Nachweis und genetische Analyse der cag Pathogenitätsinsel von Helicobacter pylori mit neuen, molekularbiologischen Methoden ...
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Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Nachweis und genetische Analyse der cag Pathogenitätsinsel
von Helicobacter pylori mit neuen,
molekularbiologischen Methoden
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
vorgelegt 2003
von Mareike Herbold
geboren in BruchsalDekan: Prof. Dr. med. Josef Zentner
1. Gutachter: Prof. Dr. med. Manfred Kist
2. Gutachter: Prof. Dr. med. Andreas Ochs
Jahr der Promotion 2004I Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1.1. Entdeckungsgeschichte der Helicobacter pylori-Infektion 1
1.2. Die Spezies der Gattung Helicobacter 2
1.3. Die mikrobiologischen Charakteristika von H. pylori 4
1.4. Epidemiologie der Helicobacter pylori-Infektion 4
1.5. Die H. pylori-assoziierten Erkrankungen 4
1.5.1. Die H. pylori-assoziierte Immunantwort 4
1.5.2. Die Gastritis 5
1.5.3. Das Ulkus duodeni 5
1.5.4. Das Ulkus ventriculi 6
1.5.5. Das Magenkarzinom 6
1.5.6. Das MALT-Lymphom 7
1.6. Diagnostik und Therapie 7
1.7. Pathogenitäts- und Virulenzfaktoren von Bakterien 8
1.7.1. Die Beweglichkeit 8
1.7.2. Die Adhäsine 8
1.7.3. Die Entgiftung von toxischen Sauerstoffradikalen 9
1.7.4. Die Antigen-Mimikry durch Lipopolysaccharide 9
1.7.5. Die Urease 9
1.7.6. Das Zytotoxin VacA 9
1.8. Die Bedeutung der Pathogenitätsinsel und des Cag A-Proteins 10
1.9. Ziele dieser Arbeit 15
2. Material
2.1. Verzeichnis der Bakterienstämme 17
2.2. Verzeichnis der Oligonukleotide 18
2.3. Verzeichnis der Puffer, Lösungen und Kulturmedien 23
2.3.1. Kulturmedium zur Anzucht von H. pylori 23
2.3.2. DNA-Isolierung 23
2.3.3. Agarosegelelektrophorese 23
2.3.4. Lösungen für die PCR 23
2.3.5. Restriktion von DNA 23
2.3.6. DNA-Markierung 23
2.3.7. DNA und Gel Banden Aufreinigung 24
2.3.8. Hybridisierung 24
2.3.9. DNA-Sequenzierung 24II Inhaltsverzeichnis
2.4. Chemikalienliste 25
2.4.1. Kits 25
2.4.2. Reagentien 25
3. Methoden
3.1. Kultivierung von H. pylori 26
3.2. Urease-Schnelltest 26
3.3. Polymerase-Kettenreaktion 26
3.4. Agarose-Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA 27
3.5. Aufreinigung von PCR-Produkten 27
3.6. DNA-Isolierung 28
3.7. Restriktionsenzymverdau von DNA 28
3.8. Markierung der DNA mit Digoxigenin 29
3.9. Herstellung des DNA-Makroarrays 29
3.10. Southern-Hybridisierung 30
3.11. DNA-Sequenzierung 31
4. Ergebnisse
4.1. Entwicklung eines PCR-Analysesystems für den Nachweis von Genen der
cag Pathogenitätsinsel von H. pylori 32
4.1.1. Der Aufbau der cag-PAI von H. pylori 32
4.1.2. Nachweis der cag-PAI-Gene durch PCR-Analyse 33
4.1.3. Spezifität der PCR-Analyse 33
4.1.4. PCR-Analyse der cag-PAI von H. pylori-Isolaten, die IL-8 induzieren und
H. pylori-Isolaten, die kein IL-8 induzieren 34
4.1.5. Anwendung des PCR-Analysesystems bei H. pylori-Isolaten von Ulkuspatienten 36
4.2. Entwicklung der Southern-Hybridisierungsmethode für den spezifischen Nachweis der
cag-PAI Gene in H. pylori-Isolaten 37
4.2.1. Amplifikation einzelner cag-PAI Gene mit den Primern für die PCR 37
4.2.2. Herstellung des DNA-Arrays 41
4.2.3. Spezifität der Southern-Hybridisierung 42
4.3. Nachweis der cag-PAI-Gene in klinischen H. pylori-Isolaten mit
der Southern-Hybridisierung 44
4.3.1. Nachweis der cag-PAI-Gene mit der Southern-Hybridisierung bei H. pylori-
Stämmen, die aus Patienten isoliert wurden 44
4.3.2. Nachweis der cag-PAI-Gene mit der Southern-Hybridisierung bei H. pylori-
Stämmen, die nach unterschiedlicher Passagenzahl aus Mäusen isoliert
wurden 49III Inhaltsverzeichnis
4.4. Identifizierung und Charakterisierung einer erhöhten genetischen Variabilität der
cag-PAI im Bereich des cag7-Gens 51
4.4.1. Analyse der cag-PAI in den H. pylori-Isolaten 1A, 2A, 2035C, HV89, 151 und 2047 51
4.4.2. PCR-Analyse der Region zwischen den Genen cag6 und cag8 53
4.4.3. Sequenzanalyse der Region zwischen den Genen cag6 und cag8 54
5. Diskussion
5.1. Einführung und kurze Darstellung bisheriger Erkenntnisse über die cag-PAI von H. pylori 56
5.1.1. Struktur und Funktion der cag-PAI von H. pylori 56
5.2. Das PCR-Analysesystem ist zur Detektion von Genen der cag-PAI geeignet 56
5.2.1. Etablierung des PCR-Analysensystems 56
5.3. Die Southern-Hybridisierung verbessert den Nachweis von Genen der cag-PAI 57
5.3.1. Etablierung der Southern-Hybridisierung 57
5.4. PCR-Analyse und Southern-Hybridisierung könnnen zur genetischen Typisierung der
cag-PAI eingesetzt werden. 59
5.4.1. Die genetische Zusammensetzung der cag-PAI bei H. pylori bestimmt die
Fähigkeit, IL-8 in Magenepithelzellen zu induzieren. 59
5.4.2. Die genetische Zusammensetzung der cag-PAI beeinflusst die Histopathologie
der H. pylori-Infektion 60
5.4.3. Die Insertionssequenzen der cag6/7/8 Region der H. pylori Stämme
151, 1A, 2A und 2035C 61
5.5. Virulenzwandel des H. pylori-Stammes SS1 bei längerfristiger in vivo-Kultivierung
im Mausmodell 62
6. Zusammenfassung 64
7. Anhang 65
8. Literaturverzeichnis 69
Danksagung
LebenslaufIV Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
A Adenin
Abb. Abbildung
AP Alkalische Phosphatase
Bp Basenpaare
C Cytosin
°C Grad Celsius
cag-PAI cag-Pathogenitätsinsel
CD cluster of differentiation
CFU colony forming units
CO Kohlenmonoxid
CO2 Kohlendioxid
Del Deletion
dH2O destilliertes Wasser
ddH2O bidestilliertes Wasser
DIG Digoxigenin
dNTP desoxygenierte Nukleosidtriphosphate
dUTP desoxygeniertes Uridintriphosphat
DNA Desoxyribonukleinsäure
dsDNA DoppelstrangDNA
E. coli Escherichia coli
ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
G Guanin
GTP Guanintriphosphat
HCL Salzsäure
HE Hämatoxylin/ Eosin
HP Helicobacter pylori
H. pylori Helicobacter pylori
Hsp Hitzeschockprotein
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
LPS Lipopolysaccharide
INS Insertion
IS Insertionssequenz
kb Kilobasen
kD Kilodalton
M molar
MgCl Magnesiumchlorid
MHC Haupthistokompatibilitätskomplex
MALT Mucosa associated lymphoid tissue
min Minute
ml Milliliter
µl Mikroliter
N2 Stickstoff
NaCl Natriumchlorid
NaOH Natriumhydroxid
NFκB Nuklearer Faktor kappa B
NIH National Institute of Health
NTP Nukleosidtriphosphat
NUD non ulcer disease
O2 Sauerstoff
ORF open reading frame
PCR Polymerasekettenreaktion
pH potentia hydrogenii
PUD peptic ulcer disease
RBS Ribosomenbindungsstelle
rpm rounds per minute
sec Sekunde
ss-DNA Einzelstrang-DNAV Abkürzungsverzeichnis T Thymin Tab. Tabelle TNF Tumornekrosefaktor U Unit UV Ultraviolett Vac A vakuolisierendes Zytotoxin wt Wildtyp
