Effekte von Chemikalienmischungen auf die Hautsensibilisierung: Untersuchungen an in-vitro-Modellen - opus4.kobv.de
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Effekte von Chemikalienmischungen auf die
Hautsensibilisierung: Untersuchungen an
in-vitro-Modellen
Institut für Arbeits-, Sozial- und Umweltmedizin
der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. med.
vorgelegt von
Anna Maria Antonia De Rentiis
Als Dissertation genehmigt von der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. med. Markus Neurath
Gutachterin: Prof. Dr. med. Simone Schmitz-Spanke
Gutachter: Prof. Dr. med. Hans Drexler
Tag der mündlichen Prüfung: 24.05.2022
meiner Familie
Inhalt
1. Einleitung ............................................................................................................................................... 1
I. Fragestellung und Zielsetzung der Dissertation ........................................................................................... 1
II. Aktueller Forschungsstand .......................................................................................................................... 1
1. Aufbau der gesunden menschlichen Haut .................................................................................................. 1
2. Hautsensibilisierung durch ein Allergen, Hautirritation durch einen Reizstoff – Begriffserklärung und
Unschärfen..................................................................................................................................................... 2
3. Sensibilisierende Wirkung von Chemikalienmischungen.......................................................................... 4
4. Adverse Outcome Pathways ...................................................................................................................... 5
5. Der AOP der allergeninduzierten Hautsensibilisierung ............................................................................. 6
6. Methoden zur Messung des AOP an der Haut ........................................................................................... 7
7. Der AOP an Ko-Kulturen: Möglichkeit mechanistischer Untersuchungen – Ausblick
Zytokine/Chemokine ..................................................................................................................................... 7
III. Methoden .................................................................................................................................................... 8
1. Chemikalien ............................................................................................................................................. 8
2. Modelle und Messgrößen ........................................................................................................................ 8
1. Keratinozyten und der KeratinoSensTM-Test......................................................................................... 8
2. Fibroblasten ........................................................................................................................................ 10
3. Monozyten und der U-SENSTM-Test .................................................................................................. 10
4. Ko-Kultur............................................................................................................................................ 11
3. Versuchsdesign ....................................................................................................................................... 13
IV. Ergebnisse .................................................................................................................................................. 15
1. Ergebnisse Einzelsubstanzen an KeratinoSensTM-Zellen ................................................................... 15
2. Ergebnisse Mischungen an KeratinoSensTM-Zellen ........................................................................... 15
3. Erste Ergebnisse zum Metabolitenprofil nach Exposition gegen Einzelsubstanzen und Mischungen
in Ko-Kultur .............................................................................................................................................. 16
V. Fazit ............................................................................................................................................................. 16
2. Text der Publikation ............................................................................................................................ 17
3. Literaturverzeichnis ............................................................................................................................ 18
4. Abkürzungsverzeichnis ....................................................................................................................... 25
5. Verzeichnis der Veröffentlichungen ..................................................................................................... 26
6. Danksagung ......................................................................................................................................... 27
1. Einleitung
I. Fragestellung und Zielsetzung der Dissertation
Die Verhinderung der Entstehung von Erkrankungen ist die Kernaufgabe der Arbeitsmedizin.
Dafür müssen pathophysiologische Mechanismen und der Übergang von adaptiven zu adversen
Effekten bekannt sein. Die vorliegende experimentelle Arbeit untersucht, ob die gleichzeitige
Applikation von Allergenen und hautreizenden Stoffen (Reizstoffen) eine sensibilisierende (=
adverse) Reaktion auslöst und diese, im Gegensatz zur alleinigen Applikation, bereits bei
niedrigeren Konzentrationen der Substanzen eintritt.
II. Aktueller Forschungsstand
1. Aufbau der gesunden menschlichen Haut
Abbildung 1: Aufbau der menschlichen Haut (eigene Grafik nach Lüllmann-Rauch, 2012 –
Libre Office Draw)
Die menschliche Haut besteht aus drei Schichten: Epidermis, Dermis und Hypodermis
(Pupovac et al., 2018).
Die Epidermis bildet einen mechanischen und chemischen Schutzwall vor der Umwelt,
vergleichbar mit einer Ziegelmauer mit Mörtelfugen (Elias, 1983). Sie besteht aus mehreren
Schichten von Keratinozyten, die durch Lipide und Zellkontakte verknüpft sind. Die
1Neubildung der Keratinozyten findet am Stratum basale der Epidermis, also an der Grenze von
Dermis zu Epidermis statt. Neugebildete Keratinozyten schieben die älteren Keratinozyten
Richtung Körperoberfläche. Die alten Keratinozyten sterben sukzessive ab und bilden so eine
variabel dicke, hydrophobe, superfizielle Hornschicht aus abgestorbenen Keratinozyten, die
weiterhin durch Lipide und Zellkontakte miteinander vernetzt sind. Dieser lipophile
„Mörtel“ hindert wasserlösliche Moleküle an der Hautpassage (Lüllmann-Rauch, 2012: 108).
Zwischen den Keratinozyten eingestreute Zellen erweitern die Schutzfunktion der Epidermis.
Dazu gehören unter anderem Melanozyten, die dem Schutz vor ultraviolettem Licht dienen,
und Langerhans-Zellen (Matejuk, 2018). Langerhans-Zellen sind besondere dendritische
Zellen. Wenn sie einen Fremdstoff detektieren, der das Stratum corneum überwunden hat,
wandern sie zu dem ihnen am nächsten gelegenen Lymphknoten und aktivieren dort v.a. über
MHC-II-Moleküle T-Zellen des adaptiven Immunsystems (Lüllmann-Rauch, 2012: 557).
