(LOC) Lab-on-a-chip Neue POCT-Technologien - Wolfgang Kaminski Institut für Klinische Chemie
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Neue POCT-Technologien Lab-on-a-chip (LOC) Wolfgang Kaminski Institut für Klinische Chemie Universität Heidelberg Campus Mannheim
Definitionen und Begriffe Was bedeutet Lab-on-a-chip? Definition: Geräte, die (multiple) Laborfunktionen auf einer millimetergrossen Plattform integ- rieren und mit sehr geringen Reaktionsvolumina umgehen können (μl – pl) Glas-Mikroreaktor Microfluidics μTAS (micro total analytic system) Micro Electro Mechanical Systems (MEMS)
Was sind die Anfänge? Anfang 1990er Mikropumpen Durchfluss-Sensoren Integrierte „Flüssigkeiten- prozessierung“ Flüssigkeitsbewegung für Analysensysteme durch Mikrokanäle - druckgesteuert - elektrokinetisch Reinigung Separation Ende 1990er Kapillarelektrophorese DNA Microarrays
Was treibt die Miniaturisierung voran? Minimierung von Probenvolumen und Reagenzienverbrauch POCT Drug Discovery Nachweis biologischer Kampfstoffe „Global Health“ Astrobiologie
Miniaturisierte PCR: Lab-on-chip-Systeme Rückseite eines Zwei-Kammer- Chip-Thermocyclers mit Ein-Kammer-Chip- Dünnschichtheizern, Meßfühlern Thermocycler mit transparenter und elektrischen Kontaktsystem Abdeckung für Fluoreszenz- Monitoring
Vorteile der LOC Miniaturisierung Geringe Reaktionsvolumina weniger: Abfall Reagenzienkosten Probenmaterial
Vorteile der LOC Miniaturisierung Geringe Reaktionsvolumina weniger: Abfall Reagenzienkosten Probenmaterial Schnellere Analysendurchführung kurze Diffusionswege effiziente Thermodynamik günstige Oberflächen:Volumen Verhältnisse
Vorteile der LOC Miniaturisierung Geringe Reaktionsvolumina weniger: Abfall Reagenzienkosten Probenmaterial Schnellere Analysendurchführung kurze Diffusionswege effiziente Thermodynamik günstige Oberflächen:Volumen Verhältnisse Geringe(re) Integration von verdichteter Funktionalität Herstellungskosten und kleinen Reaktionsvolumina
Vorteile der LOC Miniaturisierung Geringe Reaktionsvolumina weniger: Abfall Reagenzienkosten Probenmaterial Schnellere Analysendurchführung kurze Diffusionswege effiziente Thermodynamik günstige Oberflächen:Volumen Verhältnisse Geringe(re) Integration von verdichteter Funktionalität Herstellungskosten und kleinen Reaktionsvolumina Kompaktheit Einweg-Nutzung Massenproduktion
Vorteile der LOC Miniaturisierung Geringe Reaktionsvolumina weniger: Abfall Reagenzienkosten Probenmaterial Schnellere Analysendurchführung kurze Diffusionswege effiziente Thermodynamik günstige Oberflächen:Volumen Verhältnisse Geringe(re) Integration von verdichteter Funktionalität Herstellungskosten und kleinen Reaktionsvolumina Kompaktheit Einweg-Nutzung Massenproduktion Unbegrenzte (?) Parallelisierung Hochdurchsatz
Vorteile der LOC Miniaturisierung Geringe Reaktionsvolumina weniger: Abfall Reagenzienkosten Probenmaterial Schnellere Analysendurchführung kurze Diffusionswege effiziente Thermodynamik günstige Oberflächen:Volumen Verhältnisse Geringe(re) Integration von verdichteter Funktionalität Herstellungskosten und kleinen Reaktionsvolumina Kompaktheit Einweg-Nutzung Massenproduktion Unbegrenzte (?) Parallelisierung Hochdurchsatz Mehr Sicherheit Generelle Kleindimensionierung
Mikro-Arrays Der weltweite Mikro-Array Markt wird derzeit auf ein Volumen von €600 Mio taxiert - Tendenz steigend. Anforderungen an die Systeme durch den Markt: kostengünstig tragbar leicht bedienbar exakt verlässlich schnell
Mikro-Arrays Klinisch-diagnostische Anwendungen Beispiele
DNA Array basierte Genotypisierung in der Pharmakogenetik Amplichip® CYP450 Roche Anwendung: Genoytypisierung der Metabolisierungsenzyme CYP450 2D6, CYP450 2C19 Paralleler Nachweis von 33 Genvarianten zur Identifikation des Metabolisierungspotentials (z.B. Psychopharmaka) Automatisierte Hybridisierung, Imaging und Auswertung auf Basis des Affymetrix System für klin. Anwendung zugelassen !