1 1. Einleitung 1. Einleitung 1.1. Entdeckungsgeschichte der Helicobacter pylori-Infektion Für die Bildung von „Magengeschwüren“ machte Günsburg 1852 primär die Hyperazidität verantwortlich (Günsburg, 1852). Virchow nahm 1853 eine Gefäßerkrankung als Ursache der Ulkusbildung an (Virchow, 1853). Boettcher postulierte 1874 erstmals eine infektiöse Genese (Boettcher, 1874), doch da zu dieser Zeit ein Überleben von Mikroorganismen im sauren Milieu des Magens für unmöglich gehalten wurde, fand diese Hypothese zunächst nur wenig Zuspruch. In den Jahren 1881 und 1893 beschrieben Rappin und Bizzozero „spiralförmige Organismen“, die sie aus Hundemägen isolierten. Salomon bestätigte 1896 eine mögliche mikrobielle Besiedelung des Magens mit ähnlichen Befunden aus Katzen- und -Rattenmägen, während Nauwerck (1895) „Spaltpilze“ in Magengeschwüren zu entdecken glaubte und somit die Idee des mykotisch-peptischen Magengeschwüres äthiopathogenetisch als Ursache für Ulcera anführte. Im Jahre 1906 beschrieb Krienitz Bakterien im Magensekret eines Patienten, der an Magenkrebs litt. Im selben Jahr beschrieb Neumann eine von der Oberfläche ausgehende Invasion von Mikroorganismen im Magen. Im Jahre 1910 prägte Schwarz die Lehrmeinung „Ohne Säure kein Ulcus“, die auch heute noch gültig ist. Konjetzny erkannte 1923 den Zusammenhang der mikrobiellen Besiedelung mit der Gastritis und weiterhin die Assoziation zwischen Gastritis und Ulkus duodeni, nachdem er resezierte Mägen solcher Patienten untersucht hatte. Über die Art der Keime konnte er jedoch keine Aussage machen, weil die Anzucht in vitro nicht gelang. Im Jahre 1924 wiesen Luck und Seth eine hohe Ureaseaktivität bei Menschen mit Magenbeschwerden nach. Freedberg und Baron fanden 1940 in 37% der Magenresektate, die sie untersuchten, Bakterien. Jedoch konnte 1954 Palmer das Vorhandensein von Bakterien in Saugbiopsien der Magenmucosa nicht bestätigen, und so hielt man deren Vorkommen für postmortale Kontaminanten. Weitere Beschreibungen von „Spirochäten“ erfolgten von Doenges (1938), Steer und Colin-Jones (1975). Letztgenannte wiesen die Bakterien mit Hilfe der Elektronenmikroskopie nach, die aufgrund einer Kontamination der Kultur fälschlicherweise für eine Pseudomonas- Spezies gehalten wurden. Lieber und Lefevre fanden 1959 heraus, daß die Gabe von Antibiotika bei Patienten mit Hypoazidität durch Urämie eine Besserung der
2 1. Einleitung Magenbeschwerden hervorrief. Der Durchbruch gelang jedoch erst 1982 Marshall und Warren mit der Anzucht des Bakteriums und 1985 mit dem Nachweis der Pathogenität im Selbstversuch durch Marshall, womit die Kochschen Postulate für Ursache und Wirkung der Infektion erfüllt waren. Vorerst war man sich nicht sicher, ob das zunächst als Campylobacter pylori bezeichnete Bakterium der Gattung Campylobacter, Wolinella oder Spirillum zugerechnet werden sollte. Die neue Gattung Helicobacter wurde erst 1989 aufgrund biochemischer und ultrastruktureller Charakteristika, wie zum Beispiel die für ein Bakterium der Gattung Campylobacter ungewöhnlichen zellulären Fettsäuren, oder der 16S rRNA–Sequenz (Romaniuk, 1987) von Goodwin vorgeschlagen. Im Jahre 1994 wurde auf einer Konsensuskonferenz Helicobacter pylori von der NIH (National Institute of Health) zur Hauptursache für Ulcusleiden erklärt und die antimikrobielle Therapie der Infektion empfohlen. Noch im selben Jahr wurde H. pylori von der WHO als Karzinogen der Gruppe I eingestuft. Im Jahre 1997 wurde das Genom der H. pylori-Stämme 26695 und J99 vollständig sequenziert (Tomb et al. 1997, Alm et al. 1999). 1.2. Die Spezies der Gattung Helicobacter In den letzten Jahren konnten verschiedene Helicobacter-Arten in vielen Tierarten nachgewiesen werden. Die Helicobacter-Arten zeichnen sich durch eine enge Wirtsspezifität aus, deren Ursache bis jetzt noch nicht geklärt werden konnte. Die Arten der Gattung Helicobacter mit wesentlichen biochemischen und morphologischen Unterschieden zu Helicobacter pylori kolonisieren Magen und Darm verschiedener Wirbeltiere (Tabelle 1).
3 1. Einleitung
Tabelle 1 : Die Bakterienarten der Gattung Helicobacter
Lebensraum Spezies Wirtsspektrum
Magen H. pylori Mensch
H. bizzozeroni Hund
H. mustelae Frettchen
H. felis Katze, Hund, Maus
H. nemestrinae Macacus-Affe
H. acinonychis Gepard
H. aurati Hamster
H. heilmanii Mensch, Katze
Darm H. muridarium Maus, Ratte
H. canis Hund
H. cinaedi Mensch, Hamster
H. fennelliae Mensch
H. rappini Mensch, Hund
H. hepaticus L Maus
H. bilis L Maus
H. pullorum Mensch, Geflügel
H. pametensis Seemöve
H. cholecystus Hamster
H. salmonis Maus
H. wesmaedi Maus
H. trogontum Ratte
H. rodentium Maus
H. canadensis Mensch
H. ganmani Maus
H. suncus Spitzmaus
H. winghamesis Mensch
Modifiziert nach Bereswill, 1997; Marais, 1999
L
: Vorkommen auch in der Leber4 1. Einleitung 1.3. Die mikrobiologischen Charakteristika von H. pylori Helicobacter pylori ist ein gramnegatives, spiralig gekrümmtes, nicht sporenbildendes Stäbchen, das sich durch eine enge Wirtsspezifität auszeichnet. Es kolonialisiert die Magenmucosa des Menschen, ist nicht invasiv und lebt in enger Assoziation mit den Epithelzellen. Nur bei gastraler Metaplasie kommt es zur Besiedelung des Duodenums. Das zirkuläre Chromosom umfaßt 1.6 Megabasen. Der GC-Gehalt liegt bei 37% der DNA. H. pylori ist lophotrich begeißelt. Die drei bis sechs an einem Pol angehefteten Flagellen haben terminale Auftreibungen (Goodwin,1990) und sind durch eine Hülle vor dem sauren pH des Magens geschützt. Weiterhin sichern Virulenz-und Pathogenitätsfaktoren wie zum Beispiel Adhärenzproteine, Urease, Superoxiddismutase, Katalase und das vakuolisierende Zytotoxin (Vac A) das Überleben im unwirtlichen Milieu des Magens. H. pylori wird mikroaerophil in einer Atmosphäre mit 10% O2, 5% CO2 und 85% N2, in der Primäranzucht aus Biopsiematerial auf Blutagar bei 37°C kultiviert. Nach zwei bis drei Tagen sind die transparenten Kolonien mit einem Durchmesser von zwei bis drei Millimeter sichtbar. In älteren Kulturen finden sich kokkoide Formen, die zwar noch metabolisch aktiv, aber nicht mehr vermehrungsfähig sind (Bode, 1993; Nilius; 1993). 1.4. Epidemiologie der Helicobacter pylori-Infektion Die Infektion mit H. pylori wird im Kindesalter erworben (Banatvala, 1993; Parsonnet, 1995). Sie persistiert meist lebenslang. Risikofaktoren sind niedriger sozio- ökonomischer Status, Kinderreichtum, schlechte hygienische Verhältnisse, Wohnen auf engem Raum (Webb, 1994). Die Übertragung erfolgt innerhalb der Familie (Malatay, 1991), wahrscheinlich oral-oral oder fäkal-oral. In den Industrieländern liegt die Prävalenz bei 25-50%, in Entwicklungsländern bei 70-90% (Taylor, 1991). 1.5. Die H. pylori assoziierten Erkrankungen 1.5.1. Die H. pylori-assoziierte Immunantwort Die akute Besiedelung der Magenschleimhaut durch H. pylori kann zu dyspeptischen Beschwerden (Marshall, 1985; Morris, 1986) führen, die dauerhafte Besiedelung zu chronisch aktiver Gastritis, Ulcerationen und sogar zu Magenkarzinomen (Nomura,1993) oder MALT (Mucosa associated lymphoid tissue) -Lymphomen des Magens. Die Gastritis stellt sowohl eine Ursache für die Ulcera als auch eine
5 1. Einleitung präneoplastische Kondition dar (Blaser, 1991). Die Ursache hierfür liegt in der Unterhaltung einer chronischen Entzündung durch das Bakterium. Stark immunogen wirken die Urease-Untereinheiten, das Flagellin, das Hitzeschockprotein Hsp60 und das CagA-Protein, die eine lokale IgA und eine systemische IgG- Antwort auslösen (Mai, 1992). Weder Opsonierung (Wyatt, 1988) noch Beladung mit Komplement bewirken eine endgültige Eliminierung. Statt dessen akkumulieren Makrophagen und Granulozyten, welche ihrerseits die Entzündung durch verschiedene Mediatoren unterhalten (Crabtree,1991 und 1993) und so die Mucosa schädigen. Darüber hinaus wird die Entzündungsreaktion durch eine auf den Magenepithelzellen erhöhte Expression von MHC II-Molekülen (Scheynius und Engstrand,1991), IL-2 Rezeptoren (Ihan, 1996), und neutrophilen Adhäsionsmolekülen CD 54 gefördert. Durch T- Suppressorzellen kommt es zur Limitierung, nicht jedoch Eliminierung des Entzündungsgeschehens. Das Ausmaß der Entzündung hängt des weiteren vom Virulenzpotential des vorliegenden Stammes und von der Immunreaktion des Wirtes ab. 1.5.2. Die Gastritis Bei der Gastritis werden die Typ A-Gastritis autoimmuner Genese, z.B. Antikörper gegen Intrinsic factor, die Typ B-Gastritis bakterieller Genese und die Typ-C Gastritis aufgrund anderer Noxen wie z.B. nichtstereoidaler Antiphlogistika, unterschieden (Wyatt, 1988). Mit 80-90 % am häufigsten ist die Typ B Gastritis (Leung, 1992; Blaser, 1987; Cover, 1992; Dooley, 1989). Sie ist im Fundus / Korpus Bereich des Magens weniger ausgeprägt als im Antrum, wahrscheinlich aufgrund der HCl- Sekretion der Parietalzellen, welche das Mikromilieu beeinträchtigt. Das Sidney System, erstellt auf dem Weltkongreß für Gastroenterologie in Sidney 1990 und 1994 in Houston aktualisiert (Dixon, 1996), gliedert die Gastritis nach histologischen , endoskopischen und bakterioskopischen Kriterien. Die chronisch-aktive Gastritis geht mit Lymphfollikeln (Stolte, 1989; Wyatt, 1988), Schleimdepletion (Hui, 1992; Chan, 1992), Erosionen, fokaler Atrophie (Kuipers, 1995; Sipponen, 1993) oder intestinaler Metaplasie einher, deren Ausmaß ebenfalls von der Virulenz des Keimes abhängig ist. 1.5.3. Das Ulkus duodeni Etwa 95% der Ulcera duodeni sind mit H. pylori assoziiert (Stolte, 1992). Bei einer Typ B Gastritis steigt das Risiko, ein Ulkus duodeni zu entwickeln, um das 20fache