Die Dermis leistet ebenfalls einen wichtigen Beitrag zur Immunabwehr. Sie besteht aus einem
Netz von Fibroblastenausläufern, das unter anderem von zahlreichen Immunzellen (meist
dendritische Zellen) durchsetzt ist (Matejuk, 2018). Unterschiedliche Typen von Fibroblasten
unterteilen die Dermis in eine papilläre, dichtere und eine retikuläre, lockerere Schicht (Sriram
et al., 2015).
Die Hypodermis dient als dicke, mit Blutgefäßen durchsetzte Fettschicht besonders der
thermischen und mechanischen Isolierung sowie der Ernährung der Haut. Sie besteht vor allem
aus Adipozyten (Abaci et al., 2017).
2. Hautsensibilisierung durch ein Allergen, Hautirritation durch einen Reizstoff –
Begriffserklärung und Unschärfen
Unter dem Begriff „Reizstoff“ werden verschiedene Chemikalien mit irritativen Eigenschaften
zusammengefasst, wie zum Beispiel Detergentien, organische Lösungsmittel und Säuren.
„Allergene“ sind immer Antigene, also Stoffe, die eine Antwort des adaptiven Immunsystems
hervorrufen (Altmeyer, 2017a). Meist handelt es sich dabei um Eiweiße oder
Eiweißverbindungen; aber auch andere, darunter auch nicht-organische, Stoffe können als
Antigene fungieren (Altmeyer, 2017b).
2Beide Stoffgruppen können das klinische Bild einer Kontaktdermatitis hervorrufen. Reizstoffe
führen typischerweise zu einer sogenannten irritativen Kontaktdermatitis (ICD), Allergene zu
einer allergischen Kontaktdermatitis (ACD) (Ruëff and Schnuch, 2018). Unschärfen entstehen
einerseits, da die eindeutige Klassifikation eines Stoffes als Allergen oder als Reizstoff nicht
immer möglich ist, zum Beispiel besitzen bestimmte Allergene zusätzlich reizende
Eigenschaften (Koppes et al., 2017); andererseits spielen sowohl bei der allergischen als auch
bei der irritativen Kontaktdermatitis nicht nur die auslösenden Substanzen, sondern auch
intrinsische und extrinsische Faktoren eine beeinflussende Rolle (Fartasch, 2012).
So ist die Ausprägung einer irritativen Kontaktdermatitis abhängig von der Potenz des
Reizstoffes, der Expositionsdauer und der Expositionsart, aber auch von individueller
Anfälligkeit. Die Entstehung eines allergischen Kontaktekzems ist hingegen abhängig von der
individuellen immunologischen Prädisposition (Ruëff and Schnuch, 2018). Zudem wird sie von
exogenen Faktoren wie zum Beispiel klimatischen Bedingungen oder Vorschädigung der Haut
beeinflusst (Fartasch, 2012).
Vereinfacht beschrieben wird der Unterschied zwischen den beiden Kontaktekzemen
wesentlich dadurch bedingt, dass das irritative Kontaktekzem primär vom angeborenen
Immunsystem und das allergische Kontaktekzem vom erworbenen Immunsystem unterhalten
wird. Daher ist die Entstehung einer akuten irritativen (toxischen) Kontaktdermatitis, anders als
bei einer allergischen Kontaktdermatitis, schon bei Erstkontakt mit einem Reizstoff möglich.
Dieses Krankheitsbild ist nach Beendigung der Exposition in der Regel vollständig reversibel
und chronifiziert nur, wenn weiterhin Kontakt zur auslösenden Noxe besteht. Kommt es zur
erneuten Exposition auf abgeheilter Haut, ruft dieselbe Dosis eine gleich starke Hautreaktion
hervor wie bei Erstkontakt (Ruëff and Schnuch, 2018).
Im Detail ist der Pathomechanismus der irritativen Kontaktdermatitis noch nicht vollständig
geklärt (Soltanipoor et al., 2018). Es wird unter anderem davon ausgegangen, dass Reizstoffe
den Schutz der Haut durch eine chemische Schädigung der Ziegelstein-Mörtel-Struktur der
Epidermis beeinträchtigen (Williams and Barry, 2004). Reizstoffe wie Natriumdodecylsulfat
(SDS) können Lipidvernetzungen lösen und Zellkontakte sowie Zellwände denaturieren
(Crawford and Zirwas, 2014). Konsequenzen eines Kontaktes mit Reizstoffen sind meist eine
Durchlässigkeitssteigerung der Haut und eine Entzündungsreaktion (Smith et al., 2002). Die
Durchlässigkeitssteigerung wird im medizinischen Bereich genutzt, um die Hautpenetration
3von Medikamenten zu erleichtern (Mueller et al., 2016). Die Entzündungsreaktion wird durch
proinflammatorische Zytokine aus Keratinozyten hervorgerufen, die das angeborene
Immunsystem aktivieren (Ruëff and Schnuch, 2018). Zwar weisen Ergebnisse der
Grundlagenforschung darauf hin, dass es allein schon durch die Durchlässigkeitssteigerung der
Haut zu einer Rekrutierung von T-Zellen kommt (Nishijima et al., 1997), die aktive Mitwirkung
von T-Zellen als Teil des erworbenen Immunsystems wird aber bislang explizit ausgeschlossen
(Ruëff and Schnuch, 2018).
Im Gegensatz zu Reizstoffen lassen Haut- bzw. Kontaktallergene die Epidermis nach
bisherigem Stand der Forschung zum großen Teil intakt. Aktuell wird die Entstehung der
allergischen Kontaktdermatitis so erklärt: Allergene rufen in Keratinozyten eine Freisetzung
von Gefahrsignalen hervor, die zu einer vom adaptiven/spezifischen Immunsystem erzeugten,
insbesondere T-Zell-vermittelten, allergischen Reaktion der Haut führen. Anders als bei
Reizstoffen genügen durch diese Sensibilisierung des erworbenen Immunsystems bei
wiederholtem Kontakt immer kleinere Dosen des Allergens, um eine allergische Reaktion (sog.
