Charakterisierung monoklonaler Antikörper gegen die murine Fibrosarkomzellinie MCA102 und Rolle der B-Zellen in diesem Tumormodell
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Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Abteilung Immunologie der
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Charakterisierung monoklonaler Antikörper gegen
die murine Fibrosarkomzellinie MCA102 und Rolle
der B-Zellen in diesem Tumormodell
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Vorgelegt im April 2004
von
Désirée Aglaia Esther Berning
geboren in MünchenDekan: Professor Dr. med. C. Peters 1. Gutachter: Professor Dr. sc. nat. H. Pircher 2. Gutachter: PD Dr. rer. nat. Stefan Martin Jahr der Promotion: 2005
Meiner Mutter
I Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG ......................................................................1
SUMMARY..........................................................................................2
1. EINLEITUNG ..............................................................................3
1.1 Das Immunsystem ............................................................................................ 3
1.1.1 Das unspezifische Immunsystem................................................................. 3
1.1.2 Das spezifische Immunsystem..................................................................... 3
1.2 T-Lymphozyten ................................................................................................. 4
1.2.1 Antigenerkennung und Aktivierung von T-Lymphozyten .............................. 4
1.2.2 Cross-Priming.............................................................................................. 5
1.2.3 Effektormechanismen von T-Lymphozyten .................................................. 5
1.3 B-Lymphozyten................................................................................................. 5
1.3.1 Der B-Zell-Rezeptor..................................................................................... 6
1.3.2 Entwicklung des Antikörperrepertoires der B-Zellen..................................... 6
1.3.3 Antigenerkennung und Aktivierung von B-Lymphozyten .............................. 7
1.3.4 Effektormechanismen von B-Lymphozyten.................................................. 8
1.4 Tumorimmunologie .......................................................................................... 9
1.4.1 Rolle des Immunsystems bei der Bekämpfung von Tumoren ...................... 9
1.4.2 Tumorantigene ...........................................................................................10
1.4.3 Immunantwort gegen Tumoren...................................................................11
1.4.4 Wie Tumorzellen dem Immunsystem entgehen ..........................................12
1.4.5 Immuntherapie von Tumoren......................................................................13
1.5 Fragestellung ...................................................................................................14
1.6 Das MCA102GP33-Tumormodell........................................................................15
1.7 Das JHT-Mausmodell .......................................................................................15
2. MATERIAL UND METHODEN.................................................. 16
2.1 Mäuse ...............................................................................................................16
2.2 Zellinien............................................................................................................16II Inhaltsverzeichnis 2.3 Virus .................................................................................................................16 2.4 Zellbiologische Methoden...............................................................................17 2.4.1 Medien zur Zellkultur ..................................................................................17 2.4.2 Kultivierung der Zellinien ............................................................................17 2.4.3 Einfrieren von Zellen...................................................................................18 2.4.4 Auftauen von Zellen....................................................................................18 2.4.5 Herstellen einer Einzelzellsuspension.........................................................18 2.4.6 Generierung von Effektorzellen ..................................................................19 2.4.7 Subkutane Injektion von Tumorzellen .........................................................19 2.4.8 Erstellen einer Tumorwachstumskinetik......................................................19 2.4.9 Entnahme subkutaner Tumoren..................................................................20 2.5 Durchflusszytometrie ......................................................................................20 2.5.1 Verwendete Puffer ......................................................................................20 2.5.2 Verwendete Antikörper ...............................................................................20 2.5.3 Analyse von Zellen aus lymphatischen Organen ........................................20 2.5.4 Analyse von Zellen aus dem peripheren Blut ..............................................21 2.5.5 Analyse von Mausserum ............................................................................21 2.5.6 Analyse von Überstand...............................................................................22 2.5.7 Analyse von Tumorzellen............................................................................22 2.6 Immunhistologie ..............................................................................................22 2.6.1 Kryokonservierung entnommenen Gewebes ..............................................22 2.6.2 Herstellung histologischer Gewebeschnitte ................................................22 2.6.3 Auftropfen von Tumorzellen........................................................................23 2.6.4 Verwendete Antikörper ...............................................................................23 2.6.5 Färbung der Gewebeschnitte......................................................................23 2.7 Western Blot ....................................................................................................24 2.7.1 Verwendete Puffer und Lösungen...............................................................24 2.7.2 Ansetzen des Antigens ...............................................................................24 2.7.3 Herstellung einer SDS-PAGE .....................................................................25 2.7.4 Proteintransfer auf Membran ......................................................................25 2.7.5 Antigennachweis auf Membran...................................................................26 2.8 Leukapherese ..................................................................................................26 2.9 Herstellung monoklonaler Antikörper............................................................27 2.9.1 Immunisierung der Mäuse ..........................................................................27 2.9.2 Gewinnung von Peritonealmakrophagen ....................................................27 2.9.3 Fusionierung...............................................................................................27 2.9.4 Testung der Klone ......................................................................................28