6 1. Einleitung (Sipponen 1992). Durch ein Zuviel an Säure entstehen im Bulbus Erosionen, welche zum Ersatz durch Magenepithel (gastrale Metaplasie) führen. Die vermehrte Säuresekretion wird über eine Dysregulation der Somatostatin und Gastrinfreisetzung durch bakterielle Virulenzfaktoren und über Entzündungsmediatoren erklärt (McColl 1997). Dies ermöglicht eine Besiedelung durch H. pylori, welche die Bulbitis unterhält, und schließlich die Entstehung eines Ulkus (Malfertheiner, 1991). Nach Säuresuppressionstherapie beobachtete man in 95% der Fälle Rezidive (Graham, 1992). 1994 empfahl das NIH (National Institute of Health) (NIH, 1994) die effektive und durch Einsparung von Antacida kostensenkende Antibiotikatherapie bei Ulkus duodeni. Die Eradikation führt in den meisten Fällen zu dauerhafter Heilung (Stolte, 1993). 1.5.4. Das Ulkus ventriculi Das Ulkus ventriculi entsteht meist am Angulus der kleinen Kurvatur des Magens , da aufgrund der anatomischen Topographie dort die Säurestraßen zusammenlaufen (Stolte,1992). Bei 93% der Ulkus-Patienten fand man H. pylori, nachdem nichtstereoidale Antiphlogistika als Ursache ausgeschlossen waren (Ohkusa, 1991; Stolte, 1996). Andererseits entwickelten nur wenige Patienten mit H. pylori ein Ulkus ventriculi (Sipponen, 1990), was auf die unterschiedliche Virulenz der Stämme zurückgeführt wird (Crabtree, 1991). Auch hier treten Ulkusrezidive nach Säuresuppressionstherapie und weiterhin bestehender Infektion in 74% der Fälle auf (Graham, 1992). 1.5.5. Das Magenkarzinom Weil mehrere epidemiologische Studien gezeigt haben, daß die H. pylori-Infektion mit einem 4fachen (Parsonnet, 1991) Risiko für die Entstehung von Magenkarzinomen korreliert (Forman, 1991; Nomura, 1991; Parsonet, 1991), wurde Helicobacter pylori 1994 als Karzinogen der Gruppe Ι eingestuft (IARC, 1994). Infizierte Personen haben ein 4fach höheres Risiko an Magenkrebs zu erkranken. Ursächlich zur Karzinogenese sind durch körpereigene Zellen erhöhte Konzentrationen am freien Radikalen und Zytokinen im Sinne einer Abwehrreaktion und eine herabgesetzte Ascorbinsäuresekretion (Sobala, 1991). Uemura et al. (2001) zeigten in einer prospektiven Studie an 1526 japanischen Patienten sowohl mit als auch ohne H. pylori-Infektion, daß besonders Patienten mit dem histologischen Befund einer
7 1. Einleitung
schweren Magenschleimhautatrophie, Corpus-dominanter Gastritis und intestinaler
Metaplasie ein erhöhtes Risiko haben, an einem Magenkarzinom zu erkranken,
während die Patienten mit Duodenalulcus und die Patienten ohne H. pylori-Infektion
im Beobachtungszeitraum von 7,8 Jahren kein Magenkarzinom entwickelten.
Dennoch ist die H. pylori-Infektion nicht als einzige Ursache der Karzinomentstehung
zu sehen, da nur ein sehr geringer Anteil der Infizierten an einem Karzinom erkrankt.
1.5.6. Das MALT-Lymphom
Die Besiedelung des Magens mit H. pylori führt zu der Entstehung eines Mukosa-
assoziierten-lymphatischen Systems, MALT, mit Bildung von Lymphfollikeln (Stolte,
1989; Wyatt, 1988), aus dem wiederum MALT-Lymphome hervorgehen können. Eine
H. pylori Infektion wird bei über 90% der Patienten mit Magen-MALT-Lymphomen
gefunden (Wotherspoon, 1991). Etwa 70% der niedrig maligen B-Zell-Lymphome
zeigen eine komplette Rückbildung nach Eradikation (Stolte, 1993; Wotherspoon,
1993; Bayerdorffer, 1995)
1.6. Diagnostik und Therapie
Es wird zwischen den direkten und indirekten diagnostischen Methoden
unterschieden. Zu den direkten gehören Histologie, Anzüchtung der Bakterien auf
komplexen Medien mit anschließender Antibiotikaresistenz Prüfung durch
Epsilometer-Test oder Agardilutionstest und die Bakterioskopie mit der HE- oder der
Warthin/Starry-Färbung. Zu den indirekten gehören der Urease-Schnelltest mit einem
Indikatormedium, das eine Alkalisierung bei Ureaseaktivität durch Farbumschlag
13
anzeigt, der Urease-Atemtest mit C markiertem Harnstoff, für den keine
Endoskopie nötig ist (Logan, 1991), und die Serologie mit dem Nachweis von IgG
und seltener IgA Antikörpern aus dem Serum mit ELISA als Screeningverfahren oder
Immunoblot als Bestätigungstest. Die Therapie erfolgt meist als Tripeltherapie durch
Kombination von einem Protonenpumpenhemmer oder Ranitidin-Wismut-Citrat mit
Clarithromycin und Amoxicillin oder Metronidazol, bei Therapieversagen als
Quadripeltherapie mit einem Protonenpumpenhemmer, Wismut, Metronidazol und
Tetrazyklin. Beide Therapien sollen über mindestens 7 Tage erfolgen (Maastrichter
Konsensus, 2000). Die Eradikation wird besonders bei Patienten mit Magenulkus,
MALT-Lymphom, atrophischer Gastritis und bei H. pylori-Infektion nach reseziertem
Magenkarzinom empfohlen. Auch Patienten, bei denen Verwandte ersten Grades an8 1. Einleitung Magenkrebs erkrankt sind, sollen therapiert werden. Der Therapieerfolg sollte immer mit dem Urease-Atemtest, endoskopisch oder mit dem Stuhl-Antigen-Test kontrolliert werden (Maastrichter Konsensus, 2000). 1.7. Pathogenitäts- und Virulenzfaktoren von Bakterien Pathogenität ist die Fähigkeit einer Gruppe von Organismen, bei anderen Organismen eine Infektion und eine Krankheit auszulösen. Sie ist eine artspezifische Eigenschaft. Pathogenitätsfaktoren sind Eigenschaften oder Produkte eines Bakteriums, die es ihm zum Beispiel ermöglichen, trotz der Immunantwort des Wirtes eine spezifische ökologische Nische im Wirt zu kolonialisieren. Pathogenitätsfaktoren sind an der Auslösung einer Erkrankung beteiligt. Die Virulenz bezeichnet den Grad der Pathogenität eines Organismus, jeweils auf einen bestimmten Wirt bezogen. Die Virulenz ist eine stammspezifische Eigenschaft. Virulenzfaktoren sind Eigenschaften eines Bakteriums, die Einfluß auf das Ausmaß der krankmachenden Eigenschaften eines pathogenen Bakterienstammes haben, zum Beispiel deren Fähigkeit, sich zu vermehren und den Wirtsorganismus toxisch zu schädigen. 1.7.1. Die Beweglichkeit H. pylori verdankt seinen drei bis sechs Flagellen die Möglichkeit, die visköse Mukusschicht durchdringen zu können und dadurch das Magenepithel zu erreichen (Hazell 1987). Die säurelabilen Filamentproteine Fla A und Fla B werden durch eine Phospholipiddoppelschicht geschützt (Suerbaum, 1993). Die Beweglichkeit ist für H. pylori lebenswichtig, wie Experimente mit unbeweglichen Mutanten bewiesen haben (Eaton, 1996). 1.7.2. Die Adhäsine H. pylori kann an Epithel-und Immunzellen binden (Logan, 1996). Der Kontakt des Bakteriums zur Epithelzelle führt zur Ausformung eines Pedestals durch die Wirtszellmembran (Segal, 1996). H. pylori hat Rezeptorproteine, die Lewis b- Blutgruppenfaktoren (Bab A) (Ilver, 1998), Lipoproteine (Alp A/B) (Odenbreit, 1999; Lingwood, 1993), Sialinsäure und Heparansulfat binden. Viele H. pylori-Stämme können zum Beispiel mit Hilfe eines SabA (sialic acid-binding adhesin) an Sialin- Lewis x-Glycosphingolipidrezeptoren des Magenepithels binden, die während der
