(EHEC, EPEC, ETEC, EIEC, EAEC)- Infektionen mit Salmonellen und anderen Enterobacteriaceae, insbesondere E. coli
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Infektionen mit Salmonellen und anderen
Enterobacteriaceae, insbesondere E. coli
(EHEC, EPEC, ETEC, EIEC, EAEC) –
Epidemiologie und aktuelle Bewertung
Dr. Angelika Fruth
Robert Koch-Institut
Fachgebiet Bakterielle darmpathogene Erreger und Legionellen
NRZ für Salmonellen und andere bakterielle Enteritiserreger
28.09.2013, 28. Dresdner Kolloquium „Umwelt und Gesundheit“
IfSG, § 2
Aufgabe des Robert Koch-Instituts
• Erkennung, Verhütung und Bekämpfung von übertragbaren
Krankheiten
• epidemiologische Untersuchungen auf dem Gebiet der übertragbaren
Krankheiten einschließlich der Erkennung
• Salmonellose:
1888 erster Ausbruch in Bad Frankenhausen, Kyffhäuser,
notgeschlachtetes Rind
(Herr Prof. A. Gärtner aus Jena)
*Erstbeschreibung:
1880 Karl Joseph Ebert und Robert Koch: Typhus-Erreger
(heute S. Typhi)
1885 Daniel Elmer Salmon: „Schweinecholera“ (S. Choleraesuis)
Dr. Angelika Fruth 2
Statistik meldepflichtiger Infektionen des GI-Trakts
nach IfSG
(Quelle: Infektionsepidemiologisches Jahrbuch meldepflichtiger Krankheiten für 2011)
Erreger Fälle
Campylobacter 74.194
EHEC (HUS) / andere pathogene E.coli 5.802 (877) / 9.228
Salmonellen 26.116
S. Typhi / S. Paratyphi 62 / 62
Shigellen 707
Yersinien 3.550
Norovirus 116.109
Rotavirus 57.129
Giardia lamblia 4.258
Kryptosporidium 985
Dr. Angelika Fruth 3
Inzidenzen der meldepflichtigen bakteriellen
Gastroenteritiserreger (nach SurvStat RKI)
100
90
Erkrankungen pro 10.000 Einwohner
80
70
60 Salmonella
50 STEC/EHEC
40 Campylobacter
30 Yersinia
20
10
0
2008 2009 2010 2011 2012 Jahr
Dr. Angelika Fruth 4
Salmonellose (enterisch)
Art der Übertragung: häufig: Lebensmittelinfektion:
Tier Lebensmittel Mensch
selten: Mensch Mensch, Tier Mensch
Symptome: Durchfall, Fieber nicht über 39 °C,
Stühle Reiswasser-ähnlich („Cholera nostra“),
gelegentlich mit Blut (STM DT193 4,5.i:-)
Infektionsdosis: 100 - 100.000 Keime (Subspecies,
Patientenfaktoren)
Inkubationszeit: 4 h - 5 Tage (Infektionsdosis, Subspecies)
Ausscheidungsdauer: Kinder < 5 Jahre, 10 Wochen
(18 % bis zu 6 Mon., 5 % bis zu 12 Mon.)
Erwachsene und Kinder > 5 Jahre
4 Wochen (bis zu 12 Wochen)
Dr. Angelika Fruth 5
Übermittelte Salmonellose-Fälle nach Meldekategorie und
Altersgruppe, Deutschland, 2011 (SurvStat)
3000
2500
Anzahl Meldefälle
2000
1500
1000
500
0
Altersgruppe
Dr. Angelika Fruth 6
Ordnungsprinzip des Genus
Salmonella
• Nomenklatur nach klinischen Gesichts-
punkten, später nach Ort der Isolierung
• Seit 2005 (ICSP): Gattung aus 2 Arten und
eine davon mit Unterarten
• Klassifizierung der Erregergruppe anhand
serologischer Merkmale:
• 1926 Philip Bruce White, GB
• Erweiterung und Ergänzungen:
1933-1978 Fritz Kauffmann, DK
Michel Popoff, Leon LeMinor, Patrick
Grimont, François-Xavier Weill, F
Jochen Bockemühl, Rolf Rohde, D
Fritz Kauffmann (* 15.01.1899 Stargard; † 27.09.1978 Kopenhagen, Dänemark)
arbeitete von 1923 - 1932 am RKI
Dr. Angelika Fruth 7
White-Kauffmann-LeMinor-Schema
9th Edition 2007
Genus Spezies Subspezies Serovar
S. bongori 22
Salmonella
S. enterica (I) 1531
S. enterica
S. salamae (II) 505
S. arizonae (IIIa) 99
S. diarizonae (IIIb) 336
S. houtenae (IV) 73
S. indica (VI) 13
nach Grimont and Weill, WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella, 2007
Dr. Angelika Fruth 8
Salmonella enterica enterica SV. Typhimurium
(S. Typhimurium)
Drs. Reissbrodt, Gelderblom; RKI 2005
Dr. Angelika Fruth 9
Häufigkeitsverteilung der Salmonella-Serovare
vom Menschen
Deutschland, NRZ-Daten 2011
Serovar Anzahl Anteil
S. Typhimurium 1023 39,3%
S. Enteritidis 373 14,3%
Salmonella subsp. I 138 3,8%
S. Derby 98 3,8%
S. Infantis 76 2,9%
S. Newport 71 2,7%
S. Paratyphi B var. Java 58 2,2%
S. Senftenberg 55 2,1%
S. Goldcoast 45 1,7%
Salmonella subspez. IIIb 43 1,7%
S. Bovismorbificans 38 1,5%
Dr. Angelika Fruth 10Feintypisierung phänotypisch mit Serotypie und Lysotypie
• Serotypie = Bestimmung der O- und H-Antigene und
Ermittlung einer Antigenformel, die den Serovar definiert
• Differenzierung innerhalb der Serovare durch Lysefähigkeit
dieser Erreger mittels spezifischer Bakteriophagen =
Lysotypie
• Etablierte Systeme für: S. Typhi, S. Paratyphi A und B, S.
