NACHWEIS UND ANALYSE BAMA-ASSOZIIERTER FALTUNGSINTERMEDIATE DES OMPA DURCH ORTSGERICHTETE FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE - KOBRA

Nachweis und Analyse BamA-
assoziierter Faltungsintermediate des
 OmpA durch ortsgerichtete
 Fluoreszenzspektroskopie

 Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades
 des Doktors der Naturwissenschaften
 (Dr. rer. nat.)

angefertigt im Fachbereich 10 – Mathematik und Naturwissenschaften
 Institut für Biologie, Abteilung Biophysik
 Universität Kassel

 vorgelegt von
 Nicole Schürmann

 Kassel
 8. Mai 2020

Betreuer: Prof. Dr. J. H. Kleinschmidt

Promotionskommission:

1. Gutachter: Prof. Dr. J. H. Kleinschmidt

2. Gutachter: Prof. Dr. M. Maniak

3. Prüfer: Prof. Dr. R. Schaffrath

4. Prüfer: Prof. Dr. F. W. Herberg

Tag der mündlichen Prüfung: 16.07.2020

Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis 1
Formelsymbole und Einheiten 2
1. Einleitung 4
 1.1 Faltung von β-Fass Proteinen 6
 1.1.1 Modellprotein für OMP-Faltungsstudien: OmpA 6
 1.1.2 Faltungsmechanismus – Schrittweise Faltung und Insertion 8
 1.2 Der BAM Komplex 10
 1.2.1 Die Hauptkomponente des BAM Komplexes: BamA 11
 1.2.2 Lipoproteine des BAM Komplexes 13
 1.3 Modelle zum BamA-abhängigen Faltungsmechanismus von OMPs 15
 1.4 Motivation und Ziel der Arbeit 16
2. Materialien und Methoden 19
 2.1 Materialien 19
 2.1.1 Bakterienstämme 19
 2.1.2 Oligonukleotide 19
 2.1.3 Plasmide 20
 2.2 Methoden 21
 2.2.1 Homologie Sequenzvergleich 21
 2.2.2 Gezielte Punkt-Mutagenese 21
 2.2.3 Mutagenese zur Deletion der Signalsequenz von OmpA 22
 2.2.4 Expression und Reinigung von BamA und OmpA 23
 2.2.5 Präparation von Lipidfilmen und großen unilamellaren Vesikeln 23
 2.2.6 Faltung in LUVs und LDAO 24
 2.2.7 Proteolyse mittels Trypsin 25
 2.2.8 Faltungsintermediate von OmpA in Ab- und Anwesenheit von BamA 26
 2.2.9 Zirkulardichroismus Spektroskopie 27
 2.2.10 Fluoreszenzspektroskopie 28
3. Ergebnisse 30
 3.1 Charakterisierung der Tryptophan- und Cystein-freien BamA Mutante 30
 3.1.1 Identifizierung konservierter Tryptophan- und Cysteinreste in BamA-Proteinen
 mittels multiplem Proteinsequenzabgleich 30
 3.1.2 Analyse der Faltung und Insertion der WaF, CaA-BamA Mutante 33
 3.1.3 Analyse der Temperaturstabilität von wt-BamA und WaF, CaA-BamA 36
 3.1.4 Nachweis der Funktionalität von WaF, CaA-BamA 38
 3.2 Entwicklung von Modellmembransystemen für OmpA-BamA Interaktionsstudien 41
 3.2.1 Voraussetzungen des Modellmembransystems 41
 3.2.2 Zusammensetzung der LD 42
 3.2.3 Temperatur und pH-Wert 44
 I

3.2.4 Fluoreszenzspektroskopische Interaktionsstudie von wt-OmpA und WaF, CaA-
 BamA 47
 3.3 Ortsspezifische Interaktionsstudien von OmpA und BamA 51
 3.3.1 WaF, CaA-OmpA Faltungskinetik in Ab- und Anwesenheit von BamA 52
 3.3.2 Ortsspezifische Interaktionsstudien von OmpA und BamA 55
 3.3.3 Einfluss von BamA auf β-Stränge des OmpA 58
 3.3.4 Einfluss von BamA auf extrazelluläre Schleifen des OmpA 62
4. Diskussion 66
 4.1 Faltungsfähiges und funktionelles WaF, CaA-BamA 66
 4.2 Modellmembransystem aus kurzkettigen Lipiden für dynamische BamA-
 Wechselwirkungsstudien mit OMPs 69
 4.2.1 OmpA Faltungsintermediate erstmalig in kurzkettigen Lipiden und in Gegenwart
 von BamA 69
 4.2.2 WaF, CaA-OmpA und ETM von OmpA zeigen stabilen Komplex mit BamA 71
 4.2.3 BamA zeigt Chaperone ähnliche Funktion in wässeriger Umgebung 71
 4.3 Faltungsmechanismus von OmpA in LD 72
 4.4 Faltungsmechanismus von OmpA in Gegenwart von BamA 74
5. Zusammenfassung 76
6. Literatur 78
Anhang 89
Liste der Veröffentlichungen 92
Danksagung 93
Eidesstattliche Erklärung 94

 II

Abkürzungsverzeichnis
ATP Adenosintriphosphat
BAM β-barrel assembly machinery
BSA Bovines serum albumin
Borax Dinatriumtetraborat-Decahydrat
CD Circular dichroism, Zirkulardichroismus
C-Terminus Carboxy-Terminus
diC18:1PC 1-Stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC
DLPC 1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine, diC12:0PC
DLPE 1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
DLPG 1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol
DPG Diphosphatidylglycerol
E. coli Escherichia Coli
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ETM Einzeltryptophanmutante
g gefaltet
HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure
IM Innere Membran
IMP Innenmembranproteine
KTSE Kinetics of tertiary structure formation by electrophoresis
LD Lipiddoppelschicht
LD⋅[BamA] Lipiddoppelschicht mit gefaltetem und inseriertem BamA
LDAO Lauryldimethylaminoxid
LPS Lipopolysaccharid
LUV Large unilamellar vesicles
NaCl Natriumchlorid
NRMSD Normalized root mean square deviation
N-Terminus Amino-Terminus
OM Outer membrane
OMP Outer membrane protein
OmpA Outer membrane protein A
MES 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure
MOPS 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure
 1

PC Phosphatidylcholin
PCR Polymerase chain reaction
PD periplasmatische Domäne
PE Phosphatidylethanolamin
PG Phosphatidylglycerol
POTRA Polypeptide transport associated
Präproteine Präkursor-Proteine
SDS Sodium lauryl sulfate
SS Signalsequenz
TMD Transmembrandomäne
TMP Transmembranproteine
TPR Tetratricopeptide repeat
Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Trp, W Tryptophan
u ungefaltet
WaF, CaA Tryptophan gegen Phenylalanin (F), Cystein (C) gegen Alanin (A)
 substituiert
wt Wildtyp
Wmβn Mutanten mit W an Position m, Lokalisiert in β-Strang der Nummer n
XmWLn Mutanten mit Aminosäure X an Position m getauscht gegen W,
 Lokalisiert in Loop (extrazelluläre Schleife) der Nummer n

Formelsymbole und Einheiten
Å Ångström
Af Relativer Anteil der schnellen Faltungsphase
c Konzentration
cm Zentimeter
cps Counts per second
°C Grad Celsius
h Stunde (hour)
kDa Kilo Dalton
kf Geschwindigkeitskonstante des schnellen Faltungsprozesses (fast)
ks Geschwindigkeitskonstante des langsamen Faltungsprozesses (slow)
L Liter
 2

l Schichtdicke der Küvette
Mcps Millionen counts per seconds
mM Millimolar
min Minute
M Molar
ml Milliliter
Mr Relative Molarmasse
n Anzahl der Aminosäuren
nm Nanometer
pI Isoelektrischer Punkt
pKs dekadischer Logarithmus der Säurekonstante Ks
rpm round per minute
t Zeit
XFP Anteil gefaltetes Protein
Θ Elliptizität
λ Wellenlänge
λmax Wellenlängenposition des Fluoreszenzintensitätsmaximums
Δλmax Differenz der Wellenlängenpositionen der
 Fluoreszenzintensitätsmaxima
µM Mikro Molar

