PeqGOLD MicroSpin Total RNA Kit - (Safety-Line) Arbeitsanleitung - Instruction Manual
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Arbeitsanleitung – Instruction Manual peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit (Safety-Line) v0314 Creating the future together.
INHALT
EINLEITUNG 1
FUNKTIONSPRINZIP 1
LAGERUNG 2
KITBESTANDTEILE 2
WICHTIGE HINWEISE 3
PROBENAUFSCHLUSS UND HOMOGENISIERUNG 4
PEQGOLD MICROSPIN TOTAL RNA ISOLIERUNGSPROTOKOLLE 5
A. Total RNA Isolation aus Laserschnitten 5
B. Extraktion von RNA aus Mikro-Dissektionsschnitten (Formalin-fixiertes Gewebe) 7
C. RNA-Isolation aus Gewebe oder kultivierten Zellen 9
D. RNA-Extraktion aus faserigem Gewebe (Skelettmuskel, Herz- oder Aortagewebe,
etc.) 11
RNA-QUALITÄT 13
DNA-KONTAMINATIONEN 13
QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER RNA 13
BESTELLINFORMATIONEN 14
TROUBLESHOOTING TIPS 15
CONTENT
INTRODUCTION 16
THEORY 16
STORAGE AND STABILITY 17
KIT COMPONENTS 17
BEFORE STARTING 18
DISRUPTION AND HOMOGENIZATION OF SAMPLES 19
PEQGOLD MICROSPIN TOTAL RNA ISOLATION PROTOCOL 20
A. Total RNA Isolation from Laser Dissected Samples 20
B. Extraction of RNA from Micro-Dissected Formalin-fixed Tissues 22
C. RNA Isolation from Animal Tissue or Cell Culture 24
D. Extraction of RNA from Fibrous Tissues (Skeletal Muscle, Heart and Aorta Tissue, et
al.) 26
RNA QUALITY 28
DNA CONTAMINATION 28
QUANTITATION AND STORAGE OF RNA 28
ORDERING INFORMATION 29
TROUBLESHOOTING TIPS 30
APPENDIX 31EINLEITUNG Der peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit bietet eine schnelle und einfache Methode, um bis zu 50 µg Gesamtzell-RNA aus kleinen Mengen kultivierter Zellen, Geweben wie z.B. Laserschnitten oder Mikro-Biopsien zu isolieren. In weniger als 30 Minuten gestattet er die gleichzeitige Bearbeitung mehrerer Proben, wobei jeweils bis zu 5 x 105 eukaryotische Zellen oder 5 mg Gewebe (abhängig von der Gewebeart) in einem Schritt bearbeitet werden können. Extraktionen mit organischen Lösungsmitteln wie Phenol oder Chloroform oder zeitaufwendige CsCl Gradienten-Ultrazentrifugationen sind dabei ebenso wenig notwendig wie Isopropanol- oder LiCl-Präzipitationen. RNA, die mit dem peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit isoliert wurde, kann für alle Arten von Folgeanwendungen wie z.B. RT-PCR, Northern Blots, Poly (A)+-RNA-Extraktionen, Nuclease Protection Assays und in vitro Translationen weiterverwendet werden. FUNKTIONSPRINZIP Der peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit kombiniert die selektiven und reversiblen Bindungseigenschaften von PerfectBind-Silikamembranen mit der Schnelligkeit und leichten Durchführbarkeit von Zentrifugationssäulenmethoden. Ein speziell optimiertes Puffersystem erlaubt die Reinigung von RNA-Molekülen ab 25 Basen aufwärts. Zellen oder Gewebeproben werden zunächst unter denaturierenden Bedingungen lysiert, wobei alle vorhandenen RNasen und andere Enzyme effektiv inaktiviert werden. Das Lysat wird nachfolgend über eine DNA Removing Column zentrifugiert, was zur selektiven Entfernung der genomischen DNA führt. Nach Zugabe von 70 % Ethanol wird die Probe auf die PerfectBind MS RNA Column geladen, in der die RNA-Moleküle an die enthaltene Silikamembran binden, während zellulärer Debris und andere Kontaminationen effektiv entfernt werden. Die qualitativ hochwertige RNA wird letztendlich in RNase-free Water eluiert. peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Art.-Nr.: 12-6831 PEQLAB_v0314_D 1
LAGERUNG Die Aufbewahrung des peqGOLD MicroSpin Total RNA Kits sollte bei Raumtemperatur erfolgen. Bei einer Umgebungstemperatur von 22 – 25 °C bleiben die Komponenten des Kits für mindestens 12 Monate ab Lieferung stabil. Kristalle, die sich während der Lieferung im RNA Lysis Buffer T gebildet haben, können durch Erwärmen auf 37 °C wieder gelöst werden. KITBESTANDTEILE peqGOLD MicroSpin Total 5 Präparationen 50 Präparationen 200 Präparationen RNA Kit Bestellnummer 12-6831-00 12-6831-01 12-6831-02 Bestandteile PerfectBind MS RNA Columns 5 50 200 DNA Removing Columns 5 50 200 2 ml Collection Tubes 20 200 4 x 200 RNA Lysis Buffer T 1.5 ml 20 ml 80 ml RNA Wash Buffer I 5 ml 50 ml 200 ml RNA Wash Buffer II 2 ml 20 ml 3 x 20 ml RNase-free Water 1 ml 5 ml 20 ml Arbeitsanleitung 1 1 1 peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Art.-Nr.: 12-6831 PEQLAB_v0314_D 2
WICHTIGE HINWEISE Bitte lesen Sie das vorliegende Protokoll vor der ersten Verwendung des Kits vollständig durch und legen Sie alle für die Isolierung benötigten Materialien vor Präparationsbeginn bereit, um unerwünschte RNA-Degradationen zu vermeiden. ! RNA Wash Buffer II wird als Konzentrat geliefert und muss vor seiner ersten Verwendung mit absolutem Ethanol verdünnt werden. Kit 12-6831-00 2 ml RNA Wash Buffer II mit 8 ml 100 % EtOH mischen. Kit 12-6831-01 20 ml RNA Wash Buffer II mit 80 ml 100 % EtOH mischen. Kit 12-6831-02 3 x 20 ml RNA Wash Buffer II mit 3 x 80 ml 100 % EtOH mischen. ! Verdünnter RNA Wash Buffer II sollte bei Raumtemperatur gelagert werden. Falls er kühl gelagert wird, muss er vor der Verwendung auf Raumtemperatur gebracht werden. ! Alle Zentrifugationsschritte bei 22 – 25 °C ausführen. ! Bei allen Arbeiten mit RNA zur Vermeidung von RNase-Kontaminationen Einmalhandschuhe tragen. Zum Pipettieren der Puffer sollten ausschließlich saubere, RNase-freie Einmalpipettenspitzen verwendet werden. ! RNA-Präparationen sollten besonders sorgfältig, aber auch so zügig wie möglich durchgeführt werden. ! Bei niedrigen Umgebungstemperaturen kann es im RNA Lysis Buffer T zur Ausbildung von Salzkristallen kommen. Diese Kristallbildung ist normal, sollte aber vor der Verwendung des Puffers durch Erwärmen auf 37 °C rückgängig gemacht werden. peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Art.-Nr.: 12-6831 PEQLAB_v0314_D 3