III Inhaltsverzeichnis
2.9.5 Subklonierung.............................................................................................29
2.9.6 Einfrieren der Klone ....................................................................................29
2.9.7 Produktion mAk in vitro...............................................................................29
2.9.8 Affinitätschromatographie ...........................................................................29
2.9.9 Proteingehaltbestimmung ...........................................................................30
2.9.10 Bestimmung der Unterklassen der Isotypen ...............................................30
2.9.11 Biotinylierung der Antikörper.......................................................................31
2.9.12 Antikörpergabe in vivo ................................................................................31
3. ERGEBNISSE........................................................................... 32
3.1 Funktionelle Unterschiede zwischen JHT- und B6-Mäusen ..........................32
3.1.1 MCA102GP33 Tumorwachstum.....................................................................32
3.1.2 Prozentuale Unterschiede der Leukozytenpopulationen .............................33
3.1.3 Quantitative Unterschiede der Leukozytenpopulationen .............................36
3.1.4 Histologie....................................................................................................37
3.2 Humorale Immunantwort gegen MCA102GP33-Tumorzellen bei B6-Mäusen....
..........................................................................................................................39
3.3 Generierung monoklonaler Antikörper gegen MCA102 und MCA102GP33-
Tumorzellen .....................................................................................................41
3.3.1 Bindung der hergestellten monoklonalen Antikörper auf MCA102 und
MCA102GP33-Tumorzellen ...........................................................................42
3.3.1.1 Analyse der mAk im Durchflusszytometer............................................42
3.3.1.2 Analyse der mAk im Western Blot........................................................44
3.3.1.3 Analyse der mAk in der Immunhistochemie .........................................46
3.3.2 Kreuzreaktion der mAk UL1 und A2 mit Strukturen in der Milz naiver B6-
Mäuse.........................................................................................................50
3.3.3 Kreuzreaktion der mAk UL1 und A2 mit aktivierten B6-Milzzellen ...............52
3.3.4 Bindung der mAk auf verschiedenen Tumorzellinien ..................................54
3.3.5 Die mAk UL1 und A2 zeigen keinen tumorprotektiven Effekt in vivo ...........56
4. DISKUSSION............................................................................ 58
4.1 Mögliche Gründe für die effektivere Tumorantwort der JHT-Mäuse gegen
MCA102GP33-Tumoren ......................................................................................58IV Inhaltsverzeichnis
4.2 Charakterisierung der hergestellten monoklonalen Antikörper gegen
MCA102- und MCA102GP33-Tumorzellen .........................................................61
4.2.1 Grundsätzliche Überlegungen ....................................................................61
4.2.2 Diskussion der einzelnen mAk....................................................................65
I. LITERATURVERZEICHNIS ...................................................... 69
II. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS................................................. 79
LEBENSLAUF .................................................................................. 82
DANK................................................................................................ 831 Zusammenfassung ZUSAMMENFASSUNG Es ist bekannt, dass B-Zellen in einigen Tumormodellen einen inhibierenden Einfluß auf die Tumorimmunität besitzen. Dieser hängt sowohl mit T-Zell-B-Zell-Interaktionen als auch mit den von B-Zellen produzierten Antikörpern (Ak) zusammen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle der B-Zellen und der von ihnen produzierten tumorspezifischen Ak im MCA102-Tumormodell zu untersuchen. Das GP33 CD8-T- Zellepitop des Lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV) diente in diesem System als tumorassoziiertes Modellantigen. Um den Einfluß von B-Zellen auf die Tumorimmunität zu untersuchen, wurde das MCA102GP33-Tumorwachstum in C57/BL6-Mäusen (B6-Mäusen) und B-Zell defizienten JHT-Mäusen verglichen. Es konnte ein verzögertes Tumorwachstum sowie ein vermehrtes Abstoßen der Tumoren in JHT-Mäusen gezeigt werden. Dieser Effekt war weder auf eine höhere Anzahl an Granulozyten oder Makrophagen zurückzuführen, noch auf die Anzahl an CD8-T-Lymphozyten in JHT-Mäusen, da letztere in B6-Mäusen sogar doppelt so hoch war wie in JHT-Mäusen. Demnach scheint die B-Zell-Defizienz der JHT-Mäuse die Resistenz gegenüber MCA102GP33 Tumoren zu erhöhen. Weiter konnte gezeigt werden, dass in tumortragenden B6-Mäusen spezifische IgG-Ak gegen MCA102GP33-Tumorzellen gebildet wurden. Mithilfe der Hybridomtechnik wurden Mausmyelomzellen mit Milzzellen von B6-Mäusen fusioniert, die zuvor mit MCA102- und MCA102GP33-Tumorzellen immunisiert worden waren. Auf diese Weise wurden die vier monoklonalen Ak (mAk) UL1 (IgG), A2 (IgG), UL2 (IgM) und A1 (IgM) hergestellt. Jeder der hergestellten mAk zeigte ein individuelles Reaktionsmuster sowie verschiedene Grade der Kreuzreaktivität mit syngenen, allogenen und xenogenen Tumorzellinien und mit verschiedenen Autoantigenen. Es ließ sich kein tumorprotektiver Effekt der monoklonalen IgG-Ak UL1 und A2 in vivo nachweisen. Abschließend lässt sich festhalten, dass ohne Kenntnis der jeweiligen Epitope der mAk noch keine endgültige Aussage über deren Rolle im Rahmen der Tumorimmunität gegen MCA102- und MCA102GP33-Tumoren getroffen werden kann. Jedoch kann man an der Autoreaktivität der hergestellten IgG-Ak erkennen, dass die B-Zell-Toleranz gegenüber Selbstantigenen nicht absolut ist und durch Injektion von syngenen Tumorzellen leicht durchbrochen werden kann.
2 Summary SUMMARY In some tumor models, it has been demonstrated that B cells can inhibit the induction of a protective immune response. This effect could be due to B cell/T cell-interactions and/or secretion of antibodies (Abs) by B-cells. The aim of this study was to investigate the role of B cells and their secreted Abs in the MCA102GP33 tumor model. In this system, the GP33 CD8 T cell epitope from the Lymphocytic Choriomeningitis Virus (LCMV) serves as a tumor-associated model antigen. To study the role of B cells in induction of anti tumor immunology, the growth of MCA102GP33 tumors was compared between C57/BL6 mice (B6 mice) and B cell deficient JHT mice. In mice lacking B cells, we found delayed tumor growth and an elevated rejection frequency. This effect was neither due to higher numbers of granulocytes nor monocytes nor CD8 T lymphocytes in JHT mice. On the contrary, the number of CD8 T lymphocytes in B6 mice was even twice as high as in JHT mice. Thus, the B cell deficiency seems to increase the resistance to MCA102GP33 tumors in JHT mice. Additionally, we could show a specific induction of IgG Abs against MCA102GP33 tumors in tumor bearing mice respectively. Four monoclonal antibodies (mAb), namely the mAb UL1 (IgG), A2 (IgG), UL2 (IgM) and A1 (IgM) were generated by fusing mouse myeloma cells with splenocytes from B6 mice that were immunized with MCA102 and MCA102GP33 tumor cells. Each individual mAb displayed a unique pattern of reactivity. However, the mAbs showed various degrees of cross-reactivity with syngeneic, allogeneic and xenogeneic cells of malignant origin as well as with some autoantigens. No protective effect on tumor growth could be detected after in vivo application of the IgG antibodies UL1 and A2. Without knowing the epitope recognized by the generated mAbs no final statement can be made about their role in induction of an immune response against MCA102 and MCA102GP33 tumors. However, the finding that both IgG mAbs generated were autoreactive indicates that B cell tolerance is not absolute and can be broken readily by injection of syngeneic tumor cells in vivo.
3 Einleitung 1. EINLEITUNG 1.1 Das Immunsystem Der Organismus ist ständig einer Vielzahl potentiell infektiöser Mikroorganismen ausgesetzt. Ebenso stellen die Entartung und das unkontrollierte Wachstum eigener Körperzellen eine Gefahr dar. Vor diesen Gefahren schützt das Immunsystem. Es lässt sich funktionell in zwei Einheiten unterteilen, die jedoch eng miteinander zusammenhängen. 1.1.1 Das unspezifische Immunsystem Das unspezifische Immunsystem dient der ersten Abwehr des Körpers gegen eindringende Krankheitserreger. Es kann jedoch Krankheitserreger nicht spezifisch erkennen und keinen Schutz gegen eine erneute Infektion entwickeln. Es besteht aus physikalischen Barrieren, humoralen und zellulären Faktoren (76). Zu den zellulären Faktoren gehören Monozyten, Makrophagen, Granulozyten und natürliche Killerzellen (NK-Zellen). Makrophagen stehen gemeinsam mit dendritischen Zellen (DC) und B-Zellen als Antigenpräsentierende Zellen (APC) mit dem spezifischen Immunsystem in Verbindung. Auf humoraler Seite stehen das Komplementsystem und zahlreiche Chemokine, Zytokine und chemische Mediatoren. Kann das unspezifische Immunsystem eine Infektion nicht unter Kontrolle bringen, wird das spezifische Immunsystem aktiviert und reagiert etwa 3-5 Tage später. 1.1.2 Das spezifische Immunsystem Das spezifische Immunsystem wird in die humorale, B-Zell-vermittelte, und in die zelluläre, T-Zell-vermittelte, Immunantwort unterteilt. Es ist in der Lage, jedes beliebige fremde Antigen spezifisch zu erkennen und besitzt außerdem eine Gedächtnisfunktion, die bei einer wiederholten Infektion mit demselben Pathogen zu einer effizienteren Reaktion führt (142). Die naiven Lymphozyten wandern zeitlebens vom Blut in die sekundären lymphatischen Organe wie Milz, Lymphknoten sowie Mucosa assoziierte lymphatische Gewebe (MALT), wo sie auf ihr spezifisches Antigen treffen und daraufhin zu Effektorzellen differenzieren. Über die Lymphgefäße kehren sie wieder in den Blutkreislauf zurück. Über Zellkontakte und lösliche Mediatoren steht das spezifische mit dem unspezifischen Immunsystem in Verbindung.