9 1. Einleitung chronischen, H. pylori-induzierten Entzündung exprimiert werden (Mahdavi J. et al., 2002). 1.7.3. Die Entgiftung von toxischen Sauerstoffradikalen Die Superoxiddismutase (SOD) ist ein eisenhaltiges Enzym, das vom Gen sodB kodiert wird, aus zwei identischen Untereinheiten besteht und an der Oberfläche des Bakterium lokalisiert ist (Spiegelhalder et al., 1993). Die Katalase wird vom Gen katA kodiert. Diese Bakterienenzyme bewahren H. pylori vor Sauerstoffradikalen und anderen von Granulozyten gebildeten zytotoxischen Stoffen. 1.7.4. Die Antigen-Mimikry durch Lipopolysaccharide Die Lipopolysaccharide (LPS) von H. pylori besitzen nur geringe Toxizitität (Birkholz, 1993), was die Langzeitpersistenz im Wirt begünstigt. Die Lipopolysaccharide haben für Bakterien ungewöhnliche Fettsäuren (Geis, 1990), sind teilweise in den Seitenketten dem Lewis X und Lewis Y-Antigen an der Oberfläche des Magenepithels analog (Appelmelk, 1996) und tarnen das Bakterium vor dem Immunsystem des Wirtes. Eine Wirkung des H. pylori-LPS ist die vermehrte Pepsinogen I- Freisetzung aus den Hauptzellen (Moran, 1996) . 1.7.5. Die Urease Das nickelhaltige Ureaseenzym besteht aus sechs großen (Ure B) und sechs kleinen (Ure A) Untereinheiten (Labigne, 1991) und liegt sowohl auf der Zelloberfläche des Bakteriums als auch in seinem Zytoplasma vor (Scott, 1998). Die Hydrolyse von Harnstoff zu Ammoniak und CO2 (Smoot, 1990), ermöglicht es dem Bakterium, den Magen-pH zu neutralisieren. Außerdem wird dadurch der lebenswichtige Stickstoff für die Aminosäuresynthese von H. pylori bereitgestellt (Williams, 1996). Entstehende Hydroxyd- und Ammoniumionen wirken epithelschädigend (Smoot, 1990). Urease- negative Keime können nicht kolonialisieren (Eaton, 1991). Die Urease hat auch immunmodulatorische Funktion (Harris, 1996) und potenziert die Wirkung des Vac A Zytotoxins (Cover, 1992). 1.7.6. Das Zytotoxin VacA 50%-60% der H. pylori-Stämme bilden das vakuolisierende Zytotoxin (VacA) (Cover&Blaser,1992) und verursachen die Vakuolisierung des Zytoplasmas der
10 1. Einleitung Epithelzellen und deren Destruktion. Sie tragen somit über einen unbekannten Rezeptor möglicherweise zur Ulkusbildung bei (Leunk, 1988). Bindungsstudien zeigen, daß Vac A rezeptorvermittelt in die Zielzellen gelangt (Garner, 1996; Massari, 1998). Das vacA-Gen ist in allen H. pylori-Stämmen vorhanden, zeigt aber große genetische Heterogenität. So gibt es von der N- terminalen Signalsequenz die Subtypen s1a, s1b oder s2 und von der Mittelregion die Subtypen m1, m1a oder m2 (Atherton, 1995; Strobel, 1998). Besonders die Untereinheit s1 ist mit Ulcusbildung assoziiert und korreliert statistisch eng mit der Anwesenheit der cag- Pathogenitätsinsel (cag-PAI). Der Genotyp s2 ist mit geringerer zytotoxischer Aktivität und häufiger Abwesenheit der PAI assoziiert. 1.8. Die Bedeutung der Pathogenitätsinsel und des Cag A-Proteins Pathogenitätsinseln sind Segmente chromosomaler DNA, die von Insertionen oder repeat-Elementen gesäumt werden, und eine andere Nukleotidzusammensetzung haben als das restliche bakterielle Genom. Pathogenitätsinseln enthalten Gruppen Virulenz-assoziierter Gene, die spezialisierte Sekretionssysteme, sezernierbare Effektormoleküle, Adhäsine und regulatorisch wirkende Proteine kodieren, so daß der Erwerb einer solchen Virulenz einen bisher nicht-pathogenen Mikroorganismus befähigen kann, Krankheiten zu verursachen. Die Infektion mit H. pylori-Stämmen, die die cag-Pathogenitätsinsel (cag-PAI) enthalten, ist mit der Entwicklung von chronisch aktiver Gastritis (Crabtree, 1992; Peek, 1995; Yamaoka, 1997), peptischer Ulkuskrankheit (Covacci,1993; Crabtree, 1991; Graham, 1998; Walker, 1998), atrophischer Gastritis (Webb, 1999) und mit einem erhöhten Risiko, ein distales Magenadenokarzinom zu entwickeln (Blaser, 1995; Crabtree, 1994; Parsonnet, 1997; Shimoyama, 1998) assoziiert. Somit ist die cag-PAI einer der Hauptvirulenzfaktoren von H. pylori. Aus diesem Grunde werden virulente Typ I-Stämme (vacA+/cagA+) von weniger virulenten Typ II-Stämmen (vac A-/cagA-) unterschieden. Etwa 70% der H. pylori-Stämme haben die cag-PAI. Während das Gen cagA in 50-60% der H. pylori-Isolate von Patienten mit Gastritis vorhanden ist, findet man es in 88-100% der Isolate von Patienten mit Duodenalulkus (Covacci, 1993). Es wurde gezeigt, daß Mukosabiopsien von Patienten mit H. pylori Infektion deutlich höhere Spiegel von IL-1β, IL-6, TNFα, und IL-8 enthalten, als Mukosabiopsien von Patienten ohne H. pylori-Infektion (Crabtree, 1991 und 1994; Gionchetti, 1994; Noach, 1994). IL-8 verursacht die charakteristische Migration von
11 1. Einleitung Immunzellen in die Magenschleimhaut bei aktiver Gastritis (Crabtree, 1996; Shimada, 1998). Da die Exposition mit H. pylori bei Magenepithelzellen die Sekretion von IL-8 induziert (Crabtree, 1994; Sharma, 1995) und cagA-positive Stämme bedeutend höhere IL-8-Spiegel induzieren als cagA-negative Stämme (Crabtree, 1994; Huang, 1995; Peek, 1995), ist cagA ein Marker für verstärkte Pathogenität. Die cag-Pathogenitätsinsel (cag-PAI) ist eine 40 kb große Insertion, die etwa 30 Gene umfaßt, die wahrscheinlich durch horizontalen Transfer durch Plasmid oder Phagen erworben (Covacci et al., 1997) und in die letzten 31 Bp des chromosomalen Glutamatracemase-Gen integriert wurde. Für den horizontalen Transfer spricht der für H. pylori relativ niedrige GC-Gehalt von 35% der Insertion, verglichen mit den 38-45% des Restgenoms. In manchen Stämmen ist die PAI durch die Insertionssequenz IS 605 (Akopyants et al.,1998) in ein rechtes (cag I) und ein linkes Segment (cag II) geteilt. Bei einigen Stämmen sind cag I und cag II noch zusätzlich durch eine intervening sequence geteilt, die meist zwischen den ORFs Q und S liegt (Censini, 1996) und von zwei IS 605 Insertionssequenzen flankiert wird. Die Gene der cag I wurden mit einer Buchstaben-Nomenklatur von A-Q (Censini, 1996) benannt, die der cag II mit einer Zahlen-Nomenklatur von 6-18 (Akopyants, 1998), zu der auch die Gene cagS und cagT gehören. Aufgrund von Sequenzhomologien zu Genen, die zum Beispiel beim Pflanzenpathogen Agrobacterium tumefaciens ein Sekretionssystem für den Transport von Makromolekülen in die Wirtszelle kodieren (Christie, 1997), wurde vermutet, daß die cag-PAI von H. pylori ebenfalls für ein Typ IV Sekretionssystem kodiert. Heute weiß man, daß das CagA-Protein in die Wirtszelle transloziert wird und daß sowohl der Transferapparat als auch CagA selbst in der cag-PAI kodiert sind. Das CagA Protein ist ein stark immunogenes Antigen, das bei 80% der mit H. pylori infizierten Patienten lokale IgA- und systemische IgG-Antikörbildung induziert und eine Infiltration polymorphkerniger Leukozyten nach sich zieht (Apel, 1988). Das CagA Protein ist 120-140 kD groß und hat eine größenvariable Region am C- Terminus durch wechselnde Anzahl von repeat Sequenzen in der 3‘ Region des cagA Gens (Yamaoka et al, 1998; Covacci, 1993). Die wichtige Rolle des direkten Kontaktes zwischen Bakterium und Magenepithelzelle für die Induktion zellulärer Effekte wie der IL-8 Sekretion wurde unterstützt durch Experimente, in denen Filtermembranen verwandt wurden, die zwar Sekretionsprodukte hindurchlassen, aber Zellkontakte verhindern (Rieder, 1997).