PROBENAUFSCHLUSS UND HOMOGENISIERUNG Für jede erfolgreiche RNA Isolierung ist ein umfassender Aufschluss bzw. eine vollständige Homogenisierung der Probe Voraussetzung. Laserschnitte und Mikro- Biopsien können durch Vortexen gleichzeitig aufgeschlossen und homogenisiert werden. Für anderes Probenmaterial sollte eine geeignete Methode aus folgenden Möglichkeiten ausgewählt werden. a. Aufschluss mit flüssigem Stickstoff Bei Arbeiten mit flüssigem Stickstoff immer Handschuhe tragen und vorsichtig arbeiten! Gewebe ausschneiden und sofort in einem kleinen Volumen flüssigem Stickstoff einfrieren. Mit einem Keramik-Mörser und -Pistill das Gewebe in ca. 10 ml flüssigem Stickstoff zerreiben und die Suspension in ein vorgekühltes (!) 15 ml Polypropylene Tube überführen. Ist das Gefäß nicht vorgekühlt, kann die Suspension beim Einfüllen überkochen und ein Großteil des Materials verloren gehen! Sobald der flüssige Stickstoff vollständig verdampft ist, RNA Lysis Buffer T laut Protokoll zum Probenmaterial geben und mit dem Protokoll fortfahren. b. Aufschluss und Homogenisierung mit Homogenisatoren (z.B. Precellys® 24) Gewebeproben können auch mit Homogenisatoren durch sehr schnelle Bewegungen mit Kügelchen und Lysepuffer aufgeschlossen und homogenisiert werden. Das Gewebe wird in einem Schritt durch die Bewegung der Kügelchen schonend und effizient aufgeschlossen und gleichzeitig homogenisiert. c. Aufschluss und Homogenisierung mit einem Rotor-Stator Ein Rotor-Stator homogenisiert effektiv die meisten Gewebe unter Zugabe von RNA Lysis Buffer T. Der Zeitaufwand beträgt je nach Gewebeart oft nur eine Minute. Viele Rotor- Statoren arbeiten mit verschiedenen Aufsätzen, die auch die Verwendung von 1.5 ml Gefäßen ermöglichen. d. Homogenisierung mit Spritze und Nadel Nach dem Gewebeaufschluss kann das Lysat mit Spritze und Nadel weiter homogenisiert werden. Hochmolekulare DNA wird bei 5 bis 10-maligem Passieren durch eine dünne Nadel (19 - 21 gauge) geschert. peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Art.-Nr.: 12-6831 PEQLAB_v0314_D 4
PEQGOLD MICROSPIN TOTAL RNA ISOLIERUNGSPROTOKOLLE A. Total RNA Isolation aus Laserschnitten Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden: ! 100 % Ethanol ! RNase-freie Filterspitzen und Zentrifugationsröhrchen ! 70 % Ethanol Hinweis: Hinweis: Proben und RNA Lysis Buffer T vor der Bearbeitung auf Raumtemperatur bringen. Alle Arbeitsschritte bei Raumtemperatur ausführen. Zügig und sorgfältig arbeiten. Hinweis: Je nach Fixier- und Färbeprotokoll, Lagerbedingungen und dem Alter der Probe, kann die RNA hochgradig degradiert und in Moleküllängen von unter 300 Nukleotiden fragmentiert sein. Ein Verlust an RNA kann dann auftreten, wenn die Probe vollständig degradiert ist. 1. Homogenisierung und Lyse Probe je nach Menge des Ausgangsmaterials zusammen mit 200 µl RNA Lysis Buffer T in ein 1.5 ml Zentrifugationsröhrchen geben. 2. DNA-Entfernung Lysat auf eine DNA Removing Column überführen und zusammen mit dem Collection Tube bei 10.000 x g* für 1 Minute zentrifugieren. DNA Removing Column verwerfen und Filtrat weiter verwenden. 200 µl 70 % Ethanol zugeben und Probe sorgfältig mittels einer Pipette mischen. 3. Laden und Binden PerfectBind MS RNA Column in ein neues 2 ml Collection Tube stecken. Den gesamten Ansatz auf die PerfectBind MS RNA Column laden und bei 10.000 x g* für 1 Minute bei Raumtemperatur zentrifugieren. Säulendurchfluss und Collection Tube anschließend verwerfen. 4. Waschen I PerfectBind MS RNA Column in ein neues 2 ml Collection Tube stecken und 500 µl RNA Wash Buffer I zugeben. Bei 10.000 x g* für 1 Minute zentrifugieren und Säulendurchfluss verwerfen. Collection Tube im nächsten Schritt wiederverwenden. Wenn ein DNase- Verdau auf der Säule gewünscht wird, mit Schritt 5 fortfahren, ansonsten zu Schritt 6 weitergehen. 5. DNase I Verdau (optional) Da durch die PerfectBind RNA-Technologie die vorhandene DNA größtenteils entfernt wird, ist ein zusätzlicher DNase-Verdau für die meisten Folgeanwendungen nicht * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 31 peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Art.-Nr.: 12-6831 PEQLAB_v0314_D 5
erforderlich. Dennoch kann es bei einigen sensitiven RNA-Anwendungen nötig sein, die
verbliebene DNA durch DNase-Behandlung zu entfernen. Das folgende Protokoll
beschreibt den DNase I-Verdau direkt auf der PerfectBind MS RNA Column (Bestellnr.:
12-1091-01/02).
a. Für jede PerfectBind MS RNA Column folgenden DNase I Reaktionsmix vorbereiten:
DNase I Digestion Buffer 73.5 µl
RNase-freie DNase I (20 Kunitz units/µl) 1.5 µl
Gesamtvolumen 75 µl
Hinweis:
1. DNase I ist sehr empfindlich gegenüber physikalischer Denaturierung, deshalb DNase I-
Lösung niemals vortexen! Ein Invertieren des Tubes reicht zum Mischen aus. Den DNase I
Reaktionsmix immer direkt vor der RNA-Isolation ansetzen.
2. Der DNase I Digestion Buffer ist im RNase-freien DNase I Digest Kit enthalten. Standard
DNase Puffer sind nicht für den "on-membrane" Verdau geeignet!
b. 75 µl des DNase I Reakionsmixes direkt auf die Membran der PerfectBind MS RNA
Column pipettieren. Der DNase I Verdau kann nicht vollständig ablaufen, wenn ein Teil
des Reaktionsmixes an der Wand oder dem O-Ring der Säule haftet.
c. Säule bei Raumtemperatur (25 – 30 °C) für 15 Minuten inkubieren.
d. Säule in ein neues 2 ml Collection Tube stecken und 400 µl RNA Wash Buffer I
zugeben. Säule bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubieren. Anschließend bei
10.000 x g* für 5 Minuten zentrifugieren und Durchfluss verwerfen. Collection Tube im
nächsten Schritt (Schritt 6) weiterverwenden.
6. Waschen II
Säule in dasselbe 2 ml Collection Tube stecken und 500 µl RNA Wash Buffer II
(komplettiert mit 4 x Volumen abs. Ethanol) zugeben. Bei 10.000 x g* für 1 Minute
zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen und Collection Tube wiederverwenden.
7. Waschen III (optional)
Säule durch Zugabe von 500 µl RNA Wash Buffer II (komplettiert mit 4 x Volumen abs.
Ethanol) ein zweites Mal waschen wie in Schritt 6 beschrieben. Bei 10.000 x g* für
1 Minute zentrifugieren und Säulendurchfluss verwerfen.
8. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!)
PerfectBind MS RNA Column im selben Collection Tube durch Zentrifugation bei
10.000 x g* für 2 Minuten trocknen.
* Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 31
peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Art.-Nr.: 12-6831
PEQLAB_v0314_D 69. Elution PerfectBind MS RNA Column in ein sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und RNA mit 15 – 30 µl RNase-free Water eluieren. Das Wasser direkt auf die Mitte der Membran geben und 1 Minute bei 6.000 x g* zentrifugieren. Die gebundene RNA kann auch mit kleineren Volumina (< 15 µl) eluiert werden, jedoch reduziert ein kleineres Elutionsvolumen den RNA-Ertrag. Die Gesamtausbeute liegt 20 – 30 % niedriger, wenn das Elutionsvolumen weniger als 10 µl beträgt. B. Extraktion von RNA aus Mikro-Dissektionsschnitten (Formalin-fixiertes Gewebe) Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden: ! 100 % Ethanol ! RNase-freie Filterspitzen und Zentrifugationsröhrchen ! Wasserbad oder Heizblock vorgeheizt auf 55 °C ! Proteinase K (20 mg/ml) ! 70 % Ethanol Hinweis: Hinweis: Proben und RNA Lysis Buffer T vor der Bearbeitung auf Raumtemperatur bringen. Alle Arbeitsschritte bei Raumtemperatur ausführen. Zügig und sorgfältig arbeiten. Hinweis: Je nach Fixier- und Färbeprotokoll, Lagerbedingungen und dem Alter der Probe, kann die RNA hochgradig degradiert und in Moleküllängen von unter 300 Nukleotiden fragmentiert sein. Ein Verlust an RNA kann dann auftreten, wenn die Probe vollständig degradiert ist. 1. Homogenisierung und Lyse Probengewebe zusammen mit 180 µl RNA Lysis Buffer T in ein 1.5 oder 2 ml Zentrifugationsröhrchen geben. 295 µl RNase-free Water und danach 5 µl Proteinase K (20 mg/ml) hinzufügen. Ansatz bei 55 °C für 10 Minuten inkubieren und bei 10.000 x g* für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Ein kleines Pellet aus Zelldebris sowie ein dünner Film auf der Oberfläche des Lysats können dabei entstehen. Den Überstand unter diesem Film (ca. 400 µl) auf eine DNA Removing Column überführen. Hinweis: Dabei kein Pelletmaterial überführen! Die Pipettenspitze beim Pipettieren unter dem dünnen Film halten. Sollte ein Film vorhanden sein, wird er an der Pipettenspitze kleben bleiben und soll nicht übertragen werden. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 31 peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Art.-Nr.: 12-6831 PEQLAB_v0314_D 7
2. DNA-Entfernung Lysat auf eine DNA Removing Column überführen und zusammen mit Collection Tube bei 10.000 x g* für 1 Minute zentrifugieren. DNA Removing Column verwerfen und Filtrat weiter verwenden. 200 µl 70 % Ethanol zum Lysat geben und Probe sorgfältig mittels einer Pipette mischen. 3. Laden und Binden PerfectBind MS RNA Column in ein neues 2 ml Collection Tube stecken. Den gesamten Ansatz auf die PerfectBind MS RNA Column laden und bei 10.000 x g* für 1 Minute bei Raumtemperatur zentrifugieren. Säulendurchfluss und Collection Tube anschließend verwerfen. 4. Waschen I PerfectBind MS RNA Column in ein neues 2 ml Collection Tube stecken und 500 µl RNA Wash Buffer I zugeben. Bei 10.000 x g* für 1 Minute zentrifugieren und Säulendurchfluss verwerfen. Collection Tube im nächsten Schritt wiederverwenden. Wenn ein DNase- Verdau auf der Säule gewünscht wird, mit Schritt 5 fortfahren, ansonsten zu Schritt 6 weitergehen. 5. DNase I Verdau (optional) Für einen DNA-Verdau auf der Säule siehe Protokoll auf Seite 5 und 6. 6. Waschen II Säule in dasselbe 2 ml Collection Tube stecken und 500 µl RNA Wash Buffer II (komplettiert mit 4 x Volumen abs. Ethanol) zugeben. Bei 10.000 x g* für 1 Minute zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen und Collection Tube wiederverwenden. 7. Waschen III (optional) Säule durch Zugabe von 500 µl RNA Wash Buffer II (komplettiert mit 4 x Volumen abs. Ethanol) ein zweites Mal waschen wie in Schritt 6 beschrieben. Bei 10.000 x g* für 1 Minute zentrifugieren und Säulendurchfluss verwerfen. 8. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) PerfectBind MS RNA Column im selben Collection Tube durch Zentrifugation bei 10.000 x g* für 2 Minuten trocknen. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 31 peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Art.-Nr.: 12-6831 PEQLAB_v0314_D 8
9. Elution PerfectBind MS RNA Column in ein sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und RNA mit 15 – 30 µl RNase-free Water eluieren. Das Wasser direkt auf die Mitte der Membran geben und 1 Minute bei 6.000 x g* zentrifugieren. Die gebundene RNA kann auch mit kleineren Volumina (< 15 µl) eluiert werden, jedoch reduziert ein kleineres Elutionsvolumen den RNA-Ertrag. Die Gesamtausbeute liegt 20 – 30 % niedriger, wenn das Elutionsvolumen weniger als 10 µl beträgt. C. RNA-Isolation aus Gewebe oder kultivierten Zellen Diese Methode wurde entwickelt für die meisten tierischen Gewebe oder Zellen aus Zellkultur. Für die RNA-Isolation aus faserigem Gewebe empfiehlt sich das Protokoll D. Alle Zentrifugationsschritte müssen bei Raumtemperatur ausgeführt werden. Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden: ! 100 % Ethanol ! RNase-freie Filterspitzen und Zentrifugationsröhrchen ! 70 % Ethanol Hinweis: Hinweis: Proben und RNA Lysis Buffer T vor der Bearbeitung auf Raumtemperatur bringen. Alle Arbeitsschritte bei Raumtemperatur ausführen. Zügig und sorgfältig arbeiten. Hinweis: Je nach Fixier- und Färbeprotokoll, Lagerbedingungen und dem Alter der Probe, kann die RNA hochgradig degradiert und in Moleküllängen von unter 300 Nukleotiden fragmentiert sein. Ein Verlust an RNA kann dann auftreten, wenn die Probe vollständig degradiert ist. 1. Homogenisierung und Lyse Zunächst Ausgangsmenge des Materials bestimmen. Nicht mehr als 5 x 105 Zellen oder 5 mg Gewebe einsetzen. Zellen oder Gewebe in 300 µl RNA Lysis Buffer T mit einer der Methoden auf Seite 4 aufschließen und lysieren. 2. DNA-Entfernung Lysat auf eine DNA Removing Column überführen und bei 10.000 x g* für 1 Minute zentrifugieren. DNA Removing Column verwerfen und das Filtrat weiter verwenden. 200 µl 70 % Ethanol zugeben und Probe sorgfältig mittels einer Pipette mischen. 3. Laden und Binden PerfectBind MS RNA Column in ein neues 2 ml Collection Tube stecken. Den gesamten Ansatz auf die PerfectBind RNA Column laden und bei 10.000 x g* für 1 min bei Raum- temperatur zentrifugieren. Säulendurchfluss und Collection Tube anschließend verwerfen. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 31 peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Art.-Nr.: 12-6831 PEQLAB_v0314_D 9