4 Einleitung 1.2 T-Lymphozyten 1.2.1 Antigenerkennung und Aktivierung von T-Lymphozyten In den sekundären lymphatischen Organen findet die Antigenerkennung statt. T- Lymphozyten erkennen mithilfe ihres membranständigen T-Zell-Rezeptors (TCR) spezifische Antigene, die ihnen in Form von prozessierten Peptidfragmenten in Assoziation mit MHC-Molekülen von professionellen APC präsentiert werden (7). Die MHC-Moleküle werden im Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex, MHC) kodiert. Die MHC-Gene des Menschen sind im HLA-, die der Maus im H2- Genlocus kodiert (63). Sie sind polygen angelegt und unterliegen einem ausgeprägten Polymorphismus. Es gibt 2 Klassen von MHC-Molekülen: MHC-Klasse-I-Moleküle kommen auf nahezu allen kernhaltigen Zellen des Organismus vor. Sie präsentieren Peptide, die aus dem Zytosol stammen. MHC-Klasse-II-Moleküle werden auf dendritischen Zellen, Makrophagen, B-Zellen sowie den Thymusepithelzellen exprimiert und präsentieren exogene Peptide. T-Lymphozyten lassen sich aufgrund unterschiedlicher Korezeptoren in die Gruppe der CD4- und der CD8-T-Lymphozyten einteilen. CD8-T-Lymphozyten erkennen in der Regel endogene Peptide, die ihnen von MHC-Klasse-I-Molekülen präsentiert werden, während CD4-T-Lymphozyten exogene Peptide erkennen, die ihnen von MHC-Klasse-II-Molekülen präsentiert werden. Dabei erkennen T-Lymphozyten ihr spezifisches Peptid nur dann, wenn es ihnen von einem körpereigenen MHC-Molekül präsentiert wird. Dieser Mechanismus wird als MHC-Restriktion bezeichnet (143). Zur vollständigen Aktivierung naiver T-Lymphozyten werden 2 Signale benötigt. Das primäre Signal ist die Interaktion zwischen TCR, Peptid und MHC-Molekül. Zusätzlich wird noch ein zweites kostimulatorisches Signal zwischen der T-Zelle und der APC benötigt, ohne das die T- Zelle anergisch werden würde (108). Das sekundäre Signal entsteht durch die Interaktion von CD28 des T-Lymphozyten mit B7.1 (CD80) und B7.2 (CD86) auf aktivierten APC. Die Aktivierung der T-Zelle führt zur verstärkten IL-2-Synthese und Expression des IL-2- Rezeptors (30, 141). IL-2 wirkt autokrin auf die T-Zelle und stimuliert die Proliferation und Expansion des Antigen-spezifischen T-Zell-Klons (sogenannte klonale Expansion). Auf diese Weise differenzieren naive T-Zellen zu Effektor- und Gedächtniszellen. CD8-T- Zellen differenzieren zu zytotoxischen T-Zellen (CTL) und sind in der Lage, virusinfizierte Zellen oder Tumorzellen abzutöten. CD4-T-Zellen differenzieren zu TH1- oder TH2- Zellen. Diese bekämpfen mithilfe von Makrophagen- und B-Zell-Aktivierung Infektionen mit extrazellulären Erregern.
5 Einleitung 1.2.2 Cross-Priming Exogene Proteine können von APC aufgenommen werden und intrazellulär in den MHC Klasse I-Weg eingeschleust werden (17, 113). Durch Bindung bestimmter Hitze-Schock- Proteine (Hsp) wie z.B. gp96 kann die Aufnahme der Antigene und die Aktivierung der APC und der CD8-T-Zellen vermittelt werden (110). Bei der Aufnahme apoptotischer oder nekrotischer Zellen müssen allerdings ausreichend kostimulatorische Signale übermittelt werden, da die T-Zellen sonst in den Zustand der Toleranz versetzt werden (2, 118). Die Expression der Kostimulatoren wird in diesem Fall über die Bindung von CD40 auf der APC an CD40L auf TH1-Zellen induziert (46, 141). Diesen Mechanismus der Präsentation exogener Antigene über MHC Klasse I-Moleküle bezeichnet man als Cross-Präsentation, die Aktivierung der CD8-T-Zellen als Cross-Priming (3). Vermutlich spielt dieser Mechanismus eine wichtige Rolle bei der Präsentation von Tumorantigenen von entarteten nicht professionell antigenpräsentierenden Zellen. Weiterhin wird die Bedeutung des Cross-Priming für die Tumorbekämpfung diskutiert. 1.2.3 Effektormechanismen von T-Lymphozyten Treffen aktivierte T-Lymphozyten nach Migration zum Entzündungsherd auf ihr spezifisches Antigen auf der Oberfläche von APC, werden spezifische Effektormechanismen ausgelöst. CD4-T-Lymphozyten differenzieren unter Einfluß von IL- 12, das von aktivierten Makrophagen ausgeschüttet wird, zu TH1-Zellen, man bezeichnet sie auch als inflammatorische CD4-T-Zellen. Die von ihnen sezernierten Cytokine (IFN-γ, TNF) wirken aktivierend auf Makrophagen. Sie spielen v.a. eine Rolle bei der Bekämpfung intrazellulärer Pathogene wie bestimmter Bakterien, Parasiten oder Viren. Die Gruppe der TH-2-Zellen entsteht unter Einfluß von IL-4, man bezeichnet sie auch als CD4-T- Helferzellen. Deren sezernierte Zytokine (IL-4, IL-5, IL-10, IL-13) fördern die B-Zell- Aktivierung und sind somit wichtig für die Bekämpfung extrazellulärer löslicher Pathogene mithilfe von Ak. Die TH1-Zytokine wirken antagonistisch gegenüber den TH2-Zytokinen (11). Zu CTL differenzierte CD8-T-Lymphozyten führen mithilfe der Zytotoxine Perforin und Granzym zur Zellyse und Apoptoseinduktion in den Zielzellen. 1.3 B-Lymphozyten Die Stadien der B-Zell-Entwicklung sind durch Umordnung und Expression der Immunglobulingene charakterisiert. Als erste Zelle der B-Zell-Linie exprimiert die unreife B-Zelle ein komplettes IgM-Molekül auf der Oberfläche (62). Reife B-Zellen tragen