Typhimurium, S. Enteritidis, S. Virchow, S. Hadar, S.
Bovismorbificans, S. Derby, S. Infantis, S. Agona, S.
Oranienburg, S. Heidelberg
• z.B. kann man bei S. Paratyphi B mehr als
86, bei S.Typhimurium über 300 Lysotypen unterscheiden
Dr. Angelika Fruth 11Lysotypie oder Phage typing seit 1950er Jahren
extended Anderson phage extended Anderson phage Felix/Callow and Lilleengen
typing plate DT 36 typing plate DT4 phage typing plate (Blue plate)
(original sequenced LT2) 1bvar.2/2
(original sequenced LT2)
Dr. Angelika Fruth 12Dominanz verschiedener S. Typhimurium-Lysotypen bei
Patienten-Isolaten aus Deutschland von 1966 – 2012 (Daten NRZ)
60
50
40
% of STm
30
20
10
0
Year
DT9 DT204 DT104 monophasic 4,(5)12:i:-DT193
Dr. Angelika Fruth 13Feintypisierung und Molekulare Epidemiologie
PFGE
Virulenzgen-basierte Pathovar-Charakterisierung
(z.B. bei S. Paratyphi B: EPV und SPV)
Genoserotypie, z.B. fliC und fljB RFLP
Ausbruchsuntersuchungen (PFGE, MLVA, MLST, Virulenzplasmid-
Analysen)
Bestimmung von Antibiotikaresistenzen als epidemiologischer
fliC RFLP
Marker
Adhärenz und Invasion
Dr. Angelika Fruth 14PFGE-Analyse verschiedener S. Pomona-Isolate
(Xba I, PulseNet Protokoll)
1 2 3 4 5 6 7
(kbp)
Spur 1135,0
1 Standard (S. Braenderup) 668,9
2 Humanes Isolat
452,7
3 Humanes Isolat
310,1
4 Fall (1. Isolat) 244,4
5 Standard (S. Braenderup) 173,4/167,1
6 Fall (2. Isolat) 104,5
7 Kot Bartagame 33,3
Quelle: Dr. Prager, RKI 2006
Dr. Angelika Fruth 15PFGE-Muster von S. Newport-Ausbruchsstämmen 2011/12
Aufklärung von 2 zeitgleich verlaufenden Ausbrüchen mit unterschiedlichen
Infektionsquellen
PFGE-XbaI
kbp
800.00
500.00
400.00
300.00
200.00
150.00
100.00
Key
strain
LabID SourceCountry
ReceivedDate SeroType
PlasmidProfile
50.00
1500
.
11-08477 .
09/11/2011 SNWP
Ausbruchsklon 1 (Mungbohne)
.
11-08672 .
22/11/2011 SNWP
SNWPXB.0050
.
11-08784 .
29/11/2011 SNWP
.
11-09048 .
13/12/2011 SNWP
.
12-00031 Ausbruchsklon
.
03/01/2012 2 (Wassermelone)
SNWP
SNWPXB.0060
.
12-00065 .
04/01/2012 SNWP
Dr. Angelika Fruth 16Molekulare Typisierung / Molekulare Epidemiologie
PFGE- Typ Isolate 2011 MLVA Sequenztyp Sequenztyp Sequenztyp
Zeitraum 3-VNTR 7-house-
(Anzahl) Allel-Muster keeping 3 Virulenz Gene
11-VNTR
Gene MLST sopA-B-D
Allel-Muster
Allel-Muster Allel-Muster
SNWPXB.