 3

1. Einleitung
Für das Leben essentiell sind biologische Membranen. Membranen sind Strukturelemente die
die Bildung von Kompartimenten ermöglichen und sind damit Voraussetzung für die
Differenzierung komplexer Organismen. So gibt es Organismen wie Gram negative Bakterien,
die von zwei Membranen umgeben sind (siehe Abbildung 1). Das Cytoplasma ist von der
inneren Membran (IM) umgeben. Diese ist eine Doppellipidschicht und besteht bei Escherichia
coli (E. coli) aus 70-75 % Phosphatidylethanolamin (PE), 18-22 % Phosphatidylglycerol (PG)
und 6-8 % Diphosphatidylglycerol (DPG) (Lugtenberg und Peters 1976, Morein et al., 1996).
Die IM ist mit dem zwitterionische PE und dem anionische PG/DPG leicht negativ geladen.
Inseriert in die IM sind typischerweise α-Helicale Proteine. Diese können aus einer einzelnen
oder mehreren α-Helices bestehen (von Heijne und Gavel 1988). Die Insertion erfolgt mit Hilfe
des SecYEG Translokasekomplexes und/oder der YidC Insertase (Pugsley 1993, Houben et al.,
2000, Samuelson et al., 2000). Die Sec Translokasemaschinerie ist gleichermaßen für die
Translokalisation vieler Außenmembranproteine (OMPs, outer membrane proteins) und
periplasmatischer Proteine verantwortlich (siehe Cranford-Smith und Huber 2018). An die IM
schließt sich das Periplasma an. Dieses Kompartiment schließt eine Vielzahl von Enzymen z.B.
Proteasen und Phosphatasen und Funktionen wie Sekretion, Osmoseregulation und Protein
Qualitätskontrolle ein. Weiterhin enthalten ist die sogenannte Peptidoglycanschicht bestehend
aus vernetzten Zuckern und Aminosäuren (siehe Miller und Salama 2018). Umgeben ist das
Periplasma von der Außenmembran (OM, outer membrane). Die OM ist im Gegensatz zur IM
eine asymmetrische Membran, bei der die äußere Schicht meistens aus einer
Lipopolysaccharid- (LPS) Schicht besteht, während die innere Schicht aus Phospholipiden
aufgebaut ist (Kamio und Nikaido 1976, Bos et al., 2007). Bei E. coli besteht die innere zum
Periplasma gerichtete Membranschicht aus 75-80 % PE, 15-20 % PG und 2-6 % DPG
(Lugtenberg und Peters 1976, Morein et al., 1996). Damit zeigt sie einen leicht erhöhten PE
und einen leicht erniedrigten PG Anteil gegenüber der IM. Ebenso ist der Anteil an gesättigten
Lipid-Kohlenstoffketten im Vergleich zur IM minimal erhöht (Morein et al., 1996). Im
Gegensatz zur IM ist an der OM, also im Periplasma, keine Energiequelle in Form von ATP
verfügbar (Wülfing und Plückthun 1994). Ein geregelter Transport von Nährstoffen oder
anderen Molekülen über die OM wird durch inserierte Proteine ermöglicht. Diese OMPs sind
charakteristisch als β-Fass gefaltet. Bislang sind Proteine mit mindestens acht (z.B. OmpA) bis
hin zu 26 (LptD) antiparallel angeordneten β-Strängen bekannt (siehe Kleinschmidt 2015). Wie
alle Proteine werden auch OMPs im Cytoplasma synthetisiert und besitzen für den gezielten

 4

Transport zur OM eine meist 21 Aminosäure lange N-terminale Signalsequenz. Diese wird zum
Beispiel von der Sec Translokasemaschinerie erkannt und nach Translokalisation abgespalten
(siehe Cranford-Smith und Huber 2018). Im Periplasma werden Präproteine (Präkursor-
Proteine) von Chaperonen wie SurA oder Skp gebunden (siehe Kleinschmidt 2007, Sklar et al.,
2007b). Diese verhindern eine Aggregation der hydrophoben Präproteine in der wässerigen
Umgebung des Periplasmas. Von den Chaperonen werden die Präproteine zur OM transportiert.
Dort müssen sie in die Membran gefaltet und inseriert werden. In Gram negativen Bakterien
gibt es dafür den β-barrel assembly machinery (BAM) Komplex (Wu et al., 2005, Sklar et al.,
2007a). Dieser katalysiert die Faltung und Insertion der OMPs in die OM (siehe Ricci und
Silhavy 2012, Kleinschmidt 2015, Ricci und Silhavy 2019). Ähnlich zu den
Insertionsmaschinerien der IM gibt es auch bei der Insertionsmaschinerie der OM Homologe
in anderen Organellen wie Chloroplasten und Mitochondrien (siehe Schleiff und Soll 2005,
Knowles et al., 2009, Ricci und Silhavy 2012, Tsukazaki 2019). Im Gegensatz zur IM ist in der
OM bislang nur ein Komplex, der BAM Komplex, für die Insertion von OMPs bekannt.

 Extrazellularraum

 β-Fass ? BamA
 OM

 BamC Periplasma
 OMP BamB BamD
 BamE

 Skp
 SurA

 Peptidoglycan

 IMP IMP

 α- α-
 Sec Helical YidC Helical IM

 Cytoplasma

Abbildung 1: Transport und Einbau von Transmembranproteinen bei Gram negativen
Bakterien. Außenmembranproteine (OMPs) und Innenmembranproteine (IMPs) werden im
Cytoplasma synthetisiert. Die Prä-IMPs werden anhand ihrer Signal-Ankersequenz von der Sec
Translokasemaschinerie oder der YidC Insertase erkannt und in die innere Membran (IM)
gefaltet und inseriert. Die Prä-OMPs werden anhand ihrer Signalsequenz erkannt und mit Hilfe
der Sec Translokasemaschinerie über die IM translokalisiert. Im Periplasma verhindern
Chaperone wie z.B. Skp und SurA die Aggregation der Prä-OMPs und transportieren sie zur
Außenmembran (OM). Dort werden diese vom BAM Komplex erkannt und in die OM gefaltet
und inseriert (verändert nach Kleinschmidt 2015).
 5

1.1 Faltung von β-Fass Proteinen

In E. coli sind alle bekannten β-Fass Proteine aus einer geraden Anzahl an antiparallel
angeordneten β-Strängen aufgebaut, die über lange extrazelluläre und kurze periplasmatische
Schleifen verbunden sind. Das β-Fass ist durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem
ersten und letzten β-Strang geschlossen. Die einzelnen Stränge zeigen eine alternierende
Abfolge an hydrophoben und polaren Aminosäureresten. Hydrophobe Reste sind zur Membran
hin orientiert und polare Reste in das Innere des β-Fasses (siehe Kleinschmidt 2015,
Konovalova et al., 2017). Daher sind β-Fass Transmembranproteine (TMP) im Durchschnitt
weniger hydrophob als α-Helicale TMP (Vogel und Jähnig 1986) und lassen sich bereits in 8 M
Harnstoff entfaltet lösen und denaturieren (Schweizer et al., 1978). Helicale Proteine hingegen
sind in entfalteter Form nur löslich in z.B. 88 % Ameisensäure oder Trifluoressigsäure (Huang
et al., 1981). Eine Rückfaltung aus hitzedenaturiertem Zustand in LPS und Triton X-100 konnte
für das β-Fass OMP OmpA (outer membrane protein A) bereits 1978 von Schweizer et al.
gezeigt werden.

1.1.1 Modellprotein für OMP-Faltungsstudien: OmpA

OmpA ist eines der häufigsten OMPs in E. coli (Chai und Foulds 1977) und ist ein Ionen-
durchlässiges Porin, welches ebenso eine Rolle in der Strukturgebung der Zellen spielt.
Weiterhin dient es als Rezeptor für viele Bakteriophagen und ist überexprimiert in E. coli
Biofilmen (siehe Confer und Ayalew 2013). Es besteht aus einem achtsträngigen β-Fass und
einer etwa gleich großen periplasmatischen Domäne. Die Kristallstruktur des 8-strängigen β-
Fasses wurde bereits 1998 von Pautsch und Schulz veröffentlicht (Abbildung 2 A), wohingegen
die etwa gleichgroße C-Terminal gelegene periplasmatische Domäne erst 16 Jahre später
aufgelöst werden konnte (Abbildung 2 B) (Ishida et al., 2014). Sie besteht aus zwei langen α-
Helices und vier β-Strängen die zusammen als βαβαββ-Formation erscheinen. Außerdem zeigt
sich eine große Ausbuchtung in Form von zwei kleinen α-Helices, die über eine Disulfidbrücke
verbunden sind. Die C-terminale Domäne bindet nicht kovalent an Peptidoglycan und stellt
damit eine Verbindung zwischen der OM und dem Periplasma her (Koebnik et al., 2000, Ried
et al., 1994).