Erfordernis: Fluidics Station, Scanner, PC, User-Expertise ! Dauer: 1 Tag Mikrosystem, aber derzeit nicht POCT-fähig
Evaluation des Rezidivrisikos bei Brustkrebs MammaPrint® Agendia Prinzip: 70-Gen-mRNA Expression-Profiling von Brust- krebs-assoziierten Genen (van 't Veer et al., Nature 2002) Material: Frisch entnommene Mamma-Resektatproben Versand ans Netherlands Cancer Institute Dauer: 10 Tage Anwendung: Abschätzung des Risikos eines Rezidivs (5-10 Jahre nach Diagnose) LK – < 61 J Tumor < 5 cm FDA freigegeben ! Befundung erfordert ausgewiesene Expertise und Einsendung an Spezialanbieter ! Kosten: $ 3,200 !!
Prognoseevaluation bei Brustkrebs-Subentität Mammostrat® Applied Genomics Inc. Ring, B. Z., et al. 2006. J Clinical Oncol 24:3039 Prinzip: 5-Antikörper Immunohistochemie Test PFA-fixiertes Gewebe Anwendung: postmenopausales Mammakarzinom Tamoxifen-behandelt LK - Östrogenrezeptor +, Kostengünstiger als molekulargenetische Tests?
Prognoseevaluation bei Brustkrebs-Subentität Read-out: IHC Befund: niederer Risikobereich
Prognoseevaluation bei Brustkrebs-Subentität Read-out: Befund: hoher Risikobereich Befundung erfordert ausgewiesene Expertise und Einsendung an Spezialanbieter !
Mikro-Bead basierte Immunoassays Immunoassays auf chemisch sensibilisierten Beads auf Silicon- oberflächenmatrix Jeder der 280-μm Beads fungiert als Microreaktor-Sensor, dessen Selektivität sich durch die Spezifität des Capture-AK definiert Anwendungen: IL-1β CRP Parodontose-Diagnostik MMP-8 (Speicheltest) CRP-Leukozyten Assay
Vergleichbarkeit ? Qualität vergleichbar mit der kommerzieller ELISAs (Clinical Chemistry. 2005;51:2391-2395.)
