Zellbasierte & Biochemische Assays
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Zellbasierte & Biochemische
AssaysAlles aus einer Hand – Promega Ihr zuverlässiger Partner
für zellbasierte Assays und Detektionsgeräte!
Reporter und Analyse
Detektion
zellbasierte Assays und Support
Promega ist seit 40 Jahren einer der führenden Hersteller von Systemlösungen für Ihr Labor. Neben
einem umfangreichen Produktangebot an Reportergen-, biochemischen- und zellbasierten-Assays
bietet Promega passend dazu die GloMax®-Detektionsgeräte in unterschiedlichen Ausstattungen an.
Die GloMax® Systeme ermöglichen Ihnen die Detektion von Lumineszenz, Fluoreszenz, UV-VIS Ab-
sorption, BRET, FRET und gefilterter Lumineszenz mit sehr hoher Empfindlichkeit und einem großen
dynamischen Bereich im 6 – 384 Well-Format. Alle Geräte verfügen über einen Tablet-PC mit vor-
programmierten Assay-Protokollen und einer Datenanalyse-Software. Die einfache Integration in
den Arbeitsablauf machen die GloMax®-Systeme zu einem zuverlässigen Partner für Ihre Forschung.
Ein Detektionsgerät für zahlreiche Anwendungen:
• Reportergenassays
• Zellviabilitäts-, Zytotoxizitäts- und Apoptose-Assays
• Assays zum Nachweis von oxidativem Stress und Zellmetabolismus
• Kinetikmessungen
• Multiplexing
• ELISA
• Protein:Protein Interaktion
Weitere Informationen unter: www.promega.com/glomax-comparisonInhalt 3
Inhaltsverzeichnis
I Zellbasierte und biochemische Assay-Formate 4 IIf Multiplexing (Fortsetzung)
ONE-Glo™ + Tox Luciferase Reporter
II Zellviabilität, Zytotoxizität, Apoptose, Autophagie and Cell Viability Assay 41
und Entzündungsreaktionen 7 Mitochondrial ToxGlo™ Assay 42
Assay-Übersicht 8
Neu
etabolism
Cellular M üre
IIa Zellviabilität/Proliferation 9 III Zellmetabolismus Brosch 43
RealTime-Glo™ Metabolic Cell Viability Assay 10 NAD(P)H-Glo™ Detection System 44
CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay 11 NAD /NADH-Glo™ Assay
+
45
CellTiter-Glo® 2.0 Cell Viability Assay 12 NADP /NADPH-Glo™ Assay
+
45
CellTiter-Glo® 3D Viability Assay 13
CellTiter-96® AQueous One Solution IV Oxidativer Stress 47
Cell Proliferation Assay (MTS) 14 ROS-Glo™ H2O2 Assay 48
CellTiter-Blue® Cell Viability Assay 15 GSH-Glo™ Glutathione Assay 49
CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay 16 GSH/GSSG-Glo™ Assay 50
BacTiter-Glo™ Microbial Cell Viability Assay 17
V Epigenetische Assays 51
IIb Zytotoxizität 18 HDAC-Glo™ 2 Assay 53
LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay 19 HDAC-Glo™ Class IIa Assay 54
CellTox™ Green Cytotoxicity Assay 20 HDAC-Glo™ I/II Assay 55
CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay 21 HDAC-Glo™ I/II Screening Systems 55
CytoTox-Fluor™ Cytotoxicity Assay 22 SIRT-Glo™ Assays and Screening Systems 56
CytoTox-ONE™ Homogeneous Membrane
Integrity Assay (LDH) 23 VI Zellsignalwege 57
ViralTox-Glo™ Assay 24 cAMP-Glo™ Max Assay 58
ADP-Glo™ Kinase Assay 59
IIc Apoptose 25 ADP-Glo™ Max Assay 60
RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis Kinase-Glo® Luminescent Kinase Assay 60
and Necrosis Assay 26 AMP-Glo™ Assay 61
Caspase-Assays im Überblick 27 PDE-Glo™ Phosphodiesterase Assay 62
Caspase-Glo® 3/7 Assay 28 GTPase-Glo™ Assay 63
Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay 29
CaspACE™ FITC-VAD-FMK In Situ Marker 30 VII Glykobiologie 64
UDP-Glo™ Glycosyltransferase Assay 65
IId Autophagie 31 GDP-Glo™ Glycosyltransferase Assay 66
Autophagy LC3 HiBiT Reporter Assay System 32 UMP/CMP-Glo™ Glycosyltransferase Assay 67
IIe Inflammasom/Entzündungsreaktionen 33 VIII Protease-Assays 68
Caspase-Glo® 1 Inflammasome Assay 34 Cell-based Proteasome-Glo™ Assays/
Proteasome-Glo™ Assays 69
IIf Multiplexing 35 Calpain-Glo™ Protease Assay 70
Übersicht über die Kombinationsmöglichkeiten
von zellbasierten Assays 36 IX Literatur 71
MultiTox-Fluor Multiplex Cytotoxicity Assay 37 X Produktübersicht 78
MultiTox-Glo Multiplex Cytotoxicity Assay 38 Kontakt 84
ApoLive-Glo™ Multiplex Assay 39
ApoTox-Glo™ Triplex Assay 40
REG40674 Einleitung
Zellbasierte und biochemische Assay-Formate
Promega bietet ein umfassendes Portfolio für die Analyse kom- in einer einzigen Probe – vorteilhaft. So kann ein Forscher zum
plexer zellulärer und biochemischer Prozesse. Die zellbasierten Beispiel zunächst einen Fluoreszenz-Assay verwenden, um Zyto-
und biochemischen Assays werden in der Grundlagen- und an- toxizität oder Zellviabilität zu messen. Anschließend kann er
gewandten Forschung sowie bei der Identifizierung und einen lumineszenten Caspase-Assay oder Reportergen-Assay
Charakterisierung von Wirkstoffen in der pharmazeutischen mit derselben Probe durchführen. Multiplexing spart Zeit, Pro-
Industrie eingesetzt. Neben den bereits etablierten Assays für benmaterial, Zellkulturreagenzien, und seltene oder teure Test-
die Untersuchung von Zellviabilität, Zytotoxizität und Apoptose substanzen. Zudem wird die Qualität der Daten erhöht und die
gibt es neue Assays für die Analyse von zellulären Prozessen in Interpretation der Messergebnisse erleichtert.
Real-Time und Autophagie. Damit können Forscher analysieren,
wie Zellen auf Wachstumsfaktoren, Zytokine, Hormone, Mito- Assays mit höchster Sensitivität
gene, Strahlung, Effektoren, und andere Signalmoleküle reagie- Die meisten Assays von Promega basieren auf Lumineszenz
ren. Bei der Entwicklung neuer Medikamente sind diese Assays oder Fluoreszenz. Insbesondere beim Multiplexen werden diese
unverzichtbar, um Wirkstoffmoleküle auf ihre Toxizität und Wirk- beiden Assay-Typen miteinander kombiniert, um möglichst
samkeit zu untersuchen, bevor in Tierversuche oder klinische viele Informationen aus einer Probe zu erhalten. Die fluores-
Studien investiert wird. zenten Assays basieren auf profluoreszenten Farbstoffen, die
mit Erkennungssequenzen für bestimmte Enzyme bzw. Enzym-
Add-Mix-Measure – das einfache Assay-Format klassen verknüpft wurden. Abhängig von der Aktivität der ent-
Durch das Add-Mix-Measure-Format sind die zellbasierten und sprechenden Enzyme wird der fluoreszente Farbstoff freigesetzt.
biochemischen Assays besonders einfach anzuwenden. Die Im Gegensatz dazu basieren die lumineszenten Assays auf
meisten Assays sind homogen und können ohne Wasch- und Luciferase-Reaktionen wie der Ultra-Glo Luciferase (optimierte
Zentrifugationsschritte direkt zu den Zellen gegeben werden. Firefly-Luciferase) oder der NanoLuc®-Luciferase. Dabei lässt
Dadurch sind potenzielle Fehlerquellen minimiert. Zudem lässt sich die Luciferase-Reaktion auf äußerst vielfältige Weise ein-
sich dieses Format leicht automatisieren. setzen, um eine Vielzahl zellulärer Prozesse mit sehr hoher
Sensitivität zu detektieren. Die lumineszenten Assays lassen
Multiplexing: Mehr Ergebnisse durch Kombination sich in drei Assaygrundtypen unterteilen:
verschiedener Assays
Für Wissenschaftler ist es oftmals hilfreich, mehrere Daten aus • Typ I: Messung der Luciferase-Expression
einer Probe zu gewinnen. Daher ist die Eignung eines Assays für • Typ II: Messung des ATP-Gehalts
das Multiplexing – der Analyse von mehr als einem Parameter • Typ III: Messung der Luciferin-Freisetzung
• Typ IV: Messung von Protein-Protein-Interaktionen (PPI) und
Apoptose mittels NanoBiT®-Technologie
• Typ V: Messung der translationalen und post-translationa-
len Regulation von Proteinen unter Verwendung des
Add Mix HiBiT Protein Tagging and Detection Systems
GloMax™
LuminometerEinleitung 5
Fünf Assay-Grundtypen basierend auf der Luciferase-Reaktion:
Reaktion der Firefly Luciferase
–
HO S N COOH O S N O–
Firefly Luciferase
+ ATP + O2 + AMP + PPi + CO2 + Licht
N S N S
Mg2+
Beetle Luciferin Oxyluciferin
Typ I:
Messung der Luciferase-Expression Promoter luc
Die Messung der Luciferase-Expression liegt allen Reporter-
Luciferase
gen-Assays oder GPCR-Assays zugrunde. Die Menge der Lu- HO S N COOH + ATP Licht
ciferase ist der limitierende Faktor. Er hängt von der Expres-
N S
sionsstärke im jeweiligen Expressionssystem ab. Das Assay-
Luciferin
Reagenz enthält einen Überschuss an Luciferin und ATP.