4. Waschen I PerfectBind MS RNA Column in ein neues 2 ml Collection Tube stecken und 500 µl RNA Wash Buffer I zugeben. Bei 10.000 x g* für 1 Minute zentrifugieren und Säulendurchfluss verwerfen. Collection Tube im nächsten Schritt wiederverwenden. Wenn ein DNase- Verdau auf der Säule gewünscht wird, mit Schritt 5 fortfahren, ansonsten zu Schritt 6 weitergehen. 5. DNase I Verdau (optional) Für einen DNA-Verdau auf der Säule siehe Protokoll auf Seite 5 und 6. 6. Waschen II Säule in dasselbe 2 ml Collection Tube stecken und 500 µl RNA Wash Buffer II (komplettiert mit 4 x Volumen abs. Ethanol) zugeben. Bei 10.000 x g* für 1 Minute zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen und Collection Tube wiederverwenden. 7. Waschen III (optional) Säule durch Zugabe von 500 µl RNA Wash Buffer II (komplettiert mit 4 x Volumen abs. Ethanol) ein zweites Mal waschen wie in Schritt 6 beschrieben. Bei 10.000 x g* für 1 Minute zentrifugieren und Säulendurchfluss verwerfen. 8. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) PerfectBind MS RNA Column im selben Collection Tube durch Zentrifugation bei 10.000 x g* für 2 Minuten trocknen. 9. Elution PerfectBind MS RNA Column in ein sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und RNA mit 15 – 30 µl RNase-free Water eluieren. Das Wasser direkt auf die Mitte der Membran geben und 1 Minute bei 6.000 x g* zentrifugieren. Die gebundene RNA kann auch mit kleineren Volumina (< 15 µl) eluiert werden, jedoch reduziert ein kleineres Elutionsvolumen den RNA-Ertrag. Die Gesamtausbeute liegt 20 – 30 % niedriger, wenn das Elutionsvolumen weniger als 10 µl beträgt. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 31 peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Art.-Nr.: 12-6831 PEQLAB_v0314_D 10
D. RNA-Extraktion aus faserigem Gewebe (Skelettmuskel, Herz- oder Aortagewebe, etc.) Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden: ! 100 % Ethanol ! RNase-freie Filterspitzen und Zentrifugationsröhrchen ! Wasserbad oder Heizblock vorgeheizt auf 55 °C ! Proteinase K (20 mg/ml) ! 70 % Ethanol Hinweis: Hinweis: Proben und RNA Lysis Buffer T vor der Bearbeitung auf Raumtemperatur bringen. Alle Arbeitsschritte bei Raumtemperatur ausführen. Zügig und sorgfältig arbeiten. Hinweis: Je nach Fixier- und Färbeprotokoll, Lagerbedingungen und dem Alter der Probe, kann die RNA hochgradig degradiert und in Moleküllängen von unter 300 Nukleotiden fragmentiert sein. Ein Verlust an RNA kann dann auftreten, wenn die Probe vollständig degradiert ist. 1. Homogenisierung und Lyse Das Gewebe kann direkt nach der Entnahme oder auch gelagert verwendet werden. Bis zu 5 mg Gewebe in ein 1.5 ml Zentrifugationsröhrchen geben und 200 µl RNA Lysis Buffer T hinzufügen. Gewebe mit einer der Methoden von Seite 4 aufschließen und homogenisieren. Hinweis: Eine unvollständige Homogenisation resultiert in klumpigen Lysaten und verstopften Säulen, was zu deutlich verminderten Ausbeuten führt. Im Allgemeinen führt die Verwendung von Mörsern und Spritzen bei der Homogenisation zu niedrigeren Ausbeuten. Die Verwendung von Homogenisatoren mit Kügelchen (z.B. Precellys 24) oder einem Rotor-Stator wird daher empfohlen. 295 µl RNase-free Water und danach 5 µl Proteinase K (20 mg/ml) hinzufügen. Ansatz bei 55 °C für 10 Minuten inkubieren und bei 10.000 x g* für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Ein kleines Pellet aus Zelldebris sowie ein dünner Film auf der Oberfläche des Lysats können dabei entstehen. Den Überstand unter diesem Film (ca. 400 µl) auf eine DNA Removing Column überführen. Hinweis: Dabei kein Pelletmaterial überführen. Die Pipettenspitze beim Pipettieren unter dem dünnen Film halten. Sollte ein Film vorhanden sein, wird er an der Pipettenspitze kleben bleiben und soll nicht übertragen werden. 2. DNA-Entfernung Lysat auf eine DNA Removing Column überführen und bei 10.000 x g* für 1 Minute zentrifugieren. DNA Removing Column verwerfen und Filtrat weiter verwenden. 200 µl 70 % Ethanol zugeben und Probe sorgfältig mittels einer Pipette mischen. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 31 peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Art.-Nr.: 12-6831 PEQLAB_v0314_D 11
3. Laden und Binden PerfectBind MS RNA Column in ein neues 2 ml Collection Tube stecken. Den gesamten Ansatz auf die PerfectBind MS RNA Column laden und bei 10.000 x g* für 1 Minute bei Raumtemperatur zentrifugieren. Säulendurchfluss und Collection Tube anschließend verwerfen. 4. Waschen I PerfectBind MS RNA Column in ein neues 2 ml Collection Tube stecken und 500 µl RNA Wash Buffer I zugeben. Bei 10.000 x g* für 1 Minute zentrifugieren und Säulendurchfluss verwerfen. Collection Tube im nächsten Schritt wiederverwenden. Wenn ein DNase- Verdau auf der Säule gewünscht wird, mit Schritt 5 fortfahren, ansonsten zu Schritt 6 weitergehen. 5. DNase I Verdau (optional) Für einen DNA-Verdau auf der Säule siehe Protokoll auf Seite 5 und 6. 6. Waschen II Säule in dasselbe 2 ml Collection Tube stecken und 500 µl RNA Wash Buffer II (komplettiert mit 4 x Volumen abs. Ethanol) zugeben. Bei 10.000 x g* für 1 Minute zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen und Collection Tube wiederverwenden. 7. Waschen III (optional) Säule durch Zugabe von 500 µl RNA Wash Buffer II (komplettiert mit 4 x Volumen abs. Ethanol) ein zweites Mal waschen wie in Schritt 6 beschrieben. Bei 10.000 x g* für 1 Minute zentrifugieren und Säulendurchfluss verwerfen. 8. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) PerfectBind MS RNA Column im selben Collection Tube durch Zentrifugation bei 10.000 x g* für 2 Minuten trocknen. 9. Elution PerfectBind MS RNA Column in ein sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und RNA mit 15 – 30 µl RNase-free Water eluieren. Das Wasser direkt auf die Mitte der Membran geben und 1 Minute bei 6.000 x g* zentrifugieren. Die gebundene RNA kann auch mit kleineren Volumina (< 15 µl) eluiert werden, jedoch reduziert ein kleineres Elutionsvolumen den RNA-Ertrag. Die Gesamtausbeute liegt 20 – 30 % niedriger, wenn das Elutionsvolumen weniger als 10 µl beträgt. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 31 peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Art.-Nr.: 12-6831 PEQLAB_v0314_D 12
RNA-QUALITÄT Vor Ihrer Verwendung in Folgeexperimenten sollte zunächst die Qualität der extrahierten RNA durch denaturierende Agarosegelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung bestimmt werden. Auf dem gefärbten Gel müssen zwei scharfe Banden erkennbar sein, die die ribosomalen 28 S und 18 S rRNAs (bei Bakterien 23 S und 16 S) repräsentieren. Sollten diese Banden in Richtung niedermolekularer RNA-Größen schmieren, ist es während der Präparation, Lagerung oder Weiterbearbeitung zu einer Degradation gekommen, die sich je nach Folgeexperiment mehr oder weniger negativ auswirken kann. DNA-KONTAMINATIONEN Mit keinem der aktuell verfügbaren RNA-Extraktionssysteme ist es möglich, genomische DNA vollständig zu entfernen. Für sensitive Experimente wie Differential Display oder RT- PCRs muss deshalb ein DNase I Verdau durchgeführt werden. Eine einfache und zeitsparende Möglichkeit bietet der DNase-Verdau direkt auf der Säule, der in das bestehende Protokoll zwischen den Waschschritten integriert werden kann (s. Punkt 5: DNase I Verdau). Alternativ kann auch eine Nachbehandlung der isolierten RNA mit RNase-freier DNase durchgeführt werden. DNA-Kontaminationen können bei der RT-PCR auch durch die Verwendung von Intron- überspannenden Primern nachgewiesen werden, wobei das Entstehen von Banden auf mögliche Kontaminationen hinweist. QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER RNA Um die Konzentration und Reinheit der isolierten RNA zu bestimmen, muss die Absorption eines geeignet verdünnten Aliquots (10- bis 50-fach) bei 260 nm und 280 nm gemessen werden. 1 O.D. Einheit gemessen bei 260 nm entspricht 40 µg RNA/ml. RNase-free Water ist leicht sauer und kann die gemessenen Absorptionswerte dramatisch herabsetzen. Für die spektrophotometrische Analyse sollte die RNA deshalb besser in TE-Puffer verdünnt werden. Das A260/280-Verhältnis reiner Nukleinsäuren liegt bei 2.0, das reiner Proteine bei 0.6. Ein Verhältnis von 1.8 – 2.0 entspricht deshalb RNA einer Reinheit von 90 – 100 %. Die RNA kann in RNase-free Water für mindestens ein Jahr bei –70 °C aufbewahrt werden. peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Art.-Nr.: 12-6831 PEQLAB_v0314_D 13