6 Einleitung zusätzlich IgD auf der Oberfläche. Sie zeichnen sich durch Expression der Oberflächenmoleküle CD19 und CD45R (B220) aus, die bei der Signalweiterleitung des BCR eine Rolle spielen. 1.3.1 Der B-Zell-Rezeptor Die Effektor- und antigenerkennenden Moleküle der B-Zellen sind die Immunglobuline (Ig). Diese kommen in membrangebundener Form als B-Zell-Rezeptoren (BCR) und in sezernierter Form als Ak vor. BCR bzw. Ak binden nicht wie beim TCR an prozessierte Peptide, sondern direkt an Krankheitserreger und ihre toxischen Produkte (14, 134). Ein typisches Ak-Molekül (z.B. IgG) besteht aus jeweils zwei identischen schweren (je 50 kDa) und leichten Ketten (je 25 kDa), die über Disulfidbrücken miteinander verknüpft sind. Sie sind in der Form eines Y angeordnet. Die leichte Kette besteht aus zwei, die schwere aus vier Proteindomänen, eigenen kompakt gefalteten Abschnitten der Proteinstruktur. Es gibt zwei Typen von leichten Ketten, λ- und κ-Ketten. In einem Ak-Molekül kommen entweder nur λ- oder nur κ-Ketten vor. Es existieren 5 Typen von schweren Ketten, µ-, γ-, α-, ε- und δ-Ketten. Die beiden schweren Ketten eines Ak-Moleküls sind immer identisch. Sie definieren die Zugehörigkeit zu einer der 5 Hauptklassen bzw. Isotypen der sezernierten Ak (IgM, IgG, IgA, IgE, IgD). Ein Ak-Molekül besteht aus zwei funktionell unterschiedlichen Bereichen: einer variablen Region und einer konstanten Region. Die variable Region, die vom aminoterminalen Ende einer leichten und einer schweren Kette gebildet wird (VH, VL), erkennt und bindet spezifisch das Pathogen bzw. Antigen. Dieser Teil ist von Molekül zu Molekül sehr unterschiedlich, um die Bindung einer möglichst großen Bandbreite an Antigenen zu gewährleisten. Pro Ak-Molekül gibt es zwei identische Antigenbindungsstellen. Die konstante Region (CH, CL) ist für die Effektorfunktionen der sezernierten Ak verantwortlich (4, 36, 90, 99). 1.3.2 Entwicklung des Antikörperrepertoires der B-Zellen Das Antikörperrepertoire des Menschen umfasst etwa 1011 verschiedene Ak-Moleküle. Diese Diversität kann nicht durch Zuordnung eines eigenen Gens zu jeder Immunglobulinkette erreicht werden (Keimbahntheorie). Vielmehr findet eine Kombination verschiedener Gensegmente aus einer relativ kleinen Gruppe vererbter Sequenzen statt (8, 54). Diesen Mechanismus bezeichnet man als Konzept der somatischen Diversifikation. Die variablen Regionen (V-Regionen) sowohl der leichten wie auch der schweren Kette werden von mehr als einem Gensegment kodiert. Im Fall der leichten Kette wird jede variable Domäne von 2 verschiedenen DNA-Abschnitten kodiert, dem VL-
7 Einleitung und dem JL-Gen-Segment. Die Verknüpfung eines V- und eines J-Gen-Segments führen zu einem durchgehenden Exon, das die gesamte variable Region der leichten Kette codiert. Ein separates Exon kodiert die konstante Region der leichten Kette (CL). Durch Spleißen der mRNA der leichten Kette wird es mit dem Exon der variablen Region verknüpft. Jede variable Domäne der schweren Kette wird von 3 verschiedenen DNA- Abschnitten kodiert, dem VH-, JH- und dem DH-Gen-Segment. Zuerst wird ein DH- mit einem JH-Gen-Segment verknüpft, anschließend lagert sich ein VH-Gen-Segment an die DJH-Sequenz an, sodass ein vollständiges Exon für die variable Region der schweren Kette entsteht. Wie bei der leichten Kette erfolgt die Verbindung der zusammengebauten V-Region-Sequenz mit dem benachbarten C-Region-Gen (CH1, CH2, CH3 und ein Exon für die Gelenkregion) durch RNA-Spleißen. Um die enorme Vielfalt des Ak-Repertoires zu erreichen, gibt es in der Keimbahn-DNA multiple Kopien der Gensegmente für die variablen Regionen. Durch diese kombinatorische Diversität ist es möglich, bis zu 106 verschiedene Ak-Spezifitäten hervorzubringen. Bei der Rekombination der verschiedenen Gensegmente der schweren und leichten Ketten erhöht sich die Vielfalt durch Hinzufügen und Entfernen von Nukleotiden an den Verbindungsstellen der Gensegmente. Diesen Mechanismus bezeichnet man als junktionale Vielfalt. Zusätzlich tragen die verschiedenen möglichen Kombinationen einer schweren und einer leichten Kette im vollständigen Immunglobulinmolekül zur Entstehung der Ak-Vielfalt bei. Es gibt noch einen weiteren Mechanismus, die somatische Hypermutation, die auf B-Zellen in den peripheren lymphatischen Organen nach der Erzeugung funktionsfähiger Immunglobulingene einwirkt. Sie tritt auf, wenn B-Zellen nach Signalen von aktivierten T- Zellen auf ein Antigen reagieren und fügt in die variablen Regionen umgeordneter Gene in großem Umfang Punktmutationen ein (4, 99, 132). Einige der mutierten Immunglobulinmoleküle binden besser an Antigene als die ursprünglichen BCR. Diese B- Zellen werden selektiert und reifen zu Ak sezernierenden Plasmazellen aus. Dieses Phänomen nennt man Affinitätsreifung der Ak-Population. 1.3.3 Antigenerkennung und Aktivierung von B-Lymphozyten Der komplette B-Zell Rezeptor-Komplex besteht aus einem Zelloberflächen- immunglobulin (Ig), dessen schwere Kette mit jeweils einem der Proteine Igα und Igβ assoziiert ist, die an der Signalweiterleitung ins Zellinnere beteiligt sind (99). Die Signale des BCR werden durch den B-Zell-Korezeptor-Komplex CD19:CD21:CD81 verstärkt (89). Die Kopplung von anderen Oberflächenrezeptoren (z.B. CD22) an den Antigenrezeptor inhibiert die B-Zell-Antwort. Die Aktivierung einer naiven B-Zelle erfordert außer der Bindung eines passenden Antigens an den BCR auch ein kostimulierendes Signal.
