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laborwelt
Nr. 6 / 2010 – 11. Jahrgang
Polymerase-Kettenreaktion
Methylierungssensitive PCR Paper des Monats: Messung von miRNA-
zum sensitiven Nachweis von Wie EGF-Rezeptoren intra- Expressionsprofilen in
Krebs-Vorstufen zellulär aktiviert werden Blutstammzellen
ht:
Marktübersic
PCR-Kits
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Editorial | Inhalt
Neue Biomarker
Inhalt
finden mit PCR
Paperwelt Highlight des Monats
4 Cytohesine modulieren die Aktivität des EGF-Rezeptors
Michael Famulok et al., LIMES-Institut, Universität Bonn
Blitzlicht Isotherme Amplifikation
Nach Pionieren wie der Berliner Epigenomics AG mit ihrem Septin-9- 6 OSNA: Standardisierte intraoperative Sentineldiagnostik
Biomarker greifen nun auch die Laborfirmen das Thema DNA-Methy- Elisabeth Breit, Monika Zänkert, Sysmex Europe GmbH, Norderstedt
lierung auf. Gleich zwei vor dem Start stehende Universitäts-Spin-offs
präsentierten auf der Biotechnica in Hannover neue methylierungs- Titel: PCR
sensitive PCR-Tests, die versprechen, die Diagnose des HPV-induzierten Mit einem Lab-on-a-Chip wird jetzt das Expression Profiling
Gebärmutterhalskrebses (OnCGnostics, S. 14) und des Blasenkarzinoms regulatorischer miRNAs in Einzelzellen möglich. Mehr ab Seite 17.
(Epivios, S. 32) signifikant zu verbessern. Die Arbeit der noch universitären
OnCGnostics-Forscher aus Jena verspricht die bisherige testimmanente
Überdiagnose des Humanen Papillomvirus (HPV) in Cervixabstrichen Foto: Fluidigm BV
signifikant zu verbessern – weist es doch die tatsächlich krebsrelevanten
Gewebeveränderungen CIN2 und CIN3 nach. Gerüchten zufolge haben Blitzlicht Analytik
Hildener HPV-Test-Anbieter bereits an die Tür geklopft – wohl auch, weil 10 MLVA-Genotypisierung von L. pneumophila direkt im Trinkwasser
in vitro-Diagnostik-Schwergewicht Roche schon eine Kooperation mit Leila Kahlisch, Ingrid Brettar und Manfred G. Höfle,
dem DKFZ geschlossen hat, um die Gewebeveränderungen zusätzlich Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung (HZI), Braunschweig
zum PCR-Nachweis der 15 HPV-Hochrisikosubtypen nachzuweisen. Über
beides lesen Sie in diesem LABORWELT-Themenheft „PCR“. Wissenschaft DNA-Methylierung
Ganz aktuell wartet auch New England Biolabs mit einem Test auf, mit 14 Erkennung von Neoplasien und invasiven Karzinomen
dem sich die verbreitete Methylierung in CpG-Inseln von der erst seit einem des Gebärmutterhalses
Jahr bekannten Hydroxymethylcytosin-Modifikation sicher quantitativ Alfred Hansel und Matthias Dürst, Universitätsklinikum Jena
unterscheiden lässt (vgl. S. 22). Methode der Wahl, um potentiell krebs
assoziierte Methylierungsmuster nachzuweisen, ist auch hier die qPCR, Blitzlicht Microfluidics
denn es geht bei der Entstehung von Krankheiten und Identifikation neuer 17 miRNA-Expression Profiling einzelner blutbildender Stammzellen
Biomarker schließlich um Früherkennung, das heißt den Nachweis einer Ken Livak, Fluidigm Corporation,South San Francisco, USA,
beginnenden Methylierung an krankheitsrelevanten Loci. Wichtig dabei: Véronique Lecault, Adam K. White und Oleh I. Petriv, University of British
die Validierung verlässlicher Referenzgene. PCR-Experten werben daher für Columbia, Vancouver, Kanada
die Einführung eines minimalen Datensatzes, mit dem die Qualität von
PCR-Daten nachvollziehbar und vor allem reproduzierbar wird. Ihre MIQE- Report PCR-Analytik