Typ II:
Messung des ATP-Gehalts
ATP ATP
ATP
ATPATP
In ATP-abhängigen Assays wird der ATP-Gehalt in einer
Probe gemessen. ATP ist hier der limitierende Faktor. Er Zell-Lyse
wird indirekt über die Luciferase-Reaktion bestimmt. Die- Ultra-Glo™
HO S N COOH + ATP Licht
ses Prinzip wird u.a. bei der Bestimmung der Zellviabilität rLuciferase
N S
und bei der Messung von Kinaseaktivitäten eingesetzt.
Luciferin
Das Assay-Reagenz enthält einen Überschuss der rekombi-
nanten Ultra-Glo™ Luciferase und Luciferin.
Typ III:
Messung der Luciferin-Freisetzung
Pro-Luciferin
Die Luciferin-generierenden Assays enthalten ein Pro- N N CO2H
Luciferin mit Enzym-Erkennungssequenzen, wie beispiels- S
Z-DEVD-N S
-
weise das DEVD-Tetrapeptid für die Bestimmung der H
Caspase-3/7 Aktivität. Erst nachdem das Substrat freige- Caspase-3
oder andere Enzyme
setzt wird, entsteht das Lumineszenzsignal durch das ent-
DEVD +
sprechende Enzym. Das Assay-Reagenz enthält modifi-
N N CO2H Ultra-Glo™
ziertes Luciferin und einen Überschuss der rekombinanten + ATP Licht
rLuciferase
Ultra-Glo™ Luciferase und ATP. Ein analoges Prinzip liegt H2N S S
auch dem RealTime-Glo™ Metabolic Cell Viability Assay Aminoluciferin
zugrunde, welche die NanoLuc® Reaktion und ein Pro-Furi-
mazin als Substrat verwendet.6 Einleitung
Reaktion der NanoLuc® Luciferase
NanoLuc® Luciferase
Furimazin + O2 Furimamid + CO2 + Licht
Typ IV:
NanoBiT® PPI System Substrat
Messung von Protein-Protein-Interaktionen (PPI) und Licht
LgBiT SmBiT
Apoptose mittels der NanoBiT®-Technologie (17,6 kDa) (11 AS)
Die NanoLuc® Binary Technology (NanoBiT™) ist ein Protein-
fragment Komplementationsassay basierend auf zwei opti-
mierten Untereinheiten der NanoLuc®-Luciferase: LargeBiT
(LgBiT; 18kDa) und SmallBiT (SmBiT; 11 Aminosäuren). Die
beiden Untereinheiten weisen eine geringe intrinsische
Affinität zueinander auf, wodurch es nur bei Interaktion RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis Assay Substrat
zwischen zwei damit markierten Proteinen zur Formierung Licht
LgBiT SmBiT
einer katalytisch aktiven Luciferase kommt, die ein äußerst (17,6 kDa) (11 AS)
helles Lumineszenzsignal generiert. Die Technologie ermög-
licht den Aufbau von zellulären Protein-Interaktionsassays
zur Endpunkt- oder Real-Time-Messung, wie z.B. dem
NanoBiT® PPI System oder dem RealTime-Glo™ Annexin V
Annexin V Annexin V
Apoptosis and Necrosis Assay. Annexin V:PS-Bindung
Typ V:
Messung der translationalen und post-translationalen
Regulation von Proteinen unter Verwendung des HiBiT Protein
Tagging System
Das HiBiT Protein Tagging System ermöglicht die Etablierung DETEKTIONS-
SS-
REAGENZZ
von hoch-sensitiven Reporterassays basierend auf einem
11 Aminosäure kleinen Peptid-Fusionstag HiBiT. HiBiT-mar-
kierte Proteine können in kürzester Zeit unter Verwendung LgBiT
(17,6 kDa)
eines Detektionsreagenzes, welches die komplementäre
HiBiT
LargeBiT-Untereinheit (LgBiT) enthält, quantifiziert werden. (11 AS)
4 –10 min
Aufgrund der hohen intrinsischen Affinität komplementiert
Detektion
HiBiT spontan mit LgBiT zu einer funktionellen Luciferase, die
ein helles Lumineszenzsignal generiert. Eine der vielen mög-
lichen Anwendungen des HiBiT ist die Messung von
Autophagie unter Verwendung des Autophagy LC3 HiBiT Re-
porter Assay Systems.[II] Zellviabilität, Zytotoxizität, Apoptose, Autophagie und Entzündungsreaktionen 7
II Zellviabilität, Zytotoxizität, Apoptose, Autophagie
und Entzündungsreaktionen
Die Erforschung und Bestimmung von Zellviabilität, Zytoto- Mittlerweile gibt es eine Reihe verschiedener zellbasierter
xizität, Apoptose, Autophagie und Entzündungsreaktionen Assays für den Nachweis von Zellviabilität, Zytotoxizität, Apop-
zählt in vielen Bereichen der Biowissenschaften zu den wichtig- tose, Autophagie und Entzündungsreaktionen. Dabei werden
sten Methoden. Zellbasierte Assays finden daher heutzutage sowohl metabolische als auch nichtmetabolische Marker ver-
routinemäßig ihren Einsatz bei der Entwicklung neuer Thera- wendet. Die Kombination verschiedener Assays (Multiplexing)
peutika und Identifizierung von potenziellen Wirkstoffkandi- ermöglicht die Analyse von mehr als einem Parameter in einer
daten. Probe. Dadurch wird die Interpretation der Daten erleichtert und
erlaubt beispielsweise die Unterscheidung zwischen Nekrose
und Apoptose.