0050 Okt.-Dez. (43) 448 a ST31 20 - 17 - 40
0060 Dez (18) 456 i ST118 54 - 3 - 1
0002 Dez (1) 457 j ST157 20 - 17 - 13
0058 Okt (2) 450 H ST166 52 - 41 - 1
0048 Okt (1) 450 C ST166 52 - 41 - 1
0047 Okt (1) 449 b ST1635 51 - 3 - 1
0051 Aug (1) 451 d ST157 20 - 17 - 13
0052 Aug (1) 452 e ST166 52 - 41 - 1
0021 Jun/Jul (2) 455 c ST166 52 - 41 - 1
0053 Mai (1) 453 f ST118 53 - 3 - 1
Dr. Angelika Fruth 17Salmonellose des Menschen
Vielfalt der Infektionsquellen
Eier und Schweine- Rind- andere
Geflügelfleisch fleisch fleisch Infektionsquellen
35 - 45 % 25 - 35% 10 - 20 % 1-5%
Gewürze, Eisbergsalat, Paprika
Chips, Alfalfa Sprossen, Sesam
Halva, Tomaten, Schokolade,
Räucherfisch, Anistee
Spieltiere, z. B. Leguan, Gecko,
Tendenz steigend Schildkröten, Agamen und
Schlangen
Dr. Angelika Fruth 18Schnellwarnungen RASFF:
Lebensmittelsicherheit / Ausschnitt aus den Meldungen 2010
Datum der meldender Beschreibung der Produkt- Lebensmittel / Gefahrenquelle Ursprungslan Vertrieb Untersuchungs-
Meldung Staat Warnung kategorie Produkt d ergebnisse
30.07.2010 Deutsch- Salmonella Dublin in Milch und Käse Salmonella Deutschland,
land Käse aus roher Milchprodukte Dublin Niederlande
Kuhmilch aus
Deutschland
30.07.2010 Vereinigtes Salmonella Hvitting- Kräuter und Pfeffer Salmonella Thailand Nachweis von
Königreich foss in schwarzem Gewürze Hvittingfoss Salmonella
Pfeffer aus Thailand Hvittingfoss
28.07.2010 Brasilien Salmonella Geflügelfleisch Hähnchen Salmonella Minnesota Brasilien
Minnesota in und Geflügel-
gefrorenen, fleischprodukte
gepökelten
Hähnchen aus
Brasilien, via die
Niederlande
27.07.2010 Brasilien Salmonella Heidel- Geflügelfleisch Truthahn Salmonella Heidelberg Brasilien
berg in gefrorenem und Geflügel-
Truthahn (Meleagris fleischprodukte
gallapavo) aus
Brasilien
13.07.2010 Italien Salmonella spp. in Fisch und Surimi- Salmonella spp. Italien Krebsfleisch-
gefrorenen Fischerei- produkte imitat
Surimiprodukten aus produkte (außer
Vietnam Weich- und
Krustentiere)
Dr. Angelika Fruth 19Vielfalt der Infektionsquellen
Beatrix von Wissmann et al. (2012) 2012;17(6):pii=20076;available
S. Enteritidis
• Juli 2010: Hochzeitsfeier in Ansbach
• Warmes Buffet (Standzeit von 14:00 bis 20:00). Die warmen Gerichte wurden in
Wärmebehältern geheizt (ohne Temperaturkontrollen). Salate und andere kalte
Speisen waren während dieser Zeit ungekühlt (Raumtemperatur).
• Fotographien des Buffets zeigten, dass ein Teil der Salate und kalten Speisen mit
Blumen verziert waren, welche direkt in die Speisen gesteckt waren.
• Am NRZ wurden für 8 der 26 Salmonella-Isolate von Teilnehmern der
Hochzeitsfeier, für 2 der 8 Salmonella-Isolate des Catering Personals sowie für die
2 Isolate aus Lebensmittelproben Serovar, Lysotyp und Ribotyp bestimmt.
• alle 12 Isolate: S. Enteritidis Lysotyp 4/6, Ribotyp 3
Dr. Angelika Fruth 20Dr. Angelika Fruth 21
Beispiele aus der Arbeit des NRZ, 2012/2013
International:
• multinationaler Ausbruch(Deutschland, Ungarn, Tschechische Republik, Österreich, UK)
von Nalidixinsäure-resistenten S. Stanley mit dem PFGE-Muster SSTAXB.0017
• S. Thompson-Geschehen in den Niederlanden 2012 mit 9 Fällen auch in Deutschland,
ein Reiserückkehrer aus den Niederlanden
National:
• S. Panama-Geschehen in Thüringen, humanen Isolaten mit dem PFGE-Muster
SPANXB0006 und mittels PFGE nicht unterscheidbare Isolate von Mett- und Rohwurst
(PFGE-Muster wurde bereits bei früheren S. Panama-Ausbrüchen 2008 und 2009 in
Thüringen festgestellt)
• ein Döner-assoziierter S. Braenderup-Ausbruch in Sachsen mit über 20 Fällen, darunter
auch Bistro-Mitarbeiter. (PFGE-Muster SBRPXB.0008)
• S. Braenderup-Ausbruch in einem Klinikum in Bayern; vier Patienten-Isolate mit PFGE-
Muster SBRPXB.0015
• Döner-assoziierter Ausbruch durch mehrfachresistenten S. Kentucky-Stamm in
Thüringen; 12 humane und zwei Dönerfleisch-Isolate mit PFGE-Muster SKENTXB.0006c
• S. Agona PT56 in Sachsen ebenfalls Döner-assoziierter Ausbruch
• derzeit S. Infantis PT29 im südlichen Niedersachsen und Eichsfeld (PFGE SINFXB.0027)
über 100 Fälle
Dr. Angelika Fruth 22Anteil der Infektionen mit Salmonellen mit einer möglichen Reptilien-
Assoziation an gemeldeten Salmonellosen bei Kindern unter 2 Jahren
(Quelle:http://www3.rki.de/SurvStat/)
35
30
25
Anteil in %
20
15
10
5
0
2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011
Jahr
Dr. Angelika Fruth 23Infektionen von Kindern durch Kontakt zu exotischen
Haustieren
(Beispiele aus den Daten des NRZ)
Jahr Alter des Salmonella (S.) Subspecies (subsp.), Reptilienkontakt u.ä.