Standards haben sie unlängst festgelegt (S. 30) . Daneben berichten wir 22 Identifikation neuer epigenetischer Biomarker
über neue Möglichkeiten bei der Single Cell-PCR-Quantifizierung von mi Sriharsa Pradhan,
RNAs in seltenen Zellen (s. 17) und vieles mehr. Viel Lesespaß wünscht. New England Biolabs Inc., Ipswich (MA), USA
Thomas Gabrielczyk
Blitzlicht qPCR
28 Real-Time quantitative rapidPCR: Ultraschnelle Echtzeitanalyse
In diesem Heft Melanie Trenkmann, Melanie Jahn, Stefan Winter, Alexander Berka,
Analytik Jena AG, Geschäftseinheit Life Science
Blitzlicht Standardisierung
30 Qualität und Richtigkeit von qPCR-Ergebnissen steigern
Michael W. Pfaffl, Technische Universität München, Freising-Weihenstephan
Blitzlicht Diagnostik
32 Messung von Änderungen der DNA-Methylierung
zur Krebsfrüherkennung
Foued Ghanjati und Simeon Santourlidis,
Epivios, Universitätsklinikum Düsseldorf
35 Labormarkt im Umbruch
44 Karrierewelt: Forschungsergebnisse verwerten
Marktübersicht: PCR-Kits 45 Stellenmarkt
Ob zum hochsensitiven Nachweis von Krankheitserregern oder 50 Verbände
zur relativen Quantifizierung von SNPs, miRNA und der DNA-
Methylierung – PCR-Kits sind im molekularbiologischen Labor 51 Produktwelt
Standard und damit ein Riesenmarkt. Informationen zu den
spezifischen Vorteilen der verschiedenen Kits geben die Hersteller 53 Termine
in unserem aktuellen Überblick über die Tools ab Seite 36.
54 Ausblick / Impressum
LABORWELT 11. Jahrgang | Nr. 6/2010 | 3
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Paperwelt Highlight des Monats
Cytohesine modulieren
die Aktivität des
EGF-Rezeptors
Anke Bill, Anton Schmitz, Barbara Albertoni, Jin-Na Song, Lukas C. Heukamp, David Walrafen,
Franziska Thorwirth, Peter J. Verveer, Sebastian Zimmer, Lisa Meffert, Arne Schreiber, Sampur-
na Chatterjee, Roman K. Thomas, Roland T. Ullrich, Thorsten Lang & Michael Famulok (2010):
Cytohesins Are Cytoplasmic ErbB Receptor Activators, Cell, doi: 10.1016/j.cell.2010.09.011
Michael Famulok studierte in Marburg
Chemie und ging nach seiner Promotion
Der EGF-Rezeptor wird nicht allein durch seinen Liganden, den Epidermalen Wachstumsfaktor 1989 als Postdoc nach Boston, zunächst
(engl. Epidermal Growth Factor. EGF), aktiviert. Erstmals haben Famulok und Kollegen den ein Jahr an das Dept. of Chemistry des
Nachweis erbracht, dass auch cytoplasmatische Proteine aus der Familie der Cytohesine MIT, dann für zwei weitere Jahre an das
die Aktivität der Kinasefunktion des Rezeptors modulieren. In Anwesenheit des Cytohesin- Massachusetts General Hospital. Zurück-
Inhibitors SecinH3 reduzierte sich die Autophosphorylierung aktivierter EGF-Rezeptor-Dimere gekehrt nach Deutschland, gründete er
in Lungenadenokarzinomzellen um etwa 50%. Cytohesin-Überexpression korrelierte dage- seine eigene Arbeitsgruppe am Institut
gen mit einer Aktivierung des Rezeptorsignalings. Dass der Effekt physiologisch relevant für Biochemie der LMU München. Seit
ist, zeigten die Forscher um Famulok in vitro in Lungenkrebszellen. Cytohesin-Hemmung 1999 ist der Professor für Biochemie und
führte hier durch Modulation des Rezeptorsignalings zu einer signifikanten Senkung der Chemische Biologie am LIMES-Institut
Proliferationsrate, und in Lungenkrebspatienten zeigte sich ein erhöhter Cytohesinlevel. der Universität Bonn. Die Forschungs-
Obgleich der genaue Mechanismus der Cytohesin-Wirkung noch unbekannt ist, sprechen interessen des Trägers des Gottfried-