12 1. Einleitung Nach Translokation des CagA Proteins durch das Typ IV Sekretionssystem in die Wirtszelle wird dieses von einer Src-Tyrosinkinase phosphoryliert (Asahi et al, 2000; Backert et al., 2000; Odenbreit et al., 2000; Stein et al., 2000, Selbach et al. 2002), proteolytisch in die beiden Fragmente p100CagA und p35CagA prozessiert und somit aktiviert. Die Phosphorylierungsorte des CagA Proteins liegen im C-Terminus des Proteins (Odenbreit, 2000). Durch die Ähnlichkeit mit eukaryoten Proteinen wird das CagA-Protein für „wirtseigen“ gehalten und entgeht somit der Degradation. Nach Aktivierung induziert CagA eine Änderung des Zellzyklus, die Sekretion von IL-8 (Glocker et al., 1998 ; Sharma et al., 1998) und morphologische Veränderungen der Wirtszelle wie Aktin-Reorganisation mit Bildung eines Pedestals. Das aktivierte CagA Proteins führt zu kortikaler Aktinpolymerisation in der Magenepithelzelle. Dieser Effekt wird direkt über N-WASP (N-Wiskott-Aldrich syndrome protein) und Arp2/3, welches globuläres Aktin in höher organisierte Strukturen wandelt, erreicht, oder indirekt durch Stimulation GTP-bindender Moleküle, die häufig mit Kinasen assoziiert sind (Censini, 2001; Welch, 1999; Egile, 1999; Kalmann, 1999). Epithelzellen, die mit H. pylori infiziert sind, produzieren zahlreiche proinflammatorische Zytokine und Chemokine (Atherton, 1998). Diese locken Neutrophile, Makrophagen und Lymphozyten an, die den Magenepithelverband durch Invasion lockern und durch Sekretion von beispielsweise Sauerstoffradikalen zusätzlich schädigen. Anders als andere gramnegative Bakterien, die NFκB (Nuclear Factor κB) durch Lipopolysaccharide (LPS) induzieren, benutzt H. pylori dafür kein LPS (Münzenmaier, 1997). Das NFκB-Protein liegt als inaktive, zytoplasmatische Form in fast allen Zellen vor (Baeuerle, 1988) und kann über eine Vielzahl von Noxen aktiviert werden (Baeuerle, 1994). Die Aktivierung erfolgt über Phosphorylierung, Ubiquitinilierung und proteolytische Degradation von IκB, der inhibitorischen Untereinheit von NFκB (Beg, 1993; Brown, 1995; Henkel, 1993). Das freigesetzte NFκB-Dimer transloziert unmittelbar in den Nukleus, wo es die Transkription von Zielgenen wie der für IL-6, IL-1, IL-8 und TNFα aktiviert (Baeuerle, 1988). Die Fähigkeit, IL-8 zu induzieren, kann durch die Mutation einiger cag-PAI Gene deutlich reduziert werden (Akopyants, 1998; Censini, 1996; Li, 1999; Tummuru, 1995). Die Bedeutung einzelner cag-PAI Gene für die Induktion von IL-8 in Magenepithelzellen ist Gegenstand vieler Studien, die sich natürlicher oder gentechnisch hergestellter H. pylori-Mutanten bedienen, denen einzelne Gene der
13 1. Einleitung cag-PAI fehlen. So wurde von Sharma (1995) und Crabtree (1995) gezeigt, daß isogene, cagA-negative H. pylori- Mutanten genauso stark IL-8 induzieren wie der Elternstamm. Ebenso zeigten isogene Mutanten mit einem Defekt sowohl im Zytotoxin-als auch im cagA Gen (vacA/cagA) keine Abnahme in der IL-8 Induktion verglichen mit dem H. pylori-Wildtyp. Obwohl vacA und cagA also Marker verstärkter Pathogenität sind, sind sie nicht die molekularen Marker der Entzündungsreaktion. Tummuru et al. (1995) fand heraus, daß das cagE (picB) für die IL-8 Induktion notwendig ist. CagE zeigt Homologien zum Bordetella pertussis Toxin Sekretionsprotein (PtlC) und dem virB4 Gen von Agrobacterium tumefaciens. Die Mutation von cagC/D (picA) beseitigt ebenso die cagE Expression wie die Mutation des cagE Gens selbst, da cagC/D/E kotranskribiert werden. Die Folge ist, daß diese H. pylori-Mutante kein IL-8 mehr induzieren kann. Censini et al. (1996) zeigten, daß H. pylori Mutanten, die jeweils die Gene cagE, G, H, I, L und M betreffen, deutlich weniger IL-8 in Magenepithelzellen induzieren als der Wildtyp. Ebenso wies er nach, daß Mutationen in cagN und cagA keinen Einfluß auf die IL-8 Sekretion hatten. Glocker et al. (1998) zeigte, daß die Gene cagE, G, H, I, L, M ebenso absolut notwendig für die Aktivierung von NFκB sind, während dies für die H. pylori Gene cagF und cagN nicht gilt. Akopyants et al. (1998) konnten klären, daß Insertionen in zwei ORFs der cag PAI, nämlich dem ORF 13-14 (virB10-Homolog) und ORF 7, die IL-8 Induktion ebenso blockierte, wie wenn man das cag II Segment oder die gesamte cag-PAI deletierte. Li et al. (1999) zeigte, daß cag7, 11 (virB11 Homolog), 13, 14 (virB10 Homolog), 15 (virB9 Homolog), 16 und 18 ebenfalls für die Induktion der IL-8 Transkription nötig sind, da ihre Deletion zu einer deutlichen Reduktion der IL-8 Sekretion führt, die sich von der eines cag-negativen H. pylori Stammes nicht mehr unterscheidet. Somit kann man zusammenfassen, daß sowohl Gene der linken Hälfte der cag-PAI (cag II) als auch Gene der rechten Hälfte der cag-PAI (cag I) für die NFκB und IL-8 vermittelte Immunreaktion im Wirt nötig sind. Die Studie von Fischer et al. (2001) untersuchte durch Mutagenese jedes einzelnen Gens die gesamte cag-PAI im Hinblick auf die Konsequenzen für sowohl die Translokation des CagA Proteins als auch für die IL-8 Induktion. Die Ergebnisse zeigten, daß cag10, 12 und I essentiell für die Translokation von CagA, aber nicht für die Induktion von IL-8 sind, wohingegen cag 6, 7, 10, O, P, Q und S weder für Translokation noch für IL-8 Induktion essentiell sind. Mutationen von
14 1. Einleitung cag C, D, G und M führten zu einer Reduktion der Tyrosinphosphorylierung von CagA. Mutanten der Gene cagC, D, F, G, M und 12 zeigten nur partielle Effekte auf die IL-8 Induktion. Außerdem verursachte die Insertionsmutagenese von cagN den Verlust von cagT. Diese Tatsache lenkt das Interesse auf die Frage, wie die cag-PAI unterschiedlicher H. pylori-Isolate aufgebaut ist, da das Fehlen einzelner Gene anscheinend gravierende Effekte auf die IL-8 Induktion und somit möglicherweise auf die klinische Symptomatik haben kann. Daß PAIs instabile chromosomale Segmente sind, die spontan deletieren können, hat Blum 1994 gezeigt. Dies erklärt, daß bei entsprechender Selektion die Anzahl cag-negativer Kolonien um 10 - 80% der Gesamtzahl anwachsen kann (Figura, 1998; Hamlet, 1999). Um sich an eine Umwelt mit periodischen Änderungen anzupassen, koexistieren Bakterien mit und ohne cag-PAI in unterschiedlichem Verhältnis (Figura, 1998). Somit