 6

A B

Abbildung 2: Kristallstrukturen der Transmembran- und periplasmatischen-Domäne
von OmpA aus E. coli. (A) Die Transmembrandomäne besteht aus acht antiparallel
angeordneten β-Strängen, die verbunden durch lange extrazelluläre und kurze periplasmatische
Schleifen ein β-Fass ausbilden. In Rot sind die fünf nativen Tryptophanreste W7, W15, W57,
W102 und W143 dargestellt (PDB Struktur: 1bxw, Pautsch und Schulz 1998). Die Verbindung
der Transmembrandomäne mit der periplasmatischen Domäne (B) ist in Blau dargestellt. In
Grün sind die beiden Cysteinreste dargestellt, die eine Disulfidbrücke ausbilden (PDB Struktur:
2mqe, Ishida et al., 2014).

OmpA entwickelte sich über die Jahre als das Modellprotein für Faltungsstudien von OMPs.
Bislang war die Rückfaltung von OmpA in über 60 Detergenzien und in Lipiden mit
unterschiedlichsten Kohlenstoffkettenlängen (7-18) erfolgreich. Eine Notwendigkeit dabei ist
das Überschreiten der kritischen Mizellkonzentration (Kleinschmidt, Wiener et al., 1999,
Kleinschmidt 2006). Erst in Anwesenheit einer ausgebildeten Lipiddoppelschicht (LD) oder
von Lipid- oder Detergensmizellen kann das OmpA β-Fass gebildet werden. Bei Rückfaltungen
in LD aus einem in 8 M Harnstofflösung denaturierten Zustand konnte neben der ausgebildeten
Sekundärstruktur ähnlich der nativen Sekundärstruktur ebenfalls eine orientierte Insertion von
OmpA beobachtet werden (Surrey und Jähnig 1992). Orientiert bedeutet, dass die
Transmembrandomäne in die Membran inseriert ist und die periplasmatische Domäne immer
außerhalb der Vesikel liegt. Dies konnte anhand von Proteolysen gezeigt werden. Bei einer
erfolgreichen Insertion der Transmembrandomäne ist diese durch die Lipide vor der Proteolyse
geschützt, während die frei zugängliche periplasmatische Domäne hydrolysiert wird. Die
geschützte und nicht hydrolysierte Transmembrandomäne kann später mittels

 7

Gelelektrophorese nachgewiesen werden. Diese orientierte Insertion konnte für weitere OMPs
wie z.B. BamA beobachtet werden (Patel und Kleinschmidt 2013).
Die Faltungsausbeute von OMPs ist abhängig von den Kohlenstoffkettenlängen der
verwendeten Lipide, von den Lipidkopfgruppen und auch vom pH-Wert der umgebenden
Lösung (siehe Kleinschmidt 2006). Faltungsfördernd ist eine geringe Kohlenstoffkettenanzahl
wie zum Beispiel 12 Kohlenstoffatome (diC12:0PC). Dies beruht am wahrscheinlichsten auf der
hydrophoben Schichtdicke der LD die mit 19,5 ± 1 Å (Lewis und Engelman 1983) eher der
hydrophoben Region vieler OMPs mit 22-25 Å entspricht (siehe Lee 2003), als die hydrophobe
Schichtdicke von diC18:1PC mit 27 ± 1 Å (de Planque et al., 1998). Bei Verwendung der
zwitterionischen PC (Phosphatidylcholin) Kopfgruppe zeigte sich bei vielen OMPs eine höhere
Faltungsausbeute (Burgess et al., 2008), wohingegen die ebenfalls zwitterionische PE
Kopfgruppe deutliche inhibierende Faltungseffekte zeigte (Patel und Kleinschmidt 2013,
Gessmann et al., 2014). Der pH-Wert kann aufgrund der pKs-Werte von zahlreichen
protonierbaren Aminosäureseitenketten die Ladung des OmpA sowie die Faltung und
Aggregation des OmpA beeinflussen. Die Faltungsausbeute von OmpA (pI 5,6) kann zum
Beispiel mit einer neutralen Kopfgruppe wie PC und gleichzeitiger negativer Proteinladung
durch pH 10 erhöht werden. Im Vergleich dazu ist die OmpA Faltungsausbeute bei pH 7
geringer (Surrey und Jähnig 1995).
Ein Vorteil von OmpA ist, dass es im SDS-Gel ohne vorhergehende Hitzedenaturierung in
gefaltetem Zustand bei ca. 30 kDa migriert, wohingegen das ungefaltete bei ca. 35 kDa migriert
(Schweizer et al., 1978). Dies beruht auf der kompakteren Form des gefalteten Zustandes, die
weiteres migrieren durch die Gelmatrix ermöglicht. Gleichzeitig mit dieser Gelverschiebung
kann eine nativ ausgebildete Sekundärstruktur und eine volle Funktionsfähigkeit des OmpA
gezeigt werden (siehe Schweizer et al., 1978, Vogel und Jähnig 1986, Surrey und Jähnig 1992,
Rodionova et al., 1995, Kleinschmidt und Tamm 1996, Kleinschmidt, den Blaauwen et al.,
1999, Arora et al., 2000). Dies stellt eine einfache Methode zur Überprüfung der erfolgreichen
Faltung und Insertion von OmpA und dessen Funktionalität ähnlich der nativen Form dar.
Andere OMPs wie z.B. FomA und FhuA zeigen ähnliche Gelverschiebungen im gefalteten
Zustand, bezeichnet als „heat modifiability“ (Schweizer et al., 1978, Kleinschmidt 2006,
Hagan et al., 2013, Noinaj et al., 2015).

1.1.2 Faltungsmechanismus – Schrittweise Faltung und Insertion

Einhergehend mit der erfolgreichen spontanen Rückfaltung von Proteinen in
Modellmembranen in vitro kam die Frage nach dem dahinterstehenden Faltungsmechanismus
auf. Bei α-Helicalen Membranproteinen bestehend aus mehreren α-Helices (helical bundle),
 8

wird ein zweistufiger Faltungsmechanismus vermutet. Dabei falten und inserieren die einzelnen
hydrophoben Helices autonom in die Membran und erst danach interagieren die einzelnen
Helices lateral miteinander und bilden die Tertiärstruktur des Proteins aus (Popot et al., 1987,
Popot und Engelman 1990). Solch ein Mechanismus erscheint für β-Fass TMP nicht möglich,
da die einzelnen β-Stränge durch die alternierende Abfolge der hydrophoben und polaren
Aminosäurereste amphipathisch sind. Diese Eigenschaft und die Notwendigkeit der Bildung
von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den polaren Amid- und Carbonylgruppen der
Polypeptidkette innerhalb der hydrophoben Region der Membran schließen die
Membraninsertion einzelner β-Stränge aus (Kleinschmidt 2015). In den letzten Jahrzenten
erfolgten einige Faltungsstudien die den Faltungs- und Insertionsmechanismus von β-Fass
OMPs untersuchten. Neben einem einzigen, in einigen Fällen aus mehreren Schritten
bestehenden Faltungsprozess (Kleinschmidt und Tamm 1996, Huysmans et al., 2012) zeigten
unter bestimmten experimentellen Bedingungen mehrere Kinetikstudien verschiedenster OMPs
auch zwei parallele Faltungsprozesse bzw. Faltungswege (Pocanschi, Apell et al., 2006, Patel
et al., 2009, Huysmans et al., 2012). Faltungswege, die in mehreren Schritten verliefen, zeigten
dabei in den ersten Schritten membranadsorbierte Faltungsintermediate und in den
nachgeordneten Schritten die Ausbildung des β-Fasses. Die Membranadsorption erfolgte
immer sehr schnell, wohingegen die Fassausbildung sehr viel länger dauerte. Daher ist der
zweite Faltungsschritt geschwindigkeitslimitierend (siehe Kleinschmidt 2015). Der erste
Faltungsschritt kann durch die Temperatur, aber auch durch die Wahl der Phospholipide und
damit die Schichtdicke und Flexibilität der LD (Rawicz et al., 2000), sowie dem verwendeten
Phospholipidüberschuss beeinflusst werden (Kleinschmidt 2006, Pocanschi, Apell et al., 2006,
Huysmans et al., 2012). Studien mit kleinen unilamellaren Vesikeln aus Phospholipiden mit
einer langen Kettenlänge von 18 Kohlenstoffatomen (diC18:1PC) zeigten einen genaueren
Einblick in den Insertionsmechanismus von OmpA. Mittels Quenching von
Tryptophanfluoreszenz durch an die Lipide gebundenes Brom konnte die Lokalisation der
Tryptophanreste der Einzeltryptophanmutanten (ETM) des OmpA bestimmt werden. Die ETM
besaßen jeweils ein Tryptophan an den nativen Tryptophanpositionen W7, W15, W57, W102
oder W143 die bis auf W7 alle im extrazellulären aromatischen Gürtel liegen (Abbildung 2 A).
Dabei zeigte sich zunächst eine membranadsorbierte Form bei 2 °C, die für ca. eine Stunde
stabil war. Die Tryptophanreste lagen hier 15-16 Å vom Zentrum der LD entfernt. Bei
schrittweiser Temperaturerhöhung konnte eine synchrone Translokalisation der verschiedenen
Tryptophanreste (außer W7) über die LD beobachtet werden (Abbildung 3). Dabei zeigten sich
Entfernungen zum LD-Zentrum von zunächst 10-12 Å bis hin zu 0-7 Å. Nach erfolgreicher