ApoLive-Glo™ Caspase-Glo® 9 Assay One-Glo™+Tox
Caspase-3/7 CellTiter-Glo® Assay Reporter Luciferase
Live-Cell Protease Live-Cell Protease
Caspase-Glo® 8 Assay
CellTiter 96® AQueous One LDH
Solution Assay LDH Caspase-9
CellTiter-Blue® Assay LDH
LDH
RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay Viabilität LDH LDH
pro Caspase-9
Reduzierte
LDH
pro Caspase-8
Viabilität
LDH
LDH
pro Caspase-3
ATP ATP LDH
CellTiter-Fluor™ Assay
NADH NADH Caspase-8
Live-Cell
Protease
AKTIV
Reporter
CytoTox-Glo™ Assay
CytoTox-Fluor™ Assay ATP
LDH
ADP NADP-
LDH ADP
NADH
LDH
Dead-Cell LDH RealTime-Glo™
Protease
Annexin V Apoptosis
LDH and Necrosis Assay
MultiTox-Glo Assay Nekrose Apoptose
MultiTox-Fluor Assay
Dead-Cell Protease Live-Cell
LDH Protease Caspase-3
Live-Cell Protease Blebbing
LDH LDH
INAKTIV
LDH
Dead-Cell LDH
Protease
AKTIV
Mitochondrial ToxGlo™ Assay
ATP
LDH Dead-Cell Protease
CellTox™ Green Caspase-Glo® 3/7 Assay
Cytotoxicity Assay Apo-ONE® Caspase-3/7 Assay
LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay
CytoTox-ONE™ Assay
ApoTox-Glo™ Triplex
Caspase-3/7
Live-Cell Protease
Dead-Cell Protease8 Zellviabilität, Zytotoxizität, Apoptose, Autophagie und Entzündungsreaktionen [II]
Zellbasierte Assays auf einen Blick für Zellviabilität, Zytotoxizität,
Apoptose, Autophagie und Entzündungsreaktionen
96-Well
Assay Parameter/Biomarker Zeitbedarf Sensititvität 96-Well Platten Format Instrument
RealTime-Glo™ Metabolic Cell Viability Redoxpotential 0,5 – 72 h < 100 Zellen/Well 96/384/1536 Luminometer
Assay im 96-Well Format
CellTiter-Glo® Assay, ATP 10 min 10 – 15 lebende Zellen 96/384/1536 Luminometer/CCD
CellTiter-Glo® 2.0 Assay
CellTiter-Glo® 3D Assay ATP 30 min ND Alle gängigen 3D- Luminometer
Zellkultur Formate
CellTiter-Fluor™ Assay Live-Cell-Protease 0,5 – 3 h 40 lebende Zellen 96/384/1536 Fluorometer,
AFC 400Ex/505Em
CellTiter-Blue® Assay Resazurin Reduktion durch 1–4 h 400 lebende Zellen 96/384/1536 Fluorometer,
Reduktionsäquivalente Resorufin 560Ex/590Em
CellTiter 96® AQueous One Solution Assay MTS Reduktion durch 1–4 h 1000 lebende Zellen 96/384 Spektrophotometer
Reduktionsäquivalente Abs 490nm
BacTiter-Glo™ Assay ATP 5 min 10 lebende Bakterien 96/384 Luminometer
LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay LDH 30 – 60 min < 10 tote Zellen 96/384/1536 Luminometer
CellTox™ Green Assay DNA 0,25 – 72 h ND 96/384/1536 Fluorometer,
(485 – 500Ex/520 – 530Em)
CytoTox-Glo™ Assay Dead-Cell-Protease 15 min 10 tote Zellen 96/384/1536 Luminometer
Freisetzung
CytoTox-Fluor™ Assay Dead-Cell-Protease 0,5 – 3 h 10 tote Zellen 96/384 Fluorometer,
Freisetzung R110 485Ex/520Em
CytoTox-ONE™ Assay LDH-Freisetzung 10 min 200 tote Zellen 96/384 Fluorometer,
Resorufin 560Ex/590Em
Viral ToxGlo™ Assay ATP 10 min 15 lebende Zellen 96/384/1536 Luminometer
(384-well)
RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis Phosphatidylserin; 0,5 h – 48 h ND 96/384 Luminometer;
and Necrosis Assay DNA Fluorometer,
(485– 500Ex/520– 530Em)
Caspase-Glo® 3/7 Assay Caspase-3/7-Aktivität 0,5 h 100 apoptotische Zellen 96/384/1536 Luminometer
Apo-ONE® Caspase 3/7 Assay Caspase-3/7-Aktivität 1 – 18 h 625 apoptotische Zellen 96/384/1536 Fluorometer,
R110 499Ex/521Em
Autophagy LC3 HiBiT Reporter Human LC3 10 min – 3 h Signal- Hintergrund- 96/384 Luminometer
Assay System Verhältnis > 100
Caspase-Glo® 1 Inflammasome Assay Caspase-1-Aktivität 1h ND 96/384 Luminometer
MultiTox-Glo Assay Viabilität + Zytotoxizität; 0,5 h 40 lebende Zellen, 96/384/1536 Fluorometer,
Live- + Dead-Cell-Protease 10 tote Zellen AFC 400Ex/505Em
Luminometer
MultiTox-Fluor Assay Viabilität + Zytotoxizität; 0,5 – 3 h 40 lebende Zellen, 96/384/1536 Fluorometer,
Live- + Dead-Cell-Protease 10 tote Zellen AFC 400Ex/505Em
R110 485Ex/520Em
ApoLive-Glo™ Multiplex Assay Viabilität + Apoptose; 1–3 h ~ 40 lebende Zellen, 96/384 Fluorometer,
Live-Cell-Protease 100 apoptotische Zellen AFC 400Ex/505Em
+ Caspase-3/7 Luminometer
ApoTox-Glo™ Triplex Assay Viabilität, Zytotoxizität + 1–3 h ~ 40 lebende Zellen, 96/384 Fluorometer,
Apoptose 100 apoptotische Zellen AFC 400Ex/505Em
Live- + Dead-Cell-Protease + R110 485Ex/520Em
Caspase-3/7 Luminometer
One-Glo™+ Tox Assay Viabilität + Reportergen- 0,6 – 3 h ~40 lebende Zellen 96/384 Fluorometer,
expression; AFC 400Ex/505Em
Live-Cell-Protease + Luminometer
Luciferase-Aktivität
Mitochondrial ToxGlo™ Assay Mitochondriale Toxizität; 0,6 – 3 h ND 96/384 Fluorometer,
Dead-Cell-Protease + ATP; R110 485Ex/520Em
Luminometer[II] Zellviabilität, Zytotoxizität, Apoptose, Autophagie und Entzündungsreaktionen | Zellviabilität / Proliferation 9
IIa Zellviabilität
Teilen und vermehren sich die Zellen in meiner Zellkultur oder nahme der Zellpopulation auf Zytostase, Apoptose oder
nicht? Das ist meist die erste Frage, die sich stellt, wenn Zellen Nekrose beruht, empfehlen sich die Messung der Membran-
im Experiment Substanzen oder anderen Einflüssen ausgesetzt integrität und/ oder der Nachweis der Caspase-Aktivität.
sind. Die Antwort darauf kann durch die Messung verschiedener
Parameter gefunden werden. Eine bekannte Methode ist die RealTime-Glo™ Metabolic Cell Viability Assay
Messung von Reduktionsäquivalenten einer Zellkulturprobe. CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay
Dieser Wert verhält sich proportional zur Anzahl der lebenden CellTiter-Glo® 2.0 Cell Viability Assay
Zellen im Medium. Eine weitere Möglichkeit ist die Messung CellTiter-Glo® 3D Viability Assay
des ATP-Gehalts in lebenden Zellen, der indirekt mittels der Luci- CellTiter-96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)
ferase-Reaktion nachgewiesen werden kann. Die Verwendung CellTiter-Blue® Cell Viability Assay
eines lumineszenten Biosensors ist eine neue Methode, die es CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay
ermöglicht das Redoxpotential in der Zelle in Echtzeit über einen BacTiter-Glo™ Microbial Cell Viability Assay
langen Zeitraum zu messen. Um zu unterscheiden, ob die Ab-
Wirkstoffe Chemische E
inflüsse i nflüss
mittelte E e Stra
ver hlun
Zell g
Protein-Sensor: Mec
han
Nanoluc® isc
he
Ein
flü
Furimazin GF3 sse
Licht GF–N O O
H
Pro-Furimazin GF-Amino-Fluoro-Coumerin
GF-AFC
Intrazelluläre
Reduktion Luciferase
Luciferin Oxyluciferin + AMP
ATP
ATP + ATP + O2 + PPi + CO2 + Licht
GF-AFC
NADH
NADH Live-Cell-Protease
NAD+ NADH NAD+ NADH
AFC
Reduktionsreaktion ETR ETR
reduziert 380Ex / 505Em
Resazurin Resorufin MTS Formazan
O O O- Na+ O O O- Na+
N N
O10 Zellviabilität, Zytotoxizität, Apoptose, Autophagie und Entzündungsreaktionen | Zellviabilität / Proliferation [IIa]
für
Geeignet
lturen
3D-Zellku
ing mit
RealTime-Glo™ Metabolic Cell Viability Assay Multiplex
Green
CellTox™
Zellbasiert
Anwendung
Langzeitmessungen von Zellviabilität in Echtzeit, Zytotoxizität, Lebende Zellen Protein-
Intrazelluläre Substrat
Sensor:
Reduktion
Kinetische Messungen, Multiplexing mit anderen zellbasier- Nanoluc®
ten Assays.
Furimazin
Assay-Beschreibung
Licht
Der homogene RealTime-Glo™ Assay bietet eine biolumineszente Pro-Furimazin
Methode zur Bestimmung der Zellviabilität durch die Messung
Protein-
des Redoxpotentials in der Zelle. Der RealTime-Glo™ Assay ver- Sensor:
Nanoluc®
wendet die NanoLuc™ Luciferase als lumineszenten Biosensor.
