- Knock- Gain of function out express. out function Knock- Knock-in Knock-in Knock- down down
Lentiviraler Vektor
Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006Lentiviraler Gentranfer
Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006
Gentherapie, lokaler Gentransfer, AAV nicht krankheitsassoziiert
Enzymatische Generierung von Mutanten (Genome Editing) • ZINC-finger Nucleasen (ZFN) • Transcription Activator‐Like Effector Nucleases (TALEN) – Sequenzspezifische Strangbrüche – Reparaturmechanismus wird aktiviert – Homologe Rekombination möglich • CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR associated) – Mehrfachmutanten
ZFN Genome Editing
GM Tiere mit ZFN
CRISPR/Cas Genome Editing
CRISPR/Cas Genome Editing
Generierung von GM-Tieren mit
CRISPR/Cas9„Phänotypische Mutanten“: ENU
• Ethylnitrosourea
• Punktmutation AT, ATGC
• Alkylierung des Spermatogoniums
• Quantitative IVF oder Direktverpaarung
• Identifizierung von Phänotypen
• Identifizierung von Kandidatengenen für
Phänotyp
• z.B German Mouse Clinic (GMC)
http://www.mouseclinic.de
http://www.mousephenotype.orgGerman Mouse Clinic - Overview • High-throughput primary phenotyping of mouse models since 2001 • Offers phenotyping platform for the scientific community on collaborative basis • Systemic primary screening of mouse models for human diseases covering 14 different disease areas • Mouse models from 172 partners from 19 countries analyzed • Unique feature – Live import and analysis of mutant mouse lines from external partners (logistics for import of up to 2 lines/week) • Mouse line: cohort of 60 animals (30 mutants – 15 males/15 females, littermate controls)
Spontane Mutanten
• Häufig durch Zufall entdeckt
• Häufig Punktmutation
• i.A. auffälliger Phänotyp
• Oft ähnlich einer humanen Krankheit, z.B.
– gld: generalized lymphoproliferative disease
(FasL)
– lpr: lymphoproliferation (Fas)
– spa: glycine receptor, beta subunit; spastic
(Startle Syndrome)Zuchtschema (Mendel Gesetze)
tg+/- x tg-/-
50% tg+/- 50% tg-/-
25% tg+/+ 50% tg+/- 25% tg-/-
Cave: 1 von 25.000 Genen
Ausgehend von einem mutanten TierCharakterisierung transgener
Founder
• Charakterisierung von mehr als einer
„Founder Line“
• tg DNA nachweisbar? Sehr wichtig!!
• mRNA Muster (Northern Blot/RT-PCR)
• Proteinexpressionsmuster mit
brauchbaren Techniken
• PhänotypRegulatives Element Founderlinie
Transgensexpression in parallelen
Founderlinien (WAP-Bcl2)
Bcl2
Jäger et al. 1997Gewebsspezifität des WAP-
Promotors in parallelen Linien
Western Blot:
protein of lactating
mammary glands lines 965 and 1182
Jäger 2011Zygotie • Hemizygotie • Heterozygotie • Homozygotie
Ko-Mutanten (c-Fos)
Heterozygot mutiert Homozygot mutiert
Grigoriadis et al 1994Spielt der genetische
Hintergrund eine Rolle?
Beispiel: MCAoModell der MCA Okklusion CCA: arteria carotis communis; ECA: arteria carotis externa; ICA: arteria carotis interna; MCA: arteria cerebri media
Neuronaler Schaden nach Ischämie: Genetischer Hintergrund Martin-Villalba et al. (1999) Fujii et al 1997
Modell der MCA Okklusion CCA: arteria carotis communis; ECA: arteria carotis externa; ICA: arteria carotis interna; MCA: arteria cerebri media
Wichtigste Stammkategorien • Inzuchten • Hybride • Auszuchten • Spontane Mutanten • Gentechnisch veränderte (GM) Tiere • (Genetisch veränderte Tiere) • Congene Tiere • (Coisogene Tiere)