 9

Faltung lagen die Reste 9-10 Å vom LD-Zentrum entfernt. Bei dem Tryptophanrest W7 konnte
entsprechend seiner Position im periplasmatischen aromatischen Gürtel keine Translokalisation
über die Membran beobachtet werden, sondern ein konstanter Abstand von 10-11 Å zum
Zentrum der LD (Kleinschmidt und Tamm 1999). In weiteren Studien konnte ebenfalls eine β-
Strang Assoziation während des Insertionsprozesses innerhalb der LD gezeigt werden
(Kleinschmidt et al., 2011). Für ein weiteres E. coli OMP, PagP (PhoPQ-activated gene P),
konnte ebenso ein membranadsorbierter Übergangszustand (transition state) beobachtet
werden, der relativ zur Membransenkrechten in einem Winkel geneigt ist, und zu einer
sogenannten tilted insertion führt (Huysmans et al., 2010). Insgesamt deuten die Daten
entsprechend Abbildung 3 auf eine synchrone Translokalisation der β-Stränge mit
gleichzeitiger β-Fass Ausbildung hin. Diese Insertion könnte dabei, wie für PagP beobachtet,
über einen geneigten Übergangszustand stattfinden.
Ob dieser Faltungsmechanismus auch für größere OMPs zutrifft und inwiefern sich der
Mechanismus durch Anwesenheit einer Insertionsmaschinerie ändert ist bislang unklar und
wird zahlreich diskutiert. Der hohe Anteil an PE, der in vitro auch in kleinerem Anteil (30 %)
stark inhibierend auf die spontane Faltung und Insertion von OMPs wirkt (Patel et al., 2009),
zeigt aber bereits die Notwendigkeit einer Insertionsmaschinerie in Gram negativen Bakterien.

Abbildung 3: Modell zur spontanen Faltung und Insertion von OmpA. Nach einer zunächst
membranadsorbierten Form (links) erfolgt eine schrittweise synchrone Insertion der bereits
ausgebildeten β-Stränge in die Membran bis hin zum vollständig ausgebildeten β-Fass (rechts)
(entnommen aus Kleinschmidt 2003).

1.2 Der BAM Komplex

In der IM von Gram negativen Bakterien sind bislang zwei Insertionsmaschinerien (Sec und
YidC) bekannt, von denen Homologe in zahlreichen Organismen existieren (siehe Tsukazaki
2019). In der OM hingegen ist bislang nur ein Komplex, der BAM Komplex, bekannt (Wu et

 10

al., 2005). Aber auch hier existieren homologe Komplexe in anderen Organellen wie
Chloroplasten (TOC-Komplex) (Schleiff und Soll 2005) und Mitochondrien (SAM-Komplex)
(Kozjak et al., 2003, Paschen et al., 2003). Diese Maschinerien zum Einbau von OMPs in die
OM von Gram negativen Bakterien, Chloroplasten und Mitochondrien bestehen alle aus einem
TMP aus der Omp85 Familie und meistens mehreren Lipoproteinen. In E. coli besteht der BAM
Komplex aus BamA und den vier Lipoproteinen BamB bis BamE, die direkt oder indirekt an
BamA binden (Wu et al., 2005, Kim et al., 2007, Sklar et al., 2007a). Der Komplex weist in E.
coli ein Molekulargewicht von ca. 208 kDa auf (Abbildung 4) (Ruiz et al., 2005, Bakelar et al.,
2016b, Gu et al., 2016, Han et al., 2016).

 A B

 ~90°

Abbildung 4: Kristallstruktur des E. coli BAM Komplexes. Der BAM Komplex bestehend
aus BamA (grau), BamB (gelb), BamC (rot), BamD (grün) und BamE (blau) in Frontansicht
(A) und um 90 ° gedreht (B), sodass das BamA β-Fass von der periplasmatischen Seite
einsehbar ist und die Ringstruktur die von den POTRA (polypeptide transport associated)
Domänen und den Lipoproteinen um das BamA β-Fass gebildet wird sichtbar ist (PDB Struktur:
5d0O, Gu et al., 2016).

1.2.1 Die Hauptkomponente des BAM Komplexes: BamA

BamA auch bekannt als YaeT (E. coli) (Doerrler und Raetz 2005) oder Omp85 (Neisseria
meningitides) (Voulhoux et al., 2003), gehört zur Omp85 Familie die essentiell ist für die
Proteinbiogenese (Wu et al., 2005). Proteine der Omp85 Familie sind evolutionär konserviert
und kommen neben Bakterien auch in Mitochondrien als Sam50 (Kozjak et al., 2003, Kutik et
al., 2008)/ Tob55 (Paschen et al., 2003) und in Chloroplasten als Toc75 (Moslavac et al., 2005)
vor. Charakteristisch sind die Proteine der Omp85 Familie aus einer C-terminalen β-Fass

 11

Domäne mit 16 antiparallel angeordneten β-Strängen (Albrecht et al., 2014) und N-Terminal
gelegenen POTRA (polypeptide transport associated) Domänen (Kim et al., 2007) in
unterschiedlicher Anzahl aufgebaut. Sam50 besitzt eine POTRA Domäne, Toc75-V drei und
BamA aus E. coli fünf (siehe Knowles et al., 2009). Die POTRA Domänen bestehen aus den
Sekundärstrukturelementen β-α-α-β-β (Kim et al., 2007, Gatzeva-Topalova et al., 2008). Die
im Periplasma gelegenen POTRA Domänen des BamA weisen in unterschiedlichen
Kristallstrukturen unterschiedliche Konformationen auf. Dabei zeigen die POTRA Domänen
zum einen eine „geschlossene“ und eine „offene“ Konformation (Abbildung 5 B). In der
„geschlossenen“ Konformation verschließen die POTRA Domänen durch ihre Position das β-
Fass von der periplasmatischen Seite. Zudem interagiert die POTRA Domäne 5, die am
nächsten am β-Fass liegt, mit mehreren periplasmatischen Schleifen des BamA β-Fasses. Nach
einer Drehung der POTRA Domänen, erscheint das β-Fass vom Periplasma her zugänglich,
sodass dies als „offene“ Konformation beschrieben wird. Weiterhin zeigen sich in dieser
Konformation keine Interaktionen zwischen POTRA 5 und den periplasmatischen Schleifen
(Noinaj et al., 2013, Bakelar et al., 2016b, Gu et al., 2016). Diese zwei Zustände werden als
möglicher Regulationsmechanismus für den Substratzugang zum BamA β-Fass angesehen.
Weiterhin wird den POTRA Domänen eine wichtige Rolle in der Proteinassemblierung
aufgrund von Interaktionen mit zum Beispiel der Chaperone SurA zugesprochen (Sklar et al.,
2007b, Knowles et al., 2008, Bennion et al., 2010).
Auch bei der 16-strängigen β-Fass Domäne des BamA sind zwei unterschiedliche
Konformationszustände bekannt (Abbildung 5 A). Genauso wie bei den POTRA Domänen
zeigte sich eine „offene“ und eine „geschlossene“ Konformation des β-Fasses (Abbildung 5)
(Bakelar et al., 2016b, Gu et al., 2016). Durch eine Verschiebung der N-terminalen β-Stränge
ist die Anzahl der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem ersten und letzten β-Strang
verringert und das β-Fass erscheint geöffnet. Ob die laterale Öffnung des BamA β-Fasses
notwendig für die Faltung und Insertion von OMPs ist, ist derzeit umstritten. Eine Studie in der
das BamA β-Fass mittels disulfide cross-linking verschlossen wurde, zeigte eine letale Wirkung
(Noinaj et al., 2014). Andere Studien hingegen, bei denen ebenfalls mittels disulfide cross-
linking das β-Fass geschlossen gehalten wurde, zeigten keine Veränderung der BamA
bedingten Faltungs- und Insertionseffizienz bei kleinen OMPs wie OmpX und tOmpA (8 β-
Stränge) (Doerner und Sousa 2017, Schiffrin et al., 2017). Daher wird eine β-Fass Öffnung nur
bei Faltung und Insertion von größeren OMPs vermutet. Ob diese Öffnung dann zur
Translokalisation der extrazellulären Schleifen des OMP oder aber zur Faltung und Insertion
der β-Stränge dient, ist unklar.

