Klinische Chemie und Laboratoriumsdiagnostik
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Klinische Chemie und Laboratoriumsdiagnostik
Vorlesung: Molekulare Diagnostik
Dr. rer. nat. Hartmut Schmidt
Centrum für Laboratoriumsmedizin
– Zentrallaboratorium –
Universitätsklinikum Münster
Albert-Schweitzer-Campus 1
D-48149 Münster
Tel.: 0251 83-47226
Fax: 0251 83-47225
zlab-lehre.uni-muenster.de
Hartmut.Schmidt-ZL@ukmuenster.de
QR Code / Link dieser Vorlesung:
www.klichi.uni-muenster.de/folien
Sommersemester 2021
Klinische Chemie und Laboratoriumsdiagnostik
Vorlesung: Molekulare Diagnostik
Dr. rer. nat. Hartmut Schmidt
Centrum für Laboratoriumsmedizin
– Zentrallaboratorium –
Universitätsklinikum Münster
Albert-Schweitzer-Campus 1
D-48149 Münster
Tel.: 0251 83-47226
Fax: 0251 83-47225
zlab-lehre.uni-muenster.de
Hartmut.Schmidt-ZL@ukmuenster.de
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Sommersemester 2021
"Omics"-Ansatz: die molekulare Biologie der Zelle
DNA (Erbsubstanz)
Proteinvariante
Gene Variation
mRNA
Gen-Aktivität Metabolite
Genotyping Gene Profiling Proteomics Metabolic Profiling
Genom Transkriptom Proteom Metabolom
statische Größe dynamische Größen ......................................................
Aufklärung der DNA-Doppelhelix Struktur 1953
Nobelpreis 1962
Die Röntgenbeugungsdiagramme der DNA durch Franklin und
Wilkins und deren mathematische Analyse trugen wesentlich
zur Aufklärung der DNA-Doppelhelixstruktur bei und bestätigten
das theoretische Modell von James Watson und Francis Crick .
Der humane genetische Code ist endlich entschlüsselt !
2000
Die postgenomische Zeit
Venter/Collins
Celera Diagnostics
Über 99,9% der 3,2 Milliarden Bp sind nun bekannt!
Die Rohdaten aus dem Humangenomprojekt
sind frei verfügbar
“Today, we [pledge] to lead a global effort to
make the raw data from DNA sequencing
available to scientists everywhere, to benefit
people everywhere.”
„Paradise lost“: nicht so unterschiedlich wie
wir es gerne hätten
Caenorhabitis elegans Drosophila melanogaster
46% Homologie 61% Homologie
des Proteoms des Proteoms
Gleichheit zum Schimpansen auf
DNA-Ebene: etwa 99%
Probenmaterial für die Molekulardiagnostik Geeignet Bedingt geeignet Nicht geeignet • Vollblut Getrocknetes Material Heparin-Blut • Plasma (Auflösung in PBS) • Serum • buffy coat • Knochenmark • Punktaten • Lymphozyten • Zellkulturen • Geweben • forensische Proben • Cerebrospinalflüssigkeit
DNA-Isolation Säulensystem
Ausbeute: 200 µl Blut: 4-12 µg DNA
= ~ 20 ng/µl
DNA-Isolation magnetic-beads Verfahren
Automatisierte DNA-Isolierung
Maxwell 16
Tecan 1Das PCR-Labor
Die Polymerase-Ketten-Reaktion: Zugpferd
der Molekularbiologie
Nobelpreis
für Chemie
1993Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
PCR-Zyklus
95°C 95°C
72°C
60°C 60°C
25-35
Wiederholungen
DNA- Anheften Ketten- Verdopplung
Denaturierung
Doppelhelix der Primer verlängerung der DNAAgarose-Gelelektrophorese
M 30 ng 3 ng 300 pg
1500 bpRealtime-PCR mit SYBR Green
PCR-Zyklus (40x) Schmelzkurven-Analyse
95°C 95°C 95°C
72°C
60°C
42°CLightCycler: Mutationsanalyse
PCR und Realtime-PCR
Eine Vielzahl von Anwendungen
Infektionsdiagnostik (Viren, Pilze, Bakterien)
• Virusdiagnostik: HIV, HBV, HCV, BKV, EBV, CMV, HSV1+2, VZV