experimentelle Daten dafür, dass sie direkten Einfluss auf die Anordnung von EGF-Dimeren Wilhelm-Leibniz-Preises liegen in der
nehmen, welche nur in der sogenannten asymmetrischen Konformation aktiv sind. Mit dem Aptamer- und Intramer-Technologie, DNA-
neuen Modell der EGF-Aktivierung stellt sich die Frage, ob die bekannten Cytohesine bei der Nanoarchitektur und der Biologie von
Aktivierung anderer Tyrosinkinasen auch eine Rolle spielen, worin diese besteht und wie sie Guaninnukleotid-Austauschfaktoren.
mechanistisch zustande kommt.
LABORWELT: asymmetrische Dimer induziert oder aber die EGF-Signaling und die Cytohesinexpression
Worin liegt die biologische Bedeutung Ihrer Konformation des aktiven Dimers stabilisiert. miteinander korrelieren – ein starker Hinweis
Ergebnisse? Wir haben Hinweise, dass Cytohesine eine Kon- auf die physiologische Relevanz. Mittels des
formationsänderung der cytoplasmatischen von uns bereits 2006 identifizierten organi-
Famulok: Domäne bewirken beziehungsweise dass schen Cytohesin-Inhibitors SecinH3 konnten
Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) benötigen ein ihre Hemmung die Signalweiterleitung vom wir zudem das Tumorwachstum verlangsa-
Stimulationssignal, um aktiviert zu werden – EGF-Rezeptor beeinträchtigt. Nach unserer men. Das beantwortet die Frage nach der dia
im Falle des EGF-Rezeptors den Epidermalen Vorstellung ermöglichen die Cytohesine – ne- gnostischen und therapeutischen Relevanz.
Wachstumsfaktor EGF. Das Andocken des ben dem essentiellen Aktivierungssignal durch Die Hemmung intrazellulärer Aktivatoren
EGF-Liganden an seinen Rezeptor bewirkt die EGF-Bindung – eine Art Feinjustierung der durch kleine membrangängige Moleküle
dessen Dimerisierung sowie Konformations- Rezeptoraktivität. eröffnet vielleicht einen neuen Angriffpunkt
änderungen in dessen intrazellulären Do- gegen Krebs.
mänen. Bis vor einiger Zeit hat man gedacht, LABORWELT:
das die EGF-Bindung hinreichend ist, um die Wie groß ist dieser Effekt? LABORWELT:
Signalkaskade auszulösen. Dafür ist sie auch Welches sind ihre nächsten Forschungsziele?
absolut essentiell. Aber in den letzten Jahren Famulok:
mehrten sich Hinweise, dass die Aktivierung Bei Überexpression von Cytohesin 2 in Zellen Famulok:
komplexer ist – zum Beispiel ist stets nur ein sehen wir konzentrationsabhängig eine Ver- Eine der ganz wichtigen Fragen ist die nach
Bruchteil der EGF-Rezeptoren aktiv. Zudem gab dopplung bis Verdreifachung des Signals. dem genauen molekularen Mechanismus
es aus Strukturanalysen Hinweise, dass eine der Cy tohesin-Wirkung. Dem wollen wir
bestimmte Konformation – das sogenannte LABORWELT: mit Strukturanalysen und biochemischen
asymmetrische Dimer – die Kinasedomänen Welche diagnostischen oder therapeutischen Methoden nachgehen. Darüber hinaus zeigt
aktiviert. Damit kam die Frage auf, ob diese Optionen ergeben sich aus Ihrer Arbeit? die Sec7-Domäne von Cytohesinen neben
Konformation allein durch Ligandenbindung dem direkten Effekt auf die Kinasedomänen
oder zusätzliche Faktoren gefördert wird. Famulok: eine weitere Wirkung als Guaninnukleotid-
Die Bedeutung unserer Arbeit besteht darin, Nachdem der Aktivierungseffekt des EGF- Austauschfaktor, und wir würden gerne diese
dass wir mit den Cytohesinen erstmals zyto- Signalings durch Cytohesine in Lungenkrebs- duale Funktion mechanistisch verstehen.