Die NanoLuc™ Luciferase ist ein kleiner, besonders sensitiver Re-
porter, die das reduzierte metabolische Zellviabilitätssubstrat kein
Licht
ATP-unabhängig umsetzt. Das gemessene Signal korreliert direkt Tote Zellen
mit der Anzahl lebender Zellen in einer Zellkultur zum Zeitpunkt
Messung der Zellviabilität mittels eines lumineszenten Protein-
der Messung. Der Assay ist weder toxisch, noch lytisch und eig- Sensors (NanoLuc™ Luciferase) und eines metabolischen Zellvia-
bilitätssubstrats.
net sich daher besonders für kinetische Viabilitätsstudien mit
einer Inkubationszeit bis zu 72 Stunden. Zytotoxizität: CellTox™ Green
40000
RFU
Assay-Prinzip 35000
Der RealTime-Glo™ Assay enthält ein zellgängiges Pro-Furima- 30000
[Etoposid
nm ]
25000
zin-Substrat, das sogenannte „metabolische Zellviabilitätssub- 250
20000 167
strat“ und die NanoLuc™ Luciferase. Nach Zugabe des Reagen- 36 Stunden
15000 111
zes zu den Zellen wird das Pro-Substrat in den Zellen zu 10000 74
Furimazin reduziert und ins Medium abgegeben. Dort dient es 5000
49
33
als Substrat für die NanoLuc™ Luciferase, die als Sensor außer- 0
22
0 10 20 30 40 50 60 70 80
halb der Zelle agiert und ein stabiles Lumineszenzsignal gene- 15
Zeit (h)
riert. Tote Zellen sind nicht in der Lage, das metabolische 9.8
6.5
Zellviabilitätssubstrat zu reduzieren. Der Assay kann als a) End- Viabilität: RealTime-Glo 4.3
punktassay direkt zu den behandelten Zellen b) im Non-Step- 120000 2.9
RLU
1.9
Format für kinetische Bestimmungen zur Wirkstofflösung oder 100000
1.3
c) direkt bei der Aussaat hinzugegeben werden. 80000 0.86
0.57
60000 0.38
Assay-Merkmale 0.25
40000
Assay-Typ Lumineszent 0.17
12 Stunden
20000 0
Marker Redoxpotential 36 Stunden
Anwendung Messung von Zellviabilität in Echtzeit 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Zelltyp Zelllinien und Primärzellen
Zeit (h)
(adhärent oder in Suspension)
Durchführung Homogener No-Step Assay Kinetische Bestimmung der Wirkung von Etoposid auf MCF7-Zellen
durch Multiplexen von CellTox Green mit dem RealTime-Glo™ Assay.
Zeitbedarf Inkubation von 30 Minuten (nach Zugabe des Reagenzes) 500 MCF7-Zellen/Well wurden mit steigenden Konzentrationen an
Sensitivität < 100 Zellen/Well im 96-Well-Format, < 10 Zellen/ Etoposid behandelt bei simultaner Zugabe des RealTime-Glo™ Meta-
bolic Cell Viability Reagenzes und CellTox™ Green in das gleiche Well.
Well im Low-Volume 384-Well-Format
Robust HTS-geeignet, 96 – 1536-Well-Format[IIa] Zellviabilität, Zytotoxizität, Apoptose, Autophagie und Entzündungsreaktionen | Zellviabilität / Proliferation 11
für
Geeignet
Screening
CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay primäres
Zellbasiert
Anwendung
Zellviabilität; Proliferation; Zytotoxizität.
Assay-Beschreibung
Licht
Der CellTiter-Glo® Assay ist der sensitivste zellbasierte Assay für
den Nachweis der Zellviabilität. Deshalb eignet er sich auch Oxyluciferin
–
O S N O–
besonders für Studien an Primärzellen. Die einfache und
schnelle Durchführung sowie die Reproduzierbarkeit der Daten N S
sind herausragende Assay-Eigenschaften (Z‘-Faktor > 0,63 in Ultra-Glo™
O2
Luciferase ATP ATP
1536-Well). Ebenso der äußerst breite lineare Messbereich von Mg2+
10–50.000 Zellen. HO S N COOH
NADH
N S
Assay-Prinzip Luciferin
Der Assay basiert auf der Messung des ATP-Gehalts in einer
ATP-abhängigen Luciferase-Reaktion. Der ATP-Gehalt ist ein
Maß für die metabolische Aktivität von Zellen. Durch Umsatz
von Luciferin durch eine rekombinante Luciferase (Ultra-Glo™ • Messung des ATP-Gehalts
• Basiert auf einer ATP-abhängigen Luciferase-Reaktion
Luciferase) entsteht Oxyluciferin und Licht. Das Lichtsignal • Assay-Reagenz führt zur Lyse der Zellen
kann sowohl im Luminometer als auch mit Hilfe einer CCD-
Kamera gemessen werden und ist proportional zur Anzahl
lebender Zellen. Der Assay besteht aus zwei Komponenten,
einem lyophilisierten Substrat und einem Puffer, welche zu-
Ausgezeichnete Linearität und Sensitivität
sammen das Reagenz ergeben. Das Assay-Reagenz wird direkt
zu den Zellen gegeben und führt zur Lyse der Zellen.
1.800
Lumineszenz (RLU)
1.600
Assay-Merkmale 1.400
1.200 20
Assay-Typ Lumineszent (Glow-Type; T1/2 > 5 h) 1.000
Marker ATP 800
10
600
Anwendung Zellviabilität, Proliferation, Zytotoxizität 400
0
Zelltyp Zelllinien und Primärzellen 200 0 100 200 300 400
0
(adhärent oder in Suspension) 0 10.000 20.000 30.000 40.000 50.000
Durchführung Homogen, 1-Schritt-Assay Zellen/Well
Zeitbedarf 10 Minuten
Verdünnungsreihe von Jurkat Zellen in 96-Well-Platten. Die Anzahl
Sensitivität 10 lebende Zellen (96-Well) lebender Zellen von 10 bis 50.000 Zellen pro Well ist direkt propor-
Linerarität 10 – 50.000 Zellen tional zum gemessenen Lumineszenz-Signal (R = 0.99).
Robust HTS-geeignet, Hoher Z’-Faktor,
96 – 1536-Well-Format12 Zellviabilität, Zytotoxizität, Apoptose, Autophagie und Entzündungsreaktionen | Zellviabilität / Proliferation [IIa]
1 Woctuhrestabil!
tempera
bei Raum r
fü
geeignet
Besonders
CellTiter-Glo® 2.0 Cell Viability Assay Screening
primäres
Zellbasiert
Anwendung
Zellviabilität; Proliferation; Zytotoxizität. CellTiter-Glo® 2.0 und CellTiter-Glo® im Vergleich
Verbesserte Stabilität: < 20% Abnahme der Enzymaktivität
Assay-Beschreibung bei folgenden Lagerbedingungen
Der neu entwickelte Assay CellTiter-Glo® 2.0 zeichnet sich be-
22°C 4°C
sonders durch seine flexible Lagerungstemperatur und Einsetz- CellTiter-Glo® 12 Stunden 3,5 Tage
barkeit aus. Das Reagenz kann bei 4°C für 4 Wochen mit einer CellTiter-Glo® 2.0 1 Woche 4 Monate
verbleibenden Enzymaktivität von > 90% oder bei Raumtempe-
ratur für 7 Tage mit weniger als 15% Aktivitätsverlust gelagert 1,0
Lumineszenz (RLU)
werden, wodurch das Auftauen vor jeder Verwendung entfällt. 0,9
0,8
Ebenso fällt das Mischen von Puffer und Substrat weg, da der 0,7
Assay bereits als fertiges Reagenz geliefert wird. Der CellTiter- 0,6
0,5
Glo® 2.0 Assay eignet sich daher perfekt für Screens im regulä-
0,4
ren oder Low-Volume 96-Well, 384-Well und 1536-Well Format 0,3
0,2
mit einer hohen Sensitivität und einem hohen Z‘-Faktor.
0,1
0
Assay-Prinzip 0 7 14 21 28
Der Assay basiert auf der Messung des ATP-Gehalts in einer Zeit bei 22°C (Tage)
ATP-abhängigen Luciferase-Reaktion. Der ATP-Gehalt ist ein CellTiter-Glo® 2.0 Assay
CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay
Maß für die metabolische Aktivität von Zellen. Das Assay-Rea-
genz wird direkt zu den Zellen gegeben und führt zur Lyse der
Aliquots der Reagenzien wurden bei unterschiedlichen Tempera-
Zellen, wodurch Luciferin mit Hilfe der Ultra-Glo™ Luciferase turen gelagert und dann bei -80°C eingefroren. Nach dem Auftauen
der Reagenzien und Zugabe von 2 µM ATP in Wasser (1:1) wurde die
(rekombinante Luciferase) umgesetzt wird. Nach einer Inkuba-
Lumineszenz gemessen.* Die 4°C Daten wurden durch eine
tion von 10 Minuten kann ein stabiles Lumineszenzsignal mit Stabilitätsstudie bestätigt.
einer Halbwertszeit von > 3 Stunden gemessen werden, das pro-
portional zur Anzahl lebender Zellen ist.