• Subtypen-Bestimmung – z.B. Influenza A/B „Schweinegrippe“
• In Kultur langsam wachsende Erreger (z.B. Chlamydien)
BKVVorgefertigte Kits 90 Keime in 6h aus 1,5 ml Blut
PCR eine Vielzahl von Anwendungen
Genetischer Fingerabdruck
• 10-150 Bp lange, polymorphe,
repetitive, tandemartige DNA-Sequenzen
• Short tandem repeats (STR),
Unterscheidung naher Verwandte
• Lebensmittelüberwachung
(z.B. Nachweis von Pferdefleisch)
• Vater- oder Mutterschaft
M= Mutter
K= Kind
F = VaterPCR und Realtime-PCR
Eine Vielzahl von Anwendungen
Genetische Störungen des Menschen
• Humangenetik (Erbkrankheiten)
• Tumorgenetik
• Immungenetik, HLA-Typisierung
• Prädispostionsdiagnostik (Thrombose-, KHK-Risiko)
• Pharmakogenetik
Absolute Quantifizierung, Ermittlung der GenkopienzahlGeräte und Methoden in der Molekularen Diagnostik
Sonden-spezifische Quantitative
DNA-Sequenzierung
Echtzeit-PCR mit Echtzeit-PCR
Schmelzkurvenanalyse (5‘-Nuclease-Assay)
TaqMan Kapillarsequenzierer
LightCycler
ABI Prism 7900 ABI Prism 3700Prinzip der Sequenzierung nach dem Kettenabbruchprinzip nach Sanger
DNA-Sequenzierung Kapillarelektrophorese + Bioinformatik: Heute Goldstandard Hohe Zuverlässigkeit Lange Sequenzabfolgen lesbar Automatisierbar
Familiäres Mittelmeerfieber und andere vererbliche periodische
Fiebersyndrome
Molekulargenetische Differenzialdiagnose seit März 2016 im Zentrallabor etabliert
-Die Symptome sind:
Hohes periodisch auftretendes Fieber, Erytheme, u.a. auch Bauch- und/oder Thoraxschmerzen
-Die Therapie ist häufig abhängig von dem betroffenen Gen bzw. der Erkrankung
-Spätfolgen: z.B. AmyloidoseFamiliäres Mittelmeerfieber, genetische Varianten (SNPs) und Mutationen im MEFV‐Gen Fujikura, K.: Molecular Genetics & Genomic Medicine 2015; 3(4): 272–282
Mutationsnachweis im MEFV‐Gen mittels Sanger Sequenzierung
Erbgang: autosomal rezessiv
Exon10
M694V
Homozygot
c.2080A>G
rs61752717
pathogen
K695R
Homozygot
c.2084A>G
rs104895129
pathogenÄltere Sequenzierer verschiedener Hersteller
Genomsequenzierung mit dem 454 1. Schritt 2. Schritt
3. Schritt 4. Schritt
- 2 Monate für die Analyse des Watson Genoms - 2014 Start des 100.000 x humane Genomprojekt: The Prime Minister (UK) has pledged that the UK will map 100,000 human genomes by 2017. Veranschlagte Investitionskosten: 300.000.000 £
Next, Next Generation Sequencing, Stand Oktober 2014
Genpanel Exom Exom + Genom Genom + „Populationsgenome“NGS in der Routine Diagnostik im CfL seit März 2015 möglich
Beschluss vom 11. März 2016:
Im Einheitlichen Bewertungsmaßstab (EBM) der Gebührenordnung wird zum 01. Juli 2016 die
Abrechenbarkeit von NGS ermöglicht
Flow Cell
MiSeq
Bridged PCR + NGSAnwendungen der NGS‐Methodik in der molekularen Routinediagnostik 1. „Long Range PCR“ bis ca. 80 KB Allelspezifische HLA Typisierung mehrerer Patienten in einer Analyse (max. 384 Patienten) 2. Analyse von Virus‐ und Bakteriengenomen: Hygiene Nachweis von resistenten Krankenhauskeimen aus vielen verschiedenen Proben HIV‐Genotypisierung „Deep Sequencing“ frühe Erkennung neuer resistenter Stämme 3. Paneldiagnostik Neurogenetik: 12 Patienten x 200 Gene pro Run (MiSeq) Humangenetik: 40 Gene des hereditären Mammakarzinoms Molekularpathologie: „Cancer Panel“ therapierelevante Gene 4. Exomsequenzierung Humangenetik: Mutationsanalyse bei unbekannter Verdachtsdiagnose 5. Genomsequenzierung Humangenetik: Mutationsanalyse bei unbekannter Verdachtsdiagnose Exom: ca. 1% des Genoms – umfasst alle kodierende Genabschnitte Deepsequencing: Nachweis von Mutationen und genetischen Varianten in wenigen Zellen oder Zellpopulationen
