Alternative Verfahren zur Charakterisierung nativer und assoziierter Proteine
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05. Oktober 2021 Online-Seminar zu „Moderne Trenn- und Detektionsmethoden für Antikörper und Proteine: Herausforderungen und Lösungsansätze in der BioLC“ Alternative Verfahren zur Charakterisierung nativer und assoziierter Proteine Martin D. Klaßen, Dr. P. Constantinidis , J. Thißen und Dr. T. Teutenberg IUTA Institut für Energie- und Umwelttechnik e. V. An-Institut der
Die Analyten Monoklonale Antikörper (mAk)… …und deren Aggregate www.waters.com • Biopharmazeutika: • Behandlung von rheumatoider • Folge www.waters.com Arthritis, Krebs und Neutralisierung • Wirkverlust von SARS-CoV-2 • Sensibilisierung • Bildung von Auto-Anti-Antikörpern Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 2
Motivation Analytische Fragestellungen • Konzentration LC-UV LC-MS • Identität LC-HRMS LC-MS Raman + Strukturinformationen • Konformation + Signalintensität linear zur Konzentration DLS CD + kostengünstig + kein Expertenwissen geringe Empfindlichkeit Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 3
Projektidee Qualitätskontrolle …z. B. herstellende Apotheken Alterung Identität Proteinaggregate Konzentration Arbeitsbereich: 1.4-16.5 mg mL-1 (9.4 - 111 µM) Verstärkung berner-safety.de Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 4
Projektidee Surface enhanced Raman spectroscopy of protein conformation (SERS-PC) • Projektziele: • Simulation der SERS-Nanoantennen (Resonanz, Hotspots) • Laser-Interferenz-Litographie (periodisch,100- 800 nm) angewandt Chip auf belackte Wafer • Übertragung auf Silizium-Wafer durch Trockenätzen (Plasma) • Deposition des plasmonischen Metalls (Gold) • Immobilisierung von Reportermolekül und Bindeprotein Immuno-Assay IGF-Nr.: 20781 Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 5
SERS-Effekt 1. Stokes-Raman … v=2 v=1 S1 v=0 d IRaman~ L4 2N 3. Oberflächenauswahlregeln dq hvL hvR Raman-Tensor … ) z v=2 v=1 S0 v=0 Orientierung ELoc 2. Lokalisierte Oberflächenplasmonen lokale Feldverstärkung E - - - - - +++ + + + + +++ - - LSPR Absorbanz - - - λ Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 6
Raman Spektrometer 785 nm Raman-Spektrometer CCD-Spektrometer in Rückstreuanordnung AvaSpec-ULS2048x64TEC-EVO (Avantes) • Czerny-Turner (symmetr., f = 75 mm) • CCD: Hamamatsu, back-thinned, Peltier-gekühlt, 2048 x 64 Pixel CCD- Spektrometer • Gitter: 830 Zeilen/mm LWL-D S K3 778-1100 nm • 100-3650 cm-1 (Aufl. 7 cm-1) LP OD1 CUF BS cw-Laser cw-Laser K2 LWL-A K1 Cobolt 08-NLDM (Hübner Photonics) 785 nm • 785 nm (FWHM: < 100 pm ≈ 2 cm-1) LWL: Lichtwellenleiter Objektiv K: Einkoppeloptik • Wellenlängenstabilität: 1 pm (8 h) BS: dichroit. Beam-Splitter xyz- CUF: Clean-Up-FIlter • Leistung: 500 mW OD1: Neutraldichtefilter Tisch (5 µm Aufl.) LP: Longpass-Edge-Filter • Leistungsstabilität: < 1% (8 h) Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 7
SERS-Substrate SilmecoAu1 AMO-H12/AMO-K1 • Oberflächenmetall: Gold • Trägermaterial: Silizium • Struktur: Nanopillars • stochastische Verteilung der Nanopillars mit ähnlichen Dimensionen der Pillars wie AMO-H12 bei AMO-H12-Substraten (siehe AFM- • Oberflächenmetall: Gold Untersuchung von AMO) • Trägermaterial: Glas • Struktur: konisch • Periodische, gleichförmige Nanoantennen • AMO-K1, ähnlich wie AMO-H12, jedoch tiefere Strukturen (500 nm statt 250 nm) SilmecoAu Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 8
Indirekter Ansatz Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 9