Streureaktion) zu provozieren, die nicht nur lokal, sondern auch systemisch ablaufen kann
(Ruëff and Schnuch, 2018). Zudem besteht, wie bei allen Allergien, die Möglichkeit der
Kreuzsensibilisierung auf strukturähnliche Stoffe. Eine Sensibilisierung sollte also schon vor
dem Auftreten erster Hautzeichen vermieden werden (Rodrigues Neves and Gibbs, 2018). Eine
prophylaktische Karenz zu allen potentiell sensibilisierenden Stoffen ist nicht möglich. Daher
ist es notwendig, zu untersuchen, ab welchen Konzentrationen und Expositionsdauern
allergische Reaktionen entstehen, und wie diese Determinanten durch andere Faktoren, wie
etwa die gleichzeitige Applikation hautreizender Stoffe, beeinflusst werden (Rodrigues Neves
and Gibbs, 2018). Dabei sollten nicht nur Endgrößen wie das Auftreten der allergischen
Reaktion, sondern auch die zugrunde liegenden Mechanismen untersucht werden.
3. Sensibilisierende Wirkung von Chemikalienmischungen
Untersuchungen der sensibilisierenden Wirkung von Chemikalienmischungen aus mehreren
Allergenen im Vergleich zu Einzelstoffen sind nicht neu. Parfums beispielweise enthalten
häufig eine Vielzahl von Allergenen (Bonefeld et al., 2011), die unter anderem sogenannte
Compoundallergien hervorrufen können. Patienten mit einer solchen Compoundallergie zeigen
in klinischen Tests eine allergische Reaktion auf die Mischung, nicht aber bei alleiniger
Applikation der einzelnen Komponenten in gleicher Konzentration (Bashir and Maibach,
1997). Die Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen erfolgt in klinischen Studien
4(Bonefeld et al., 2017), Tierversuchen (Bonefeld et al., 2011; Morimoto et al., 2014) und in-
vitro-Hautmodellen (Choi et al., 2014). Vermutet wird, dass Mischungen aus verschiedenen
Allergenen im Vergleich zur Einzelapplikation der Allergene folgende Auswirkungen auf die
Sensibilisierungswirkung haben können: additiv, synergistisch oder inhibitorisch (Pedersen et
al., 2004), wobei letzterer auch als „quenching“ bekannter Effekt umstritten ist (Basketter,
2000).
Im Unterschied dazu stammen Beobachtungen über die Effekte einer Ko-Exposition von
Allergenen und hautreizenden Stoffen bislang hauptsächlich aus klinischen Studien. Diese in-
vivo-Beobachtungen legen nahe, dass bei einer gleichzeitigen Behandlung der Haut mit einem
Reizstoff bereits geringere Konzentrationen des Allergens zu einer Hautsensibilisierung führen
(Pedersen et al., 2004). Es wird angenommen, dass diese Bahnung bzw. Verstärkung von
allergischen Hautreaktionen durch ein Zusammenwirken von Penetrationsratensteigerung und
erhöhter Grundaktivität des Immunsystems aufgrund der Hautbarriereschädigung entsteht
(Fartasch, 2012). In-vitro wurde diese Beobachtung allerdings bislang nur anhand einer sehr
begrenzten Anzahl von Stoffen und Konzentrationen an einem Epidermismodell (EpiSkin® s.
II.4.) nachvollzogen. In dieser 2020 von Cottrez et al. veröffentlichten Studie wurde die
Induktion von allergieassoziierten Signalwegen durch eine 1%ige Lösung des Allergens
Zimtaldehyd mit der Induktion durch eine 0,1%ige Lösung Zimtaldehyd in Kombination mit
1% SLS und mit 1% Milchsäure verglichen. Im Rahmen dieses Versuchsaufbaus wurden
Veränderungen von Genexpressions-Mustern untersucht, da Allergene zur Induktion von Genen
führen, die durch Reizstoffe nicht induziert werden. Bei der Untersuchung von Mischungen
wurde in diesem Fall eine quantitativ verstärkte Induktion von Genen, die durch Allergene
induziert werden, im Vergleich zur Induktion von Genen durch einzelne Allergene beobachtet
(Cottrez et al., 2020). Besonders hervorzuheben ist, dass das hier verwendete Epidermismodell
EpiSkin® (s. 1.III.2.4.) keine Immunzellen enthielt. Dass kombinatorische Effekte dennoch
beobachtet wurden, macht die weitere differenzierte Erforschung der Wirkmechanismen von
Mischungen aus Reizstoffen und Allergenen in immunzellfreien und immunzellhaltigen
Modellen notwendig.
4. Adverse Outcome Pathways
Zur strukturierten Untersuchung von Wirkmechanismen ist unter anderem das Modell des
Adverse Outcome Pathways (AOP) entwickelt worden. AOPs gliedern den Weg zu einem
schädlichen Ergebnis (Adverse Outcome) in eine nachvollziehbare und reproduzierbare
5Kausalkette von sogenannten Schlüsselereignissen (Key Events [KEs]). Idealerweise können
KEs mit standardisierten Testverfahren überprüft werden. Sie werden über
Schlüsselereignisbeziehungen (Key Event Relationships [KERs]) unter den Gesichtspunkten
logischer Plausibilität und empirischer Ergebnisse miteinander verknüpft (Leist et al., 2017;
OECD, 2014). Man kann sie sich wie Pixel vorstellen, die zusammengesetzt ein Bild ergeben
– im Fall der vorliegenden Arbeit: Hautsensibilisierung.