Auswertung und Befunderstellung mit Hilfe von:
‐ Datenbanken (NCBI, HGMD, Infevers)
‐ Vorhersageprogrammen (Mutation Taster, Polyphen 2)
‐ Einschlägiger Fachliteratur
Klassifikation der nachgewiesenen Sequenzvarianten
nach RICHARDS et al (2015) ACMG Standards and Guidelines, Interpretation of sequence variants
1. Nicht pathogen oder keine klinische Signifikanz
SNPs ohne Effekt auf die Funktionalität des Proteins
2. Wahrscheinlich nicht pathogen oder von geringer klinischer Signifikanz
SNP oder häufige Mutation mit Aminosäureaustausch mit fraglicher Auswirkung auf die Funktionalität
3. Mutationen unklarer klinischer Signifikanz
Mutationen mit geringer Auswirkung auf die Funktionalität , häufig „Low Penetrance Mutationen“
4. Mutationsnachweis mit hoher klinischer Signifikanz
wahrscheinlich für die Erkrankung ursächliche Mutation/en mit Veränderung der Funktionalität des Proteins
5. Mutationsnachweis mit klarer klinischer Signifikanz
ursächliche Mutation/en, mit starker Auswirkung auf die Funktion oder Funktionsverlust des Proteins
‐ Wildtyp: negativ (Kategorie 1 wird in der Regel zum Wildtyp gerechnet)
‐ Fraglich: Kategorie 2 und 3
‐ Positiv: Kategorie 4 und 5
Single Nucleotide Polymorphism (SNP): MAF > 1%, Mutation: MAF < 1%Alle Menschen sind eng miteinander verwandt
Unterschied zwischen
diesen beiden
Personen < 1 von 1.000
Basen
Das menschliche Genom (3,2 GBasen) hat:
- ca. 38 Millionen Einzelpolimorphismen (SNPs)
- ca. 1,4 Millionen kurze Insertionen und Deletionen sowie 14.000 größere Deletionen
- ca. 90% der genetischen Unterschiede zwischen Menschen werden durch ca. 60,000 SNPs in
kodierenden Regionen verursachtWas ist ein Gen-Chip?
* *
* *
*
20 µmGeneChip® Process Flow
Hybridize Wash
(16-18 hours) &
Stain
Hybridization Oven 640 Fluidics Station 450
Scanner 3000
Data Analysis I
and
Quality Control Data Analysis II
0.00077 *** 2615 11352 -8737 0.2 0.0097 40415_at ACAA1 Chr:3p23-p22 acety l-Coenzy me A ac yltransferas
0.00009 **** 1378 9567 -8189 0.1 0.0385 40787_at WIRE Chr:17q21.1 WIRE protein
0.00168 ** 288 4835 -4547 0.1 0.0004 41139_at MAGED1 Chr:Xp11.23 melanoma antigen, family D, 1
0.00032 *** 2946 20102 -17157 0.1 0.0008 41153_f_at MAGED1 Chr:Xp11.23 melanoma antigen, family D, 1
0.01402 * 267 1286 -1018 0.2 0.0045 41154_r_at MAGED1 Chr:Xp11.23 melanoma antigen, family D, 1
0.00338 ** 3951 40495 -36544 0.1 0.0 41155_at MAGED1 Chr:Xp11.23 melanoma antigen, family D, 1
0.00080 *** 2845 20349 -17505 0.1 0.0013 41156_g_at MAGED1 Chr:Xp11.23 melanoma antigen, family D, 1
Scan Analysis
0.00038 *** 1440 12563 -11124 0.1 0.0002 41200_at SCARB1 Chr:12q24.31 sc avenger receptor class B, mem
0.00660 ** 2088 7425 -5337 0.3 0.0040 41222_at STAT6 Chr:12q13 signal transduc er and ac tivator of trans
0.00241 ** 935 9117 -8182 0.1 0.0 32195_at - - Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp586B1922 (from c
0.00015 *** 483 4807 -4324 0.1 0.0091 32235_at KIAA0544 Chr:16p13.3 KIAA0544 protein