plasmatische Faktoren identifizieren konnten, zellen gezeigt war, haben wir uns zusammen Zudem möchten wir uns gerne die Rollen
deren Präsenz die Aktivierung noch weiter mit Pathologen die Cytohesinspiegel in Lun- der vier bekannten Cytohesine bei anderen
verstärken kann. Der molekulare Mechanismus genkrebsproben angesehen und statistisch Rezeptortyrosinkinasen anschauen – für den
ist allerdings noch unbekannt. Wir können erhöhte Spiegel in den Tumoren gefunden. Insulinrezeptor ist zum Beispiel bereits ihre
aber sagen, dass ein Cytohesin entweder das Wir konnten darüber hinaus zeigen, dass das Rolle als Aktivator gezeigt.
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Blitzlicht Isotherme Amplifikation
OSNA: Standardisierte morlast charakterisiert werden kann. Die mo-
lekulardiagnostische Methode ermöglicht eine
semi-quantitative Bestimmung der zellulären
intraoperative Zytokeratin 19 (CK19)-mRNA-Expression. CK19
ist als Epithelzellmarker im tumorfreien axillä-
ren Lymphknotengewebe nicht nachweisbar.
Sentineldiagnostik Benigne epitheliale Inklusionen fallen unter
die Nachweisgrenze der Methode.
Dr. Elisabeth Breit, Monika Zänkert, Sysmex Europe GmbH, Norderstedt Das OSNA-Verfahren
OSNA ist ein isothermes Reaktionsverfahren,
Der axilläre Nodalstatus ist der wichtigste Prognosefaktor beim Mammakarzinom. Lange Zeit welches auf einer speziellen Technologie zur
war die komplette Ausräumung der axillären Lymphknoten und deren pathologische Beurteilung Amplifizierung von Nukleinsäuren basiert: der
die klassische Behandlungsmethode. Seit den neunziger Jahren ist diese radikale chirurgische Reverse Transcription Loop-Mediated Isother-
Herangehensweise durch eine selektive und weniger invasive Methode ersetzt worden – die mal Amplification (RT-LAMP)6. Gegenüber ge-
Wächterlymphknoten-Biopsie. Nach intraoperativer Beurteilung der Wächterlymphknoten mittels läufigen PCR-Methoden bietet die Anwendung
histologischer Schnellschnittanalyse entscheidet der Arzt über die operative Entfernung oder den der RT-LAMP-Technologie deutliche Vorteile.
Verbleib der axillären Lymphknoten. Mit dem molekularbiologischen Diagnoseverfahren OSNA Der Assay wurde so optimiert, dass eine hohe
(One Step Nucleic Acid Amplification) ist eine standardisierte Analyse des gesamten Lymphknotens Spezifität und Sensitivität gewährleistet sind.
intraoperativ möglich. Eine verlässliche Diagnose des Nodalstatus erfolgt während der Erstope- Durch die konstante Reaktionstemperatur wird
ration. Die bislang notwendige postoperative histologische Analyse entfällt. Den betroffenen die unerwünschte Amplifizierung genomischer
Brustkrebspatientinnen wird die psychische Belastung der Ungewissheit während des Wartens DNA verhindert. Die Amplifikation erfolgt über
sowie ein zweiter chirurgischer Eingriff erspart. eine Strand-displacement-Polymerase, deren
Reaktionsoptimum bei 65°C liegt. Während
für die RT-PCR nur zwei Primer zur Erkennung
der Zielsequenz eingesetzt werden, wurden
für die RT-LAMP sechs Exon-übergreifende
Primer so konzipiert, dass einerseits die Am
plifizierung von Pseudogenen ausgeschlossen,
andererseits die Reaktionsgeschwindigkeit
erhöht wird. Falsch-positive Ergebnisse werden
dadurch vermieden.