Inzuchten • Homogener genetischer Hintergrund (>99.98%) • Versuchstierkundlich wichtig für standardisierte Versuchsbedingungen • Ergebnis von mindestens 20 Generation Bruder x Schwesterverpaarungen • Gefahr der Generierung von Sublinien
Warum Inzucht? • Große Homologie • Genau definierter genetischer Hintergrund • Einheitliche Reaktionsweise • Statistisch signifikante Aussage wird mit relativ wenigen Tieren erreicht • Wegen des Tiermodellcharakters ist die Inzucht unproblematisch
Fox & Witham 1997
Auszucht • Genetisch heterogen • Für Modelle, die eine statistische Signifikanz benötigen, eher ungeeignet • Für das Tierexperiment unterstützende Verfahren, z.B. Ammen, sehr gut geeignet, da vitale Linien • Inzucht muss vermieden werden
Hybride • F1 Hybride – Nachkommen zweier Inzuchtstämme D2B6F1 DBA/2 Mutter x C57BL/6 Vater B6D2F1 C57BL/6 Mutter x DBA/2 Vater • Inzucht und Vitalität verbunden • Relativ leicht rückkreuzbar auf congenen genetischen Hintergrund
Cave: Geschlechtsreife (Maus) 4 – 5 Wochen
Zuchtreife (Maus) 8 – 10 WochenRückkreuzung / Congene Tiere
Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006Substrains Genetische Drift
Undefinierte Substrains: Genetische Drift
Bourdi et al 2011
Konditionale / Induzierbare
Mutagenese
• knock-outs können zur Letalität führen
• knock-outs können zu unerwarteten Reak-
tionen führen, vor allem bei Expression
des Wildtypgens in verschiedenen Zellen
• für das Gene Targeting benötigte
Selektionsmarker können den Wirt und
den Phänotyp der Mutante beeinflussen
• Konditionale / Induzierbare
Mutagenese?Konditionale Mutagenese (cre/loxP,
Flp/FRT)
• Maus 1: Flankierung des Gens von
Interesse: loxP (Locus of cross over
(X) in Bakteriophage P1)
– durch Sequenzen anderer Spezies
– Flankierung homozygot
• Maus 2 : Rekombinase (site spe-cific):
cre (causes recombination)
– Expression im Gewebe des Interesses
• Maus 1 x Maus 2:
– Inaktivierung des Gens von Interesse in
den Rekombinase exprimierenden Zellen
• Homöostase bei 37°C
• Verlust des Resistenzgens
• Effizienz?
• Konditionaler knock-in / Aktivierung
möglich
Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006cre-Expression cre-Expression häufig schwer regulierbar Rajewsky et al. (1996) J. Clin. Invest 98, 600-603
Reporter-Maus Rosa26
loxP-neomycin-loxP-lacZ
ist innerhalb des ubiqiutär exprimierten
Locus ROSA26 homolog rekombiniert
• Soriano P. Generalized lacZ expression with the ROSA26
Crereporter strain. Nat Genet 1999;21:70-71
Tannour-Louet al. Hepatology 2002 35(5):1072-81Verpaarungsschema
P loxP+/+ cre-/- loxP -/- cre+/-
F1 loxP+/- cre+/- loxP+/- cre-/- loxP+/- cre+/- loxP+/- cre-/-
F2 loxP-/- cre+/- loxP+/- cre-/- loxP+/- cre+/- loxP+/- cre+/-
loxP+/- cre-/- loxP+/+ cre-/- loxP+/- cre+/- loxP+/+ cre+/-
loxP-/- cre+/- loxP+/- cre+/- loxP-/- cre+/+ loxP+/- cre+/+
loxP+/+ cre+/- loxP+/- cre+/- loxP+/- cre+/+ loxP+/+ cre+/+
Genetischer Hintergrund wichtig!!Induzierbare Systeme • Grosse Expressionsveränderungen möglich • Viele Ansätze • Endogene Einflüsse • Anschalten – Stärke? • Ausschalten – Nachweisbarkeitsgrenze? – Restaktivitäten?
Induzierbare Systeme:
Tet-on/Tet-off
cave: Licht
Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006Induzierbare Systeme: ERT2
cave: Phytooestrogene
Masahira et al 2006Woher Mutanten?