Ergebnisse mit verschiedenen Zelllinien und Medien
Assay-Merkmale Lumineszenz Signalhalbwertszeit
Zelltyp (RLU x 106) (Stunden)
Assay-Typ Lumineszent (Glow-Type; T1/2 > 3 Stunden)
Medium CellTiter-Glo® CellTiter-Glo® CellTiter-Glo® CellTiter-Glo®
Marker ATP Reagent 2.0 Reagent Reagent 2.0 Reagent
Mema MCF7 4.06 6.40 7.30 4.81
Anwendung Zellviabilität, Proliferation, Zytotoxizität DU145 8.42 12.45 7.00 5.13
McCoy’s U20S 5.98 9.27 7.14 5.07
Zelltyp Zelllinien und Primärzellen 5A
(adhärent oder in Suspension) F12 CHO 5.86 8.76 6.97 4.99
RPMI HCT116 6.75 10.86 7.53 4.95
Durchführung Homogen, 1-Schritt-Assay Jurkat 12.80 21.10 7.41 5.33
U397 13.51 20.86 7.07 5.33
mit flexiblen Lagerungstemperaturen DMEM HEK293 6.21 10.07 7.27 4.83
Zeitbedarf 10 Minuten HeLa 5.80 9.01 7.02 4.88
HepG2 6.52 10.34 7.27 4.83
Sensitivität 15 lebende Zellen (384-Well)
Linearität 15 – 50.000 Zellen 10.000 Zellen wurden ausgesät und 24 Stunden inkubiert, das Me-
Robust HTS-geeignet, Hoher Z’-Faktor: 0,81 im dium 1:1 mit Reagenz gemischt und die Lumineszenz gemessen.
384-Well-Format, Skalierbar von * 100.000 Suspensionszellen
96 – 1536-Well-Format[IIa] Zellviabilität, Zytotoxizität, Apoptose, Autophagie und Entzündungsreaktionen | Zellviabilität / Proliferation 13
Anwendung des CellTiter-Glo® 3D Viability Assays
bei 3D-Mikrokulturen
fü r
ntwickelt
Speziell e
CellTiter-Glo® 3D lture n GravityTRAP™ Platte, Hanging-Drop Verfahren:
3D-Zellku Zellzahl (ausgesät) vs Lumineszenz und ATP-Recovery
Viability Assay 9
Lumineszenz (RLU x 106)
8
7
Zellbasiert 6
5 CellTiter-Glo® 3D
4 Herkömmlicher Assay
Anwendung 3
2
Zellviabilität; Proliferation; Zytotoxizität in 3D-Mikrokulturen.
1
0
Assay-Beschreibung 0 2,000 4,000 6,000
Der CellTiter-Glo® 3D Viability Assay ist eine Weiterentwicklung Zellzahl
des CellTiter-Glo® Assays zur Bestimmung der Zellviabilität spe- ATP (nM)
ziell in 3D-Kulturen. Dreidimensionale und hoch organisierte Zellzahl Durchmesser (µm) CellTiter-Glo® 3D Herkömmlicher Assay
Mikrogewebe spiegeln die natürliche Umgebung von Zell- und 6,000 716 1,327 290
2,250 533 1,079 262
Gewebeverbänden besser wider als traditionelle Monolayer- 1,125 468 799 206
Zellkulturen. Stoffwechselprozesse, Transportvorgänge und das 563 355 539 134
Zusammenspiel von Signalnetzwerken können erst in ihrer
HCT 116-Zellen (RPMI + 10% FBS) wurden mittels der Hanging Drop
organotypischen Mikroumgebung realistisch untersucht wer- Methode für 4 Tage zu einer Mikrokultur herangezogen (Gravity-
TRAP™ Platte, InSphero).
den. Der CellTiter-Glo® 3D ist ein biolumineszenter ATP-
Detektionsassay mit großer lytischer Stärke und vollständiger
ATP-Freisetzung durch Optimierung von Reagenz und Protokoll. Vergleich des Signal/Hintergrundverhältnisses
mit anderen Zellviabilitätsassays
Er besteht aus nur einem Reagenz und kann für eine Reihe von
3D-Zellkulturmodellen angewendet werden, wie ECM-unab-
10.000
Signal/Hintergrundverhältnis
HCT 116 Darmkrebszell-Spheroide
hängige (z.B. Hanging-Drop), ECM-abhängige (z.B. Matrigel™)
und synthetische Gerüstsubstanzen (z.B. Alvetex™). 1.000
Assay-Prinzip 100
Das Assay-Prinzip entspricht dem des CellTiter-Glo®, wobei es
10
sich bei diesem Assay um ein Einkomponenten-Reagenz mit
einem verlängerten Lyseprotokoll handelt. Nach Zugabe des 1
Reagenzes und einer Inkubation von insgesamt 30 Minuten CellTiter-Glo® 3D Alamar Blue MTT
lässt sich ein stabiles Lumineszenzsignal mit einer Halbwerts-
1.000
Signal/Hintergrundverhältnis
zeit von > 4 Stunden messen. Menschliches Leber-Mikrogewebe
Assay-Merkmale 100
Assay-Typ Lumineszent (Glow-Type; T1/2 > 4 Stunden)
Marker ATP 10
Anwendung Zellviabilität, Proliferation,
Zytotoxizität in 3D-Zellkulturen 1
3D-Zellkulturen Hanging-Drop-Mikrogewebe, Matrigel™,
CellTiter-Glo® 3D Alamar Blue MTT
Alvetex™, Kollagen-Matrix
Durchführung Homogen, 1-Schritt-Assay mit verbesserten Vergleich der Sensitivität verschiedener Viabilitätsassays an 3D-
Mikrogewebe. 400 HCT 116 Darmkrebszellen wurden in 96-Well
Lyseprotokoll GravityPlus™ Hanging-Drop-Platten (InSphero AG) ausgesät und für
Zeitbedarf 30 Minuten 4 Tage inkubiert. Die Zellviabilität der Spheroide mit einem Durch-
messer von ~ 340 µm wurde nach Herstellerangeben bestimmt. Der
Robust 96 – 1536-Well-Format, Mikrogewebe bis zu Zeitbedarf zur Durchführung der Assays lag für den CellTiter-Glo®
700 Mikrometer (Zelltyp-abhängig) 3D Assay bei 30 Minuten, für AlamarBlue® bei 3 Stunden und für
MTT Assays bei 8 Stunden. Dasselbe Protokoll wurde für mensch-
liches Leber-Mikrogewebe mit einem Durchmesser von ~ 200 µm
angewendet.14 Zellviabilität, Zytotoxizität, Apoptose, Autophagie und Entzündungsreaktionen | Zellviabilität / Proliferation [IIa]
on nur
Zugabe v
agenz
einem Re
CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)
Zellbasiert
Anwendung
Zellviabilität; Proliferation; Zytotoxizität .
Assay-Beschreibung ATP
Der CellTiter 96® AQueous One Solution Assay (MTS) beruht auf einer
colorimetrischen Methode zur Bestimmung der lebenden
NADH
Zellen und ist geeignet für Zellviabilitäts-, Proliferations- und
indirekt auch Zytotoxizitätsmessungen. Dieser 1-Schritt-Assay
NAD+ NADH
hat gegenüber MTT-Assays den Vorteil, dass das MTS-Forma-
zan-Produkt wasserlöslich ist. Somit entfallen Extraktions- ETR ETR
reduziert
schritte mit organischen Lösungsmitteln. Im Gegensatz zu her- MTS Formazan
kömmlichen colorimetrischen Assays kann der MTS-Assay auch
für Blutlymphozyten verwendet werden. Desweiteren besitzt
das Assay-Reagenz eine erhöhte Lagerungsstabilität bei 4°C im
Umsatz von MTS zu Formazan
Vergleich zu herkömmlichen Reagenzien. durch stoffwechselaktive Zellen
Assay-Prinzip
Der Nachweis der Zellviabilität mittels MTS beruht auf der
Reduktion des Tetrazoliumsalzes MTS zu wasserlöslichem
Formazan durch stoffwechselaktive Zellen. Das Assay-Reagenz Vergleich zwischen MTT- und MTS-Assay
enthält zusätzlich ein Elektronen-Transfer-Reagenz (ETR), das
1,0
Absorption (490 nm)
Phenazinethosulfat (PES). PES wird intrazellulär durch Reduk- 0,9
tionsäquivalente wie z.B. NADH oder NADPH reduziert und 0,8
0,7
führt außerhalb der Zelle zur Reduktion von MTS in das farb- 0,6
intensive Formazan. Die Absorption des Formazans bei 490 nm 0,5
0,4
kann ohne zusätzliche Behandlungsschritte direkt in der 0,3
96-Well-Platte gemessen werden. Der Readout ist direkt pro- 0,2
0,1
portional zur Anzahl lebender Zellen in Kultur.