 12

Neben der destabilisierten Bindung des ersten und letzten β-Stranges, zeigen die
Kristallstrukturen von BamA eine asymmetrische Form des β-Fasses. Die Fassregion um das
C-terminale Ende weist eine geringere Höhe auf, als die gegenüberliegende Seite (Abbildung
4 A, 5 A). Gleichzeitig konnte eine verringerte Schichtdicke der umliegenden Membran in der
Region des C-terminalen Endes bestimmt werden (Noinaj et al., 2013, Sinnige et al., 2014).
Die Hauptfunktion des BamAs könnte daher darin liegen die Aktivierungsenergie zur Faltung
von OMPs durch Verjüngung der LD Schichtdicke herabzusetzen.

 A B

 P5 “geschlossen”
 P5 “offen”

 P5 “geschlossen”

 P5 “offen”

Abbildung 5: BamA β-Fass zeigt unterschiedliche Konformationszustände. Gezeigt sind
die unterschiedlichen Konformationszustände des β-Fasses (A) und der POTRA Domäne 5 (B).
Die PDB Struktur 4C4V (Albrecht et al., 2014) in blau dargestellt und die PDB Struktur 5EKQ
(Bakelar et al., 2016a) in grün. Während die Struktur in grün dargestellt ein geöffnetes β-Fass
zeigt, ist gleichzeitig eine Bewegung der POTRA 5 vor die periplasmatische Öffnung des β-
Fasses zu beobachten wodurch sich ein zum Periplasma geschlossenes β-Fass zeigt. Die
Struktur in blau zeigt genau die gegenteiligen Zustände (entnommen aus Bakelar et al., 2016b).

1.2.2 Lipoproteine des BAM Komplexes

Die vier Lipoproteine des E. coli BAM Komplexes binden direkt oder indirekt an die POTRA
Domänen des BamA. BamC (NlpB) und BamE (SmpA) bilden mit BamD (YfiO) einen
Subkomplex und sind nur indirekt über BamD an BamA gebunden. BamB (YfgL) bindet
unabhängig von diesem Subkomplex an BamA (Abbildung 4) (Wu et al., 2005, Hagan et al.,
 13

2010). BamB-BamE zählen genauer zu den Lipidanker Proteinen, sodass sie mittels N-
terminalem Lipidanker in die innere Schicht der OM verankert sind (Sankaran und Wu 1994).
Zwar sind nur BamA und BamD essentiell (Malinverni et al., 2006, Kim et al., 2007), jedoch
arbeitet der BAM Komplex nur in Anwesenheit aller Bam-Lipoproteine am effektivsten (Wu
et al., 2005, Charlson et al., 2006, Sklar et al., 2007a). BamB ist mit 41,9 kDa das größte
Lipoprotein des BAM Komplexes. Es bildet mit acht Blättern, bestehend aus je vier antiparallel
angeordneten β-Strängen, eine propellerartige Struktur (Heuck et al., 2011). BamB bindet an
BamA POTRA 2 – 5 (Kim et al., 2007, Chen et al., 2016) und zeigt zu BamD überlappende
Funktionen (Heuck et al., 2011). BamB sowie BamD spielen eine wichtige Rolle in der BamA
Faltung (Tellez und Misra 2012). Ebenso trägt BamB zur effizienten Faltung und Insertion
verschiedener OMPs bei (Ureta et al., 2007, Palomino et al., 2011). BamC (36,8 kDa) zeigt
zwei definierte Helix-Griff Domänen (helix-grip), die als Protein-Protein Interaktionsstellen
dienen könnten (Warner et al., 2011). Zusammen mit BamE spielt es eine Rolle in Dynamik
und Funktion von BamA durch die Stabilisierung der BamA-BamD Verbindung (Malinverni
et al., 2006, Rigel et al., 2012). Das an POTRA 5 bindende (Kim et al., 2007) essentielle
Lipoprotein BamD (27,2 kDa) ist aus 10 α-Helices aufgebaut, die wiederum in fünf
tetratricopeptide repeat (TPR) unterteilt werden können. Ein TPR Motiv besteht aus zwei
benachbarten α-Helices, die durch eine Schleife verbunden sind. Das Motiv ist bekannt als
Protein-Protein Interaktionsstelle und besitzt zudem mehrere Furchen für die Bindung von
Liganden (Albrecht und Zeth 2011, Sandoval et al., 2011, Dong et al., 2012). BamD dient daher
wahrscheinlich als OMP Rezeptor. Das sogenannte β-Signal, eine C-terminale Peptidsequenz
die bei allen OMPs in Prokaryoten und Eukaryoten vorkommt (siehe Ricci und Silhavy 2019),
dient dabei als Erkennungssequenz für BamD (Hagan et al., 2015). BamD erkennt und bindet
neben anderen OMPs auch ungefaltetes BamA an dessen β-Signalsequenz und beeinflusst
Bindung und Lokalisation der OMPs in der OM (Hagan et al., 2015, Ricci und Silhavy 2019).
Im gebildeten BAM Komplex induziert BamD eine BamA Konformationsänderung, die die
Faltung und Insertion von OMPs erleichtert (McCabe et al., 2017, Lee et al., 2018). Das kleinste
Lipoprotein des BAM Komplexes, BamE (12,3 kDa) ist aus zwei N-Terminal gelegenen α-
Helices und einem C-Terminal gelegenen β-Faltblatt bestehend aus drei antiparallel
angeordneten β-Strängen aufgebaut (Kim et al., 2011). Neben der stabilisierenden Wirkung auf
die BamA-BamD Bindung ist außerdem bekannt, dass es PG bindet (Knowles et al., 2011).