Indirekter Ansatz mAb Fusionsprotein Cys-AG (47.8 kDa): (150 kDa) • 5 IgG-bindende Regionen von Protein A (E-D-A-B-C), 2 von Protein G (C1-C3) • bindet an die Fc-Region des Antikörpers SERS-Reporter: • 4-Mercaptobenzoesäure (4-MBA) • Bindung des Liganden über Säuregruppe Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 10
Indirekter Ansatz Immobilisierung des SERS-Reporters 4-MBA *v(C-S) + **v(C=C) i.p. ring-breathing 1594 cm-1 1095 cm-1 GAMESS (US)1 1"Advances in electronic structure theory: GAMESS a decade later" M.S.Gordon, M.W.Schmidt pp. 1167-1189, in "Theory and Applications of Computational Chemistry: the first forty years" C.E.Dykstra, G.Frenking, K.S.Kim, G.E.Scuseria (editors), Elsevier, Amsterdam, 2005. B3LYP/6-311G(d,p) Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 11
Indirekter Ansatz Peak-Shift (Δpeak) Änderung der FWHM (ΔFWHM) Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 12
Indirekter Ansatz Kombination der Features ΔPeak und ΔFWHM Quantifizierung ist grundsätzlich möglich! Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 13
Aggregation Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 14
Aggregation • Monomer: native, globuläre Proteinstruktur • Intermediat: teilw. Entfaltung der Proteinstruktur (sek. und tert.) • Oligomer: Stabilisierung der Intermediate durch Oligomerisierung • Nukleationskeim: Umfaltung der Oligomerstruktur/ Ausbildung β-Faltblatt-Motiv • Protofibrille: Vorstufe zur ausgewachsenen Fibrille (fibrilläre Struktur) • Fibrille: typisches β-Faltblatt-Motiv senkrecht zur Fibrillenachse Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 15
Aggregation Sekundärstruktur R H R H Raman C N C N O R O R Amid I Amid III paralleles β-Faltblatt1,2 Aminosäurereste H H H H H (1) 1Qiu, C.; Arzhantsev, S. Secondary Structure Assessment of Formulated Bevacizumab in the Ring-Atmung Presence of SDS by Deep Ultraviolet Resonance Raman (DUVRR) Spectroscopy. Analytical Biochemistry 2018, 555. https://doi.org/10.1016/j.ab.2018.06.003. 2http://www.chemgapedia.de/vsengine/vlu/vsc/de/ch/8/bc/vlu/proteine/proteinaufbau.vlu/Page/vs c/de/ch/8/bc/proteine/aminos_u_einleit/faltblatt.vscml.html Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 16
Aggregation Lysozym Lyophilisat 1,2 Lysozym Aggregat Messbedingungen: 0,8 • Analyt: Lysozym Norm. Ramanintensität/ A.U. 0,4 • Lyophilisat: 20 mW, 10 s, 36 n 0,0 • Aggregat: 10 mW, 10 s, 36 n 600 900 1200 1500 1800 • Messung nach je 45 min Raman-Verschiebung/ cm-1 Photobleaching 1667 0,8 • Mittelwert aus 3-fach Differenzspektrum: Aggregat - Lyophilisat 1221 Bestimmung 0,4 • Probenhalter: Goldslide 0,0 1188 759 1304 1645 1550 506 -0,4 1103 955 871 1325 895 926 600 900 1200 1500 1800 Raman-Verschiebung/ cm-1 Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 17
Aggregation Aggregationsexperiment • UVC-LED (Luminous, XST- 3535-UV-40mW): 275-280 nm Quarzküvette • Leistung: ~ 1 mW • Bevacizumab (Avastin®), c = 25 mg mL-1 UV278 Analytik: SEC (size exclusion chromatography) • LC-System: LC-10 (Shimadzu) • SEC-Säule: YMC SEC MAB, 300 x 4.6 mm (25 nm, 3 m) • isokratische Trennung (1 x PBS + 0.05 % NaN3), RT • Detektion: 190-800 nm (DAD), SEC-Trace: 280 (300) nm Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 18
Aggregation SEC-Fraktionierung • Fl.-Rate: 0.3 mL min-1 • LM: 1 x PBS • VInj: 40 L (4x) • Fraktionssammler Ergebnis • Trennung möglich • Zusammensetzung der Fraktionen stabil • beide Fraktionen stark verdünnt (~ 5%) Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 19