5. Der AOP der allergeninduzierten Hautsensibilisierung
Die Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (OECD) unterstützt
diesen Ansatz und veröffentlicht die verfügbaren AOPs unter https://aopwiki.org. Die AOPs
werden ständig durch publizierte Studien aktualisiert und erweitert (Leist et al., 2017). Der AOP
der allergeninduzierten Hautsensibilisierung wird unter dem Titel „Covalent Protein binding
leading to Skin Sensitisation“ (AOP 40) gelistet. In ihm wird der erste von zwei Schritten des
Pathomechanismus der allergischen Kontaktdermatitis modularisiert, die sog. Induktionsphase
(s. Tabelle 1). Sie umfasst die Entstehung einer Hautsensibilisierung nach akutem Kontakt mit
einer Chemikalie (OECD, 2014).
Tabelle 1:
Schlüsselereignisse nach AOP 40 „Covalent Protein binding leading to Skin Sensitisation“
Schlüsselereignisse Beschreibung
1 (MIE) Kovalente Bindung einer elektrophilen Substanz an Proteine der Haut
2 Keratinozytenaktivierung, Ausschüttung von Gefahrensignalen
3 Aktivierung von dendritischen Zellen
4 Aktivierung/Proliferation von T-Zellen
5 (AO) Hautsensibilisierung
Erklärung: MIE: Auslösendes molekulares Ereignis; AO: Adverse Outcome (adverser Effekt); Der AOP der
Hautsensibilisierung wird in eine Induktionsphase und eine Elizitationsphase unterteilt. Beide bestehen aus diesen
fünf Schritten, die sich wiederholen. Der erste Schritt wird als auslösendes molekulares Ereignis bezeichnet, der
letzte als adverser Effekt.
Dem AOP 40 folgt laut OECD noch ein zweiter Schritt, die Auslösephase. Hierbei handelt es
sich um eine chronische Entzündungsreaktion durch andauernden Kontakt zu einem Allergen.
Da diese Phase aber nur auf Grundlage einer durchlaufenen Induktionsphase stattfinden kann
und sich noch dazu hinsichtlich der molekularen Vorgänge – mit Ausnahme des initiierenden
Schrittes – mit ihr deckt, ist es der OECD folgend hinreichend, die Induktionsphase zu
6untersuchen, um einen Stoff in Hinblick auf seine adversen Effekte an der Haut zu
klassifizieren. Die zugrunde liegende Logik setzt voraus, dass ein Stoff, der einmal ein
molekulares Ereignis auf eine bestimmte Art hervorruft, das Potential besitzt, auch ein zweites
Mal eine Reaktion auf diesem Wege auszulösen (OECD, 2014).
6. Methoden zur Messung des AOP an der Haut
Für den AOP der Haut gibt es bereits für jedes Schlüsselereignis standardisierte Testverfahren,
für deren Vergleichbarkeit und Validierung die OECD und in Zusammenarbeit das EU
Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing (EURL-ECVAM) zuständig sind. Bei
diesen Tests handelt es sich um eine Vielzahl von in-silico-, in-vitro- und in-vivo-
Untersuchungen.
Nach wie vor sind Tierversuche wie der meist an Mäusen durchgeführte Local Lymph Node
Assay (LLNA) und der Guinea Pig Maximization Test (GPMT) Goldstandard bei der Testung
von Allergenen. Seit Erlass der Richtlinie 76/768/EWG über kosmetische Mittel 1976 wird
jedoch versucht, diese systematisch durch Alternativen zu ersetzen. Neuere Studien zeigen, dass
Kombinationen von Ergebnissen von in-vitro-Tests inzwischen Ergebnisse erzielen, die denen
der Humanexperimente ähnlicher sind als der LLNA (Bauch et al., 2012; Kreiling et al., 2017;
Ramirez et al., 2014).
In der vorliegenden Arbeit über die Wirkung von Chemikalienmischungen an der Haut wurden
einerseits bereits standardisierten Tests verwendet, andererseits in einem komplexeren Modell
(Ko-Kulturen) weitere Wirkungen untersucht.
7. Der AOP an Ko-Kulturen: Möglichkeit mechanistischer Untersuchungen – Ausblick
Zytokine/Chemokine
Ko-Kulturen aus verschiedenen Zelltypen repräsentieren in-vivo Verhältnisse besser als
Monokulturen (Pupovac et al., 2018). So spielt in der Untersuchung von Reizstoffen eine
wichtige Rolle, dass HaCaT-Keratinozyten erst durch Ko-Kultivierung auf einer
Fibroblastenschicht zur Ausbildung einer Epidermis mit Stratum corneum angeregt werden
(Schoop et al., 1999). In der Untersuchung von Allergenen bieten Ko-Kulturen die Möglichkeit,
KERs des AOP genauer zu untersuchen. So wurde in Ko-Kulturen aus Keratinozyten und
Monozyten beobachtet, dass mit einem Allergen exponierte Keratinozyten über Zytokine, TLRs
7(Toll-like Receptors) und weitere Signalwege (Matjeka et al., 2012) und Enzyme wie NQO1
(NAD(P)H: Quinone Oxidoreduktase 1) (Hennen et al., 2011) mit dendritischen Zellen
kommunizieren und deren Immunantwort auf ein Allergen verstärken. Ebenso wurde bei
dendritischen Zellen eine Aktivierung von Genen des NQO1-Weges bei direktem Kontakt zu
einem Allergen beobachtet (Ade et al., 2009).
III. Methoden
Im Rahmen der vorliegenden Promotionsleistung wurden Versuche an Mono- und Ko-Kulturen
durchgeführt. Die Ergebnisse der Versuche an Monokulturen im KeratinoSensTM-Test (IV.1.
und 2.) wurden in der anhängenden Publikation veröffentlicht. Die Ergebnisse der Ko-Kultur
(IV.3.) sollen ebenfalls publiziert werden. Im Folgenden werden die Versuche mit beiden
Kulturformen beschrieben.