0
0 50 100 150 200 250
Assay-Merkmale Zellen (x 103)/Well
Assay-Typ Absorptionsassay (Abs 490 nm +/- 40 nm)
MTS
Marker Reduktionsäquivalente MTT
wie z.B. NADH/NADPH
Anwendung Zellviabilität, Proliferation, Zytotoxizität Bestimmung der Zellviabilität von PBMCs (Periphäre mononukle-
äre Blutzellen) in einer 96-Well-Platte mit MTT bzw. MTS. Der MTS-
Zelltyp Zelllinien und Primärzellen, Pflanzen, Assay zeigt bei gleicher Zellzahl deutlich höhere Absorptionswerte
Hefen, Blutlymphozyten als der MTT-Assay.
Durchführung Homogen, 1-Schritt-Assay Abkürzungen:
Zeitbedarf 1 – 4 Stunden MTS: 3-(4,5-Dimethyl-2-yl)-5-(3-Carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-Tetrazol
PES: Phenazinethosulfat
Sensitivität 1000 lebende Zellen (96-Well) MTT: 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbrom[IIa] Zellviabilität, Zytotoxizität, Apoptose, Autophagie und Entzündungsreaktionen | Zellviabilität / Proliferation 15
CellTiter-Blue® Cell Viability Assay
Zellbasiert
Anwendung
Zellviabilität; Proliferation; Zytotoxizität; Multiplexing.
Assay-Beschreibung
Der CellTiter-Blue® Assay ist ein fluoreszenter zellbasierter Assay
für die Bestimmung der Zellviabilität, Proliferation und Zyto-
NAD+ NADH
toxizität. Im Gegensatz zu vergleichbaren Resazurin Assays ist
das Assay-Reagenz Resazurin hochrein und nicht toxisch für die Reduktionsreaktion
Zellen, so dass flexible Inkubationszeiten möglich sind. Kombi- Resazurin Resorufin
nationen mit weiteren zellbasierten Assays können mit densel- O O O- Na+ O O O- Na+
ben Zellen durchgeführt werden (z.B. Apo-ONE® Homogeneous N N
Caspase-3/7 Assay). O
Assay-Prinzip
Der Nachweis der Zellviabilität beruht auf dem blauen Indi-
Umsatz von Resazurin in Resorufin
kator-Farbstoff Resazurin, der intrazellulär durch stoffwechsel- durch stoffwechselaktive Zellen
aktive Zellen in das rosafarbene, fluoreszierende Resorufin um-
gesetzt wird. Das Assay-Reagenz wird direkt ins Medium gege-
ben. Die Bildung des Resorufins kann entweder im Fluorometer
(empfohlene Methode 560Ex/590Em) oder im Spektrophotome- Flexible Inkubationszeiten
ter (ELISA-Reader, 570 nm) detektiert werden.
12.000
Fluoreszenz (560Ex/590Em)
Assay-Merkmale 10.000
Assay-Typ Fluoreszent (560Ex/590Em) 8.000
Marker Reduktionsäquivalente wie z.B. NADH 6.000
Anwendung Zellviabilität, Proliferation, Zytotoxizität,
4.000
Multiplexing
2.000
Zelltyp Zelllinien und Primärzellen
0
(adhärent oder in Suspension) 0 10 20 30 40 50 60
Durchführung Homogen, 1-Schritt-Assay 3
Zellen (x 10 )/Well
Zeitbedarf 1 – 4 Stunden
4 Stunden
(Inkubation bis zu 22 Stunden möglich) 22 Stunden
Sensitivität 400 lebende Zellen (96-Well)
Robust Hoher Z’-Faktor, 96 – 384-Well-Format Jurkat Zellen wurden in einer 96-Well-Platte ausgesät und über
4 Stunden bzw. 22 Stunden mit dem CellTiter-Blue® Assay inku-
biert. Nach 4 Stunden liegt die Sensitivität bei 400 Zellen/Well und
das Signal verhält sich über den gesamten Messbereich linear zur
Zellzahl. Bei einer verlängerten Inkubation von 22 Stunden erhöht
sich die Nachweisgrenze auf etwa 50 Zellen/Well; allerdings ver-
hält sich der Assay bei einer Zellzahl von über 12.500 Zellen/Well
nicht mehr linear.16 Zellviabilität, Zytotoxizität, Apoptose, Autophagie und Entzündungsreaktionen | Zellviabilität / Proliferation [IIa]
CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay
Zellbasiert
Anwendung
CFF3
Zellviabilität; Zytotoxizität; Multiplexing mit anderen zell-
basierten Assays.
GF–N O O
H
Assay-Beschreibung GF-Amino-Fluoro-Coumarin
Der CellTiter-Fluor™ Assay ist ein fluoreszenter zellbasierter GF-AFC
Assay für die Bestimmung der Zellviabilität. Er eignet sich be-
sonders für das Multiplexing, da die Zellen intakt bleiben. Der
Assay wird häufig für die Normalisierung von Daten eingesetzt,
d.h. um Unterschiede zwischen einzelnen Wells und Platten GF-AFC
auszugleichen. Weil der verwendete Marker unabhängig von Live-Cell-Protease
Veränderungen im Reduktionspotential der Zelle ist, eignet sich
der Assay zur Messung von Viabilität als Alternative für andere AFC
Assays oder als Ergänzung. Außerdem kann der CellTiter-Fluor™
380Ex/505Em
Assay sehr gut für die Automatisierung eingesetzt werden.
Assay-Prinzip
Der Assay basiert auf der Messung einer konservierten und • Umsatz von zellpermeablen GF-AFC
durch die Live-Cell-Protease
konstitutiven Protease-Aktivität, der sogenannten Live-Cell- • Die Live-Cell-Protease ist extrazelluär inaktiv
Protease, die nur in lebenden Zellen aktiv ist. Die Aktivitätsmes-
sung erfolgt über das pro-fluorogene, zellpermeable
Peptidsubstrat Gly-Phe-Aminofluorocoumarin (GF-AFC), das
intrazellulär zu dem fluoreszierenden Produkt AFC umgesetzt
wird. Das entstehende Fluoreszenz-Signal ist proportional zur Exzellente Korrelation zwischen ATP-basierter
Zellviabilität und korreliert mit anderen Zellviabilitätsmessun- und Live-Cell-Protease-basierter Zellviablitätsmessung
gen, wie der Messung von ATP oder Reduktionsäquivalenten.
ATP-basierter Assay Lumineszenz (RLU)
160.000
Assay-Merkmale 120.000
r2 = 0.9923
Assay-Typ Fluoreszent (380 – 400Ex/505Em)
Marker Live-Cell-Protease 80.000
Anwendung Zellviabilität, Zytotoxizität, Multiplexing
40.000
mit anderen zellbasierten Assays
Zelltyp Zelllinien und Primärzellen 0
(adhärent oder in Suspension) 250 750 1.250 1.750 2.250 2.750
Durchführung Homogen, 1-Schritt-Assay GF-AFC Fluoreszenz (RFU)
Zeitbedarf 0,5 – 3 Stunden
Sensitivität 40 lebende Zellen (96-Well) Der CellTiter-Fluor™ Assay zeigt eine sehr gute Korrelation zu bereits
etablierten Nachweismethoden für die Zellviabilität, wie hier am
Robust HTS-geeignet, Skalierbar von Beispiel des ATP-basierten CellTiter-Glo® Assays zu erkennen ist.
96 – 1536-Well-Format[IIa] Zellviabilität, Zytotoxizität, Apoptose, Autophagie und Entzündungsreaktionen | Zellviabilität / Proliferation 17
BacTiter-Glo™ Microbial Cell Viability Assay
Zellbasiert
Anwendung
Viabilität von Gram-positiven & Gram-negativen Bakterien & Ausgezeichnete Sensitivität und Linearität
Hefen; einfache Bestimmung von Wachstumskurven; Aktivi-
Signal : Hintergrund
107
tätsbestimmung und Screening antimikrobieller Substanzen.
106
105
Assay-Beschreibung 104
Der BacTiter-Glo™ Microbial Cell Viability Assay ist ein lumines- 103
zenter Assay für die Bestimmung der Viabilität von Bakterien 102
10 Detektionslimit
in Kultur durch Messung des ATP-Gehalts. Dieser einzigartige
1
1-Schritt-Assay ist geeignet für den Hochdurchsatz. Er zeichnet 0
sich durch eine äußerst hohe Sensitivität und einen breiten 1 10 102 103 104 105 106 107 108
linearen Messbereich aus. Der Assay ist kompatibel mit gängi- Zellen/Well
gen Medien und Lösungsmitteln. E. coli
Korrelation zwischen Bakterienanzahl und Lu-
S. aureus
P. aeruginosa mineszenzsignal. Es können bis zu 10 Zellen in
Assay-Prinzip B. cereus Abhängigkeit des Bakterienstamms nachge-
wiesen werden.