Patienten Serovar, Antigenformel
2008 2 Monate S. enterica subsp. IIIb, 53:z10:- Schlange
2008 3 Monate S. enterica subsp. II, 58:lz13,z28:z6 Bartagame
2008 7 Monate S. Poona, 13,22:z:1,6 Schlange
2008 11 Monate S. Gaminara, 16:d:1,7 Bartagame
2008 3,9 Jahre S. Jangwani, 17:a:1,5 Reptil
2008 8 Monate S. enterica subsp. IV, 18:z36z38:- Leguan
2008 17 Monate S. Pomona 28:y:1,7 Schildkröte
2008 5 Wochen S. enterica subsp. II, 35:g,m,s,t:- Bartagame o. Chamäleon
2008 1 Woche S. Johannisburg, 40:b:e,n,x div. Schlangen
2008 2 Wochen S. enterica subsp. II, 58:c:z6 Leguan, Wasseragame
2008 9 Wochen S. enterica subsp. IV, 48:g,z51:- Wasseragame
2009 9 Monate S. Eastbourne, 9,12:e,h:1,5 Bartagame
2009 3 Monate S. Herston, 6,8:d:e,n, z15 Leguan
2009 6 Jahre S. Thompson, 6,7:k:1,5 Wasserschildkröte
2010 5 Tage S. enterica subsp. II, 21:z10:z6 Waran
Dr. Angelika Fruth 24PFGE-Analyse von S. Eastbourne-Isolaten aus einem Haushalt
(Xba I, PulseNet Protokoll)
1 2 3 4 5 6
(kbp)
1135,0
Spur
1 Standard S. Braenderup 668,9
2 Fall 2008 (Säugling, 4 Monate) 452,7
3 Kater 310,1
4 Bartagame 1 244,4
5 Bartagame 2 173,4/167,1
6 Standard S. Braenderup
104,5
33,3
Quelle: Dr. Prager, RKI 2006
Dr. Angelika Fruth 25Wer war es? Bartagame oder Katze Dr. Angelika Fruth 26
Reptilien-assoziierte Lebensmittelvergiftung
Lowther, S.A. et al. Zoonoses Public Health. 58 (2011) 560–566
• Dezember 2009, Minnesota, USA
• 3 Patientenisolate S. subsp. IV gleiche PFGE-Muster
• keiner der Patienten hatte Reptilienkontakt
• alle 3 Personen waren beim „potluck dinner“ (jeder Gast bringt Essen
selbst mit)
• Gastgeber 66 Gäste
• Insgesamt 19 Gäste erkrankt mit mittlerer Inkubationszeit 19 h (3 - 26 h)
Dauer der Erkrankung 5 Tage (1 - 11 Tage)
• Infektionsquelle: Bratensoße, hergestellt durch Bartagamen-Besitzer
(asymptomatischer Ausscheider)
• Abstriche im Haushalt : Türöffner, Abfluss-Badezimmer, Ausguss-Küche
Staubsaugerbeutelinhalt und Tier
– Bartagame: S. subsp. IV 6,7:z4z23:- und S. Labadi
Dr. Angelika Fruth 27Dr. Angelika Fruth 28
Escherichia coli
Reissbrodt, Gelderblom; RKI 2005
Dr. Angelika Fruth 29Humanmedizin
Escherichia coli
apathogen pathogen
intestinal (IPEC) extraintestinal (ExPEC)
EHEC/STEC UPEC
EPEC SEPEC
EAEC, DAEC NMEC
EIEC
ETEC
E. coli Asymptoma- Diarrhoe Extra-intestinale
tische Manifestation
Colonisation
Commensale +++ - +
IPEC - +++ -
ExPEC +++ + +++
Dr. Angelika Fruth 30Erkrankungen durch darmpathogene E. coli (IPEC)
Erreger Klinik Wirkort
wässrige Durchfälle Dünndarm
EPEC (besonders bei Säuglingen)
EIEC Dysenterie mit Tenesmen Dickdarm
ETEC Reisediarrhoe, choleraähnliche Durchfälle Dünndarm
wässrige Durchfälle, chronische Darmstö- Dünndarm
EAEC rungen, Reisediarrhoe
wässrige, blutige Durchfälle bis zur Dickdarm
EHEC hämorrhagischen Kolitis – Komplikation HUS
(Hämolyse, Nierenversagen, Thrombopenie)
Dr. Angelika Fruth 31Leitmerkmale zur Diagnostik von E. coli
Pathovar Virulenzfaktor Zielgen
EHEC / EHEC-LST Shigatoxin stx1 und stx2
Intimin eaeA
Enterohämolysin ehxA
EPEC / aEPEC Intimin eaeA
Virulenzplasmid EAF, bfp
EIEC Invasin/Membranprotein ipaH
Virulenzplasmid ial
ETEC / aETEC Enterotoxine lth, sth
Kolonisationsfaktoren cfa
EAEC-I / aEAEC Virulenzregulator aggR
Virulenzplasmid EAEC-probe, aatA
EAEC-II Virulenzregulator aggR
Virulenzplasmid EAEC-probe, aatA
P-Fimbrien pap
Aerobactin iucC
Yersiniabactin irp2
Dr. Angelika Fruth 32EHEC / STEC / VTEC
= Enterohämorragische /Shigatoxin bildende/Verotoxin
bildende Escherichia coli
• 1977 Erstbeschreibung duch Konowalchuk