1. Chemikalien
Als Allergene wurden Zimtaldehyd (CA) und Ethylenglykoldimethacrylat (EGDMA)
verwendet, als Reizstoffe Natriumdodecylsulfat (SDS), Salizylsäure (SA) und α-Pinen (aP).
Die Positivkontrolle erfolgte je nach Test mit CA oder Phorbol-12-Myristat-Acetat (PMA) und
die Vehikelkontrolle mit Dimethylsulfoxid (DMSO) (weitere Details zu Eigenschaften der
Chemikalien s. anhängende Publikation, Punkt 4.1.).
2. Modelle und Messgrößen
Im Rahmen der Versuche wurden drei Zelltypen verwendet: Genetisch modifizierte humane
HaCaT-Keratinozyten vom Typ KeratinoSensTM, Mausfibroblasten der Zelllinie 3T3 und
humane Monozyten der Zelllinie U937. Die Keratinozyten und Monozyten wurden sowohl in
Monokultur als auch in Ko-Kultur in Form eines dreidimensionalen Hautmodells für Tests
verwendet, die Fibroblasten nur in Ko-Kultur.
1. Keratinozyten und der KeratinoSensTM-Test
Bei der Keratinozytenzelllinie vom Typ HaCaT (Human adult low Calcium high Temperature)
handelt es sich um eine vor gut dreißig Jahren spontan immortalisierte humane Zelllinie mit
vollständig erhaltener Fähigkeit zur epidermalen Differenzierung (Boukamp et al., 1988).
Aufgrund dieser Eigenschaften wird diese Zelllinie bei der Erstellung von Hautmodellen
verwendet (Hennen and Blömeke, 2017; Okugawa and Hirai, 2008; Pudlas et al., 2011). Die in
8der vorliegenden Arbeit verwendeten HaCaT-Zellen wurden mit einem Plasmid stabil
transfiziert (KeratinoSensTM Zelllinie). Dadurch enthalten die Zellen ein lumineszierendes
Enzym (Luciferase-Gen), das eine Aktivierung des ARE-Nrf2-Signalwegs (Antioxidative
response element - Nuclear erythroid 2-related factor-2) anzeigt. Dieser Signalweg wird bei
Exposition gegen die meisten Allergene aktiviert, nicht aber bei Kontakt mit einem Reizstoff.
Die freigesetzte Lumineszenz ermöglicht die quantitative Messung der Luciferase-
Geninduktion und ist ein Indikator für die Aktivität des Nrf2-Transkriptionsfaktors. Diese
Eigenschaft ermöglicht es, mittels Fluoreszenzmessung die Keratinozytenaktivierung – Schritt
2 des AOP – zu prüfen. Der KeratinoSensTM-Test beruht auf der oben beschriebenen
Lumineszenz-Entwicklung der KeratinoSensTM-Keratinozyten bei Exposition gegen Allergene
(Emter et al., 2013; OECD, 2018a).
Nach der Richtlinie TG 442D besteht der Test aus zwei Schritten. Zunächst wird mittels MTT-
Test (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromid) die Zellvitalität
überprüft, im zweiten Schritt folgt die Lumineszenzmessung. Als Schwellenwert gilt nach
OECD-Richtlinie die Konzentration, bei der in der Lumineszenzmessung eine signifikante
(>1,5fache) Induktion des Signalweges bei erhaltener Zellvitalität (>70%) erfolgt. Diese
Konzentration wird als EC1.5-Wert bezeichnet. Je niedriger der EC1.5-Wert, desto größer die
Induktion des ARE-Nrf2-Signalweges durch das Allergen (OECD, 2018a).
In der vorliegenden Arbeit wurden die KeratinoSensTM-Zellen als Monokultur nach OECD-
Richtlinie und in der Ko-Kultur eingesetzt (s. III.2.4.).
9Abbildung 2: Funktionsweise des Tests (eigene Grafik in Anlehnung an Natsch et al., 2013 -
Libre Office Impress, vgl De Rentiis et al., 2019)
2. Fibroblasten
Die 3T3-Fibroblastenzelllinie ist eine immortalisierte Zelllinie von Mausfibroblasten, die in
Kombination mit HaCaT-Zellen in der Erstellung von Hautmodellen verwendet wird (Cubo et
al., 2016; Koch et al., 2012; Okugawa and Hirai, 2008). Im Rahmen der Versuche der
vorliegenden Arbeit wurde sie nicht in Monokultur getestet, sondern nur in der Ko-Kultur
verwendet. Sie diente dazu, die Keratinozyten zur Ausbildung einer Epidermis anzuregen und
Nährstoffe zu liefern (Wojtowicz et al., 2014).
3. Monozyten und der U-SENSTM-Test
Immunzellen wurden in Form der humanen myeloiden Leukämiezelllinie U937 in das
Hautmodell integriert. Diese in der Untersuchung der Hautsensibilisierung bereits in
Monokultur etablierte Zelllinie entwickelt bei Aktivierung durch hautsensibilisierende Stoffe
ähnliche Eigenschaften wie dendritische Zellen (Python et al., 2007). Sie wird mit HaCaT-
Zellen in Ko-Kultur verwendet (Ramadan and Ting, 2016). Die U937-Zellen exprimieren bei
Kontakt zu Allergenen unter anderem das Oberflächenprotein CD86. Diese Expression kann
zum Beispiel mittels Durchflusszytometrie quantitativ bestimmt werden (OECD, 2018b) und
bietet somit eine Möglichkeit, das dritte Schlüsselereignis des AOP zu testen. Wie schon im
KeratinoSensTM-Test wird diese Expression im Rahmen des U-SENSTM-Tests in
10Zusammenschau mit Zytotoxizitätsmessungen genutzt, um Allergene von Reizstoffen zu
unterscheiden.