wird angenommen, daß im Magen häufig cag-negative Mutanten vorkommen. Die Sequenzierung verschiedener ausgewählter Loci zeigte, daß die Heterogenität nur auf cag-Niveau zu finden ist - so daß die Mutanten anscheinend ursprünglich von einem einzigen gemeinsamen H. pylori-Stamm abstammen. Die Instabilität der cag-PAI ist wahrscheinlich Teil des Infektionsprozeßes und wirkt als Regulationsmechanismus, indem durch Verlust der cag-PAI die Virulenz von H. pylori vorübergehend reduziert wird. So wies Hacker 1997 ein dynamisches Gleichgewicht zwischen H. pylori-Stämmen ohne cag-PAI und H. pylori-Stämmen mit cag-PAI nach. Lange Zeit fehlte der H. pylori-Forschung ein geeignetes Maus-Tiermodell, da die meisten H. pylori-Stämme die Maus nicht dauerhaft infizieren können. Lee et al. gelang es 1997, einen H. pylori-Stamm zu isolieren, der in großer Anzahl im Magen der Maus kolonisiert. Dieses H. pylori-Tiermodell erfüllt die Anforderungen der Lausanne Kriterien. Dazu wird die Kolonisierung und Histopathologie in Magenantrum- und -korpus untersucht, die Anzahl der H. pylori pro Gramm Magengewebe bestimmt, die An- oder Abwesenheit der Adhäsion an den Magenepithelzellen dokumentiert, sowie die längste beobachtete kontinuierliche Besiedlung und die Anzahl der möglichen in vitro Passagen bestimmt. Der sogenannte Sydney Strain, SS1, von H. pylori ist cagA und vacA (s2m2) positiv. Er kolonisiert den Magen von C57BL/6 Mäusen in hoher Dichte: 106-107 CFU (colony forming units) pro Gramm Gewebe, und über einen langen Zeitraum (≥8 Monate). Der Phänotyp und die Kolonisierungsfähigkeit blieben auch nach 20 in vitro
15 1. Einleitung Subkultivierungen stabil. Das Bakterium zeigte sich elektronenmikroskopisch in engem Kontakt zum Magenepithel mit Ausbildung kleiner Magenepithelzellfortsätze. 3,5 Monate nach der Infektion konnnte eine milde Gastritis bei den C57BL/6 Mäusen beobachtet werden, nach acht Monaten entwickelte sich langsam eine chronisch aktive Gastritis, die zu Magenschleimhautatrophie führte (Lee, 1997). Typischerweise sah man auch in der C57BL/6 Maus eine zunehmende Infiltration der Magenmukosa mit polymorphkernigen Granulozyten. Interessanterweise induziert der H. pylori-Stamm SS1 , der cagA und vacA (s2m2)- positiv ist, keine Vakuolen in HeLa-Zellen, und auch kein IL-8 in KATO III Zellen (van Doorn 1999) oder NFκB (Philpott 2001). Möglicherweise kolonisiert der H. pylori Stamm SS1 deswegen in Mäusen in großer Anzahl und über lange Zeit, weil er nur eine schwache Entzündungsreaktion auslöst. Deswegen ist es natürlich von Interesse, wie die gesamte cag-PAI von H. pylori Stamm SS1 aufgebaut ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde deshalb unter anderem die cag-PAI des H. pylori- Stammes SS1 und seiner Derivate mit einer neu etablierten Southern-Hybridisierung für die cag-PAI untersucht. 1.9. Ziele dieser Arbeit Da Akopyants et al. 1998 gezeigt haben, daß die Struktur der cag-PAI bei verschiedenen H. pylori-Stämmen variiert, und daß der Nachweis des cagA Gens in einem Stamm nicht in allen Fällen bedeutet, daß die komplette, funktionell aktive cag-PAI vorhanden ist, wurden in dieser Arbeit H. pylori-Stämme nicht nur hinsichtlich eines Markergens, sondern auf das Vorhandensein aller cag-PAI Gene untersucht. Verschiedene H. pylori-Isolate induzieren unterschiedlich hohe IL-8 Spiegel (Münzenmaier, 1997) und dies kann nicht allein mit der Variabilität des cagA-Gens erklärt werden. Deswegen war das Ziel dieser Arbeit, Analysesysteme zu entwickeln, die es ermöglichen, alle Gene der cag-PAI einzeln nachzuweisen. Damit sollten auch spontane Deletionen einzelner cag-PAI Gene nachgewiesen werden und der jeweilige Zusammenhang zwischen der reduzierten Fähigkeit eines H. pylori- Stammes, IL-8 zu induzieren und dem Aufbau seiner cag-PAI hergestellt werden. Mit Hilfe der PCR-Technik sollten die H. pylori-Stämme, deren IL-8 Induktion in Vorarbeiten quantifiziert worden war, hinsichtlich ihrer gesamten cag-PAI typisiert werden. Da die PCR-Analyse bei hoher Spezifität auch häufig falsch-negative
16 1. Einleitung Ergebnisse aufgrund der natürlichen Sequenzvariabilität von H. pylori liefert, sollte alternativ die Gesamt-DNA Markierung und Hybridisierung als zuverlässigeres Analysesystem in Form ein DNA-Arrays entwickelt werden. Im Rahmen dieser Arbeit sollten desweiteren H. pylori-Isolate sowohl von Patienten mit als auch ohne peptischer Ulcuskrankheit aus einer vorangegangenen Multicenter-Studie mit Hilfe dieses DNA-Arrays untersucht und genetische Unterschiede charakterisiert werden. Schließlich sollten mit Hilfe eines DNA-Makroarrays Derivate des H. pylori-Stammes SS1, der durch längerfristige Kultivierung in einem Mausstamm modifiziert wurde, auf Veränderungen in der cag-PAI untersucht werden.
17 2. Material
2. Material
2.1. Verzeichnis der Bakterienstämme
Tabelle 2: Stämme der Bakterien Helicobacter pylori und Escherichia coli
Stamma Beschreibungb Quelle oder Referenz
H. pylori
• Referenzstämme
G 27 wt, cag A+, vac A (s1b/m1) Covacci 1996
26695 wt, cag A+, vac A (s1a/m1a) Tomb et al., 1997
1061 wt, cag A -, vac A (s1a/m2) Kusters et al., 2002
151 wt, cag A+, vac A (s1b/m1) Bereswill et al.
• Klinische Isolate
2025 wt, cag A -, vac A (s2/m2) Münzenmeier et al., 1997
2047 wt, cag A -, vac A (s1a/m2) Münzenmeier et al., 1997
2067 wt, cag A -, vac A (s2/m2) Münzenmeier et al., 1997
2074 wt, cag A+, vac A (s1a/m2) Münzenmeier et al., 1997
2022 wt, cag A+, vac A (s1a/m2) Münzenmeier et al., 1997
HV89 wt, cag A+, vac A (s1b/m1) Münzenmeier et al., 1997
c
3039 A wt, cag A -, vac A (s2/m2) Strobel et al., 1997
c
3068 A wt, cag A -, vac A (s2/m2) Strobel et al., 1997
cd
3035 A wt, cag A -, vac A (s2/m2) Strobel et al., 1997
3035 C wt, cag A -, vac A (s2/m2)cd Strobel et al., 1997
c
3109 A wt, cag A -, vac A (s2/m2) Strobel et al., 1997
e
1A wt, cag A+, vac A (s1a/m2) Strobel et al., 1997
e
2A wt, cag A+, vac A (s1a/m2) Strobel et al., 1997
e
3C wt, cag A+, vac A (s1a/m1a) Strobel et al., 1997
e
4A wt, cag A+, vac A (s1a/m2) Strobel et al., 1997
e
5A wt, cag A+, vac A (s1a/m1) Strobel et al., 1997
• Tiermodell
SS - 1 wt, cag A+, vac A (s2/m2) Sommer et al.
RMSS wt, cag A+, vac A (s2/m2) Sommer et al.
M 39 - 4 wt, cag A+, vac A (s2/m2) Sommer et al.