Optimierung der Ausbeuten
ImporteNo. Embryos/Donor
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
all L=125 E=70629 D=9727
7,26
Iso L=9 E=4037 D=570
7,08
SPF 1 L=21 E=11877 D=1297
9,16
SPF 2 L=2 E=794 D=112
7,09
SPF 3 L=12 E=6302 D=1021
6,17
Facility
SPF 4 L=44 E=25334 D=3135
8,08
Conv. 1 L=19 E=11389 D=1757
6,48
Conv. 2 L=4 E=2732 D=335
8,16
Conv. 3 L=14 E=8164 D=1500
5,44
Haltung
Andauernder Frühling, strikter Tag-/Nachtrhythmus
Wayss et al 2005, Ramin et al 2015Umwelt
Schwab and Schenkel 2008;
Diercks et al. 2010No. Embryos/Donor
0
2
4
6
8
10
12
all L=125 E=70629 D=9727
7,26
BDFn L=18 E=9579 D=1031
9,29
NMRI L=6 E=4835 D=1031
9,12
C57BL/6 L=46 E=26606 D=4408
6,04
Biologische Parameter
FVB/N L=8 E=5501 D=783
7,03
Genetic Background
CBA L=7 E=4501 D=446
10,09
C3H L=5 E=3086 D=392
7,87
Wayss et al. 2005; Schwab and Schenkel 2008
not known/mixed L=35 E=16521 D=21237
7,73“Klassische” Haltung
Züchter 1 Haltung A
Züchter 2 Haltung B
Hygienischer Zustand bekanntTransgene Haltung
Haltung 1 Haltung 2
Haltung 3 Haltung 4
Hygienischer Zustand unbekannt
EigenzuchtSanierung
Quarantäne- Zwischen-
Zielhaltung
bereich haltung
Zucht und Haltung der
kontaminierten Linie
Superovulation und
Zucht der Ammen
Verpaarung
Entnahme von
Embryonen aus VP+- Embryotransfer
Tieren Bielanski 2014
Austragen und Auf-
Kryokonservierte
zucht der transferierten Aufbau einer Zucht
Embryonen
EmbryonenNomenklatur von Mutanten www.informatics.jax.org http://www.gv-solas.de/ fileadmin/user_upload/pdf_publik ation/Genetik/2018- 10gen_nomenklatur_Ratte- Maus.pdf
Arbeiten mit GM Tieren.... • Gezielte Mutanten von enormen wissenschaftlichem Wert • Sehr aufwändige Generierung und Charakterisierung • Erhebliche Zunahme von genetisch/gentechnisch modifizierten (GM) Mauslinien • Kleine Populationen sehr wertvoller, ingezüchteter Linien • Linien müssen weitergezüchtet werden, auch wenn sie aktuell nicht benötigt werden, sonst: Verlust • Reine Erhaltungszucht aus vielen Gründen nicht vertretbar • Schutz vor unerwartetem Verlust (Unfall, Hygieneeinbruch) • Austausch von Mutanten zwischen verschiedenen Haltungen • Kryokonservierung • Stabile Lagerung und hygienisch einwandfreie Revitalisierung nach Jahren/Jahrzehnten
Kryokonservierung von Embryonen
Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006Revitalisierung
Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006
Ramin et al, 2014 and 2015Kryokonservierung/Spermatozoen
Schenkel J Transgene Tiere Springer Verlag 2006Diercks et al J Vet Sci 2012
Kontaminationsgefahr bei
Kryokonservierung
Umweltkeime (Maus-) Pathogene
verwendete Medien - -
LN2 Behälter, oben n=20 + nd
LN2 Behälter, Boden n=20 + nd
Dryshipper + nd
Gasphase Behälter nd nd
Raumluft + nd
Spermatozoen n=80 - -
Embryonen n=28 - -
ES-Zellen n=12 - -
Kreuzkontamination nd -
Wurf nach Embryotransfer - +Dry shipper Cave: Zoll, Veterinärinspektion, Röntgen
Beispiele transgene Tiermodelle
Startle Syndrom /
Hypereclplexie
• Neuromotor Krankheit
• Postsynaptischer GlyR-beta Gendefekt
• Spontane Mausmutante verfügbar (spa)
• Rescue experiment verfiziert Mutation
• Einfügen des Humanen Homologs in
spa/spa Mäuse muittels Transgenese
• Phenotyp?Experimentelles Vorgehen
Hartenstein et al. 1996, Becker et al. 2000Rescue des spa-Phenotyps
Hartenstein et al. 1996, Becker et al. 2000Regulation der Erythropoese:
Erythropoetin (EPO)
Gassmann Schweiz Arch Tierheilkd. 2001 143(9):455Leistungsfähigkeit EPO-
überexprimierender Mäuse (hohe
O2-Transportkapazität)
Gassmann Schweiz Arch Tierheilkd. 2001 143(9):455Transgene Bioreaktoren
Jährlicher Bedarf an humanen Proteinen in USA
De Boer 1993Ausbeuten zur Generierung
transgener Rinder
Krimpenfort et al 1991Lentiviraler Gentransfer im Rind
Hofmann et al Biol Reprod. 2004 71(2):405Acknowledgements • Anna Schwab, Heidelberg • Heiner Bürgers, Heidelberg/Wien • Ann-Kathrin Diercks, Heidelberg • Michael Staudt, Heidelberg • Michael Ramin, Heidelberg • Theresa Voggenreiter, Heidelberg • Marie Schubert, Heidelberg • Andrea Rausch, Heidelberg • Helmut Eskerski, Heidelberg • Beatrix Imkeit, Heidelberg • Heinrich Steinbauer, Heidelberg • Gefördert durch BfR/ZEBET, BMBF und GDK
Vielen Dank!
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