Die Reaktionszeit für eine Probe beträgt 16
Minuten, und der Amplifizierungsverlauf wird
in Echtzeit überwacht (Abb. 1). Als Messgröße
dient ein Nebenprodukt der Reaktion: Magne-
siumpyrophosphat bildet sich mengenmäßig
proportional zum Amplifikat und führt zu
Abb. 1: Arbeitsablauf bei der One Step Nucleic Acid Amplification (OSNA) einer Trübung im Reaktionsgemisch, die pho-
tometrisch bei 465 nm gemessen wird7. Das
Die Wächterlymphknoten-Biopsie (sentinel Die Anzahl unnötiger Lymphadenektomien Präzipitat bildet sich aus Pyrophoshat-Ionen,
lymph node biopsy) ist als minimalinvasive und damit einhergehende Komplikationen wie die bei der Amplifizierung aus den Nukleotiden
Methode zur Bestimmung des Nodalstatus bei Schulter-Arm-Morbidität werden erheblich freigesetzt werden, und in der Reagenzlösung
Patientinnen mit primärem Mammakarzinom reduziert3. Der Wächterlymphknoten kann intra vorhandenem zweiwertigem Magnesium. Zur
in einem frühen Stadium als Behandlungs- operativ mittels Gefrierschnittdiagnostik oder Ergebnisermittlung dient eine Standardkurve
standard etabliert1. Ein Wächterlymphknoten ist Imprintzytologie untersucht werden; allerdings mit drei Kalibratoren unterschiedlicher CK19-
der erste Lymphknoten im Lymphabflussgebiet weisen diese Methoden falsch-negative Raten mRNA-Konzentrationen, welche im gebrauchs-
eines Mammakarzinoms und repräsentativ für zwischen 5% und 45% auf4. Die eingeschränkte fertigen Reagenzienkit LYNOAMP BC (Sysmex,
den Nodalstatus der Axilla2. Bei einem positiven Sensitivität resultiert aus der geringen Menge Kobe, Japan) enthalten sind.
Wächterlymphknoten wird eine konventionelle an Lymphknotengewebe, welche in dem be- Nach der Homogenisierung (90 Sekunden)
Axilladissektion durchgeführt, bei einem nega- grenzten Zeitrahmen einer Operation begut- des Lymphknotengewebes mit dem Homoge-
tiven wird darauf verzichtet. achtet werden kann. Eine große Anzahl von nisierungspuffer (LYNORHAG, Sysmex) erfolgt
Lymphknotenmetastasen wird erst postoperativ ein kurzer Zentrifugationsschritt (Abb. 1). Im
bei einer aufwendigen histopathologischen Un- Gegensatz zur RT-PCR entfällt ein vorheriger
Grundlagen der intraoperativen tersuchung am Paraffinschnitt erkannt. Davon Aufreinigungsschritt der RNA. Die Amplifizie-
Sentineldiagnostik betroffene Patientinnen müssen sich dann einer rung erfolgt direkt aus dem Lysat. Der Reakti-
Zweitoperation unterziehen. Die Applikation onsansatz wird durch einen Pipettierrobotor
Eine zuverlässige intraoperative Detektion dieser Methoden erfolgt zudem nicht standar- im RD-100i (Sysmex) vorbereitet. Anschließend
von Metastasen im Wächterlymphknoten er- disiert, woraus sich die Spannbreite hinsichtlich erfolgt die Amplifizierung und Detektion in dem
möglicht die Entscheidung über eine axilläre der Genauigkeit ergibt5 automatisierten Real-Time-System unter stan-
Dissektion während derselben Operation. Somit Im Gegensatz dazu ist der OSNA (One Step
entfällt die nachgeführte Bestätigungsanalyse Nucleic Acid Amplification)-Test ein automa-
und damit für die Patientinnen die belastende tisiertes System, mit dem intraoperativ der
Wartezeit bis zur definitiven Diagnosestellung. gesamte Lymphknoten bezüglich seiner Tu-
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Blitzlicht Isotherme Amplifikation