E. coli
DH 5a F -, endA1, hsdR17 (rk- mk+), supE44, thi, recA1, Bethesda Research
gyrA96, relA1, DlacZM15 Laboratories
a
A = Anthrum, C = Corpus; b Genotypen nach Atherton et al., 1995; c Klinische Isolate von Patienten
mit dyspeptischen Beschwerden, NUD (engl.:Non-ulcer disease); d Klinische Isolate eines einzelnen
Patienten; e Klinische Isolate von Patienten mit peptischem Ulcus18 2. Material
2.2. Verzeichnis der Oligonukleotide
Tabelle 3 : Oligonukleotide für die PCR
Bezeichnung Nukleotidsequenz Gena Referenz
cag A - L 5 5‘ - ATG ACT AAC GAA ACT ATT G – 3‘ cag 26 , cag A , 547 diese Arbeit
cag A - R 5 5‘ – CTT CTT GCC TTT CTT TC – 3‘ cag 26 , cag A , 547 diese Arbeit
cag B - L 2 5‘ – TAC TTG TCC CAA CCA TT – 3‘ cag 25 , cag B , 546 diese Arbeit
cag B - R 2 5‘ – CCA CAT TGG GAA ATA AA – 3‘ cag 25 , cag B , 546 diese Arbeit
cag C - L 3 5‘ – CTG CCA CCG CTA ACA – 3‘ cag 25 , cag C , 545 diese Arbeit
cag C - R 3 5‘ – CAA GAA TCA CTG ACA – 3‘ cag 25 , cag C , 545 diese Arbeit
cag D - L 2 5‘ – AGA TAT ACG GCT TCA CA – 3‘ cag 24 , cag D , 545 diese Arbeit
cag D - R 2 5‘ – TTT GTG AAA GTT CTC TTA AG – 3‘ cag 24 , cag D , 545 diese Arbeit
cag E - L 5 5‘ – GTC CCT ATT GGT TTC ATC – 3‘ cag 23 , cag E , 544 diese Arbeit
cag E - R 5 5‘ – AAA TAG AAG AAC TTA AAG CA - 3‘ cag 23 , cag E , 544 diese Arbeit
cag F - L 2 5‘ –AAA TTC GCT TGA ACA AA – 3‘ cag 22 , cag F , 543 diese Arbeit
cag F - R 2 5‘ – ATG AAA CAA AGT TTG CG – 3‘ cag 22 , cag F , 543 diese Arbeit
cag G - L 3 5‘ – TAA TAC CCT AAG ATC GG – 3‘ cag 21 , cag G , 542 diese Arbeit
cag G - R 3 5‘ – TAA GAA TAA AGG AGT CAA A – 3‘ cag 21 , cag G , 542 diese Arbeit
cag H - L 2 5‘ – CGG CTG TAT CAT TCA TT – 3‘ cag 20 , cag H , 541 diese Arbeit
cag H - R 2 5‘ – ATG GCA GGT ACA CAA GC – 3‘ cag 20 , cag H , 541 diese Arbeit
cag I - L2 5‘ – TAG CCC ATC AAG ATA GG – 3‘ cag 19 , cag I, 540 diese Arbeit
cag I - R 2 5‘ – GCT TGC AAC CAT GAG TG – 3‘ cag 19 , cag I , 540 diese Arbeit
cag L - L 2 5‘ – CGT CCA ACT CCT CTA AA – 3‘ cag 18 , cag L , 539 diese Arbeit
cag L - R 2 5‘ – TTT GCT CTT GTC TGT TT – 3‘ cag 18 , cag L , 539 diese Arbeit
cag M - L 3 5‘ – GCT CAT TGG TTG CGT T – 3‘ cag 16 , cag M , 537 diese Arbeit
cag M - R 3 5‘ – AAA CAC ACC CAT TTG AAG – 3‘ cag 16 , cag M , 537 diese Arbeit
cag O - L 3 5‘ – CTA ACT CCA AAT CTC AAA – 3‘ cag 15 , cag O , 536 diese Arbeit
cag O - R 3 5‘ – TGT CTT ATA GTG TTA TGT TT – 3‘ cag 15 , cag O , 536 diese Arbeit
cag P - L 3 5‘ – CGA ATC ATA AGA ACC AA – 3‘ cag 15 , cag P , 536 diese Arbeit
cag P - R 3 5‘ – ATG AAA CGA CCG ATT AG – 3‘ cag 15 , cag P , 536 diese Arbeit
a
Nomenklatur bei 26695/ NCTC 11638/ HP – Nomenklatur19 2. Material Fortsetzung Tabelle 3: Oligonukleotide für die PCR Bezeichnung Nukleotidsequenz Gena Referenz cag Q - L 3 5‘ – CTG CGT GAA AGA TGA AA – 3‘ cag 14 , cag Q , 535 diese Arbeit cag Q - R 3 5‘ – GAA ATG CTT CCT ACT AAA – 3‘ cag 14 , cag Q , 535 diese Arbeit cag S - L 2 5‘ – TTC CAC ATC AAG CAT TT – 3‘ cag 13 , cag S , 534 diese Arbeit cag S - R 2 5‘ – CCA AGA GCG ATA TGA GT – 3‘ cag 13 , cag S , 534 diese Arbeit cag T - L 2 5‘ – AAT GAA ACT GAG AGC AA – 3‘ cag 12 , cag T , 532 diese Arbeit cag T - R 2 5‘ – TGT TCC TTG TCT TGT AAA – 3‘ cag 12 , cag T , 532 diese Arbeit cag 6 - L2 5‘ – GCT ATA ATG ACA TGA ATT T – 3‘ cag 1 , cag 6 , 521 diese Arbeit cag 6 - R 2 5‘ – TGC CTC AAT CTT TAG TC – 3‘ cag 1 , cag 6 , 521 diese Arbeit cag 7 - L 2 5‘ – AAA TGA TAC AAA GAG ATT – 3‘ cag 2 , cag 7 , 522 diese Arbeit cag 7 - R 2 5‘ – TTT CAT CAA TCC ATT GC – 3‘ cag 2 , cag 7 , 522 diese Arbeit cag 8 - L 3 5‘ – AGG AAA CTA ATG TTT AGA AA – 3‘ cag 3 , cag 8 , 523 diese Arbeit cag 8 - R 4 5‘ – AGG CAT GTT CTC ATT GAT – 3‘ cag 3 , cag 8 , 523 diese Arbeit cag 9 - L 2 5‘ – AAG TGA TGT GCA GAA CG – 3‘ cag 4 , cag 9 , 524 diese Arbeit cag 9 - R 2 5‘ – CTA CTC GTT ATA TCG AC – 3‘ cag 4 , cag 9 , 524 diese Arbeit cag 10 - L 3 5‘ – TTT GGC TTT GAT CAT TT – 3‘ cag 5 , cag 10 , 525 diese Arbeit cag 10 - R 3 5‘ – GCA CAA TGG AAG ACT TT – 3‘ cag 5 , cag 10 , 525 diese Arbeit cag 11 - L 2 5‘ – TTC TTC TTT AGG GAT AAA – 3‘ VirB11 – hom. diese Arbeit cag 11 - R 2 5‘ – ATG ACT GAA GAC AGA TTG A – 3‘ VirB11 – hom. diese Arbeit cag 12 - L 2 5‘ – GTT CTT ATT CCA AAT TTA A – 3‘ cag 6 , cag 12 , 526 diese Arbeit cag 12 - R 2 5‘ –GCA ATG GAA CTC GGT TT – 3‘ cag 6 , cag 12 , 526 diese Arbeit cag 14 - L 3 5‘ – GAG TTT GGG TTT CTT CT – 3‘ cag 7 , cag 14 , 527 diese Arbeit cag 14 - R 3 5‘ – GGC GTT AAG ACA TGA AT – 3‘ cag 7 , cag 14 , 527 diese Arbeit cag 15 - L 2 5‘ – GAT AAA TTC GCT AAG ATT – 3‘ cag 8 , cag 15 , 528 diese Arbeit cag 15 - R 2 5‘ – GAG GAA TTG TTG ATG GG – 3‘ cag 8 , cag 15 , 528 diese Arbeit cag 16 - L 2 5‘ – CAA ATT AAA CCA TCA GC – 3‘ cag 9 , cag 16 , 529 diese Arbeit cag 16 - R 2 5‘ – GGC ATT AAA TAA ATA AGA A – 3‘ cag 9 , cag 16 , 529 diese Arbeit cag 17 - L 3 5‘ – TTT CTT GAG AAG AGT TAC C – 3‘ cag 10 , cag 17 , 530 diese Arbeit cag 17 - R 3 5‘ – GTC GCA TGT TAG GGA AA – 3‘ cag 10 , cag 17 , 530 a Nomenklatur bei 26695/ NCTC 11638/ HP - Nomenklatur
20 2. Material
Fortsetzung Tabelle 3:Oligonukleotide für die PCR
Bezeichnung Nukleotidsequenz Gena Referenz
cag 18 - L 2 5‘ – ATG AAC GAT ACA ACA GAG C – 3‘ cag 11 , cag 18 , 531a diese Arbeit
cag 18 - R 2 5‘ – CCA ATA ACC TTA ATA ACT T – 3‘ cag 11 , cag 18 , 531a diese Arbeit
cag - L 1 5‘ – TGC TAA ATT AGA CAA CTT GAG cag 26 , cag A , 547a diese Arbeit
CGA – 3‘ ?