• 1980er O´Brian (Shiga-like Toxin) und Karmali
(Verotoxin)
• USA: „Hamburger disease“
• Haupttyp: O157:H7 (Serovar: LPS-O-Antigen aus
Zellwand und Flagellen-H-Antigen)
• Vielfalt von Serovaren und weiteren Virulenzfaktoren
Dr. Angelika Fruth 33Shigatoxin
rRNA-N-Glycosidase (AB5 – Struktur)
A = Aktivität; B = Bindung
Bindung an Oberflächenrezeptoren (Gb3 und
Gb4)
zytotoxisch: Hemmung Proteinbiosynthese
der eukaryotischen Zellen
Induktion Apoptose
im Genom funktioneller oder kryptischer
Prophagen kodiert
Expression an Phagenvermehrungszyklus
gekoppelt
Stx1- und Stx2- Familien
(Stx1a,c,d und Stx2a,b,c,d,e,f,g)
Dr. Angelika Fruth 34Erkrankungsverlauf bei Infektion mit EHEC
HUS (5-10%), davon
lethal 3-5%
Adhäsion (Intimin) Bildung von
Komplementkomplexen
und Hemmung der
glomerulären Filtration -Gb3
-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 -Gb4
Niere Darm
Infektion wässrige Diarrhoe,
kolikartige spontane
Bauchschmerzen Ausheilung
(85-90%)
blutige Diarrhoe
(30%)
Dr. Angelika Fruth 35Altersverteilung bei Infektion mit EHEC
(Daten NRZ 2006)
Anzahl n
250
männlich weiblich
200
150
100
50
0
0–5 6 – 9 10 – 14 15 – 19 20 – 24 25 – 29 30 – 34 35 – 39 40 – 49 50 – 59 > 60
männlich 226 21 11 5 0 3 5 4 5 2 7
weiblich 178 19 8 3 3 6 10 6 3 2 17
Dr. Angelika Fruth 36Monatliche EHEC-Meldezahlen in Deutschland, 2001-2009
Anzahl EHEC-Meldungen
200
gleitender Mittelwert über 3 Monate
150
100
50
0
03
06
09
12
03
06
09
12
03
06
09
12
03
06
09
12
03
06
09
12
03
06
09
12
03
06
09
12
03
06
09
12
03
06
09
12
2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009
Meldejahre
Dr. Angelika Fruth 37Serogruppenverteilung von gemeldeten
EHEC- und HUS-Fällen (2001-2008)
EHEC HUS
Andere (5%)
O157 (20%) O111 (2%)
O157 (80%)
O145 (3%)
Andere (33%) O91 (0%)
O26 (9%)
O103 (1%)
O103 (17%)
O111 (3%)
O145 (5%)
O91 (8%) O26 (14%)
Dr. Angelika Fruth 38EHEC bei Patienten und Isolate aus Lebensmitteln
25
patient isolates food isolates
20
Proportion (%)
15
10
5
0
Ont
Orough
O26
O91
O76
O8
O5
O157
O103
O145
O111
O128
O177
O146
O174
O113
O156
O115
* PF28
† P29
‡ F20
STEC serogroups
Werber, Beutin, Pichner, Stark, Fruth: STEC Serogroups in Food and Patients, Germany.
Emerg Infect Dis 2008; 14(11): 1803-6
Dr. Angelika Fruth 39Große EHEC-Ausbrüche
nach KARCH (1999)
Land/ Monat/ STEC- Anzahl Anzahl Kran- Anzahl Anzahl Ursache
Region Jahr Serovar Fälle kenhausbe- HUS- Todes-
handlungen Fälle fälle
Japan/Sakai City Juli 1996 O157:H7 8576 606 106 3 Rettichsprossen als
Teil der Schulspeisung
USA/Washington, Dezember, O157 :H7 732 195 55 4 Hamburger aus einer
Idaho, Nevada, Cal- 1992 bis einzelnen Fast-Food-
ifornia Februar 1993 Kette
Kanada/ Sommer O157:H7 521 nicht 22 2 Hackfleisch und da-
Nordwestbereich 1991 verfügbar durch kontaminierte
Lebensmittel
Großbritannien/ November O157:H7 501 151 27 20 gekochtes Fleisch von
Zentral-Schottland bis Dezem- einem Fleischer
ber 1996
USA/Cabool, Dezember O157:H7 243 32 2 4 unchloriertes Trink-
Missouri 1989 bis Ja- wasser
nuar 1990
Australien/Adelaide Januar bis O111:H- > 200 nicht 22 0 nicht gekochte Wurst
Februar 1995 verfügbar
Großbritannien/ Mai 1994 O157:H7 > 100 1/3 der Fälle 9 1 pasteurisierte Milch
Lothian, Schottland
Schweden Sommer O157:H7 110 nicht 29 0 nicht bestimmt
1995 verfügbar
Dr. Angelika Fruth 40Seropathovare von EHEC
nach KARMALI 2003 und GYLES 2007
Sero- Relative Assoziation Assoziation Serovare
pathovar Inzidenz mit mit HUS
Ausbrüchen und HC
A hoch häufig ja O157
B mittel mäßig ja O26, O103, O111,
O121, O145
C niedrig selten ja O91, O104, O113,
O165 u.a.