8 Einleitung Sogenannte thymusabhängige Antigene werden nach Bindung an den BCR von der B- Zelle aufgenommen und kehren als an MHC-Klasse-II-Moleküle gebundene Peptide an die Zelloberfläche zurück. Der MHC-Peptid-Komplex ist in der Lage, für das Peptid spezifische bewaffnete T-Helferzellen zu binden, welche vorher durch APC aktiviert wurden. Die Bindung der T-Helferzelle an den MHC-Peptid-Komplex aktiviert B-Zellen auf mehreren Wegen. Ein wichtiges membranständiges Effektormolekül der bewaffneten T- Helferzelle ist CD40L (CD154), welches an CD40 auf der B-Zelle bindet (56, 68, 85). Zusätzlich wird die B-Zelle durch IL-4 und verschiedene andere Kontaktsignale der T- Helferzelle aktiviert und zur klonalen Vermehrung angeregt (93). Um miteinander in Wechselwirkung zu treten, müssen B-Zellen und T-Helferzellen Epitope desselben Molekülkomplexes erkennen, die jedoch nicht identisch sein müssen. Diesen Mechanismus bezeichnet man als gekoppelte Erkennung (linked recognition). Nach einigen Proliferationszyklen durchlaufen B-Zellen eine Reihe wichtiger Modifikationen wie die Affinitätsreifung oder den Isotypwechsel von IgM zu IgG und IgA bevor sie später entweder zu B-Gedächtniszellen oder zu Plasmazellen differenzieren (116). Letztere sezernieren große Mengen spezifischer Ak mit hoher Affinität. Thymusunabhängige Antigene können B-Zellen ohne T-Zell-Hilfe aktivieren, sie bewirken jedoch nur einen begrenzten Isotypwechsel und führen nicht zur Bildung von B- Gedächtniszellen (82). 1.3.4 Effektormechanismen von B-Lymphozyten Die humorale Immunantwort schützt die Extrazellulärräume des Körpers vor Krankheitserregern. Es lassen sich 5 Hauptisotypen von Ak unterscheiden: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD. Aufgrund kleinerer Unterschiede in der Aminosäuresequenz lassen sich die IgG- Ak beim Menschen in die Unterklassen IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4, bei der Maus in IgG1, IgG2a, IgG2b und IgG3 einteilen. IgM wird als erstes Immunglobulin bei einer Ak-Antwort ins Blut sezerniert und liegt als Pentamer vor. IgG ist der häufigste Ak im Plasma und in extrazellulären Flüssigkeiten. Es liegt als Monomer vor und zeigt im Allgemeinen eine hohe Affinität für das Antigen. IgA diffundiert als Monomer in die Extrazellulärflüssigkeit, über einen Transportmechanismus namens Transcytose wird es als Dimer durch verschiedene Epithelien in Körpersekrete abgegeben (Darm, Atemtrakt, Muttermilch), wo es am häufigsten vorkommt (83). Dadurch bildet IgA die erste Verteidigungslinie gegen ein breites Spektrum von Erregern. IgE befindet sich hauptsächlich als mastzellassoziierter Ak direkt unterhalb epithelialer Oberflächen (Atemwege, Gastrointestinaltrakt, Haut) und spielt eine Rolle bei allergischen
9 Einleitung Reaktionen. IgD kommt als Oberflächenimmunglobulin auf reifen naiven B-Zellen vor, seine Funktion ist jedoch unbekannt. Ak schützen den Organismus auf 3 verschiedene Arten vor extrazellulären Krankheitserregern bzw. deren toxischen Produkten (25, 133). Den ersten Mechanismus, die Bindung der Antigene bezeichnet man als Neutralisation. Von Ak (IgA, IgG) gebundene bakterielle Toxine oder Viren können nicht mehr mit Zellen wechselwirken bzw. in diese eindringen (104). Manche Bakterien besitzen bestimmte Schutzmechanismen, mit denen sie einer direkten Erkennung durch Phagozyten entgehen. In diesem Fall ermöglichen an das Bakterium gebundene Ak (IgG) den Phagozyten, das Bakterium aufzunehmen und zu zerstören. Diesen zweiten Mechanismus bezeichnet man als Opsonierung. Der dritte Effektormechanismus von Ak (IgM, IgG) ist die Aktivierung des Komplementsystems, die zur direkten Lyse von Bakterienzellen und zur Aufnahme und Zerstörung durch Phagozyten führt (28). Alle von Ak ausgelösten Effektormechanismen führen letztendlich zur Aufnahme und Zerstörung von Krankheitserregern durch antigenunspezifische Phagozyten. Die Erkennung der mit Ak markierten Zellen durch Phagozyten erfolgt über sogenannte Fc- Rezeptoren, die für das Fc-Fragment von Ak spezifisch sind (102). Fc-Rezeptor tragende Zellen werden als akzessorische Effektorzellen bezeichnet. Dazu gehören außer den Phagozyten noch NK-Zellen, Mastzellen sowie eosinophile und basophile Granulozyten. 1.4 Tumorimmunologie Die Entartung und unkontrollierte Teilung einer einzigen körpereigenen Zelle bildet die Grundlage für die Entstehung eines Tumors. Zellen können spontan entarten, aber auch durch chemische oder physikalische Noxen oder onkogene Viren transformiert werden. Krebs ist in den industrialisierten Ländern eine der 3 häufigsten Todesursachen. Dessen Bekämpfung beschäftigt Forscher der unterschiedlichsten Fachgebiete. Auch die Immunologie versucht ihren Teil dazu beizutragen. Da eine erfolgreiche Tumorbekämpfung die Vernichtung sämtlicher bösartiger Zellen voraussetzt, wäre eine Immunantwort, die Tumorzellen spezifisch erkennen und eliminieren könnte, eine ideale Heilungsmethode. 1.4.1 Rolle des Immunsystems bei der Bekämpfung von Tumoren Die Hypothese, dass die meisten Tumoren von Lymphozyten kontrolliert und eliminiert werden, bezeichnet man als Immunüberwachung (immune surveillance), sie ist jedoch sehr umstritten (35). Tatsächlich existieren Immunreaktionen gegen Tumoren (96).
10 Einleitung
Injiziert man Mäusen bestrahlte, nicht teilungsfähige Tumorzellen, so sind die Mäuse
häufig bei späterer Injektion derselben, unbestrahlten lebensfähigen Tumorzellen an einer
anderen Körperstelle gegen diese immun und in der Lage, die Zellen abzustoßen.
Wiederholt man dasselbe Experiment mit Mäusen, die keine T-Zellen besitzen, wird keine
schützende Immunität erzeugt. Durch adoptiven Transfer von T-Zellen aus immunen
Mäusen lässt sich diese jedoch wieder herstellen (43). Diese Experimente beweisen, dass
T-Zellen für diese Effekte verantwortlich sind. Allerdings sind nicht alle Tumorzellen in der
Lage, eine schützende Immunantwort auszulösen. Tumorzellen, die eine protektive
Immunantwort induzieren können, werden als immunogen bezeichnet. Außer den T-
Zellen spielen auch andere Zellen des Immunsystems wie z.B. NK-Zellen eine wichtige
Rolle bei der Tumorbekämpfung.
1.4.2 Tumorantigene
CD8-T-Lymphozyten sind in der Regel für die Abstoßung von transplantierten Tumoren
verantwortlich, gegen die die Empfänger vorher immunisiert wurden. Dabei erkennen
diese bestimmte Peptide aus mutierten oder überexprimierten zellulären Proteinen, die an
MHC-Klasse-I-Moleküle auf der Oberfläche der Tumorzellen gebunden sind (106). Diese
Peptide nennt man Tumorassoziierte Antigene (TAA) bzw. Tumorantigene. Es gibt auch
Tumorantigene, die von CD4-T-Lymphozyten erkannt werden können, wenn sie mithilfe
eines MHC-Klasse-II-Moleküls präsentiert werden (127). Sowohl von humanen als auch
von murinen Tumoren ist es gelungen, eine Vielzahl verschiedener Antigene zu isolieren
(88, 119). Sie kommen nicht oder mit verringerter Expressionsstärke auf normalen Zellen
vor und unterscheiden sich in ihrem immunogenen Potential und in der Fähigkeit, eine
Tumorabstoßung zu vermitteln.
Tumorantigene lassen sich je nach ihrer Entstehungsweise in sechs verschiedene
Gruppen einteilen (12, 13, 125).
• Es gibt streng tumorspezifische Antigene, die durch Mutation von Onkogenen (z.B.
Ras) oder Tumorsuppressorgenen (z.B. p53) entstehen und auf diese Weise das
Tumorwachstum erst initiieren.
• Bestimmte Tumoren werden durch Virusinfektion (Lymphom durch EBV,
Zervixkarzinom durch HPV 16) verursacht und präsentieren virale Antigene (Typ-16-
Proteine E6, E7 des menschlichen Papillomvirus).
• Einige Gene werden normalerweise nur in immunprivilegierten Regionen wie Testes,
Plazenta oder Retina aktiviert. Dort werden keine MHC-Moleküle exprimiert, weshalb
keine Peptidpräsentation stattfindet. Aus diesem Grund bezeichnet man sie auch als
„Stille Gene“. Zu diesen streng tumorspezifischen Antigenen gehören MAGE-1,11 Einleitung
MAGE-3, GAGE und BAGE, die von manchen humanen Melanomen und Karzinomen
exprimiert werden sowie das murine P1A (121).