BESTELLINFORMATIONEN
für die RNA-Isolierung aus Zellen, Geweben und Blut:
peqGOLD Plant RNA Kit 12-6627-00 5 Reinigungen
(Safety-Line) 12-6627-01 50 Reinigungen
12-6627-02 200 Reinigungen
peqGOLD Bacterial RNA Kit 12-6850-00 5 Reinigungen
(Safety-Line) 12-6850-01 50 Reinigungen
12-6850-02 200 Reinigungen
peqGOLD Viral RNA Kit 12-6874-00 5 Reinigungen
(Safety-Line) 12-6874-01 50 Reinigungen
12-6874-02 200 Reinigungen
peqGOLD Total RNA Kit 12-6834-00 5 Reinigungen
(Safety-Line) 12-6834-01 50 Reinigungen
12-6834-02 200 Reinigungen
peqGOLD Total RNA Kit 12-6634-00 5 Reinigungen
(Classic-Line) 12-6634-01 50 Reinigungen
12-6634-02 200 Reinigungen
peqGOLD Blood RNA Kit 12-6814-00 5 Reinigungen
(Safety-Line) 12-6814-01 50 Reinigungen
12-6814-02 200 Reinigungen
peqGOLD Blood RNA Kit 12-6614-00 5 Reinigungen
(Classic-Line) 12-6614-01 50 Reinigungen
12-6614-02 200 Reinigungen
peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit 12-6831-00 5 Reinigungen
(Safety-Line) 12-6831-01 50 Reinigungen
12-6831-02 200 Reinigungen
peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Art.-Nr.: 12-6831
PEQLAB_v0314_D 14TROUBLESHOOTING TIPS
Problem Ursache
Ursache Abhilfe
Wenig oder keine RNA bleibt auf der Säule Elution wiederholen.
RNA im Eluat
RNase-free Water vor der Elution auf 70 °C
vorwärmen.
Säule vor dem Eluieren für 10 min mit
RNase-free Water inkubieren.
Säule ist überladen Menge des Ausgangsmaterials reduzieren.
Säule verstopft Unvollständige Probe vollständig homogenisieren.
Homogenisation Zentrifugationszeit verlängern.
Menge des Ausgangsmaterials reduzieren.
RNA-Degradation Schlechtes Ausgangsmaterial sofort nach der
Ausgangsmaterial Probennahme in Stickstoff einfrieren.
Ausgangsmaterial vor der Lagerung zuerst
lysieren.
Präparation zügiger und exakt nach
Vorschrift durchführen.
RNase Kontamination Nur RNase-freies Material verwenden und
Handschuhe tragen.
Puffer auf RNase-Kontaminationen prüfen.
Probleme in Salzübertragung Sicherstellen, dass RNA Wash Buffer II mit
Folgereaktionen während der Elution 4 Volumen 100 % Ethanol verdünnt wurde.
Verdünnter RNA Wash Buffer II muss bei
Raumtemperatur gelagert und verwendet
werden.
Waschschritt mit RNA Wash Buffer II
wiederholen.
DNA Kontamination Physikalische Ähnlichkeit Verdau mit RNase-freier DNase (5 min bei
von RNA und DNA 37 °C inkubieren) oder DNA-Verdau auf der
Säule durchführen.
RNase-free Water ist sauer und kann die
Niedrige RNA in saurem Puffer
Absorptionsraten oder Wasser verdünnt A260-Werte dramatisch herabsetzen. RNA
zum Vermessen in TE-Puffer verdünnen.
peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Art.-Nr.: 12-6831
PEQLAB_v0314_D 15INTRODUCTION peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit provides a rapid and easy method for the isolation of up to 50 µg of total RNA from small amounts of cultured eukaryotic cells, tissues such as laser dissected samples (LDS) or fine needle aspirates (FNA). Normally, up to 5 x 105 eukaryotic cells or 5 mg tissue (amounts depend on the tissue used) can be processed in a single experiment. The kit allows single or multiple, simultaneous processing of samples in less than 30 min. There is no need for phenol/chloroform extractions, and time- consuming steps such as CsCl gradient ultracentrifugation and precipitation with isopropanol or LiCl are eliminated. RNA purified using the peqGOLD MicroSpin Total RNA method is ready for applications such as RT-PCR, Northern blotting, Poly (A)+ RNA (mRNA) purification, nuclease protection and in vitro translation. THEORY The peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit combines the reversible binding properties of PerfectBind matrix, a new silica-based material, with the speed of mini-column spin technology. A specifically formulated high salt buffer system allows RNA molecules greater than 25 bases to bind to the matrix. Cells or tissues are first lysed under denaturing conditions that practically inactivate RNases. In the following the lysate is applied to a DNA Removing Column which leads to the selective removal of genomic DNA. After adding 70 % ethanol samples are applied to the PerfectBind RNA Columns to which total RNA binds, while cellular debris and other contaminants are effectively washed away. High quality RNA is finally eluted in RNase- free Water. peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Order No.: 12-6831 PEQLAB_v0314_E 16
STORAGE AND STABILITY peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit should be stored at room temperature. During shipment crystals may form in the RNA Lysis Buffer T. Warm to 37 °C to dissolve. All peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit components are guaranteed for at least 12 months from the date of purchase when stored at 22 – 25 °C. KIT COMPONENTS peqGOLD MicroSpin Total 5 Preparations 50 Preparations 200 Preparations RNA Kit Product Number 12-6831-00 12-6831-01 12-6831-02 Components PerfectBind MS RNA Columns 5 50 200 DNA Removing Columns 5 50 200 2 ml Collection Tubes 20 200 4 x 200 RNA Lysis Buffer T 1.5 ml 20 ml 80 ml RNA Wash Buffer I 5 ml 50 ml 200 ml RNA Wash Buffer II (conc.) 2 ml 20 ml 3 x 20 ml RNase-free Water 1 ml 5 ml 20 ml Instruction manual 1 1 1 peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Order No.: 12-6831 PEQLAB_v0314_E 17
BEFORE STARTING
Please read the protocol carefully before the first use of the peqGOLD MicroSpin Total RNA
Kit and keep all required materials available before starting preparation.
! RNA Wash Buffer II is delivered as a concentrate and must be diluted with absolute
ethanol before use:
Kit 12-6831-00 Add 8 ml 100% EtOH to 2 ml RNA Wash Buffer II
Kit 12-6831-01 Add 80 ml 100% EtOH to 20 ml RNA Wash Buffer II
Kit 12-6831-02 Add 3 x 80 ml 100% EtOH to 3 x 20 ml RNA Wash Buffer II
! Diluted RNA Wash Buffer II should be stored at room temperature. If stored at lower
temperatures, it should be warmed to room temperature before use.