Der Assay basiert auf der Messung des ATP-Gehalts und korre-
liert somit mit metabolisch-aktiven Zellen. Die Formulierung
des Assay-Reagenz führt zur Lyse der Bakterien. Dadurch wird
ATP freigesetzt und über eine ATP-abhängige Luciferase-Reak-
BacTiter-Glo™-Assay ist kompatibel
tion bestimmt. Bereits nach 5-minütiger Inkubationszeit mit mit gängigen Medien und Lösungsmitteln
dem Assay-Reagenz können die Signale ausgelesen werden.
107
RLU
MH: Mueller Hinton II Broth
Assay-Merkmale LB: Luria Bertani
TSB: Trypticase Soy Broth
Assay-Typ Lumineszent (Glow-Type; T1/2 > 0,5 h) YPD: Yeast Peptone Dextrose
Marker ATP
106
Anwendung Viabilitätsmessung von Bakterien & Hefen
Bakterien/Hefe Gram-positive Bakterien,
Gram-negative Bakterien, Hefen
105
Durchführung Homogen, 1-Schritt-Assay MH LB TSB YPD
Zeitbedarf 5 Minuten
107
RLU
Sensitivität 10 Bakterien (1.000-fach sensitiver
0%
als die Messung der optischen Dichte) 3%
Robust HTS-geeignet, Hoher Z’-Faktor, Skalierbar
von 96 – 1536-Well-Format
105
Ethanol Isopropanol DMSO Methanol
Die Kompatibilität des BacTiter-Glo™-Assays wurde in unterschied-
lichen Medien und gegenüber verschiedenen Lösungsmittelzu-
sätzen mit ~ 1 × 10-12 mol ATP getestet.18 Zellviabilität, Zytotoxizität, Apoptose, Autophagie und Entzündungsreaktionen | Zytotoxizität [IIb]
IIb Zytotoxizität
Der Begriff der Zytotoxizität steht für das Potenzial bzw. die bei apoptotischen Zellen wird als sekundäre Nekrose bezeichnet
Aktivität, Gewebezellen zu schädigen und den Zelltod einzulei- und findet zu einem späteren Zeitpunkt statt als bei der zeitlich
ten. Dafür kommen unter anderem sowohl chemische und bio- schnell ablaufenden primären Nekrose. Daher ist die Wahl der
logische Verbindungen als auch Immunzellen (z.B. zytotoxische optimalen Kultivierungsdauer entscheidend und sollte durch
T-Zellen) in Frage. Zytotoxische Aktivität führt zu einer Reduk- Messung zu verschiedenen Zeitpunkten ermittelt werden. In Ab-
tion der Zellviabilität und leitet den Zelltod über Nekrose und/ hängigkeit von der Substanz und der Konzentration sind teil-
oder Apoptose ein. Häufig werden auch Zellviabilitätsassays weise gemischte Phänomene zu beobachten, d.h. der Zelltod
eingesetzt, um das zytotoxische Potenzial von beispielsweise verläuft über nekrotische und apoptotische Anteile.
einer Substanz nachzuweisen. Möchte man allerdings zwi- Die hier im Folgenden beschriebenen Zytotoxizitätsassays ba-
schen nekrotischen und apoptotischen Prozessen unterschei- sieren auf dem Nachweis von zytosolischen Enzymen (Lactat-
den, sind weitere Assays erforderlich, die auf dem Nachweis Dehydrogenase (LDH); Dead-Cell-Protease) und DNA, die in Folge
anderer Marker beruhen. von Membranschäden in das Kulturmedium abgegeben wurden.
Die Nekrose wird durch Zellmembranintegritätstests ge- Ein ATP-basierender Assay bestimmt den zytophatischen Effekt
messen. Der zeitlich schnell ablaufende Verlust der Zellmembran- von lytischen Viren in Zellen.
integrität und die Freisetzung zytoplasmatischer Bestandteile
sind typische Kennzeichen für Nekrose. Im Gegensatz dazu, bleibt LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay
bei der Apoptose die Membranintegrität erhalten und diese Zel- CellTox™ Green Cytotoxicity Assay
len werden in vivo durch Phagozyten beseitigt. Bei der Interpre- CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay
tation von Datensätzen ist stets zu beachten, dass Phagozyten CytoTox-Fluor™ Cytotoxicity Assay
in der Zellkultur fehlen, und dass auch apoptotische Zellen ihre CytoTox-ONE™ Homogeneous Membrane Integrity Assay (LDH)
Membranintegrität verlieren. Der Verlust der Membranintegrität ViralTox-Glo™ Assay
HO S N COOH
Oxyluciferin Licht
Luciferin N S
oder
oder
O O O- Na+ O O O- Na+
Diaphorase
H Resorufin Resazurin
S N COOH N N
AAF-N
OH NAD+ NADH O O
N S
CH3 – C – COOH CH3 – C – COOH
Dead-Cell LDH
Protease Aktivität H Pyruvat
Laktat
H2N S N COOH
AAF + + ATP + O2
N S
Luciferase
Mg2+ LDH
LDH
Licht LDH
NADP - ADP
bis-AAF-R110 CellTox Green
Dead-Cell Dead-Cell
Protease Protease
R110[IIb] Zellviabilität, Zytotoxizität, Apoptose, Autophagie und Entzündungsreaktionen | Zytotoxizität 19
eit
über die Z
Messung
für
Geeignet
LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay lture n
3D-Zellku
Zellbasiert
Anwendung
Nachweis von Zytotoxizität bei geringer Zellzahl und aus der- LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay-Prinzip
selben Probe über die Zeit.
Beschädigte
Assay-Beschreibung Zelle
LDH
Der biolumineszente LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay misst die Frei-
setzung von Laktatdehydrogenase (LDH) ins Zellkulturmedium Laktat LDH Pyruvat
bei Beschädigung der Plasmamembran. Die hohe Sensitivität
des Assays erlaubt die Zytotoxizitätsmessung bei Proben mit NAD NADH
geringer Zellzahl wie 3D-Zellkultur-Sphäroiden oder Stamm- Ultra-Glo™ rLuciferase
Reduktase- + ATP
zellen. Die mehrmalige Entnahme kleiner Mengen an Medium Substrat
Reduktase Luciferin Licht
(2 – 5 µl) zu verschiedenen Zeitpunkten aus einem Well ermög-
licht es, aus nur einem Experiment mehr Datenpunkte zu gene-
rieren, während gleichzeitig verbleibendes Medium mit den
Multiplexing mit dem CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay
Zellen für weitere zellbasierte Assays genutzt werden kann.
RLU (CellTiter-Glo® 3D Assay)
RLU (LDH-Glo™ Assay)
2 x 106 2,5 x 105
Assay-Prinzip
Durch Entnahme von 2 – 5 μl Zellkulturüberstand zu den ge-
2 x 105
1,5 x 106
wünschten experimentellen Zeitpunkten und direkte Ver- 1 x 106
1,5 x 105
dünnung in LDH Storage Buffer werden die Proben gesammelt. 1 x 105
5 x 105
Danach können diese entweder sofort gemessen oder bei -20°C 5 x 104
für bis zu 4 Wochen gelagert werden. Das LDH-Detektions- 0
0
reagenz (welches Laktat, NAD+, Reduktase, Reduktase-Substrat -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
und Ultra-Glo™ rLuciferase enthält) wird zur verdünnten Probe
log [Aflatoxin B1], µM
gegeben. LDH katalysiert die Oxidation von Laktat bei gleichzei-
tiger Reduktion von NAD+ zu NADH, welches die Reduktase für LDH Assay CTG 3D Assay CellTiter-Glo® 3D Assay
EC50 3.52 0.4999 LDH-Glo™Assay
den Umsatz ihres Substrats zu Luciferin nutzt. Dieses wird
durch die Ultra-Glo™ rLuciferase in einer biolumineszenten Re-
behandelt. Proben (10 μl) wurden in PBS mit einer Verdünnung von
Humane Leber-Mikrogewebe wurden für 48 h mit Aflatoxin B1
aktion umgesetzt, deren Signal proportional zur vorhandenen
LDH-Menge ist. 1:2,5 gesammelt und 10-fach weiter verdünnt. Die Toxizitäts-
Glo™ Cytotoxicity Assays bestimmt, indem 15 μl der Probe mit
veränderung während der Behandlung wurde mithilfe des LDH
Assay-Merkmale 15 μl des LDH-Detekionsreagenzes gemischt und die Lumineszenz
nach 60-minütiger Inkubation (Raumtemperatur) gemessen
Assay-Typ Lumineszent wurde. Nach Entnahme der Probe für die LDH-Bestimmung wurde
Marker LDH der verbliebenen Mikrogewebeprobe ein gleiches Volumen an
CellTiter-Glo® 3D-Reagenz hinzugefügt, um die Viabilität zu be-
Anwendung Zytotoxizität; Multiplexing stimmen.