cag - R 1 5‘ – AAT AAT CAA CAA ACA TCA CGC cag 26 , cag A , 547a diese Arbeit
CAT – 3‘
HPU - 25 5‘ – TGG TTT GAG GGC GAA TC – 3‘ ure b S. Bereswill
HPU - 50 5‘ – GAA CAT GAC TAC ACC AT – 3‘ ure b S. Bereswill
BFHUF - L 1 5‘ – AAG TAA GAT GAC TGT GC – 3‘ fhu F - Ec F. Faßbinder
1999
BFHUF - R 1 5‘ – GAT AAT GAT TGC TAA TC – 3‘ fhu F - Ec F. Faßbinder
1999
a
Nomenklatur bei 26695/ NCTC 11638/ HP - Nomenklatur
Tabelle 4: PAI-PCR-Primer
Bezeichnung Nukleotidsequenz Gena Referenz
cag A - L 1 5‘ – TAA GCA ACT CCA TAG ACC AC –3‘ cag 26 , cag A , 547 diese Arbeit
cag A - R 1 5‘ – GGT ATT CCT TAA TCC TTT AA – 3‘ cag 26 , cag A , 547 diese Arbeit
cag B - L 1 5‘ – TAC TAT TCA TAC AAG CG – 3‘ cag 25 , cag B , 546 diese Arbeit
cag B - R 1 5‘ – ACA AGA AAT AAG AAA TGA G – 3‘ cag 25 , cag B , 546 diese Arbeit
cag C - L 1 5‘ – CGA GAC TTA AGA GAA CTT – 3‘ cag 25 , cag C , 545 diese Arbeit
cag C - R 1 5‘ – AGC GCT TGT ATG AAT AG – 3‘ cag 25 , cag C , 545 diese Arbeit
cag D - L 1 5‘ – GCT TTA AGT TCT TCT ATT T – 3‘ cag 24 , cag D , 545 diese Arbeit
cag D - R 1 5‘ – GGC GGT ATT ATC TAT TT – 3‘ cag 24 , cag D , 545 diese Arbeit
cag E - L 1 5‘ – CTT CCA TTT CTT CTT CTA T – 3‘ cag 23 , cag E , 544 diese Arbeit
cag E - R 1 5‘ – GAA ACA TAT TAG CAC CGT – 3‘ cag 23 , cag E , 544 diese Arbeit
cag F - L 1 5‘ – GCC AAT GAT AAG ACA CCA – 3‘ cag 22 , cag F , 543 diese Arbeit
cag F - R 1 5‘ – TAG ATA AAT ATC AGG CCT TG – 3‘ cag 22 , cag F , 543 diese Arbeit
cag G - L 1 5‘ – CTT GTG CTT GAG ATG ATT GA – 3‘ cag 21 , cag G , 542 diese Arbeit
cag G - R 1 5‘ – TGA TAT GAG CGT TGA AGC – 3‘ cag 21 , cag G , 542 diese Arbeit
cag H - L 1 5‘ – CAC CAT TAA TAA CGC CAT – 3‘ cag 20 , cag H , 541 diese Arbeit21 2. Material Fortsetzung Tabelle 4: PAI-PCR-Primer Bezeichnung Nukleotidsequenz Gena Referenz cag H - R 1 5‘ – TCC AAA CAA TCC TTT CAT G – 3‘ cag 20 , cag H , 541 diese Arbeit cag I – L1 5‘ – TTA TAT CTT CTG CCA TCA AA – 3‘ cag 19 , cag I, 540 diese Arbeit cag I - R 1 5‘ – TAA CAG AAA GGG TGC AAA – 3‘ cag 19 , cag I , 540 diese Arbeit cag L - L 1 5‘ – CTG CCC AAT AGC GTC AT – 3‘ cag 18 , cag L , 539 diese Arbeit cag L - R 1 5‘ – GAA ACG ACA GCA AGA AAC A – 3‘ cag 18 , cag L , 539 diese Arbeit cag M - R 1 5‘ – ACT CAT CAG GCA CAA GC – 3‘ cag 16 , cag M , 538 diese Arbeit cag N - L 1 5‘ – TCC TAT GAT GAG CGA CAA – 3‘ cag 17 , cag N , 537 diese Arbeit cag N - R 1 5‘ – CGC ATT AGA AAG ATC CC – 3‘ cag 17 , cag N , 537 diese Arbeit cag P - L 1 5‘ – CCC ATG ATC AGT CCT TT – 3‘ cag 15 , cag P , 536 diese Arbeit cag P - R 1 5‘ – CAT AAA CAA ACA AAT CGT – 3‘ cag 15 , cag P , 536 diese Arbeit cag Q - L 1 5‘ – GCA ATC ATT GAG AAG AGT – 3‘ cag 14 , cag Q , 535 diese Arbeit cag Q - R 1 5‘ – ACT ATC TCT TAA GCC ACG – 3‘ cag 14 , cag Q , 535 diese Arbeit cag S - L 1 5‘ – GAA TGG CAA CTT GAA CA – 3‘ cag 13 , cag S , 534 diese Arbeit cag S - R 1 5‘ – TTT AGG GCT ATT TGT GA – 3‘ cag 13 , cag S , 534 diese Arbeit cag T - L 1 5‘ – TTA AGG TTA TTG GTA TAA A – 3‘ cag 12 , cag T , 532 diese Arbeit cag T - R 1 5‘ – AGG GAT TTG CTG ATG AA – 3‘ cag 12 , cag T , 532 diese Arbeit cag 6 – L 1 5‘ – AAT TTG AGC CAT TCT TTA GC – 3‘ cag 1 , cag 6 , 521 diese Arbeit cag 6 - R 1 5‘ – CAT TCT TTC TTC AGT CAA A– 3‘ cag 1 , cag 6 , 521 diese Arbeit cag 7 - L 1 5‘ – AAA TTT AGG CGT TGT AG – 3‘ cag 2 , cag 7 , 522 diese Arbeit cag 7 - R 1 5‘ – CTA TGA GCG ATA CAG CG – 3‘ cag 2 , cag 7 , 522 diese Arbeit cag 8 - L 1 5‘ – TGC AAT GGA TTG ATG AA – 3‘ cag 3 , cag 8 , 523 diese Arbeit cag 8 - R 1 5‘ – TTT GGC ATG GAT AGG CT – 3‘ cag 3 , cag 8 , 523 diese Arbeit cag 9 - L 1 5‘ – AGC CTA TCC ATG CCA AA –3‘ cag 4 , cag 9 , 524 diese Arbeit cag 9 - R 1 5‘ – CAA GCG AAC TGT GAT TA – 3‘ cag 4 , cag 9 , 524 diese Arbeit cag 10 - L 1 5‘ – TTT ATT CTC AAG TGC GA – 3‘ cag 5 , cag 10 , 525 diese Arbeit cag 10 - R 1 5‘ – TCA ACC ACC ACA AAC AG – 3‘ cag 5 , cag 10 , 525 diese Arbeit cag 11 - L 1 5‘ – CAA CCA ACT TAT AAT CCT C – 3‘ VirB11 – hom. diese Arbeit cag 11 - R 1 5‘ – AGC TAA ATT GAT AAC CCA – 3‘ VirB11 – hom. diese Arbeit
22 2. Material
Fortsetzung Tabelle 4: PAI-PCR-Primer
Bezeichnung Nukleotidsequenz Gena Referenz
cag 12 - L 1 5‘ – TTC TGC ACT CAA TCT GTC – 3‘ cag 6 , cag 12 , 526 diese Arbeit
cag 12 - R 1 5‘ – AGG ATA TAG TGG CGA AA – 3‘ cag 6 , cag 12 , 526 diese Arbeit
cag 15 - L 1 5‘ – TTT AGA AGT TTC AAG TTT ATC –3‘ cag 8 , cag 15 , 528 diese Arbeit
cag 15 - R 1 5‘ – GGA AGA GTT GGT GGA TC – 3‘ cag 8 , cag 15 , 528 diese Arbeit
cag 16 - L 1 5‘ – CCA AGA CAG AAA CAG CC – 3‘ cag 9 , cag 16 , 529 diese Arbeit
cag 16 - R 1 5‘ – GAC GGT AAG CGA AAT TT – 3‘ cag 9 , cag 16 , 529 diese Arbeit
cag 17 - L 1 5‘ – CCA ATT AGG AAC AAT GAG – 3‘ cag 10 , cag 17 , 530 diese Arbeit
cag 17 - R 1 5‘ – ATT GCT CTG TGA GTT GC – 3‘ cag 10 , cag 17 , 530 diese Arbeit
cag 18 - L 1 5‘ – ATC AAG GGC TAT CAC AC – 3‘ cag 11 , cag 18 , 531a diese Arbeit
cag 18 - R 1 5‘ – GCA CAG AAT TGT CGC AC – 3‘ cag 11 , cag 18 , 531a diese Arbeit
a
Nomenklatur bei 26695/ NCTC 11638/ HP - Nomenklatur
Tabelle 5 : Oligonukleotide für die DNA-Sequenzierung
Bezeichnung Nukleotidsequenz Gena Referenz
cag 6 - L 1 5‘ – AAT TTG AGC CAT TCT TTA GC – 3‘ cag 1 , cag 6 , 520 diese Arbeit
cag 8 - R 1 5‘ – TTT GGC ATG GAT AGG CT – 3‘ cag 3 , cag 8 , 522 diese Arbeit
cag 6 - S 1 5‘ – ACC TAA AGC GGC AAC AAC TG – 3‘ cag 1 , cag 6 , 520 diese Arbeit
cag 8 - S 1 5‘ – TCT TTA TCC ACT AAT AAC CC – 3‘ cag 3 , cag 8 , 522 diese Arbeit
cag 6 - S 2 5‘ – ATG AGA ATT TGT CCA TAG GG – 3‘ cag 1 , cag 6 , 520 diese Arbeit
a
Nomenklatur bei 26695/ NCTC 11638/ HP - NomenklaturSie können auch lesen