0.01305 * 230 4841 -4610 0.0 0.0 32783_at FBLN2 Chr:3p25-p24 fibulin 2
0.00018 *** 343 3188 -2845 0.1 0.0030 33358_at KIAA1157 Chr:12q13.3 KIAA1157 protein
0.00060 *** 109 1067 -958 0.1 0.0050 33382_at ASAHL Chr:4q21.1 N-acylsphingos ine amidohy drolase (
0.00785 ** 7236 24427 -17190 0.3 0.0108 33448_at SPINT1 Chr:15q14 serine proteas e inhibitor, Kunitz type 1
0.00168 ** 373 1546 -1173 0.2 0.0091 33840_at TPD52 Chr:8q21 tumor protein D52
0.00300 ** 89 1479 -1390 0.1 0.0 33907_at EIF4G3 Chr:1p36.12 eukaryotic trans lation initiation factor
0.03802 * 124 1207 -1083 0.1 0.0 33925_at NRGN Chr:11q24 neurogranin (protein kinase C substra
0.01693 * 1128 5996 -4867 0.2 0.0104 34408_at RTN2 Chr:19q13.32 reticulon 2
0.00513 ** 3219 7785 -4566 0.4 0.0477 34409_at LRP10 Chr:14q11.2 low dens ity lipoprotein receptor-rela
0.02805 * 148 3600 -3452 0.0 0.0 34884_at CPS1 Chr:2q35 carbamoyl-phosphate sy nthetase 1, mito
0.00168 ** 8220 101 8119 81.4 0.0084 35367_at LGALS3 Chr:14q21-q22 lec tin, galactoside-binding, s olub
0.03611 * 1586 95 1491 16.7 0.0111 35824_at ZNF238 Chr:1q44-qter zinc finger protein 238
0.00341 ** 3362 25230 -21868 0.1 0.0028 35828_at CRIP2 Chr:14q32.3 cysteine-rich protein 2
0.00067 *** 1009 5862 -4853 0.2 0.0066 36196_at PFKM Chr:12q13.3 phosphofructokinase, muscle
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0.00748 ** 25407 437 24969 58.1 0.0170 36589_at AKR1B1 Chr:7q35 aldo-keto reductase family 1, member
0.00088 *** 138 1736 -1598 0.1 0.0 36681_at APOD Chr:3q26.2-qter apolipoprotein D
0.03349 * 146 1722 -1577 0.1 0.0025 37023_at LCP1 Chr:13q14.3 lymphoc yte cy tosolic protein 1 (L-plas
0.04247 * 8567 27667 -19101 0.3 0.0116 37025_at PIG7 Chr:16p13.3-p12 LPS-induced TNF-alpha factor
av.value in group 1
pvalue xbar ybar diff ratio F-pv alue description av.value in group 2
-40000 40000 0 20000
cutoff: t-p = 20, F-p = 2, page 3of 5, n=61:90 of 128
Fig.3.t-test c omparisons with 95 % confidence limits , var.eq= TRUE , p-adjust.: BH, data: Kemming.signal , 1:12600 , scaling: IQR
Group 1: TAT21 TAT22 DEL31 DEL32 NEO41 NEO42 PM51 PM52
Group 2: SK61 SK62 SK63Multistage Design of the Whole Genome
Association Study
and SNP-Reduction
Samples SNPs
Stage I
Mendel 536.179
500K Screening
210 210
Cases & controls 20.982
Meg
Stage II
Replication 5.616
600 600
Taq
Man
Stage III 415
3900 from PROCAM cohort Verification
950 at high or intermediate risk 34
2.950 at low risk (< 10%) 3
Follow-up: 130 MIs at 11/07 Risk AlgorithmThe risk calculator
COMPAQ
3970
Handheld
Application
Visual Basic 6.0
applicationIndikation Gen Analyse
Hypercholesterinämie ApoB100, ApoE Sonden spezifische
Echtzeit PCR
Hypercholesterinämie LDLR, PCSK9 Sequenzierung
Hämochromatose HFE Sequenzierung
Morbus Wilson ATP7B Sequenzierung
Familiäre adenomatöse APC Sequenzierung
Polyposis
Solide Tumore z.B. p53, BRAF, KRAS Sequenzierung / NGS
Familiäres Mamma Carcinom BRCA1, BRCA2 Sequenzierung / NGS
MEN2A, MEN2B, familäres RET Sequenzierung
Schilddrüsenkarzinom
Pharmakogenetik Cytochrome (P450) Sonden spezifische Echtzeit
NAT2, TPMT PCR / Sequenzierung
HIV-Infektion HIV-RNA Sequenzierung / NGSZwingend notwendig seit in Kraft treten des Gendiagnostikgesetzes am 01.02.2010
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