Versuche, auch an U937-Monozyten eine Analyse hinsichtlich Sensibilisierung vorzunehmen,
waren im Rahmen dieser Untersuchung aufgrund eines fehlenden Durchflusszytometers nicht
nach den Vorgaben der OECD durchführbar. Alternative Versuche mittels Antikörperfärbung
und Fluoreszenzmessung oder indirekte Messung der Aktivierung mittels NQO1-Test wurden
begonnen, eine Etablierung und Standardisierung, die für vergleichbare und verwertbare
Ergebnisse notwendig gewesen wäre, hätte hier jedoch den zeitlichen Rahmen überschritten
und soll Gegenstand künftiger Forschung sein.
4. Ko-Kultur
Das 3D-Hautmodell, dessen Erstellung und Etablierung ein Teil der vorliegenden
Promotionsleistung war, besteht aus den drei o.g. Zelltypen (s. Abbildung 3).
Abbildung 3: schematische Darstellung des 3D-Hautmodells (eigene Grafik - Libre Office
Draw, vgl. Pink et al., 2019)
Es gibt inzwischen eine Vielzahl von 3D-Hautmodellen aus verschiedenen Zelltypen und mit
verschiedenen Eigenschaften (s. Tabelle 2).
11Tabelle 2:
Nomenklatur 3D-Hautmodelle in Anlehnung an Pupovac et al., 2018
Name Inhalt Hautschicht Beispiel
Rekonstruiertes Kollagen + Epidermis Episkin®,
Epidermismodell Keratinozyten + EpidermTM
(Melanozyten)
Vollhautmodell Kollagen + Epidermis + Epiderm-FTTM
(FTS-Modell) Keratinozyten + Dermis
Fibroblasten
FTS-Modell mit zusätzlichen Kollagen + Epidermis + KDF-Skin
Zelltypen Keratinozyten + Dermis
Fibroblasten +
Langerhans-Zellen/
dendritische Zellen
Erklärung: FTS: Full Thickness Skin; die Nomenklatur von Hautmodellen unterscheidet sich je nach Publikation.
Die vorliegende Tabelle orientiert sich an einer Übersichtsarbeit von Pupovac et al., 2018
Bei dem in dieser Arbeit verwendeten Hautmodell handelte es sich um ein Vollhautmodell mit
zusätzlichen dendritischen Zellen. Es basiert auf einem Protokoll von Li et al. (Li et al., 2011)
und einer Publikation des Fraunhofer Instituts (Fraunhofer IPA and BRAND, 2014), die
modifiziert wurden: 3T3-Fibroblasten wurden in eine Kollagenmischung eingebettet und in
einen Plastikzylinder gefüllt, dessen Boden aus einer Membran besteht. Dieser Zylinder wurde
in eine Nährschale gehängt, die mit Nährmedium gefüllt war (s. Abbildung 3). Eine Suspension
aus Keratinozyten und Medium wurde auf die Oberfläche des Kollagenkissens gegeben und für
drei bis vier Tage bebrütet. In dieser Zeit vermehrten sich die Keratinozyten, angeregt und
ernährt durch die Fibroblasten, und bildeten eine mehrschichtige Kultur, allerdings noch kein
Stratum corneum. Die Ausbildung dieser obersten Epidermisschicht wurde nach drei bis vier
Tagen Bebrütung provoziert, indem das Medium auf den Keratinozyten entfernt und der
Mediumspiegel in der Nährschale unterhalb des Niveaus der Keratinozyten gesenkt wurde.
Dadurch kam es zu einem Kalziumgradienten, der innerhalb von drei Wochen zur Ausbildung
eines künstlichen Stratum corneums führte. Nach dieser Zeit wurde das Nährmedium in der
Nährschale durch eine Mischung aus Monozyten und Medium ersetzt. Das Modell war nun
versuchsbereit. Einzelstoffe und Mischungen wurden auf das Stratum corneum appliziert.
12Die Analyse des Kollagen-Epidermis-Kissens erfolgte mittels quantitativer
gaschromatografischer Bestimmung der Menge enthaltener Metabolite wie Zucker oder
Aminosäuren (sog. Metabolomics) im Vergleich zur Kontrolle. Der dabei entstandene
Datensatz wurde in zwei Schritten ausgewertet. Im ersten Schritt erfolgte eine Cluster-Analyse
mittels Hauptkomponenten- und Diskriminanzanalyse (PCA und PLS-DA – mathematische
Methoden zur strukturierten Analyse von Veränderungen komplexer Datensätze), im zweiten
Schritt die Identifikation einzelner Biomarker mit dem Software-Analyse-Werkzeug
MetaboAnalyst.
3. Versuchsdesign
Das Versuchsdesign wurde in drei Phasen eingeteilt. Nach jeder Phase wurden repräsentative
Konzentrationen für die folgende Phase ausgewählt (siehe Abbildung 4).
Abbildung 4: Versuchsdesign; Probenzahlen exemplarisch am Beispiel der KeratinoSensTM-
Tests bzw. in Phase III Metabolomics. Probenzahl = Zahl Allergene x getestete Konzentrationen
+ Zahl Reizstoffe x getestete Konzentrationen (eigene Grafik – Libre Office Present)
13In Phase I wurden den Leitlinien der OECD folgend Messungen ausgewählter
Stoffkonzentrationen an den KeratinoSensTM-Zellen (und U937) vorgenommen. An den
Keratinozyten wurde der KeratinoSensTM-Test (OECD 442D) durchgeführt. Das bedeutete für
Phase I konkret, dass zwölf verschiedene Konzentrationen von 0,98-2000 µM des jeweiligen
Allergens bzw. Reizstoffs untersucht wurden.