• Werden Antigene beispielsweise nur in Melanozyten exprimiert, so nennt man sie
Differenzierungsantigene (z.B. Tyrosinase, MART1, gp100). Auch die onkofetalen
Antigene α-Fetoprotein (AFP) oder Karzinoembryonales Antigen (CEA) werden im
adulten Organismus nicht synthetisiert, aber von bestimmten Tumoren exprimiert.
• Manche Antigene werden im Vergleich zu normalen Zellen in Tumorzellen stark
überexprimiert (z.B. HER-2/neu).
• Werden Moleküle posttranslational anomal modifiziert, so können auch dabei
Tumorantigene entstehen (MUC-1 auf Pankreas- und Mammatumoren, GM2, GD2,
GD3 auf Melanomen).
1.4.3 Immunantwort gegen Tumoren
Wie aus vorher beschriebenem Experiment hervorgeht, wird die Tumorimmunität
wesentlich durch cytotoxische T-Lymphozyten vermittelt. Diese können MHC-Klasse-I
assoziierte Tumorantigene entweder auf den Tumorzellen selbst oder durch
Crosspräsentation über APC erkennen. Letztere können direkt von CD8-T-Zellen oder
mithilfe von CD4-T-Zellen über die CD40-CD40L-Interaktion kostimuliert werden (139,
141). Einmal differenzierte tumorspezifische CTL können Tumorzellen auch ohne
Kostimulation erkennen und diese lysieren.
Der Beitrag der CD4-T-Zellen zur Tumorimmunität ist unterschiedlich. CD4-T-Zellen
werden v.a. bei MHC-Klasse-II negativen Tumoren zur Kostimulation von APC benötigt,
sie spielen auch bei Verlust der von CD8-T-Zellen erkannten Tumorantigene eine Rolle,
da Tumorzellen ihre von CD4-T-Zellen erkannten Tumorantigene behalten (127). CD4-T-
Zellen sind sogar in der Lage, Tumoren durch die indirekten Effekte von IFN-γ unabhängig
von CD8-T-Zellen erfolgreich abzustoßen (84). Es wird allerdings auch über eine
verbesserte Tumorabstoßung in CD4-depletierten Mäusen berichtet (65). Letztere hängt
wahrscheinlich mit dem Beitrag der B-Zellen zur Tumorimmunität zusammen, der
kontrovers diskutiert wird.
Ein inhibierender Einfluss von B-Zellen auf die CTL-abhängige (81, 97) und NK-Zell-
abhängige Tumorimmunität ist beschrieben (22). Im Gegenteil dazu korreliert die Anzahl
B-Zellen in einem Rattentumormodell positiv mit der Überlebensdauer und negativ mit der
Tumorgröße (31). Auch ist eine insuffiziente CTL-Antwort gegen eine Virus-induzierte
Leukämie in Abwesenheit von B-Zellen beschrieben (107). Ob diese Effekte abhängig von
Ak sind, ist nicht vollständig geklärt.12 Einleitung Die Generierung tumorspezifischer Ak ist ein häufig zu beobachtendes Phänomen, welche Rolle sie im Rahmen der Tumorimmunität spielen, ist jedoch noch weitgehend unklar. Erfolgreiche Vakzinierungsstudien weisen auf einen möglichen protektiven Effekt von tumorspezifischen Ak hin (20, 41, 55, 73). Es ist aber auch ein die CTL-Antwort blockierender Effekt tumorspezifischer Ak beschrieben (40, 53, 58, 59, 70, 130). In einigen Fällen von Magen- und Mammakarzinomen bei Patienten korrelierte das Vorhandensein von α-p53-Ak mit einer schlechten Prognose (20, 138), in einer anderen Studie mit kleinzelligem Lungenkarzinom war das Vorhandensein von α-p53-Ak mit einem Überlebensvorteil assoziiert (86). In jedem Fall können tumorspezifische Ak ein nützlicher Indikator für frühe Diagnosen bestimmter Malignome bzw. für Rezidivkontrollen sein. Auch das unspezifische Immunsystem spielt eine Rolle bei der Tumorabwehr. NK-Zellen können MHC-Klasse-I negative Tumorzellen mithilfe von Perforin lysieren. Mit ihrem Fc- Rezeptor sind sie in der Lage, mit Ak bedeckte Tumorzellen zu erkennen und zu zerstören. Diesen Mechanismus bezeichnet man als Ak-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität. Makrophagen setzen nach Aktivierung TNF-α oder NO frei und können damit in transformierten Zellen Apoptose auslösen. Auch γδ-T-Zellen, NKT-Zellen und neutrophilen Granulozyten wird eine Rolle bei der Tumorabwehr zugeschrieben (21, 112). 1.4.4 Wie Tumorzellen dem Immunsystem entgehen Tumoren besitzen verschiedene Möglichkeiten, einer Immunantwort zu entgehen (61, 106). Durch deren genetische Instabilität können sich unter Selektionsdruck neue Zellvarianten herausbilden, die ihre von CD8-T-Zellen erkannten Tumorantigene verloren haben (10). Dadurch verringern sie ihre Immunogenität und werden nicht mehr als fremd erkannt. Es gibt auch Tumorvarianten, deren Antigene zu wenig immunogen sind, um eine Immunantwort auszulösen (42). Die Expression von Antigenen, die in vielen Geweben des Organismus exprimiert werden, führt zur Toleranzinduktion (67). Auch durch mangelnde Expression von Adhäsions- bzw. kostimulatorischen Molekülen sind manche Tumorzellen nicht in der Lage, T-Zellen oder APC adäquat zu aktivieren. So kann der Kontakt einer T-Zelle mit einer Tumorzelle, die keine kostimulatorischen Moleküle exprimiert, zu Anergie oder Ignoranz der T-Zelle führen (10, 115). Treffen T-Zellen auf Tumorantigene ohne Anwesenheit von aktivierten APC, so kommt es zur Apoptose der T- Zelle (45). Oft fehlt auch die Präsentation MHC-Klasse-II-Molekül assoziierter Antigene an CD4-T-Zellen, die APC über die CD40/CD40L-Bindung aktivieren könnten. Einige Tumorzellen sind in der Lage, die Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen zu verringern. Dadurch können sie von CD8-T-Lymphozyten nicht mehr erkannt werden, sind jedoch in diesem Fall für Angriffe von NK-Zellen anfällig. Die experimentell durch IFN-γ