! All centrifugation steps have to be performed at 22 – 25 °C.
! Whenever working with RNA, always wear latex gloves to minimize RNase
contamination. Use only clean RNase-free disposable plastic pipette tips when using
the supplied reagents.
! During the procedure work carefully but quickly.
! Under cool ambient conditions, crystals may form in RNA Lysis Buffer T. This is normal
and the bottle should be warmed to 37 °C to redissolve the salt.
peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Order No.: 12-6831
PEQLAB_v0314_E 18DISRUPTION AND HOMOGENIZATION OF SAMPLES For all RNA isolation process, it is absolutely critical to disrupt and homogenize the sample. Laser dissected samples (LDS) and fine needle aspirates (FNA) can be simultaneously disrupted and homogenized by vortexing. For other samples, select one of the following methods for disruption and homogenization. a. Disruption with Liquid Nitrogen Wear gloves and take great care when working with liquid nitrogen! Excise tissue and promptly freeze in a small volume of liquid nitrogen. Grind tissue with a ceramic mortar and pestle under approximately 10 ml of liquid nitrogen and pour the suspension into a pre-cooled (!) 15 ml polypropylene tube. Unless the tube is pre-cooled (in liquid nitrogen), the suspension will boil vigorously possibly causing loss of tissue. When the liquid nitrogen has completely evaporated, add RNA Lysis Buffer T and continue with the procedure as outlined below. b. Disruption and Homogenization with Homogenizers (e.g. Precellys® 24) Tissue samples can also be effectively disrupted and homogenized by rapid agitation in the presence of beads and lysis buffer in a Homogenizer. Tissue samples are disrupted and simultaneously homogenized with the sheared and crushed action of the beads as they collide with cells. c. Disruption and Homogenization with Rotor-Stator Rotor-stator homogenizers effectively homogenize most tissues in the presence of RNA Lysis Buffer T. The process usually takes less than a minute depending on the tissue. Many Rotor-stator homogenizers operate with differently sized probes or generators that allow processing of small volumes in microcentrifuge tubes. d. Homogenization using syringe and fine needle After disrupting the tissue, the lysate can be homogenized with a syringe and needle. High molecular-weight DNA can be sheared by passing the lysate through a narrow needle (19 - 21 gauge) for 5 to 10 times. peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Order No.: 12-6831 PEQLAB_v0314_E 19
PEQGOLD MICROSPIN TOTAL RNA ISOLATION PROTOCOL A. Total RNA Isolation from Laser Dissected Samples Materials required, but not supplied: ! 100 % ethanol ! RNase-free pipette tips and microcentrifuge tubes ! 70 % ethanol Note: Equilibrate samples and RNA Lysis Buffer T to room temperature before start. All steps must be carried out at room temperature. Work quickly, but carefully. Note: Depending on the process of the fixation protocol, storage condition, staining protocol and the age of the sample, RNA can be highly degraded into small fragments less than 300 nt. A loss of RNA can occur if the sample is completely degraded. 1. Homogenization and lysis Collect samples into a 1.5 centrifuge tube containing 200 µl RNA Lysis Buffer T, depending on the starting amount of material. 2. DNA Removal Apply lysate to a DNA Removing Column and centrifuge for 1 min at 10.000 x g*. Discard the DNA Removing Column and use the filtrate for step 3. Add 200 µl 70 % ethanol and mix thoroughly with a pipette. 3. Loading and Binding Place a PerfectBind MS RNA Column in a new 2 ml Collection Tube. Apply the whole sample to the PerfectBind MS RNA Column and centrifuge at 10.000 x g* for 1 min at room temperature. Discard flow-through and Collection Tube. 4. Wash I Place PerfectBind MS RNA Column in a new 2 ml Collection Tube and add 500 µl RNA Wash Buffer I. Centrifuge for 1 min at 10.000 x g* and discard flow-through. Re-use the Collection Tube for the next step. If on-membrane DNase I digestion is desired, proceed with step 5, otherwise go to step 6. 5. DNase I Digestion (optional) Since PerfectBind RNA resin and spin-column technology actually removes most of DNA without the DNase treatment, it is not necessary to do DNase digestion for most downstream applications. However, certain sensitive RNA applications might require further DNA removal. Following steps provide on-membrane DNase I digestion (Order No. 12-1091). * Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 31 peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Order No.: 12-6831 PEQLAB_v0314_E 20
a. For each PerfectBind MS RNA Column, prepare this DNase I digestion reaction mix:
DNase I Digestion Buffer 73.5 µl
RNase-free DNase I (20 Kunitz units/µl) 1.5 µl
Total volume 75 µl
Note:
1. DNase I is very sensitive for physical denaturation, so do not vortex this DNase I mixture!
Mix gently by inverting the tube. Prepare the fresh DNase I digestion mixture directly before
RNA isolation.
2. DNase I Digestion Buffer is supplied with RNase-free DNase set.
Standard DNase buffers are not compatible with on-membrane DNase digestion!
b. Pipet 75 µl of the DNase I digestion reaction mix directly onto the surface of
PerfectBind RNA resin in each column. Make sure to pipet the DNase I digestion
mixture directly onto the membrane. DNase I digestion will not be complete if some of
the mix stick to the wall or the O-ring of the PerfectBind MS RNA Column.
c. Incubate at room temperature (25 – 30 °C) for 15 minutes.
d. Place a PerfectBind MS RNA Column into a new 2 ml Collection Tube and add 400 µl
RNA Wash Buffer I. Place the column at benchtop for 5 minutes. Centrifuge at
10.000 x g* for 5 minutes and discard flow-through. Re-use Collection Tube in the next
step. Continue with step 6.
6. Wash II
Place a PerfectBind MS RNA Column in the same 2 ml Collection Tube and add 500 µl
RNA Wash Buffer II (completed with 4 volumes of 100 % ethanol). Centrifuge at
10.000 x g* for 1 min. Discard flow-through and re-use the Collection Tube in the next
step.
7. Wash III (optional)
Wash PerfectBind MS RNA Column with a second 500 µl of RNA Wash Buffer II
(completed with 4 volumes of 100 % ethanol) as described in step 6. Centrifuge and
discard flow-through.
8. Dry (Important! Do not skip this step!)
Using the same Collection Tube, centrifuge the PerfectBind MS RNA Column for 2 min at
10.000 x g* to completely dry the PerfectBind matrix.
9. Elution
Transfer the PerfectBind MS RNA Column to a clean 1.5 ml microfuge tube and elute the
RNA with 15 – 30 µl of RNase-free Water. Make sure to add water directly onto the
center of the membrane. Centrifuge 1 min at 6.000 x g*.
* Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 31
peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Order No.: 12-6831
PEQLAB_v0314_E 21RNA may be eluted with a smaller (< 15 µl) volume of water to get higher RNA concentration, though reduced elution volume decreases total RNA yield. The total yield will be 20 – 30 % less when the elution volume is less than 10 µl. B. Extraction of RNA from Micro-Dissected Formalin-fixed Tissues Materials required, but not supplied: ! 100 % ethanol ! RNase-free pipette tips and microcentrifuge tubes ! Water bath or heat block preset at 55 °C ! Proteinase K (20 mg/ml) ! 70 % ethanol Note: Equilibrate samples and RNA Lysis Buffer T to room temperature before start. All steps must be carried out at room temperature. Work quickly, but carefully. Note: Depending on the process of the fixation protocol, storage condition, staining protocol and the age of the sample, RNA can be highly degraded into small fragments less than 300 nt. A loss of RNA can occur if the sample is completely degraded. 1. Homogenization and Lysis Collect samples into a 1.5 or 2 ml centrifuge tube containing 180 µl RNA Lysis Buffer T. Add 295 µl RNase-free Water and then 5 µl of Proteinase K (20 mg/ml) to the sample. Incubate at 55 °C for 10 minutes and centrifuge at 10.000 x g* for 5 minutes at room temperature. A small pellet of tissue debris will form and a thin layer or film can be seen on top of the supernatant. Transfer the supernatant (about 400 µl) to a DNA Removing Column. Note: Avoid to transfer any material of the pellet. Hold the pipet tip under the thin layer or film on top of the supernatant, if present. This layer will usually adhere to the outside of the tip and should not be transferred. 2. DNA Removal Apply the lysate to a DNA Removing Column and centrifuge for 1 min at 10.000 x g*. Discard the DNA Removing Column and use the filtrate for step 3. Add 200 µl 70 % ethanol and mix thoroughly with a pipette. 3. Loading and Binding Place a PerfectBind MS RNA Column in a new 2 ml Collection Tube. Apply the whole sample to the PerfectBind MS RNA Column and centrifuge at 10.000 x g* for 1 min at room temperature. Discard flow-through and Collection Tube. * Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 31 peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Order No.: 12-6831 PEQLAB_v0314_E 22
4. Wash I Place PerfectBind MS RNA Column in a new 2 ml Collection Tube and add 500 µl RNA Wash Buffer I. Centrifuge for 1 min at 10.000 x g* and discard flow-through. Re-use the Collection Tube for the next step. If on-membrane DNase I digestion is desired, proceed with step 5, otherwise go to step 6. 5. DNase I Digestion (optional) For DNase I digest on the column see protocol page 20 and 21. 6. Wash II Place PerfectBind MS RNA Column in the same 2 ml Collection Tube and add 500 µl RNA Wash Buffer II (completed with 4 volumes of 100 % ethanol). Centrifuge at 10.000 x g* for 1 min. Discard the flow-through and re-use the Collection Tube in the next step. 7. Wash III (optional) Wash PerfectBind MS RNA Column with a second 500 µl of RNA Wash Buffer II (completed with 4 volumes of 100 % ethanol) as described in step 6. Centrifuge and discard flow-through. 8. Dry (Important! Do not skip this step!) Using the same Collection Tube, centrifuge the PerfectBind MS RNA Column for 2 min at 10.000 x g* to completely dry the PerfectBind matrix. 9. Elution Transfer the PerfectBind MS RNA Column to a clean 1.5 ml microfuge tube and elute the RNA with 15 – 30 µl of RNase-free Water. Make sure to add water directly onto the center of the membrane. Centrifuge 1 min at 6.000 x g*. RNA may be eluted with a smaller (< 15 µl) volume of water to get higher RNA concentration, though reduced elution volume decreases total RNA yield. The total yield will be 20 – 30 % less when the elution volume is less than 10 µl. peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Order No.: 12-6831 PEQLAB_v0314_E 23
C. RNA Isolation from Animal Tissue or Cell Culture This method is designed for most animal tissues and culture cells. For RNA isolation from fibrous tissue, follow the specialized protocol D. For laser dissected samples, please follow the protocol A. All centrifugation steps must be carried out at room temperature. Materials required, but not supplied: ! 100% ethanol ! RNase-free pipette tips and microcentrifuge tubes ! 70 % ethanol Note: Equilibrate samples and RNA Lysis Buffer T to room temperature before start. All steps must be carried out at room temperature. Work quickly, but carefully. Note: Depending on the process of the fixation protocol, storage condition, staining protocol and the age of the sample, RNA can be highly degraded into small fragments less than 300 nt. A loss of RNA can occur if the sample is completely degraded. 1. Homogenization and Lysis Determine the starting amount of sample. Do not use more than 5 x 105 cells or 5 mg tissue. Lyse cells or tissues with 300 µl of RNA Lysis Buffer T. Disrupt the tissue or cells and homogenize the lysate in RNA Lysis Buffer T according to one of the methods on page 19. 2. DNA Removal Apply lysate to a DNA Removing Column and centrifuge for 1 minute at 10.000 x g*. Discard the DNA Removing Column and use filtrate for step 3. Add 200 µl 70 % ethanol and mix thoroughly with a pipette. 3. Loading and Binding Place a PerfectBind MS RNA Column in a 2 ml Collection Tube. Apply the whole sample to the PerfectBind MS RNA Column and centrifuge at 10.000 x g* for 1 min at room temperature. Discard flow-through and Collection Tube. 4. Wash I Place PerfectBind MS RNA Column in a new 2 ml Collection Tube and add 500 µl RNA Wash Buffer I. Centrifuge for 1 minute at 10.000 x g* and discard flow-through. Re-use the Collection Tube for the next step. If on-membrane DNase I digestion is desired, proceed with step 5, otherwise go to step 6. * Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 31 peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Order No.: 12-6831 PEQLAB_v0314_E 24
5. DNase I Digestion (optional) For DNase I digest on the column see protocol page 20 and 21. 6. Wash II Place PerfectBind MS RNA Column in the same 2 ml Collection Tube and add 500 µl RNA Wash Buffer II (completed with 4 volumes of 100 % ethanol). Centrifuge at 10.000 x g* for 1 min. Discard the flow-through and re-use the Collection Tube in the next step. 7. Wash III (optional) Wash PerfectBind MS RNA Column with a second 500 µl of RNA Wash Buffer II (completed with 4 volumes of 100 % ethanol) as described in step 6. Centrifuge and discard flow-through. 8. Dry (Important! Do not skip this step!) Using the same Collection Tube, centrifuge the PerfectBind MS RNA Column for 2 min at 10.000 x g* to completely dry the PerfectBind matrix. 9. Elution Transfer the PerfectBind MS RNA Column to a clean 1.5 ml microfuge tube and elute the RNA with 15 – 30 µl of RNase-free Water. Make sure to add water directly onto the center of the membrane. Centrifuge 1 min at 6.000 x g*. RNA may be eluted with a smaller (< 15 µl) volume of water to get higher RNA concentration, though reduced elution volume decreases total RNA yield. The total yield will be 20 – 30 % less when the elution volume is less than 10 µl. * Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 31 peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Order No.: 12-6831 PEQLAB_v0314_E 25