 14

1.3 Modelle zum BamA-abhängigen Faltungsmechanismus von OMPs

Für die BamA katalysierte Faltung und Insertion von OMPs gibt es mehrere Modelle, die
hauptsächlich versuchen, die Frage der Translokation und Faltung der β-Stränge der OMPs zu
beantworten. Die als das ‚budding model‘ bekannte Theorie erklärt diese Vorgänge zum
Beispiel so, dass sich das BamA β-Fass öffnet und die β-Stränge 1 und 16 als
Ausgangspunkt/Vorlage für die Bildung von β-Strängen des OMP dienen. Daraufhin wird das
BamA β-Fass durch die OMP β-Stränge erweitert und es entsteht ein hybrid BamA-OMP Fass.
Nachdem alle β-Stränge des OMP β-Fasses ausgebildet sind wird das Fass von BamA in die
OM abgestoßen und das OMP ist in die Membran inseriert (Abbildung 6 C) (Noinaj et al.,
2014). Ein weiteres Modell besagt, dass eine Bindung des N-terminalen Endes des OMP an die
BamA β-Fass Öffnung entsteht während sich die OMP-β-Stränge im Inneren des BamA β-
Fasses bilden. Dabei wirkt das innere des BamA β-Fasses durch Bindung einzelner OMP β-
Stränge unterstützend. Eine Paarung des N-terminalen Endes mit dem C-terminalen Ende des
OMP schließt getrieben durch OMP Schleifeninteraktionen das β-Fass (Abbildung 6 B)
(Albrecht et al., 2014, Lee et al., 2019). Bei Toc75, das BamA Homolog aus der Omp85 Familie
aus Chloroplasten wird ebenfalls eine β-Fass Öffnung vermutet (Ganesan und Theg 2019).
Weiterhin gibt es das sogenannte ‚assisted model‘. In dieser Theorie ist das BamA lediglich
passiv beteiligt. Die Schichtdicke der OM ist am C-terminalen Ende des BamAs (β-Fass
Öffnung) deutlich verringert (Sinnige et al., 2014), sodass dadurch die Aktivierungsenergie zur
Faltung und Insertion von OMPs in die OM herabgesetzt sein könnte. Die OMPs falten und
inserieren dabei getrieben durch thermodynamische Prozesse selbstständig (ΔG° < 0, spontane
Faltung) in die OM (Abbildung 6 A) (Noinaj et al., 2013, Patel und Kleinschmidt 2013,
Gessmann et al., 2014, Sinnige et al., 2014) so wie dies für die Faltung von verschiedenen
OMPs wie OmpA oder PagP in Abwesenheit von BamA für Modellmembranen experimentell
vielfach bestätigt wurde (siehe Kleinschmidt 2015). Unterstützt wird dieses Modell durch
experimentelle Studien zur Funktion des BAM-Komplexes bei der Faltung des 26-strängigen
β-Fasses LptD, des LPS-Transporters (Lee et al., 2016). Für Sam50, der Hauptkomponente des
SAM Komplexes aus Mitochondrien, wurden die gleichen Modelle für den Sam50-abhängigen
OMP Faltungsmechanismus postuliert, wie hier für BamA vorgestellt (Hohr et al., 2015, Hohr
et al., 2018).

 15

Abbildung 6: Modelle der BamA-abhängigen Faltung und Insertion von β-Fass OMPs.
(A) Die Sekundärstrukturausbildung des Prä-OMP erfolgt an der Membran. Die Insertion
erfolgt durch die BamA induzierte geringere Schichtdicke der Membran („assisted model“).
Durch die geringer Schichtdicke, wird die Aktivierungsenergie herabgesetzt und es kommt zu
einer spontanen Faltung. (B) Die Sekundärstrukturausbildung erfolgt innerhalb des BamA β-
Fasses und die Insertion in die Membran wird durch die laterale BamA β-Fass Öffnung
möglich. (C) Mit dem ersten und letzten β-Strang des BamA β-Fasses als Vorlage werden die
β-Stränge des Prä-OMP ausgebildet, wodurch ein hybrid β-Fass entsteht. Nach vollständiger
Ausbildung der β-Fass Struktur wird das OMP lateral in die Membran entlassen („budding
model“).

1.4 Motivation und Ziel der Arbeit

OMPs sind der erste Kommunikationspunkt zwischen Zellen und deren Umgebung. Sie können
als Kontaktpunkte z.B. in medizinischen Fragestellungen (Entwicklung neuer Antibiotika) eine
bedeutende Rolle spielen. Das Verständnis des Mechanismus der Faltung und Insertion in die
OM ist daher von zentraler Bedeutung, aber bislang ist nur sehr wenig darüber bekannt. In vitro
kann eine spontane Faltung von E. coli OMPs in Modellmembranen beobachtet werden und
verschiedene Studien geben Hinweise auf den dahinterstehenden Faltungs- und
Insertionsmechanismus. In E. coli ist der BAM Komplex involviert in die Proteinbiogenese.
Ob und wie sich der Faltungsmechanismus von OMPs in Anwesenheit des BAM Komplexes
im Vergleich zur spontanen Faltung in Abwesenheit des BAM Komplexes in vitro verändert
wird rege diskutiert, konnte aber noch nicht experimentell aufgeklärt werden. Bisher
durchgeführte Studien dazu nutzten Methoden wie disulfide cross-linking, wodurch eine
Interaktion zwischen BamA und einem Klienten-OMP erzwungen wird.

 16

In dieser Arbeit wird dazu ein komplett neuer Ansatz zur Untersuchung des
Faltungsmechanismus von Membranproteinen des β-Fass Typs vorgestellt. Dieser besteht aus
einer Kombination von molekularbiologischen und biophysikalischen Verfahren mit der
Konzeption und Erprobung neuer Modellmembranen für Faltungsstudien. Die spezifischen
Ziele waren:
1. Die Etablierung eines Systems, indem BamA Wechselwirkungen mit entfalteten OMPs
untersucht werden können ohne massiv in die Interaktionen einzugreifen, so wie dies z.B. durch
chemische Reaktionen (z.B. disulfide cross-linking) der Fall ist. Für die lokale Untersuchung
von Konformationsänderungen in Proteinen oder Untersuchungen (auch des zeitlichen
Verlaufs) von lokalen Protein-Protein-Wechselwirkungen bieten sich hoch sensitive
fluoreszenzspektroskopische Verfahren in Kombination mit ortsgerichteter Mutagenese an.
Diese Technik erlaubt sowohl das Studium lokaler Änderungen in der Umgebung des
Fluorophors im Protein als auch die lokale Untersuchung von intermolekularen
Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Proteinen, wie z.B. zwischen BamA und einem
(ungefalteten oder teilgefalteten) Klienten-OMP. Mit geeigneten Paaren von Fluorophoren
lassen sich auch Abstandsmessungen durch Messung des Fluoreszenz-
Resonanzenergietransfers durchführen. Die Fluoreszenzmarker (meist kommerziell erhältliche
Fluoreszenzlabel) lassen sich z.B. durch proteinchemische Reaktionen kovalent z.B. an die
Sulfhydrylgruppe einer Einzelcysteinmutante des Proteins koppeln. Auch kann die intrinsische
Fluoreszenz der Aminosäure Tryptophan ausgenutzt werden, wozu ETM des Proteins
präpariert werden müssen. Für diese Arten von ortsgerichteter Fluoreszenzspektroskopie muss
zunächst getestet werden, ob es möglich ist, die natürlich vorhandenen zwei Cystein- bzw. 13
Tryptophanreste im E. coli BamA konservativ, d. h. ohne Verlust der Funktion des BamA,
gegen möglichst ähnliche Aminosäuren auszutauschen. Die Trp- und Cys- freie Mutante des
BamAs kann dann als Ausgangsplattform verwendet werden, um fluoreszenzspektroskopisch
nutzbare Punktmutanten zu präparieren.

2. Neben dieser BamA Mutante soll ein Modellmembransystem, aufgebaut aus
Dilauroylphospholipiden (12 Kohlenstoffatomen) mit verschiedenen Kopfgruppen, entwickelt
werden. In solche dünnen und flexiblen Modellmembranen falten und inserieren
erfahrungsgemäß viele verschiedene OMPs, wahrscheinlich weil die hydrophobe Schichtdicke
am ehesten der hydrophoben Transmembranregion vieler OMPs entspricht. Bislang gelang es
aber nicht Faltungsintermediate in solch einer Membran zu stabilisieren und zu analysieren.
Dieses System soll durch geeignete Auswahl von Lipiden und physikalischen Bedingungen

 17

eine Verringerung der Faltungsreaktionsgeschwindigkeit von OMPs in Ab- und Anwesenheit
von BamA gewährleisten, bei gleichzeitiger Stabilisierung von OMP Faltungsintermediaten,
die dann analysiert werden können.

3. Mit Hilfe der in den Meilensteinen 1 und 2 entwickelten Verfahren sollen schließlich die
BamA-abhängige OMP-Faltung und der Membraneinbau anhand von Faltungsintermediaten,
hier am Beispiel von OmpA, analysiert werden, um eine Aufklärung des Faltungsmechanismus
in Anwesenheit von BamA zu erreichen. Dabei werden OmpA ETM des OmpA verwendet, die
an verschiedenen Positionen im Protein wie z.B. in β-Fasssträngen und extrazellulären
Schleifen einen Tryptophanrest aufweisen. Damit soll eine ortspezifische
fluoreszenzspektroskopische Analyse der Faltung und Insertion in Abhängigkeit von BamA
erfolgen.

 18

2. Materialien und Methoden
2.1 Materialien

Alle nicht extra aufgeführten Materialien wurden von den Firmen Carl Roth (Karlsruhe,
Deutschland) und Sarstedt (Nümbrecht, Deutschland) bezogen.