D niedrig selten nein verschiedene
E* nicht nicht bekannt nein verschiedene
human
Dr. Angelika Fruth 41Kombination verschiedener Pathovar-bestimmender
Virulenzmerkmale
Daten NRZ Salmonellen
Pathovar Virulenzmerkmal Serovar
EHEC/EAEC stx1, stx2, eaeA, ehxA, astA O157:H-, O26:H11
STEC/EAEC stx1, astA O115:H10
STEC/EAEC stx2, astA O146:H28, O43:H2
STEC/EAEC stx1, stx2, ehxA, astA O91:H-, O113:H4
EPEC/EAEC eaeA, astA O99:H33
ETEC/EAEC sth, astA O25:H-
Dr. Angelika Fruth 42Der Ausbruch durch EHEC O104:H4 in Deutschland, Frühjahr 2011
250
EHEC
HUS
200
Anzahl Erkrankungen
150
100
50
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2122 23 2425 26 27 28 29 30 31 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 212223 24 25 26 27 2829 30 1 2 3 4
M ai Juni Juli
Erkrankungsbeginn, Datum 2011 (Durchfall)
Dr. Angelika Fruth 43Stamm-Charakteristik
„typischer“ E. coli: Lactose positiv, Sorbitol-fermentierend,
ß-Glucuronidase positiv, Indole positiv, H2S negativ, kein Wachstum auf Simmons
Citrate Agar
> EHEC
• Shiga toxin 1 / stx1-Gen: negativ
• Shiga toxin 2 / stx2-Gen (vtx 2a variant): positiv
• Intimin (eaeA-Gen): negativ
• Enterohemolysin / ehxA-Gen: negativ
oder EAEC ?
• EAggEC Virulenzplasmid:
aatA (ABC-transporter gene) positiv
aagR (master regulator of vir-plasmid genes) positiv
aap (secreted protein dispersin gene) positiv
aggA (AAF/I-fimbrial subunit gene) positiv
aggC (AAF/I-fimbrial operon gene) positiv
Dr. Angelika Fruth 44Weitere Virulenzmarker
(Bielaszewska, M. et al.: Lancet, 2011)
• STEC:
iha (IrgA homologue adhesin)
lpfAO26 (structural subunit of long polar fimbriae)
lpfAO113 (structural subunit of long polar fimbriae)
ter cluster (tellurite resistence)
irp2 (component of iron uptake system on HPI)
fyuA (component of iron uptake system on HPI)
• EAEC:
set1 (Shigella enterotoxin 1)
pic (protein involved in intestinal colonisation)
• MLST sequence type: ST 678
(adk 6, fumC 6, gyrB 5, icd 136, mdh 9, purA 7, recA 7)
H. Karch, KL HUS, Universität Münster
• Phylotype: B1
• ESBL-Resistenz: CTX-M15 + ß-TEM-1
….. oder ExPEC ?
Dr. Angelika Fruth 45Makrorestriktionsmuster (XbaI) von E. coli O104:H4
Isolaten des Ausbruchs
1 2 3 4 5
kbp
kb
1135
668,9
452,7
Spur 1, 5: MW Standard
398,4 Salmonella Braenderup H9812
336,5
310,1 Spur 2: RKI 11-02027 (HUS),
244,4 Spur 3: RKI 11-02034 (Diarrhoe)
216,9
Spur 4: RKI 11-02060 (blutige Diarrhoe)
138,9
104,5
54,7
33,3
28,8
20,5
PFGE nach Prager et al. (2011) IJMM 301:181-191
Dr. Angelika Fruth 46„Attack-Rate“
nach Scheutz, 2011
Serovar Shigatoxin % HUS-Fälle
O157 (eaeA+) 1a+2a, 2a+2c, 2a, 2c 13
Non-O157 (eaeA+) 1a+1c, 2a, 2a+2c 8
Non-O157 2d act 0,5
(eaeA-)
O104:H4 2a 22
(eaeA-)
Dr. Angelika Fruth 47Hintergrundsgeschehen von EHEC und weiteren E. coli-
Pathovaren im Ausbruch mit EHEC O104:H4
• Neben dem Ausbruchsstamm O104:H4 wurden 87 EPEC und
702 EHEC im Ausbruchszeitraum aus den Einsendungen an
das NRZ detektiert
• 311 der EHEC- und 53 der EPEC-Isolate konnten 42
verschiedenen Serovaren zugeordnet werden
• wachsende Zahl stx2-positiver Isolate der Serovare O26,
O91 und O146
• 2 Cluster O157-Fälle und 1 Cluster O26-Fälle (mit HUS)
Dr. Angelika Fruth 48PFGE-Analyse der O157:Hnm – Cluster aus 2011
Quelle: NRZ-Bericht 2012, PulseNet Protocol
PFGE-XbaI
kbp
600.00
400.00
300.00
200.00
100.00
50.00
20.00
Key
strain Serovar PlasmidStx2
Stx1 eaeA
1000
600.00
400.00
300.00
200.00
100.00
50.00
20.00
1000
.
11-02106 O157:H- + + +
O157XB.0124
.
11-05383 O157:H- + + +
.
11-03890 O157:H- + + +
.
11-02539 O157:H- + + +
O157XB.0132
.
11-04132 O157:H- + + +
.
11-05273 O157:H- .
+ + +
Dr. Angelika Fruth 49Identifizierung von EHEC-Erkrankungen durch mikrobiologische
Laboratorien in Deutschland
Stufendiagnostik
1. Primärdiagnostik
• Shigatoxin-Produktion oder Nachweis der stx-Gene in einer coliformen bakteriellen Flora
(einer Stuhlprobe) aus Anreicherungskultur (mittels Elisa, PCR)
• Nutzung von Indikator-/Selektiv-medien für E. coli z.B. O157:H7 (sorbitol non-fermenting)
• Üblicherweise keine Isolierung (Reinkultur) der Stämme, aber nach Diagnosestellung
Meldung an die Gesundheitsämter
• … danach: Weiterleitung der Proben (insbesondere Isolate) !