Chip-basierte Immunoassay-Techniken Randox Evidence® Konventionelle Immunoassay-Technologie auf Chip Zytokin-Array: Interleukin-1α (IL-1α) Interleukin-1β (IL-1β) Interleukin-2 (IL-2) Interleukin-4 (IL-4) Interleukin-6 (IL-6) Interleukin-8 (IL-8) Interleukin-10 (IL-10) Interleukin-12 (IL-12) Vascular endothelial growth factor (VEGF) TNF-α IFN-γ Epidermal growth factor (EGF) Monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1)
„Stroke-Chip“ Triage Stroke Panel, Biosite BNP MMP-9 S-100β D-Dimere 2006 premarket approval zurückgezogen
Neue Entwicklungen in der miniaturisierten Diagnostik Biohybride Systeme Bioelektronische Mikrosensoren Testzellen Mikrosensoren monitoren anhand von Zellen oder Geweben die Funktion des Testorganismus. Simulation der in-vivo Umgebung Potentiell Anwendungen: Reaktion auf Chemotherapeutika Bestimmung der individuellen Chemosensitiviät von Tumoren
Neue Entwicklungen in der miniaturisierten Diagnostik Intelligent mobile lab (IMOLA) Heinz Nixdorf-Lehrstuhl für Medizinische Elektronik (TU München) Entwicklung eines mobilen Bioanalysetools Prinzip: Biologische Zellen als Signalwandler Anwendungsgebiete Allergiesensorik Pestiziddetektion therapierelevante Analytik aus Urin, Speichel
IMOLA Extrazelluläre Ansäuerung Zellatmung Zellproliferation Veränderungen von Morphologie und Adhäsion Multiparametrischer Sensor-Chip pH Sensor pO2 Sensor Impedanz Keramikchip
Neue Entwicklungen in der miniaturisierten Diagnostik IMOLA set-up Voll mobil ! Messungen an lebenden Zellen Datentransfer Mikrofluidik- einheit Biochip + Digitalmodul
Gegenwärtiger Status LOC Die erfolgreiche Kommerzialisierung von Lab-on-a-Chip- Systemen lässt auf sich warten Immer noch an der Austestungsgrenze des Machbaren Technische Limitationen z.B. ist das Auslesen der Daten immer noch auf externe optische Auslesesysteme angewiesen (off-chip Auslese-technik) nachteilig für die geforderte kompakte Systemgrösse und Handhabung
Insuläre Entwicklungen Medizinische Elektronik Mikrotechnik Mikrofluidik Mikrooptik
Integration/Kommunikation ? Koordinierte strategische Planung ? Medizinische Elektronik Mikrotechnik Diagnostischer Anwender Mikrofluidik Mikrooptik
Problemfelder Gegenwärtige Entwicklungen noch weitgehend auf dem Stand der Auslotung der technischen Machbarkeit Vielfach sind nur Teilkomponenten der Analysesysteme miniaturisiert Anwendung in der Serie - ist diese überhaupt möglich? Wer „integriert“ die Fülle der Daten von grossen Parallelansätzen? Wo liegen cut-offs oder andere Entscheidunghilfen bei Profiling-Daten? Das LOC ist problemlos an den Patienten zu bringen nicht aber die Expertise von Anwendung und QC Miniaturisierung aus technischer Begeisterung / Machbarkeit ? Ist das immer sinnvoll?
Herausforderungen Validisierung von miniaturisierten, integrierten Diagnostikplattformen. Verlässlichkeit sind unabdingbare Voraussetzungen für Reproduzierbarkeit klinisch-diagnostische Fragestellungen ! Kosteneffizienz Qualitätskontrolle Effizienzevaluation
Verzögerte (R)evolution Elektrotechnik Bioanalytik Transistor 1947 1962 Mikrolitergefäss Mikroprozessor 1971 Intel 4004 Pentium-Prozessor 1993 1995 cDNA Mikroarray Quanten-Prozessor? Lab-on-a-chip
Wohin geht die Reise? Sub-Mikrometer Bereich Nanosensoren Einzelzellanalysen /-Profiling Single Cell Profiling Integrating whole transcriptome assays on a lab-on-a-chip for single cell gene profiling. Lab Chip. 2008 Mar;8(3):443-50 2008 Jan 31. We demonstrate that, using the microfluidic protocol, 74% of the genes expressed in mouse brain were detected, while only 4% were found with the conventional approach. We next profiled single neuronal progenitors. Using our microfluidic approach, i.e. performing cell capture, lysis and reverse transcription on-chip followed by TS-PCR amplification in tube, a mean of 5000 genes were detected in each neuron, which corresponds to the expected number of genes expressed in a single cell. This demonstrates the outstanding sensitivity of the microfluidic method.
October 12 - 16, 2008
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