D. Extraction of RNA from Fibrous Tissues (Skeletal Muscle, Heart and Aorta Tissue, et al.) Materials required, but not supplied: ! 100 % ethanol ! RNase-free pipette tips and microcentrifuge tubes ! Water bath or heat block preset at 55 °C ! Proteinase K (20 mg/ml) ! 70 % ethanol Note: Equilibrate samples and RNA Lysis Buffer T to room temperature before start. All steps must be carried out at room temperature. Work quickly, but carefully. Note: Depending on the process of the fixation protocol, storage condition, staining protocol and the age of the sample, RNA can be highly degraded into small fragments less than 300 nt. A loss of RNA can occur if the sample is completely degraded. 1. Homogenization and Lysis Excise tissue from animal or from storage. Weigh up to 5 mg tissue and immediately place it into a 1.5 ml tube. Add 200 µl RNA Lysis Buffer T and disrupt tissue and homogenize lysate in RNA Lysis Buffer T by using methods described on page 19. Note: Incomplete homogenization will cause clogging of the PerfectBind MS RNA Column and lead to significantly lower yield. Generally, disruption and homogenization by using mortar and pestle or needle and syringe can generate lower yield. It is recommended to use beads milling methods (e.g. Precellys 24) or a rotor stator homogenizer for animal tissues. Add 295 µl RNase-free Water and then 5 µl of Proteinase K (20 mg/ml) to the sample. Incubate at 55 °C for 10 minutes and centrifuge at 10.000 x g* for 5 minutes at room temperature. A small pellet of tissue debris will form and a thin layer or film can be seen on top of the supernatant. Transfer the supernatant (about 400 µl) to a DNA Removing Column. Note: Avoid to transfer any material of the pellet. Hold the pipet tip under the thin layer or film on top of the supernatant, if present. This layer will usually adhere to the outside of the tip and should not be transferred. 2. DNA Removal Apply lysate to a DNA Removing Column and centrifuge for 1 minute at 10.000 x g*. Discard the DNA Removing Column and use the filtrate for step 3. Add 200 µl 70 % ethanol and mix thoroughly with a pipette. * Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 31 peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Order No.: 12-6831 PEQLAB_v0314_E 26
3. Loading and Binding Place a PerfectBind MS RNA Column in a new 2 ml Collection Tube. Apply the whole sample to the PerfectBind MS RNA Column and centrifuge at 10.000 x g* for 1 min at room temperature. Discard flow-through and Collection Tube. 4. Wash I Place PerfectBind MS RNA Column in a new 2 ml Collection Tube and add 500 µl RNA Wash Buffer I. Centrifuge for 1 min at 10.000 x g* and discard flow-through. Re-use the Collection Tube for the next step. If on-membrane DNase I digestion is desired, proceed with step 5, otherwise go to step 6. 5. DNase I Digestion (optional) For DNase I digest on the column see protocol page 20 and 21. 6. Wash II Place PerfectBind MS RNA Column in the same 2 ml Collection Tube and add 500 µl RNA Wash Buffer II (completed with 4 volumes of 100 % ethanol). Centrifuge at 10.000 x g* for 1 min. Discard the flow-through and re-use the Collection Tube in the next step. 7. Wash III (optional) Wash PerfectBind MS RNA Column with a second 500 µl of RNA Wash Buffer II (completed with 4 volumes of 100 % ethanol) as described in step 6. Centrifuge and discard flow-through. 8. Dry (Important! Do not skip this step!) Using the same Collection Tube, centrifuge the PerfectBind MS RNA Column for 2 min at 10.000 x g* to completely dry the PerfectBind matrix. 9. Elution Transfer the PerfectBind MS RNA Column to a clean 1.5 ml microfuge tube and elute the RNA with 15 – 30 µl of RNase-free Water. Make sure to add water directly onto the center of the membrane. Centrifuge 1 min at 6.000 x g*. RNA may be eluted with a smaller (< 15 µl) volume of water to get higher RNA concentration, though reduced elution volume decreases total RNA yield. The total yield will be 20 – 30 % less when the elution volume is less than 10 µl. peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Order No.: 12-6831 PEQLAB_v0314_E 27
RNA QUALITY It is highly recommended that RNA quality be determined prior to all analyses. The quality of RNA can best be assessed by denaturing agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining. Two sharp bands should appear on the gel. These are the 28 S and 18 S (23 S and 16 S for bacteria) ribosomal RNA bands. If these bands smear towards lower molecular weight RNAs, then the RNA has undergone major degradation during preparation, handling or storage. DNA CONTAMINATION Generally PerfectBind MS RNA Column technology will efficiently remove most of the DNA without DNase treatment. However, no RNA extraction procedure can completely remove genomic DNA. For sensitive work (such as RT-PCR or differential display) we suggest that you treat the eluted RNA with RNase-free DNase. On-membrane DNase I Digestion (order no. 12-1091-01/02) is a simple and fast method and can be integrated into the standard protocol between the washing steps (see point 5). Alternatively, eluted RNA can be treated with RNase-free DNase. Also for RT-PCR, use intron-spanning primers that allow easy identification of DNA contamination. QUANTITATION AND STORAGE OF RNA To determine the concentration and purity of RNA, measure absorbance at 260 nm and 280 nm in a spectrophotometer. 1 O.D. unit measured at 260 nm corresponds to 40 µg of RNA per ml. RNase-free Water is slightly acidic and can dramatically lower absorbance values.We suggest that you dilute the sample in a buffered solution (TE) for spectrophotometric analysis. The ratio of A260/280 of pure nucleic acids is 2.0, while for pure protein it is approximately 0.6. A ratio of 1.8 – 2.0 corresponds to 90 % – 100 % pure nucleic acid. Store RNA samples at –70 °C in RNase-free Water. Under such conditions RNA prepared with the peqGOLD system is stable for more than a year. peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Order No.: 12-6831 PEQLAB_v0314_E 28
ORDERING INFORMATION
For RNA isolation from cells, tissues and blood:
peqGOLD Plant RNA Kit 12-6627-00 5 Preparations
(Safety-Line) 12-6627-01 50 Preparations
12-6627-02 200 Preparations
peqGOLD Bacterial RNA Kit 12-6850-00 5 Preparations
(Safety-Line) 12-6850-01 50 Preparations
12-6850-02 200 Preparations
peqGOLD Viral RNA Kit 12-6874-00 5 Preparations
(Safety-Line) 12-6874-01 50 Preparations
12-6874-02 200 Preparations
peqGOLD Total RNA Kit 12-6834-00 5 Preparations
(Safety-Line) 12-6834-01 50 Preparations
12-6834-02 200 Preparations
peqGOLD Total RNA Kit 12-6634-00 5 Preparations
(Classic-Line) 12-6634-01 50 Preparations
12-6634-02 200 Preparations
peqGOLD Blood RNA Kit 12-6814-00 5 Preparations
(Safety-Line) 12-6814-01 50 Preparations
12-6814-02 200 Preparations
peqGOLD Blood RNA Kit 12-6614-00 5 Preparations
(Classic-Line) 12-6614-01 50 Preparations
12-6614-02 200 Preparations
peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit 12-6831-00 5 Preparations
(Safety-Line) 12-6831-01 50 Preparations
12-6831-02 200 Preparations
peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Order No.: 12-6831
PEQLAB_v0314_E 29TROUBLESHOOTING TIPS
Problem Likely cause Suggestion
Little or no RNA eluted RNA remains on the Repeat elution.
column
Pre-heat RNase-free Water to 70 °C prior to
elution.
Incubate column for 10 min with water prior
to centrifugation.
Column is overloaded Reduce quantity of starting material.
Clogged column Incomplete Completely homogenize sample.
homogenization Increase centrifugation time.
Reduce amount of starting material.
Degraded RNA Source Freeze starting material quickly in liquid
nitrogen.
Do not store tissue or culture cells prior to
extraction unless they are lysed first.
Follow protocol closely, and work quickly.
RNase contamination Ensure not to introduce RNase during the
procedure, use gloves.
Check buffers for RNase contamination.
Problem in Salt carry-over during Ensure RNA Wash Buffer II Concentrate has
downstream elution been diluted with 4 volumes of 100 %
applications ethanol as indicated on the bottle.
Diluted RNA Wash Buffer II must be stored
and used at room temperature.
Repeat wash step with RNA Wash Buffer II.
DNA contamination Physical similarity of DNA DNA can be digested with RNase-free
and RNA DNase by incubating sample at 37 °C for
5 minutes
RNase-free Water is acidic and can
Low Absorption ratios RNA diluted in acidic
buffer or water dramatically lower A260 values. Use TE buffer
to dilute RNA prior to spectrophotometric
analysis.
peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Order No.: 12-6831
PEQLAB_v0314_E 30APPENDIX Abb. 1: Umrechnungstabelle rcf/rpm. Werte für Zentrifugen, abhängig vom Rotordurchmesser. Fig. 1: Table rcf/rpm. Values for centrifuges depending on rotor diameter. peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit Order No.: 12-6831 PEQLAB_v0314_E 31
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