Aggregation Aufkonzentrierung • Zentrifugen-Filter Bildung reversibler Aggregate (50 kDa Cut-off) beim Aufkonzentrieren? • Konz.-Faktor: ~ 20x Ergebnis • Aggregat-Fraktion (Fra1) qual. unverändert • Monomer-Fraktion (Fra3) und Bvcz in PBS weisen vermehrt Aggregate auf Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 20
Aggregation Unterscheidung der Raman-Spektren (DCDR) von Bevacizumab (PBS), UV- gestresstem Aggregat (PBS) bzw. Monomer (PBS) möglich (vorläufige Ergebnisse) Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 21
Zusammenfassung • Indirekter Nachweis von Antikörpern mit Reportermolekül und „Immuno-Assay“ erlaubt Quantifizierung • Aggregate können mittels Raman Spektroskopie von Monomeren unterschieden werden • Unterscheidung von Intermediaten und Monomeren (muss noch bestätigt werden) möglich • Unterscheidung unterschiedlicher Antikörper (Identifizierung) steht noch aus Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 22
Die Analyten Virusähnliche Partikel… • Keine funktionale Nukleinsäure • Ikosaedrisches Kapsid aus VP1- Pentameren • Rekombinate Herstellung • Vektor zum Transport von Medikamenten (Zytostatika, Gentherapie) zur Zielzelle, Organ • Umgeht Immunsystem • weniger Nebenwirkung, kein Abbau Zdanowicz et al. (2016) Acta Biochimica Polonica (63) 469-473 Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 23
Die Analyten …und deren Assemblierung • VP1 Monomere bilden Capsomere • Durch Erhöhung der Ionenstärke bildet sich das Kapsid • Beladung durch osmotischen Schock • Reassemblierung durch erneute Erhöhung der Ionenstärke • Wie wird die Beladungseffizienz bestimmt? www.ascenion.de Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 24
Strategien • ES-DMA-CPC* • Elektrospray • Neutralisator • Differentieller Mobilitäts Analysator • Kodensationspartikelzähler *Mobility Particle Size Spectrometer Guha et al. (2012) Trends in Biotechnology (30) 291-300 Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 25
Strategien • ES-DMA-CPC 1.20 20 mM acetate buffer 2 kV 1:1 1:5 1.00 • Nichtflüchtige Puffer können Analyse 1:10 Normalized number concentration 1:20 beeinträchtigen (hier: TRIS-HCl) 0.80 • Salzkristallgröße ist konzentrationsabhängig 0.60 • In Gasphase wachsen Kristalle auf 0.40 0.20 0.00 1 10 100 Particle diameter dp (nm) Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 26
Strategien • ES-DMA-CPC • TRIS Kristalle überlagern VLP • Verschiebung zu größerem Partikeldurchmesser Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 27
Strategien • ES-DMA-CPC • Nach vollständiger Dialyse gegen Ammoniumacetat 40 mM • Monodisperse Partikelgrößenverteilung • Keine Matrixeffekte Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 28
Strategien • ES-DMA-CPC • Unterscheidung von beladenen und „tinies“ unbeladenen VLP anhand der Partikelgröße • „Falsch“ reassemblierte Vektoren lassen sich identifizieren Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 29
Strategien • ES-DMA-CPC • Überprüfung der Packqualität möglich • Geeignetes Verfahren zur Chargenanalyse Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 30
Zusammenfassung • Mobility Particle Size Spectrometer kann zur Größencharakterisierung von VLP eingesetzt werden • Der Probenvorbereitung kommt eine hohe Bedeutung zu • Reassemblierte Partikel mit Cargo können von Unbeladenen unterschieden werden • Qualitätskontrolle mit diesem Verfahren denkbar Duisburg, 05.10.2021 Martin D. Klaßen | klassen@iuta.de 31
Fragen und Diskussion Martin Klaßen klassen@iuta.de 02065 / 418 - 68
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