kürzlich publiziert13. Die Konkordanz zwischen
beiden Diagnostikverfahren lag bei mehr als
95%13. Im Gegensatz zum Einsatz beim Mam-
makarzinom ist OSNA beim Kolonkarzinom
für die postoperative Analytik indiziert. Die
Lymphadenektomie wird beim Kolonkarzinom
standardmäßig durchgeführt. Daraus resultiert
eine relativ große Anzahl von Lymphknoten für
die histologische Untersuchung, welche in der
Regel aus einem oder gegebenenfalls seriellen
H&E-Schnitten besteht. Allerdings erleiden 20%
der initial nodal-negativen Darmkrebspatienten,
für die keine adjuvante Therapie indiziert ist,
innerhalb von fünf Jahren ein Rezidiv14 – ein
deutlicher Hinweis darauf, dass bei diesen
Patienten Metastasen übersehen wurden15.
Abb. 2: Das OSNA-System: Innenansicht des RD-100i (links) mit Reagenzien (Pfeil) und Homo- Auch hier könnte die OSNA-Analyse des ganzen
genisierungspuffer (rechts) Lymphknotens entscheidend zu einer genaueren
und standardisierten Anzeige der Tumorlast und
dardisierten Bedingungen. Je eine Negativ- und somit einer richtigen Zuordnung von Kolonkarzi-
Positivkontrolle der CK19-mRNA, die Bestand- OSNA in der klinischen Routine nompatienten in klinischen Stadien beitragen.
teile des Reagenzienkits sind, werden in jedem
Analysenlauf mitgeführt und gewährleisten OSNA ist CE-zertifiziert und konform zu den An-
die Ergebnisqualität. Bis zu vier Lymphknoten forderungen der Richtlinie 98/79/eG für in-vitro- Fazit
können parallel analysiert werden. Die Ergeb- Diagnostika. Der Test ist für den Einsatz in der
nisse stehen nach etwa dreißig Minuten zur Diagnostik zugelassen. Er kommt europaweit in OSNA ist ein standardisiertes, molekulardiag-
Verfügung. Dies schließt die kurze manuelle derzeit mehr als 80 Kliniken routinemäßig zur nostisches Testverfahren für die intraoperative
Vorbereitungszeit ein. Die semi-quantitative Anwendung. Der Anteil des Lymphknotengewe- Diagnostik des Wächterlymphknotens beim
Bestimmung der CK19-mRNA-Kopienzahl dif- bes, der intraoperativ mit OSNA analysiert wird, Mammakarzinom. Die Genauigkeit von OSNA
ferenziert positive und negative Ergebnisse. Zu- kann individuellen Protokollen und Anforderun- ist vergleichbar mit einer aufwendigen histolo-
dem wird die Größe der metastatischen Herde gen angepasst werden. Einige OSNA-Nutzer gischen Aufarbeitung (H&E sowie IHC-Färbung)
indiziert. Abhängig von der gemessenen Kopien asservieren etwa eine 1 mm dicke Mittelscheibe von seriellen Paraffinschnitten. Im Gegensatz zu
zahl der Marker-mRNA werden die Ergebnisse für die Histologie. den konventionellen histopathologischen Me-
in drei Kategorien unterteilt: Makrometastasen Bei kompletter Lymphknotenanalyse entfällt thoden ermöglicht das OSNA-System die Ana-
(++, >5000 CK19-mRNA-Kopien/µL), Mikrome- die postoperative Histologie mit der entsprechen- lyse des gesamten Lymphknotens und somit die
tastasen (+, 250-5000 CK19-mRNA-Kopien/µL) den Arbeitsentlastung und Kosteneinsparung. Entscheidung während des chirurgischen Ein-
und keine Metastasen (–, < 250 CK19-mRNA- Vom intraoperativen Nachweis von Metastasen griffs. Beim Kolonkarzinom kann es postoperativ
Kopien/µL). im Wächterlymphknoten profitieren insbeson- zur Typisierung der metastatischen Besiedlung
dere die Brustkrebspatientinnen. Das psychisch in den Lymphknoten eingesetzt werden.