2. Weiterführende bzw. Spezialdiagnostik
• Spezialisierte Labore (NRZ, KL HUS, LUA´s) verarbeiten die Proben (Mischkulturen) aus den
Laboren der Primärdiagnostik
• daraus Stammisolierung als Grundvoraussetzung für epidemiologisches Subtypisieren
• Testung von Virulenzgen-Profilen / Genotypisierung (PCR, Sequenzierung)
• Serotypisierung, MLST zur Sequenztypbestimmung (Macro-Evolution)
• PFGE (PT, MLVA) für Klärung epidemiologischer Zusammenhänge (Micro- Evolution)
Dr. Angelika Fruth 50(Keine) Korrelation mit Qualität der Meldung
Daten SurvStat
Falldefinition nach IfSG erfüllt
Angaben in SurvStat (%) 95%KI
Toxin(gen)-nachweis 25 15% - 35%
Erregerisolierung 32 20% - 44%
Keine Methode 20 06% - 46%
Dr. Angelika Fruth 51Weshalb ist die weiterführende Analyse der Erreger von
besonderer Bedeutung?
• Zeitnahe Ausbruchsentdeckung und – kontrolle
• Vermeidung von Sekundärübertragungen
- Häufig (5-15%); bei O157:H-/H7 publiziert
- Übertragung früh in der Erkrankungsphase
- Betrifft vor allem (jüngere) Geschwisterkinder
- Hohes HUS-Risiko
• Risikobewertung wird ermöglicht
z.B. im Zusammenhang mit Therapieempfehlungen, Empfehlungen
für Hygienemaßnahmen, Umgang mit Langzeitausscheidern,
Wiederzulassung zu Gemeinschaftseinrichtungen etc.
• Erfassung des Erregerwechsels und –wandels (Sammlung von
Stamminformationen)
• Ableitung von Maßnahmen zur Prophylaxe (Impfprävention, Intervention
in der Lebensmittelproduktion, Erweiterung des Diagnostik-Panels)
Dr. Angelika Fruth 52Dank
RKI, Abteilung Infektionskrankheiten Universität Leipzig
Prof. Dr. Martin Mielke Prof. Dr. Peggy Braun
Prof. Dr. Antje Flieger PD Dr. Michael Pees
Dr. Rita Prager
Dr. Erhard Tietze ÖGD, Landesuntersuchungs- und
Dr. Wolfgang Rabsch Gesundheitsämter
RKI, Abteilung Infektionsepidemiologie
Dr. Christina Frank
Dr. Dirk Werber
Prof. Dr. Klaus Stark
Dr. Hermann Claus
… das Ausbruchsteam des RKI
Institut für Hygiene, KL HUS, Universität Münster
Prof. Dr. Helge Karch
PD Dr. Martina Bielaszewska
PD Dr. Alexander Mellmann
Dr. Angelika Fruth 53… Ihnen für Ihre Aufmerksamkeit! Dr. Angelika Fruth 54
Resümee
• Die Anwendung molekularer Verfahren in der mikrobiologischen Routine-
Diagnostik ist weit vorangeschritten.
• Die Konsequenz ist ein Mangel an Patientenisolaten (besonders bei
EHEC).
• Kopplung der Isolatgewinnung und -versendung an die Meldung der
Erreger nach IfSG
• Für den Aufbau einer umfassenden molekularen Surveillance
lebensmittelbedingter Erreger (EHEC) müssen neue
Bearbeitungsstrategien in allen Ebenen des ÖGD diskutiert werden.
Dr. Angelika Fruth 55Zukunft Toxin-basierter EHEC Surveillance
• Testverfahren, die gleichzeitig Shigatoxin, Serogruppe, und weitere
Virulenzfaktoren (eaeA) detektieren
– Phänotypisch und/oder genotypisch
– Liefert Basisinformationen zu allen STEC
• Information über (dominierende) non-O157
– Problematisch für den Infektionsschutz
• Diagnostik unvollständig und nicht zeitnah
– Modernere Testverfahren müssen etabliert und in Routinediagnostik
angewendet werden
• aktive HUS-Surveillance
Dr. Angelika Fruth 56Zusammenfassung
• Pathovare von E.coli müssen aus klinischer und epidemiologischer Sicht
molekularbiologisch definiert werden
• Diagnostik sollte nicht auf intestinale Pathovare beschränkt sein
• Risikobewertung wird ermöglicht, z.B. im Zusammenhang mit
Therapieempfehlungen
• Vielzahl von Verfahren wurde publiziert und in der Praxis erprobt (DNA-
Hybridiserungs-, Microarray-, PCR-, RT-PCR-, PCR-ELISA-Verfahren)
• Zeit- und Kostenökonomie im Einklang mit verbesserter Diagnosestellung
Dr. Angelika Fruth 57Diagnostik 2001: Einführung des IfSG
• Serotypie (Agglutinationsteste) für Einordnung in E.coli- Pathovare:
z.B. Zuordnung nach bekannten Serovaren wie
O25, O55, O127 für EPEC
O44 für EAEC
O78, O86 für ETEC
O124, O143, O144 für EIEC
• Stufenplan für EHEC ( primär keine O157-Diagnostik!)