13 Einleitung gesteigerte MHC-Expression erhöht wiederum die Immunogenität. Die Herabregulation von CD95 schützt die Tumorzelle vor Apoptose, die durch Bindung von CD95L (Fas-L) induziert wird (120). Dagegen sind Tumorzellen in der Lage, die Expression von CD95L zu steigern. Des Weiteren produzieren viele Tumoren immunsuppressive Zytokine wie TGF-β oder IL-10 (48) und schwächen auf diese Weise das Immunsystem. 1.4.5 Immuntherapie von Tumoren Eine Tumorimmuntherapie sollte den Organismus idealerweise in die Lage versetzen, zwischen normalen und entarteten Zellen unterscheiden zu können, um nur die entarteten Zellen gezielt zu eliminieren. Grundsätzlich lassen sich zwei verschiedene Typen von Immuntherapien unterscheiden. Es gibt die Möglichkeit einer Stimulation des unspezifischen oder des spezifischen Immunsystems. Das Immunsystem lässt sich unspezifisch durch Injektion von inflammatorischen Substanzen wie Endotoxinen, TNF-α, Interferonen oder durch Gabe von polyklonalen Anti-CD3-Ak in tumortragende Mäuse stimulieren (37). Dabei dienen die genannten Substanzen als polyklonale Aktivatoren von Lymphozyten (69, 78). Bei der Stimulation des spezifischen Immunsystems lässt sich die aktive Stimulation von der passiven Immunisierung unterscheiden. Ziel der aktiven Stimulation ist die Generierung tumorspezifischer CTL. Dabei gibt es verschiedene Ansätze. Die Injektion isolierter Tumorantigene ist möglich, die gleichzeitige Applikation von Adjuvantien (BCG, bestimmte bakterielle Toxine) oder Zytokinen führt jedoch zu einer effizienteren Antigenpräsentation durch APC. Allerdings ist die klinische Wirksamkeit unbefriedigend, da weniger als 20% der Patienten überhaupt auf die Vakzinierung reagieren (41, 55, 73). Aus Tumorzellen isolierte Hsp-Peptid-Komplexe können als mögliche Vehikel für den Transport von Antigenen auf APC dienen und Cross-Präsentation auslösen (24). Es besteht die Möglichkeit, Vorläuferzellen von Dendritischen Zellen zu isolieren und in vitro anzuzüchten. Dann können sie mit Tumorantigenen beladen oder mit cDNA transfiziert und reinjiziert werden (91). Auch eine Vakzinierung mit genetisch veränderten Tumorzellen ist möglich. Diese können vermehrt MHC- oder kostimulatorische Moleküle wie CD86 oder CD80 exprimieren oder bestimmte Zytokine wie GM-CSF, IL-2, TNF oder IL-12 sezernieren. Bei der passiven Immunisierung versucht man, durch die Gabe spezifischer Zellen oder mAk gegen Tumoren vorzugehen. Der adoptive Transfer spezifischer CTL zeigte in einigen Fällen Erfolge (51, 64). Lymphozyten können auch aus dem Patientenblut isoliert werden, in vitro durch IL-2 zu LAK-Zellen (lymphokin activated killer cells) differenzieren und reinjiziert werden (105). Auch der genetische Transfer spezifischer Antigenrezeptoren
14 Einleitung auf expandierten PBL bietet eine Möglichkeit zur Tumorbekämpfung (15). MAk lassen sich auf vielfältige Weise zur Tumorbekämpfung einsetzen (9, 44, 75). Mit Ak bedeckte Tumorzellen können durch Fc-Rezeptoren von NK-Zellen erkannt und lysiert werden. Ak können auch die Wechselwirkung zwischen dem Rezeptor und seinem natürlichen Liganden blockieren wie im Fall von Herceptin. Das ist ein mAk, der gegen den Wachstumsfaktorrezeptor HER-2/neu gerichtet ist, der bei bestimmten Mammakarzinomen überexprimiert wird. Andere mAk initiieren durch Bindung an bestimmte Oberflächenproteine der Tumorzelle eine Signalkaskade. Rituximab beispielsweise bindet an CD20 auf Non-Hodgkin-B-Zell-Lymphomen und löst damit Apoptose aus (44). Außerdem lassen sich mAk mit Toxinen (z.B. Pseudomonas-Toxin oder Ricin-A-Kette), Chemotherapeutika oder Radionukleiden koppeln (75). Im ersten Fall entstehen Immunotoxine, die ihre Wirkung nach Aufnahme in die Tumorzellen entfalten und die Zelle töten. In den anderen beiden Fällen konzentriert sich die Wirkung des Chemotherapeutikums bzw. des Radioisotops an der Tumorzelle und auch an benachbarten Tumorzellen. Durch die Produktion von bispezifischen Ak ist es möglich, die T-Zell-Aktivität in unmittelbare Nähe der Tumorzellen zu fokussieren (27, 114). Allerdings müssen mAk in ihrem Fc-Teil an den Empfängerorganismus adaptiert werden, um eine Abstoßung des Ig zu verhindern (9). Auch besteht die Gefahr der Auslösung einer Autoimmunreaktion, wenn das Tumorantigen auch auf normalen Körperzellen exprimiert wird. 1.5 Fragestellung Untersuchungen verschiedener Arbeitsgruppen zeigen, dass B-Zellen in einigen Tumormodellen einen inhibierenden Einfluß auf die Tumorimmunität besitzen (16, 65, 81, 97). Dieser hängt sowohl mit den von B-Zellen produzierten Ak zusammen als auch mit den Interaktionen, die B-Zellen vor allem mit CD4-T-Zellen eingehen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollte die Rolle der B-Zellen im MCA102GP33-Tumormodell untersucht werden. Hierfür sollte das Wachstum von MCA102GP33-Tumorzellen in B-Zell-defizienten JHT-Mäusen mit dem in B6-Mäusen verglichen und funktionelle Unterschiede zwischen den beiden Mauslinien herausgearbeitet werden. Es sollte untersucht werden, ob B6- Mäuse eine humorale Immunantwort gegen etablierte MCA102- und MCA102GP33- Tumoren entwickeln. Um die Rolle einer humoralen Immunantwort gegen MCA102- und MCA102GP33-Tumoren zu verstehen, sollten mAk hergestellt und charakterisiert werden, die aus der Fusion von Milzen tumortragender B6-Mäuse mit Myelomzellen entstehen.
15 Einleitung 1.6 Das MCA102GP33-Tumormodell Trotz des Vorhandenseins von Tumorantigenen sind T-Zell-Antworten gegen Tumoren oft ineffektiv und verhindern nicht die Ausbildung solider Tumoren. Ein möglicher Grund dafür ist die niedrige Immunogenität der vorhandenen Tumorantigene. Um die Immunogenität von MCA102 Fibrosarkomen zu erhöhen, wurde das MCA102GP33-Tumormodell geschaffen. MCA-Tumoren sind chemisch induzierte Fibrosarkome, die durch Injektion von 3-Methylcholantren in B6-Mäuse generiert wurden. Erste Untersuchungen von MCA- Tumoren stammen aus den 50er Jahren (43). In dem MCA102GP33-Tumormodell ist die murine Fibrosarkomzellinie MCA102 mit einem Minigen transfiziert, das für das gut charakterisierte GP33-CTL-Epitop des Lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV) kodiert. Das GP33-T-Zellepitop wird von Kb und Db präsentiert und ist ein ideales Modellantigen. Nach Injektion von MCA102GP33-Tumorzellen in B6-Mäuse wird eine GP33-tumorspezifische CTL-Antwort induziert, die jedoch nicht in der Lage ist, den Tumor zu eliminieren (10). 1.7 Das JHT-Mausmodell Mithilfe des Cre-loxP-Rekombinationssystems wurde eine Mauslinie namens JHT geschaffen, bei der die J-Gensequenzen für die variablen Anteile der schweren Ak-Ketten deletiert wurden (49). Somit ist keine somatische VH-DH-JH-Rekombination mehr möglich und die Mäuse können keine funktionellen Ig-Moleküle herstellen. Da die Expression von membrangebundenem Ig für die frühe B-Zell-Entwicklung essentiell ist (62), können JHT- Mäuse keine B-Zellen generieren. Die B-Zell-Entwicklung ist also im Prä-B-Zell-Stadium blockiert. Damit sind JHT-Mäuse ein ideales Mausmodell einer kompletten B-Zell- Defizienz.