2.1.1 Bakterienstämme

Escherichia coli:
- BL21(DE3) omp8 fhuA
[F ̄, ompT hsdSB (rB− mB−) gal dcm (DE3) ΔlamB ompF:: Tn5 ΔompA ΔompC ΔfhuA]

- XL10-Gold
TetR D(mcrA)183 D(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac
Hte [F´ proAB lacIqZDM15 Tn10 (TetR) Amy CamR]

2.1.2 Oligonukleotide

Die Oligonukleotide wurden mittels der Software SnapGene (GSL Biotech LLC, San Diego,
USA) designt und von Eurofins Scientific (Luxemburg, Luxemburg) bezogen.
Tabelle 1: Liste der Oligonukleotide die zur Sequenzierung oder Mutagenese
(Restriktionssequenz in fett gedruckt) der OmpA Mutanten verwendet wurden.

 Beschreibung Sequenz
 T7_pET22b fw 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'
 (Sequenzierung)
 pET-RP_pET22b rev 5'-CTAGTTATTGCTCAGCGG-3'
 (Sequenzierung)
 OmpA W7 NdeI fw 5'-CACATATGGCTCCGAAAGATAACACCTGGTAC-3'
 OmpA F7 NdeI fw 5'-CACATATGGCTCCGAAAGATAACACCTTCTAC-3'
 OmpA XhoI rev 5'-CTGCTCGAGTTAAGCCTGCGGCTGAGTTACA-3'

 19

2.1.3 Plasmide

Alle verwendeten Vektoren enthalten zur Selektion einen Genabschnitt für die
Ampicillinresistenz.

Tabelle 2: Aufgelistet sind die verwendeten Plasmide unter Angabe der Vektoren, eingefügter
Genabschnitt, sonstige Informationen und die Bezugsquelle. (SS = Signalsequenz)

 Vektor eingefügtes Gen Information Bezugsquelle
 pET22b(+) C-terminaler His-Tag Novagen
 pJET blunt ends Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA
 pET15b bamA - SS + N-terminaler His-Tag pET15_EcOMP85 (Patel und
 Kleinschmidt 2013)
 pET15b bamA WaF CaA - SS + N-terminaler His-Tag Trenzyme GmbH, Konstanz,
 WaF CaA Deutschland
 pET22b ompA wt - SS Sonja Braun 2013
 pET22b ompA WaF CaA - SS WaF CaA pET22b185 (Qu et al., 2009)
 pJET ompA W7 - SS WaF diese Arbeit
 pET22b ompA W7 - SS WaF diese Arbeit, Sonja Kasten
 pJET ompA W15 - SS WaF diese Arbeit
 pET22b ompA W15 - SS WaF diese Arbeit, Sonja Kasten
 pJET ompA W102 - SS WaF diese Arbeit
 pET22b ompA W102 - SS WaF diese Arbeit, Sonja Kasten
 pJET ompA W143 - SS WaF diese Arbeit
 pET22b ompA W143 - SS WaF diese Arbeit, Sonja Kasten
 pET22b ompA I24W - SS WaF CaA pET24 (Qu et al., 2009)
 pET22b ompA V67W - SS WaF CaA pET67 (Qu et al., 2009)
 pET22b ompA V110W - SS WaF CaA pET110 (Qu et al., 2009)
 pET22b ompA I153W - SS WaF CaA pET153 (Qu et al., 2009)
 pTRC99A ompA W7 + SS WaF pET1102
 (Kleinschmidt, den Blaauwen et al.,
 1999)
 pTRC99A ompA W15 + SS WaF pET1115
 (Kleinschmidt, den Blaauwen et al.,
 1999)
 pTRC99A ompA W102 + SS WaF pET186
 (Kleinschmidt, den Blaauwen et al.,
 1999)
 pTRC99A ompA W143 + SS WaF pET1103
 (Kleinschmidt, den Blaauwen et al.,
 1999)

 20

2.2 Methoden

2.2.1 Homologie Sequenzvergleich

Um konservierte Aminosäuren in der BamA Proteinsequenz aus E. coli im Vergleich zu BamA
Homologen anderer Gram negativer Bakterien (siehe Tabelle 3) zu bestimmen wurden die
Proteinsequenzen mittels SnapGene (GSL Biotech LLC, San Diego, USA) über das Clustal
Omega Sequenzvergleichsprogramm abgeglichen. BamA aus E. coli wurde als
Vergleichssequenz genutzt und eine Grenzschwelle von 50 % angewendet.

Tabelle 3: Gram negative Bakterienarten die für den Homologie Sequenzvergleich der BamA
Homologe verwendet wurden. Aufgelistet ist die Bakterienart, Abteilung, Klasse, Familie und
der NCBI Code das BamA Homolog aus der Bakterienart.
 uniprot, NCBI
 Bakterienart Abteilung Klasse Familie Datenbank
 Escherichia coli Proteobacteria Gammaproteobacteria Enterobacteriaceae P0A940

 Shigella flexneri Proteobacteria Gammaproteobacteria Enterobacteriaceae P0A943

 Salmonella typhimurium Proteobacteria Gammaproteobacteria Enterobacteriaceae Q8ZRP0

 Legionella longbeachae Proteobacteria Gammaproteobacteria Legionellaceae D3HKZ9

 Stenotrophomonas Proteobacteria Gammaproteobacteria Xanthomonadaceae B8L348

 Pseudomonas aeruginosa Proteobacteria Gammaproteobacteria Pseudomonadaceae Q9HXY4

 Helicobacter pylori Proteobacteria Epsilonproteobacteria Helicobacteraceae O25369

 Neisseria gonorrhoeae Proteobacteria Betaproteobacteria Neisseriaceae P95359

 Neisseria meningitidis Proteobacteria Betaproteobacteria Neisseriaceae Q9K1H0

 Caulobacter vibrioides Proteobacteria Alphabroteobacteria Caulobacteraceae Q9A711

 Borrelia turcica Spirochaetae Spirochaetes Spirochaetaceae A0A386PMY4

 Pirellula sp. Planctomycea Planctomycea Planctomyceaceae A0A142XW14

 Chlamydia pneumoniae Chlamydiae Chlamydiaceae Chlamydiaceae A0A0F7X3D0

2.2.2 Gezielte Punkt-Mutagenese

Die gezielte Insertion, Deletion oder Substitution einzelner Basenpaare innerhalb einer
Plasmid-DNA-Sequenz dient zur Änderung der Aminosäuresequenz oder zum Verschieben des
Leserahmens. Hier wurde das QuikChange XL Site-Directed Mutagenese Kit (Agilent
Technologies, Santa Clara, USA) genutzt um Einzelcystein- oder Einzeltryptophanmutanten

 21

für Protein-Protein und Protein-Lipid Interaktionsstudien herzustellen. Die Mutagenese und
anschließende Transformation in XL10-Gold ultrakompetente Zellen wurde nach
Herstellerangaben des QuikChange XL Site-Directed Mutagenese Kit durchgeführt. Eine
Änderung war das verwenden der PfuUltra Polymerase (Thermo Fisher Scientific, Waltham,
USA) anstatt der im Kit verwendeten PfuTurbo Polymerase. Die PfuUltra weist einen dreifach
niedrigeren mittleren Fehler auf als die PfuTurbo. Die Mutation wurde mit Hilfe von Nukleotid
Sequenzierung überprüft (Eurofins Scientific, Luxemburg, Luxemburg). Alle verwendeten
Oligonukleotide sind in Tabelle 1 aufgeführt.