Auf der Basis dieser Ergebnisse wurden drei nicht zytotoxische Konzentrationen je Reizstoff
ausgewählt (s. Abbildung 5), eine unter-, eine mittel- und eine überschwellige (low: 1 µM;
medium: 4 µM und high: 16 µM), und die Tests aus Phase I wiederholt. Im Unterschied zum
ersten Testdurchlauf wurden nun gleichzeitig Reizstoff und Allergen appliziert. Die Zahl der
getesteten Konzentrationen der Allergene (zwölf bzw. sechs pro Allergen) wurde nicht
reduziert.
Abbildung 5: Auswahl der Testkonzentrationen der Mischungen anhand des MTT im Rahmen
des KeratinoSensTM-Test; Ovale markieren ausgewählte Konzentrationen für die weiteren
Versuche in Phase II (vgl. Pink et al., 2019)
Aus den so erzielten Ergebnissen wurden wiederum Konzentrationen ausgewählt. In Phase III
erfolgte zusätzlich der Wechsel von der Monokultur zur Ko-Kultur. Hier wurden zunächst
ausgewählte Konzentrationen der Allergene allein appliziert (je zwei Konzentrationen) sowie
dann in Kombination mit ausgewählten Konzentrationen der Reizstoffe. Nach Exposition
wurden die Keratinozyten-Kollagen-Kissen von den Monozyten getrennt und Stanzproben der
14Kissen entnommen. Diese wurden zunächst mit 0,9% NaCl gewaschen und bis zur Weiterverarbeitung eingefroren. Zur Durchführung der Metabolomics wurden die gefrorenen Stanzen chemisch und mechanisch lysiert und das Metabolitenprofil mittels GC-MS (Gaschromatographie-Massenspektrometrie) erstellt. IV. Ergebnisse 1. Ergebnisse Einzelsubstanzen an KeratinoSensTM-Zellen Der MTT-Vitalitätstest zeigte an den Keratinozyten vom Typ KeratinoSensTM bei Exposition gegen Zimtaldehyd eine deutliche Reduktion der Zellvitalität auf
3. Erste Ergebnisse zum Metabolitenprofil nach Exposition gegen Einzelsubstanzen und
Mischungen in Ko-Kultur
Die oben beschriebene Hauptkomponentenanalyse in Verbindung mit der Diskriminanzanalyse
(PLS-DA) clusterte Proben, die mit EGDMA exponiert wurden, entfernt von Proben, die mit
Zimtaldehyd exponiert wurden (s. Abbildung 6).
Abbildung 6: PLS-DA Analyse Metabolomics; oranges Cluster: Ergebnisse Zimtaldehyd-
Koexposition sowie Zimtaldehyd und EGDMA als Einzelstoffe; rotes Cluster: EGDMA in
Kombination mit Reizstoff; Positivkontrolle: Phorbol-12-Myristat-Acetat (vgl Pink et al., 2019)
Die im zweiten Schritt durchgeführte Analyse zeigte in ersten Ergebnissen, dass in den
Hautmodellen, die gegen Zimtaldehyd exponiert wurden, mehr Serotonin-Derivate vorkamen
als in Hautmodellen, die gegen EGDMA exponiert wurden (Pink et al., 2019; De Rentiis et al.,
2020a). Eine differenzierte Analyse ist zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch in Arbeit.
V. Fazit
Die vorliegende Promotionsleistung zeigt Effekte von Mischungen aus Allergenen und
Reizstoffen in in-vitro-Modellen. In Einzelzellkulturen wurde in Keratinozyten eine verstärkte
Induktion eines für Allergie typischen Signalweges beobachtet. Da die Methoden an den U937-
16Zellen bislang jedoch nicht etabliert wurden, ist unklar, ob diese Ergebnisse verwertbar sind. In
metabolomischen Untersuchungen der Ko-Kulturen zeigte sich eine Abhängigkeit der
exprimierten Metabolite von dem verwendeten Allergen. Erste Ergebnisse wurden bereits auf
der o.e.e.s.c.-Tagung 2019 in Dublin sowie als Abstrakt im Rahmen der DGAUM 2020
präsentiert und sollen ebenfalls publiziert werden.
Die beschriebenen Effekte sind komplex und bislang noch nicht verstanden. Weitere Versuche
sind notwendig und, wie gezeigt wurde, auch möglich. Dabei stellt die OECD im AOP weitere,
hier nicht verwendete Tests zur Verfügung und ermöglicht so auch eine standardisierte
Untersuchung der Auswirkungen von Chemikalien in vitro in Laboren mit anderen Geräten und
Ausstattungen. Möglicherweise können so in der industriellen Herstellung von Produkten für
die Haut in Zukunft nicht nur die einzelnen Komponenten in vitro auf ihr allergisierendes
Potential getestet werden, sondern auch Chemikalienmischungen, womit die Zahl von
Tierversuchen reduziert würde.
Zusätzlich wird mit zunehmendem Wissen über die interzelluläre Kommunikation bei Kontakt
zu Allergenen und Reizstoffen die Verwendung von Ko-Kulturen in der in-vitro-Forschung zu
Chemikalien ermöglicht. So könnten zunehmend komplexere in-vitro-Modelle verwendet
werden, die den natürlichen Aufbau der Haut besser nachbilden als die aktuell verwendeten
Monokulturen. Ein möglicher Ansatzpunkt ist die weitere Erforschung der gegenseitigen
Beeinflussung von Keratinozyten und Monozyten durch den NQO1-Signalweg und der hieraus
entstehenden Wechselwirkungen.