enorm belastende Warten bis zur endgültigen
OSNA in der klinischen Anwendung Diagnose bleibt ihnen erspart, ebenso wie ein
weiterer operativer Eingriff und die damit ver- Literatur
Der Beleg für die Wirksamkeit dieser neuen Me- bundene Belastung einer erneuten Anästhesie.
thode erfolgte weltweit in mehreren klinischen Das Risiko möglicher technischer Komplikationen [1] Lyman GH, et al (2005). J Clin Oncol 23:7703-20.
[2] Morton DL, et al (1992). Arch Surg 127:392-99.
Studien8-12 an insgesamt 2.313 Lymphkoten. Hier- wird vermindert und weitere therapeutische [3] Lucci A, et al (2007). J Clin Oncol 25:3657-63.
zu wurde der Lymphknoten mit einem speziell Schritte deutlich früher eingeleitet. [4] Motumura K, et al (2000). Br J Surg 87:597-601.
entwickelten Schneidegerät in vier gleichgroße Das Vermeiden von Zweiteingriffen und post- [5] Cserni G (2005). Histopathology 46: 697-706.
[6] Notomi T, et al (2000). Nucleic Acids Research 28:e63.
Scheiben zerteilt. Zwei alternierende Scheiben operativen Untersuchungen ist auch wirtschaft- [7] Mori Y, et al (2001). Biochem Biophys Res Commun
wurden mit OSNA untersucht und die beiden lich von Vorteil. Prozesse werden optimiert und 289:150-54.
Vergleichsproben histologisch aufgearbeitet. knapp bemessene finanzielle sowie personelle [8] Tsujimoto M, et al (2007). Clin Can Res 13: 4807-16.
[9] Visser M, et al (2008). Int J Cancer 122: 2562-67.
Die beiden histologischen Scheiben wurden in Ressourcen auf andere Bereiche verteilt. Kürzere [10] Schem C, et al (2009). Virchows Arch 454: 203-10.
Formalin fixiert. Postoperativ wurde jede dieser stationäre Aufenthalte, besser ausgelastete [11] Tamaki Y, et al (2009). Clin Can Res 15: 2879-84.
Scheiben in Stufen mit 100-250 µm-Intervallen, Operationsflächen und die damit einhergehen- [12] Snook KL, et al (2010). Br J Surg, accepted 10/2010
[13] Croner RS, et al (2010). J Transl Med 8:83-8.
je nach Studienprotokoll, histologisch unter- de Effizienzsteigerung sind das Ergebnis. [14] Berberoglu U (2004). Hepatogastroenterology 51:1689-93.
sucht. Jede Stufe bestand aus drei Schnitten [15] Bilchik AJ, et al (2002). Arch Surg 137:1377-83.