2.2.3 Mutagenese zur Deletion der Signalsequenz von OmpA

Die Signalsequenz von OmpA ist 20 Aminosäuren lang und führt nach erfolgter Translation
zum Transport hin zur OM. Die Expression und Isolation von OMPs aus der OM führt meist
zu kleinen und verunreinigten Mengen. Die Expression und Isolation aus cytosolischen
Einschlusskörpern (inclusion bodies) hingegen führt zu größeren und reineren Mengen (siehe
Übersichtsartikel dazu (Popot 2014). Für diese Art der Reinigung muss die Signalsequenz
deletiert werden, damit das Protein im Cytoplasma verbleibt. Die ETM von OmpA (W7, W15,
W102 und W143) von (Kleinschmidt, den Blaauwen et al., 1999) lagen im Vektor pTRC99A
mit Signalsequenz vor. Daher wurden sie ohne Signalsequenz in den Expressionsvektor
pET22b(+) kloniert. Dies wurde über eine PCR (polymerase chain reaction) mit synthetischen
Oligonukleotiden erreicht, die die OmpA-Sequenz ohne Signalsequenz flankierten und jeweils
eine unterschiedliche Restriktionsschnittstelle enthielten. Für das vorwärts gerichtete
Oligonukleotid wurde die NdeI Schnittstelle gewählt und für das rückwärtsgerichtete die XhoI
Schnittstelle (Tabelle 1). Nach der Amplifikation mittels PCR wurde das DNA-Fragment in
den pJET Vektor ligiert (nach Herstellerangaben, CloneJET PCR Cloning Kit, Thermo Fischer
Scientific, Waltham, USA). Bei dem Vektor handelt es sich um einen blunt-end („glattes
Ende“) Vektor, wodurch das PCR-Produkt ohne Restriktionsverdau ligiert werden kann. Nach
der Hitzeschock-Transformation in XL10-Gold ultrakompetente Zellen, konnte die via
MiniPrep (Thermo Fischer Scientific, Waltham, USA) isolierte DNA mit NdeI und XhoI
(Thermo Fischer Scientific, Waltham, USA) verdaut werden. Der Restriktionsverdau wurde
anhand eines Agarosegels überprüft, die DNA daraus ausgeschnitten und mit Hilfe des
Gelextraction Kits (Quiagen, Hilden, Deutschland) gereinigt. Danach erfolgte die Ligation in
den NdeI/XhoI verdauten pET22b Vektor und die Hitzeschock Transformation in XL10-Gold
Bakterien (T4 Ligase, Thermo Fischer Scientific, Waltham, USA). Insofern die Sequenzierung
eine erfolgreiche Mutagenese zeigte, wurde das Plasmid in die Expressionszellen BL21(DE3)
omp8 fhuA mittels Hitzeschock transformiert.
 22

2.2.4 Expression und Reinigung von BamA und OmpA

Die Expression und Reinigung des wildtyp BamA (wt-BamA) und der Mutante WaF, CaA-
BamA (siehe Tabelle 2) erfolgte entsprechend des Expressions- und Reinigungsprotokolls aus
2013 (Patel und Kleinschmidt 2013). Die Anionenaustauschchromatographie wurde mit einer
Q-Sepharose Säule unter Verwendung einer ÄKTAprime plus (GE Healthcare Life Sciences,
Freiburg) oder NGC (Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Deutschland) durchgeführt.
Lediglich der NaCl-Gradient zur Elution wurde auf 0-500 mM NaCl erhöht. Nach der Elution,
wurden die BamA-enthaltenden Fraktionen gegen 15 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan
(Tris), 8 M Harnstoff, pH 8,5 in Dialyseschläuchen (Spectrum Spectra/Por 1, MWCO 6000-
8000 Dalton, 50 mm Breite, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) dialysiert um das NaCl
zu entfernen.
Der wildtyp OmpA (wt-OmpA) und alle Mutanten wurden entsprechend des Protokolls aus
2009 (Qu et al., 2009) exprimiert und gereinigt. Die Fällung, mittels Isopropanol, während der
Isolation wurde ausgelassen, da sie keinerlei Einfluss auf die Reinheit des OmpAs zeigte. Die
Anionenaustauschchromatographie wurde mit einer Q-Sepharose Säule unter Verwendung
einer ÄKTAprime plus (GE Healthcare Life Sciences, Freiburg) oder NGC (Bio-Rad
Laboratories, Feldkirchen, Deutschland) durchgeführt. Das Ankonzentrieren der Proteine aus
den Fraktionen der Elution erfolgte mit Hilfe der Vivaspin 20 Ultrafiltration Unit (Sartorius,
Göttingen, Deutschland) Zentrifugenkonzentratoren nach Herstellerangaben bei 10 °C. Die
Konzentrationen wurden durch die Methode nach Lowry et al. aus 1951 bestimmt. Hierbei
wurde BSA (bovines serum albumin) als Standard verwendet.

2.2.5 Präparation von Lipidfilmen und großen unilamellaren Vesikeln

Für alle Faltungen wurden, neben wässerigen Lösungen von Detergensmizellen aus
Lauryldimethylaminoxid (LDAO), Phospholipide mit einer Kettenlänge von 12
Kohlenstoffatomen verwendet. Dabei wurden 1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine
(DLPC), 1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DLPE), 1,2-Dilauroyl-sn-glycero-
3-phosphoglycerol (DLPG) (Avanti Polar Lipids, Alabama, USA) in einem molaren Verhältnis
von 5:3:2 verwendet. Insgesamt wurden 10 bis 20 mg Phospholipide in braune Glasfläschchen
eingewogen und unter einem Abzug in Methanol und Chloroform (Verhältnis 1:1 (v/v)) gelöst.
Die organischen Lösungsmittel wurden unter einem Abzug mittels eines Stickstoffstroms
verblasen. Daraufhin wurden die Lipidfilme in einem Exsikkator unter Vakuum für vier
Stunden getrocknet. Zur Lagerung wurden sie unter Argon versetzt bei -20 °C gelagert.

 23

Für die Herstellung von großen unilamellaren Vesikeln (LUVs, large unilamellar vesicles)
wurde ein Lipidfilm in dem entsprechenden Puffer der geplanten Faltung durch Mischen mittels
Vortexer gelöst (auf 10 mg/ml). Danach folgten sieben Schritte von Einfrieren in flüssigem
Stickstoff (30 s) und Auftauen bei 55 °C 300 rpm im Thermoschüttler. Dabei entstehen
unilamellare Vesikel unterschiedlicher Größe. Um eine einheitliche Größe in allen
Experimenten zu gewährleisten, wurden die Vesikel mit Hilfe eines Extruders (Avanti Polar
Lipids, Alabama, USA) und einer Membran mit einer Porengröße von 100 nm (Nucleopore
Track-Etch-Membran PC, GE Whatman, Clifton, USA) auf eine einheitliche Größe von 100 nm
Durchmesser gebracht. Die LUVs wurden direkt verwendet oder bei 4 °C gelagert.

2.2.6 Faltung in LUVs und LDAO

Die Faltung der in 8 M Harnstoff denaturierten Proteine BamA und OmpA erfolgte jeweils über
die Verdünnung des Harnstoffs auf maximal 0,6 M in Anwesenheit von LUVs oder LDAO-
Mizellen.
 Faltung von BamA

Zur Faltung von BamA in LUVs (LD bestehend aus DLPC, DLPE und DLPG in einem
Verhältnis von 5:3:2, oder DLPE, DLPG in 4:1) wurde dieses in einem molaren Verhältnis
Protein zu LD von 1 zu 1000 in 10 mM Borax (Dinatriumtetraborat-Decahydrat), pH 10 bei
4 °C, 300 rpm für 48 h inkubiert. Die finale Konzentration im Faltungsansatz betrug 6,3 µM
BamA und 6,3 mM LUVs.
Zur Faltung in LDAO-Mizellen wurden 10 µM BamA in 10 mM LDAO ebenfalls in 10 mM
Borax, pH 10 bei 4°C, 300 rpm für 48 h inkubiert. Die Harnstoffkonzentration in den finalen
Faltungsansätzen betrug maximal 0,6 M.
 OmpA Faltungskinetik in Ab- und Anwesenheit von BamA

Kinetische Studien (KTSE, kinetics of tertiary structure formation by electrophoresis) zur
OmpA-Faltung in LUVs wurden unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt. Um den
Einfluss von BamA auf die OmpA-Faltung zu untersuchen, wurden Faltungskinetiken in reine
LD (DLPC, DLPE, DLPG, 5:3:2) und mit in die LD inseriertem BamA (LD⋅[BamA]) bei pH 8
(50 mM HEPES (2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure), 2 mM EDTA
(Ethylendiamintetraessigsäure)), 300 rpm und 30 °C (40 °C) parallel durchgeführt. Die finalen
Konzentrationen in den Faltungsansätzen waren 7,1 µM OmpA, 2,13 µM BamA und 2,13 mM
LUVs (LD bestehend aus DLPC, DLPE, DLPG in einem Verhältnis von 5:3:2) und maximal
0,3 M Harnstoff. Die OmpA-Faltung wurde von 2 bis 180 min in acht Zeitschritten (bei 40 °C,
1-90 min in acht Zeitschritten) aufgezeichnet. An jedem Zeitpunkt wurde eine Probe (16 µl)

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