2. Text der Publikation
De Rentiis, A.M.A., Pink, M., Verma, N., Schmitz-Spanke, S., 2020. Assessment of the
different skin sensitization potentials of irritants and allergens as single substances and in
combination using the KeratinoSensTM assay. Contact Dermatitis.
https://doi.org/10.1111/cod.13762
Der Text der Publikation ist einsehbar unter:
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/cod.13762
173. Literaturverzeichnis
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244. Abkürzungsverzeichnis
3T3 – 3 day transfer, inoculum 3 x 105 cells
ACD – allergische Kontaktdermatitis
AO – Adverse outcome
AOP – Adverse outcome pathway
aP – α-Pinen
ARE-Nrf2-Signalweg – Antioxidative response element - Nuclear erythroid 2-related factor-2
CA – Zimtaldehyd
DMSO – Dimethylsulfoxid
EGDMA – Etylenglykoldimethacrylat
EURL-ECVAM – EU reference laboratory for alternatives to animal testing
FTS – Full thickness skin
GC-MS – Gaschromatographie-Massenspektrometrie
GPMT – Guinea pig maximization test
HaCaT – Human adult low calcium high temperature
ICD – irritative Kontaktdermatitis
KDF-Skin – dreidimensionales Hautmodell
KE – Key event
Keap1 – Kelch-like ECH-associated protein 1
KER – Key event relationship
LLNA – Local lymph node assay
MAF – musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog
MHC-II – major histocompatibility complex II
MIE – Molekulares Initiationsereignis
MTT – 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
NQO1 – NAD(P)H: Quinone Oxidoreduktase 1
OECD – Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung
PCA – Principal component analysis
PLS-DA – Partial least squares discriminant analysis
PMA – Phorbol-12-Myristat-Acetat
SA – Salizylsäure
SDS – Natriumdodecylsulfat
TLR – Toll-like receptor
255. Verzeichnis der Veröffentlichungen
De Rentiis, A.M.A., Pink, M., Verma, N., Schmitz-Spanke, S., 2020. Assessment of the
different skin sensitization potentials of irritants and allergens as single substances and in
combination using the KeratinoSensTM assay. Contact Dermatitis.
https://doi.org/10.1111/cod.13762 (Paper)
De Rentiis A., Pink M., Verma N., Schmitz-Spanke S., 2020. Analyse des metabolomischen
Profils von 3D-Hautmodellen nach gleichzeitiger Applikation von Allergenen und
Reizstoffen. 60. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Arbeits-, Sozial- und
Umweltmedizin (DGAUM), München (Abstrakt)
De Rentiis A., Pink M., Verma N., Schmitz-Spanke S., 2019. Einfluss einer gleichzeitigen
Applikation von Allergenen und Irritanzien auf einen Schlüsselsignalweg der
Hautsensibilisierung (ARE-Nrf2 Signalweg). 15. Tagung der Arbeitsgemeinschaft für Berufs-
und Umweltdermatologie (ABD), 26.-28.09.2019, Osnabrück (Poster)
Pink M., De Rentiis A., Schmitz-Spanke S., 2019. Effect of simultaneous exposure to mixtures
of skin sensitizers and irritants on the Keap1-Nrf2-ARE pathway. Occupational and
Environmental Exposure of the Skin to Chemicals (o.e.e.s.c.), 16.-18.09.2019, Dublin (Vortrag)
De Rentiis A., Verma N., Schmitz-Spanke S., M. Pink, 2019. Veränderungen der
hautsensibilisierenden Wirkung von Allergenen bei gleichzeitiger Exposition gegen Irritantien.
59. Wissenschaftliche Jahrestagung der DGAUM, 20.-22.03.2019, Erfurt (Poster)
266. Danksagung
Mein erster und besonderer Dank gilt meiner Betreuerin Frau Prof. Dr. med. Simone Schmitz-
Spanke, die mit sehr viel Engagement das Werden dieser Arbeit und der aus ihr entstandenen
Publikationen von Anfang 2018 bis jetzt begleitet und unterstützt hat.
Ganz besonders danke ich auch Herrn Prof. Dr. med. Hans Drexler, dem Leiter des Institutes
für Arbeits-, Sozial- und Umweltmedizin einerseits für die Schaffung der grundlegenden
Strukturen, die das Fundament dieser Arbeit bilden, andererseits aber auch für seine
weitsichtige Begleitung und Einladung zur „Kür“, zum Beispiel auf der ABD-Tagung 2019.
Herrn Dr. rer. nat. Mario Pink danke ich sehr für die Mitbetreuung der Dissertation und seine
weitere Unterstützung auch noch nach seinem Ausscheiden aus dem Institut. Ihm, Frau Dr.
Nisha Verma und Herrn Christian Kersch danke ich besonders für die Heranführungen an das
experimentelle Arbeiten im Labor.
Mein weiterer Dank gilt dem gesamten Team sowie meinen Mitdoktoranden des Institutes für
Arbeits-, Sozial- und Umweltmedizin der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
für die Unterstützung, die regen Diskussionen und die bestärkenden Worte auf den Fluren und
im Anschluss an die Promovierendentreffen.
Auch danke ich Frau Prof. Dr. med. Berking und dem Team der Dermatologie des
Universitätsklinikums Erlangen, besonders auch Frau PD Dr. med. habil. Erfurt-Berge, die mir
mit der Ermöglichung der Tagungsteilnahme und anschließender erneuter Präsentation der
Ergebnisse im Rahmen der Diaklinik während meines Praktischen Jahres sehr wichtige
Anregungen gegeben haben.
Meiner Familie und meinen Freunden: Jedem einzelnen von euch danke ich für eure liebevolle
Begleitung, nicht nur während dieser Arbeit. Danke, dass ihr immer für mich da seid.
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