16 Material und Methoden
2. MATERIAL UND METHODEN
2.1 Mäuse
Die in den Experimenten verwendeten Mäuse wurden in den Tierställen des Instituts für
medizinische Mikrobiologie und Hygiene und im SPF-Tierstall des Universitätsklinikums
Freiburg gehalten. C57BL/6-Mäuse (Haplotyp H-2b) wurden von Harlan Winkelmann
(Borchen, Deutschland) bezogen. Verwendete JHT Mäuse wurden von Ulrich Kalinke
(Paul-Ehrlich-Institut, Langen, Deutschland) bezogen (49).
2.2 Zellinien
Murine MCA102-Fibrosarkomzellen wurden von S. Rosenberg (NIH, Bethesda) bezogen.
MCA102GP33-Fibrosarkomzellen wurden durch Transfektion der parentalen Tumorzellinie
mit dem GP33-Minigen des Lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV) hergestellt
(10). Murine SP2/0 Myelomzellen wurden von der BFA Zellbank, Insel Riems zur
Verfügung gestellt. Des weiteren wurden nachstehend aufgeführte Zellinien verwendet:
• Mauszellinien: EL-4 (Lymphom), P815 (Mastocytom), A20 (B-Zellen),
BW5147 (T-Zell-Lymphom), RMA-S (T-Zell-Lymphom),
MC57(Fibrosarkom), L929 (Fibrosarkom), B16.F10GP33
(Melanom), 3LL-A9GP33 (Lungenkarzinom)
• Rattenzellinien: 208F (Fibroblasten)
• Affenzellinien: BSC (Nierenepithel), Verozellen (Nierenepithel), CV1
(Nierenepithel)
• Menschliche Zellinien: K562 (CML-Zellen), H9 (T-Zell-Lymphom), Jurkat (T-Zell-
Lymphom), Huh7 (Hepatom), A546 (Adenokarzinom Lunge)
2.3 Virus
LCMV-WE: Der Virusstamm wurde von R. Zinkernagel (Universitätsspital Zürich) zur
Verfügung gestellt und in L929 Fibroblasten vermehrt.17 Material und Methoden
2.4 Zellbiologische Methoden
2.4.1 Medien zur Zellkultur
• DMEM-Kulturmedium: DMEM-Grundmedium (Biochrom, Berlin)
10% hitzeinaktiviertes FKS (Life Technology, Wiesbaden)
100 U/ml P/S (Life Technology, Wiesbaden)
2 mM L-Glutamin (Life Technology, Wiesbaden)
• IMDM-Kulturmedium: IMDM-Grundmedium (Life Technology, Wiesbaden)
10% hitzeinaktiviertes FKS (Life Technology, Wiesbaden)
100 U/ml P/S (Life Technology, Wiesbaden)
2 mM L-Glutamin (Life Technology, Wiesbaden)
• SP2/0-Medium: 250 ml IMDM-Grundmedium (Life Technology, Wiesbaden)
250 ml HAMS-F12-Medium (Biochrom AG, Berlin)
10% hitzeinaktiviertes FKS (Life Technology, Wiesbaden)
100 U/ml P/S (Life Technology, Wiesbaden)
2 mM L-Glutamin (Life Technology, Wiesbaden)
• Fusionsmedium: wie SP2/0-Medium FKS-frei
• HT-Stammlösung: 2 M Hypoxanthin (Merck, Darmstadt)
3 M Thymidin (Sigma-Aldrich, Deutschland)
100 ml Aqua dest.
• Aminopterin: 1,76 mg Aminopterin (Sigma-Aldrich, Deutschland)
100 ml Aqua dest.
0,5 ml NAOH 1 M (Merck, Darmstadt)
0,5 ml HCL 1 M (Merck, Darmstadt)
• Selektionsmedium: wie SP2/O-Medium
+ 5 ml HT-Stammlösung
+ 5 ml Aminopterin
2.4.2 Kultivierung der Zellinien
EL-4-, P815-, A20-, BW5147-, RMA-S-, K562-, Jurkat- und H9-Zellen wurden in IMDM-
Kulturmedium gehalten. Die leicht adhärenten Zellen wurden, sobald sich ein konfluenter
Zellrasen gebildet hatte, durch Schlagen mit der flachen Hand auf den Boden der
Zellkulturflasche abgelöst und ca. 6 Tropfen in eine neue Kulturflasche gegeben. Diese
wurde mit 15 ml IMDM-Kulturmedium aufgefüllt. MCA102-, MCA102GP33-, MC57-, L929-,
B16.F10GP33-, 3LL-A9GP33-, 208F-, BSC-, CV1-, Huh7-, A546- und Verozellen wurden in18 Material und Methoden DMEM-Kulturmedium gehalten. Sobald sich ein konfluenter Zellrasen gebildet hatte, wurden die Zellen ausverdünnt. Dazu wurde das Medium abgesaugt und die am Boden der Zellkulturflasche adhärierenden Zellen mit 2,5 ml zweifach konzentrierter Trypsin- EDTA-Lösung (Life Technology, Wiesbaden) vom Boden der Flasche gelöst. Danach wurde die Trypsinreaktion durch Zugabe von 2,5 ml DMEM-Kulturmedium abgestoppt und ca. 6 Tropfen dieser Zellsuspension in eine neue Kulturflasche gegeben. Diese wurde mit 15 ml DMEM-Kulturmedium aufgefüllt. Das Medium der mit dem GP33-Minigen transfizierten Zellinien enthielt zusätzlich G418-Sulfat (Life Technology, Wiesbaden, MCA102GP33: 1mg/ml, 3LL-A9GP33: 1,3 mg/ml, B16.F10GP33: 0,8mg/ml), um das selektive Wachstum der transfizierten Zellen zu gewährleisten. Alle Zellen wurden im Feuchtinkubator mit 5% CO2-Atmosphäre bei 37°C kultiviert. 2.4.3 Einfrieren von Zellen Zum Einfrieren wurden etwa 107 Zellen einmal gewaschen und in 3 ml Kulturmedium mit zusätzlich 10% FKS und 10% DMSO (Merck, Darmstadt) aufgenommen. Das Medium wurde auf Eis vorgekühlt. Dann wurden die Zellen in einer mit Isopropanol gefüllten Einfrierbox bei –70°C eingefroren und anschließend entweder im Tiefkühlschrank bei –80°C oder in flüssigem Stickstoff bei –196°C gelagert. 2.4.4 Auftauen von Zellen Die Zellen wurden schnell aufgetaut und in Kulturmedium aufgenommen. Anschließend wurden sie zur Entfernung des DMSO 10 min. bei 250 g in 4°C zentrifugiert und danach unter den beschriebenen Bedingungen kultiviert. 2.4.5 Herstellen einer Einzelzellsuspension Die Mäuse wurden mit Metofane (Jansson-Cilag, Deutschland) narkotisiert und durch Zervikaldislokation getötet. Die entnommene Milz wurde direkt in 5 ml DMEM- Kulturmedium überführt und in einer Petrischale mit einem sterilen Spritzenstempel durch ein grobes Metallnetz gedrückt. Nach Zugabe weiterer 5 ml DMEM-Kulturmedium wurde das Netz mehrmals durchgespült und die Zellsuspension schließlich aufgenommen. Nachdem sich die groben Bestandteile nach ca. 3 min. abgesetzt hatten, wurde der Überstand abgenommen und abzentrifugiert. Schließlich wurde das Pellet in 5 ml frischem Medium resuspendiert und mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer gezählt und auf die gewünschte Zellzahl eingestellt. Dazu wurden 20 µl der Zellsuspension mit 180 µl 2%-iger
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