• keine weitere Analyse von E.coli aus anderen Reservoiren, insbesondere
ExPEC (UPEC, NMEC, SEPEC)
Dr. Angelika Fruth 58Stufenplan zur EHEC-Diagnostik
(Fruth,A. et.al. BGBl. 2000, 43:310-317)
• 1. Schritt: Screening auf EHEC/STEC in Stuhlproben nach Anreicherung
mittels Shigatoxin-ELISA gemäß Herstellervorschrift
• 2. Schritt: Bestätigung eines positiven Befunds mittels zweitem
Nachweisverfahren (z.B. PCR) ggf. in Speziallaboratorien
• 3. Schritt:Typisierung des EHEC/STEC-Isolats mittels Serotypie, Genotypie
u.a. für epidemiologische Untersuchungen (IfSG)
Dr. Angelika Fruth 59Untersuchungsverfahren
auf dem Weg von der Probe…
Anreicherungskultur
EIA
mTSB; EHECdirekt
Erregeranzucht und-
isolierung Serotypie (klassisch
oder molekular)
SMac, Ehly-Agar
… zur Anwendung molekularer Verfahren für
schnelle und effiziente Diagnosen
Nachweis von Virulenzgenen:
MALDI-TOF
Inhouse-PCR-Verfahren
LAMP
RT-PCR
PCR-ELOSA
WGS/Metagenomics
LUMINEX
Dr. Angelika Fruth 60Molekulare Surveillance von EHEC
Untersuchung auf EHEC gemäß Indikationsliste:
Kinder mit Diarrhoe unter 6 J., Patienten mit blutigen Durchfällen ohne
Altersbeschränkung, Vorliegen eines HUS, Häufung von Diarrhoe-Fällen in
Gemeinschaftseinrichtungen etc. (MiQ)
mittels zertifizierter Verfahren (EIA, PCR) Netzwerk der
Primärdiagnostik-
bei positivem Nachweis des Shigatoxins / Shigatoxingene Labore
Meldung an GA
Isolierung des Erregers
Lagerung des Versand des Isolats an Speziallabore mit eindeutigem
Probenmaterials für
weitere Untersuchungen Identifikator / Minimum an Epi-Info
(mind. 14 Tage) (LUA‘s, KL, NRZ)
Typisierung des Erregers (NRZ, KL):
mit Phänotypie: Serotypie, biochem. Differenzierung, Resistenztestung Netzwerk der LUA‘s
und molekularen Methoden: Virulenzgenprofil, PFGE, MLST, SLST +
Zusammenführung aller Daten NRZ / KL
und Analyse zur Ausbruchserkennung RKI, Abt. 3
(zentrale Datenbank am NRZ und Stammsammlung) (SurvNet)
Ergänzung der Meldedaten
Übermittlung relevanter Informationen nach IfSG an Landesstellen und ECDC / TESSy
Dr. Angelika Fruth 61Zusammenfassung
• Pathovare von E.coli müssen aus klinischer und epidemiologischer Sicht
molekularbiologisch definiert werden
• Diagnostik sollte nicht auf intestinale Pathovare beschränkt sein
• Risikobewertung wird ermöglicht, z.B. im Zusammenhang mit
Therapieempfehlungen
• Vielzahl von Verfahren wurde publiziert und in der Praxis erprobt (DNA-
Hybridiserungs-, Microarray-, PCR-, RT-PCR-, PCR-ELISA-Verfahren)
• Zeit- und Kostenökonomie im Einklang mit verbesserter Diagnosestellung
Dr. Angelika Fruth 62PulseNet USA
• entwickelt nach E.coli O157-Ausbruch 1993 verursacht durch „Hamburger“ mit 726
Erkrankten und 4 toten Kindern
• seit 1996 am CDC in Atlanta betrieben
• finanziert durch Regierung
• Bereitstellung von Geräten und Know-how für alle US-Bundesstaaten und
Datenauswertungs-Support
• Standardisiertes molekulares Fingerprinting auf der Basis der PFGE
unter Einbeziehung weiterer Feintypisierungsergebnisse (Serovar, Lysotyp,
AMR, MLST, MLVA, SNP-VNTR)
• Kumulative Datenbank
• Nationales Netzwerk des öffentlichen Gesundheitswesens und der
Lebensmittelbehörden (public health and food regulatory agency laboratories) zur
Aufklärung lebensmittelbedingter Ausbrüche
• Zwischen 7 und 17 Tagen bis zum Analysenbericht
Dr. Angelika Fruth 63Vergleich der Plasmidprofile von E. coli O104:H4 und
HUSEC041
(Quelle: NRZ für Salmonellen, RKI)
1 2 3 4
kbp Spur 1: HUSEC041
95kbp plasmid: blaTEM-1
75kbp EAEC virulence plasmid:
147
aatA, aggR, aaf/III
Spur 2, 3: Isolate des Ausbruchs
63
90kbp plasmid: blaTEM-1,
blaCTX-M-15
36 83kbp EAEC virulence plasmid:
aatA, aggR, aaf/I
Spur 4: MW Standard E. coli 39R861
(Plasmidprofilanalyse nach Kado & Liu; J. Bact. Vol. 145, 3; 1365-1373)
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