Zelltyp Zelllinien, 3D-Mikrogewebe, Primärzellen,
Stammzellen
Durchführung Nicht-lytisch, 1-Schritt-Assay; Proben-
nahme aus demselben Well über die Zeit
Zeitbedarf 30 – 60 Minuten
Sensitivität < 10 tote Zellen
Robust Skalierbar von 384- – 1536-Well-Format20 Zellviabilität, Zytotoxizität, Apoptose, Autophagie und Entzündungsreaktionen | Zytotoxizität [IIb]
für
Geeignet
lturen
3D-Zellku
ing mit
Multiplex
CellTox™ Green Cytotoxicity Assay lo® 3D
CellTiter-G
Zellbasiert
Anwendung
Nachweis von Zytotoxizität und Membranschäden; kinetische Freigesetzte DNA – ein stabiler Biomarker
für die Zytotoxizität
Studien; Multiplexing mit anderen Assays.
Assay-Beschreibung
Der CellTox™ Green Cytotoxicity Assay misst zytotoxische Effekte
in Zellkulturen mittels eines fluoreszenten DNA-Markers. Der
CellTox™ Green Fluoreszenzfarbstoff ist für mindestens 72 Stun-
den stabil, nicht toxisch und flexibel einsetzbar. Möglich sind Lebende Zellen Tote Zellen
sowohl kinetische Studien als auch Endpunkt-Bestimmungen
im Add-Mix-Measure-Format. Besonders geeignet ist dieser geringe Fluoreszenz hohe Fluoreszenz
Assay für Wirkstoffstudien mit langen Expositionszeiten (bis zu
72 Stunden) im Hochdurchsatzverfahren (96- bis 1536-Well Sequentielles oder simultanes Multiplexing
Format). Sequenzielles oder simultanes Multiplexing erweitern mit CellTiter-Glo®
CellTox™ Green Assay
die flexiblen Einsatzmöglichkeiten. Der CellTox™ Green Farbstoff CellTiter-Glo® Assay
400.000
Fluoreszenz (RFU)
ist photostabil und kann für das Imaging eingesetzt werden.
Lumineszenz (RLU)
14.000
300.000
12.000
Assay-Prinzip
Der Nachweis der Zytotoxizität durch DNA ist besonders zuver- 10.000 200.000
lässig, da er nicht von enzymatischen Reaktionen abhängt. Der 8.000
100.000
CellTox™ Green Fluoreszenzfarbstoff ist nicht membrangängig.
6.000
Er bindet an die DNA toter Zellen, die nach Verlust der Membra-
0
nintegrität freigesetzt wird, was zu einer starken Zunahme der -10 -9 -8 -7 -6 -5
Fluoreszenz führt. Lebende intakte Zellen tragen nicht zum Sig- Log [Bortezomib], M
nal bei. Somit ist das Fluoreszenzsignal direkt proportional zur
Zytotoxizität. Multiplexing mit CellTiter-Glo® 3D
Der CellTox™ Green Farbstoff kann jederzeit zugegeben werden,
z.B. während des Aussäens der Zellen, des Mediumwechsels
Lumineszenz (RLU)
3,500,000 CellTiter-Glo® 3D 3,500
Fluoreszenz (RFU)
CellTox™ Green
oder mit der Wirkstofflösung. 3,000,000 3,000
2,500,000 2,500
Assay-Merkmale 2,000,000 2,000
Assay-Typ Stabiles Fluoreszenzsignal für 72 Stunden 1,500,000 1,500
1,000,000 1,000
(485 – 500Ex/520 – 530Em)
500,000 500
Marker DNA
0 0
Anwendung Zytotoxizität, Membranintegrität, 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100
Multiplexing mit anderen Assays
Panobinostat (µM)
Zelltyp Zelllinien
Durchführung Kinetische Studien oder Endpunkt- HCT 116 Zellen wurden in InSphero GravityPLUS™ 3D Zellkultur-
platten 4 Tage kultiviert, um ein Mikrogewebe von 350 µm Dicke zu
bestimmung
bilden. Die Ansätze wurden mit CellTox™ Green und Panobinostat
Zeitbedarf 15 Minuten Inkubation für 48 Stunden behandelt. Nach Messung der Fluoreszenz wurde
ein gleiches Volumen an CellTiter-Glo® 3D hinzugegeben, die Plat-
Robust HTS-geeignet, Skalierbar von
ten für 5 Minuten geschüttelt und nach einer Inkubation von 30 Mi-
96 – 1536-Well-Format nuten die Lumineszenz gemessen.[IIb] Zellviabilität, Zytotoxizität, Apoptose, Autophagie und Entzündungsreaktionen | Zytotoxizität 21
er
Sensitivst y
zitätsassa
CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay Zytotoxit
Zellbasiert
Anwendung
H
Zytotoxizität; Membranschäden; Multiplexing mit anderen S N COOH
AAF-N
Assays.
N S
Dead-Cell
Assay-Beschreibung Protease-Aktivität
Der CytoTox-Glo™ Assay ist ein lumineszenter zellbasierter H2N S N COOH
AAF + + ATP + O2
Assay für die Bestimmung der Zytotoxizität. Der Assay ist be- N S
sonders für das Multiplexing geeignet, da die Zellen intakt blei- Luciferase
Mg2+ NADP - ADP
ben, und ist daher eine Komponente des MultiTox-Glo Multiplex
Cytotoxicity Assay. Er wird auch für die Normalisierung von
Licht
Daten eingesetzt, d.h. um Unterschiede zwischen einzelnen
Wells und Platten auszugleichen. Der CytoTox-Glo™ Assay kor-
reliert sehr gut mit anderen Zytotoxizitätsmessungen wie LDH-
Nachweis und DNA-Färbung.
Assay-Prinzip
Das Prinzip des CytoTox-Glo™ Assays basiert auf der Aktivitäts-
messung der Dead-Cell-Protease, die in Folge von Zellmem-
Der CytoTox-Glo™ Assay korreliert sehr gut mit etablierten
branschäden ins Medium freigesetzt wird. Über ein luminoge- Methoden zur Bestimmung der Membranintegrität
nes Peptidsubstrat Ala-Ala-Phe-Aminoluciferin (AAF-Amino-
luciferin), das nicht die Zellmembran passieren kann, wird die
Laktat-Dehydrogenase
Fluoreszenz (AU x 103)
DNA-Färbung
Fluoreszenz (RFU x 103)
20 5
r2 = 0.9938 r2 = 0.9973
15 4
Aktivität der Dead-Cell-Protease indirekt über eine nachge- 3
10
schaltete Luciferase-Reaktion gemessen. Das Reagenz wird 5
2
1
direkt zu den Zellen gegeben. Bereits nach 15 Minuten kann der 0 0
0 5 10 15 20 25 0 10 20 30 40 50
Assay ausgelesen werden. Das Lumineszenzsignal ist ein Maß Dead-Cell-Protease Dead-Cell-Protease
Lumineszenz (RLU x 103) Lumineszenz (RLU x 103)
für die Anzahl geschädigter Zellen. Durch Zugabe eines lyti- D
schen Reagenzes kann in einem weiteren Schritt zusätzlich ein
Wert für die Gesamtzellzahl ermittelt werden (totale Lyse).
Dieser Wert eignet sich zur Normalisierung. Vergleich zwischen LDH- und CytoTox-Glo™ Assay
Assay-Merkmale 2.500
Signal/Hintergrund
Assay-Typ Lumineszent (Glow-Type) 2.000 CytoTox-Glo™ Assay
Fluorescent LDH Assay
Marker Dead-Cell-Protease
1.500
Anwendung Zytotoxizität, Membranintegrität,
1.000
Komplement-abhängige Zytotoxizität
(CDC), Multiplexing mit anderen Assays 500
Zelltyp Zelllinien und Primärzellen 0
0 2.500
Durchführung Homogen, 1-Schritt-Assay 5.000 7.500 10.000
Zeitbedarf 15 Minuten Tote Zellen/Well
Sensitivität 10 tote Zellen (96-Well)
Höhere Sensitivität und größerer Messbereich mit CytoTox-Glo™
Robust HTS-geeignet, Skalierbar von
96 – 1536-Well-FormatSie können auch lesen