mit jeweils einer Hämatoxylin&Eosin (H&E)-
Färbung, einer immunhistochemischen Fär- OSNA beim Kolonkarzinom
bung mit einem pan-CK-Antikörper sowie des Korrespondenzadresse
CK19-Proteins. Diese postoperative Analytik ist Neben dem routinemäßigen Einsatz beim Mam-
sehr viel gründlicher als dies in nationalen und makarzinom ist die Anwendung von OSNA auch Dr. Elisabeth Breit
internationalen Empfehlungen für die Unter- in anderen Krebsentitäten in der Entwicklung. So Monika Zänkert
suchung eines Wächterlymphknotens vorge- wurden in einer klinischen Studie 600 Lymph- Sysmex Europe GmbH
geben wird. Für den OSNA-Test konnte in diesen knoten von Patienten mit Kolonkarzinom einer Bornbarch 1, 22848 Norderstedt
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Blitzlicht qPCR
MLVA-Genotypisierung Von den bisher identifizierten 48 Legionella-
Spezies ist Legionella pneumophila für etwa
91% aller Legionellen-Erkrankungen beim Men-
von L. pneumophila direkt schen verantwortlich2. Das Bakterium wurde
erstmals 1976 bei einem Veteranentreffen der
„American Legion“ in Philadelphia identifiziert,
im Trinkwasser bei dem 29 Teilnehmer an einer schweren Lun-
geninfektion starben3. Daher rührt der Name
„Legionärskrankheit“. Legionellen-assoziierte
Lungeninfektionen haben in den vergangenen
Dr. Leila Kahlisch, Dr. Ingrid Brettar und Dr. Manfred G. Höfle, Abteilung Vakzinologie und Jahrzehnten zugenommen. Dies lässt sich vor
Angewandte Mikrobiologie, Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung (HZI), Braunschweig allem auf Veränderungen im Lebensstil zurück-
führen, die das Vorkommen von warmem Was-
ser fördern: Kühltürme, Klimaanlagen, Duschen
Legionella pneumophila verursacht die Legionärskrankheit, eine schwere Lungeninfektion, und Whirlpools bieten für Legionellen ideale
und ist vor allem für ältere und immungeschwächte Personen eine Gefahr. Die Infektion er- Lebensräume und unterstützen zugleich ihre
folgt durch Einatmen erregerhaltiger Aerosole, etwa beim Duschen oder über Klimaanlagen. Übertragung per Aerosol auf den Menschen.
Da Legionellen natürlich in den meisten aquatischen Lebensräumen vorkommen, ist es kaum
möglich, ihr Eindringen in von Menschen geschaffene Lebensräume wie Trinkwasserversor-
gungssysteme zu verhindern. Um L. pneumophila-bedingte Lungeninfektionen besser verstehen Methoden zur Genotypisierung von
und vermeiden zu können, ist es wichtig, das Bakterium möglichst frühzeitig zu erkennen und Legionella pneumophila-Isolaten
einzuordnen. PCR-gestützte Verfahren auf Grundlage repetitiver DNA-Elemente können dabei
helfen, Legionellen-Isolate sehr präzise zu genotypisieren und damit Informationen über ihre Eine Infektion mit Legionella pneumophila
Virulenz und Herkunft zu erhalten. Da die Isolierung der Legionellen oft problematisch ist, kann – vor allem für immungeschwächte,
haben wir die Methodik weiterentwickelt, so dass Legionellenstämme nun direkt auf der Basis ältere Menschen, AIDS-Patienten oder Organ
von aus dem Wasser gewonnener genomischer Bakterien-DNA identifiziert und genotypisiert transplantatempfänger – ein bedeutendes
werden können. Gesundheitsrisiko darstellen. Um durch diesen
Erreger verursachte Lungeninfektionen und
deren Epidemiologie zu verstehen, ist eine
Bei der Gattung Legionella handelt es sich um Legionellen sind in der Lage, im Menschen genaue Identifizierung von Stämmen, mindes-
stäbchenförmige Bakterien aus der Klasse der g- eine atypische Pneumonie auszulösen. Dies tens Sub-Spezies, nötig. Molekulare Werkzeuge
Proteobakterien. Die Gram-negativen begeißel- geschieht über das Inhalieren kontaminierter zur Analyse bakterieller DNA wie zum Beispiel
ten Bakterien kommen in vielen natürlichen und Wassertröpfchen, die zum Beispiel beim Du- MLST (Multi-Locus Sequence Typing,4) und MLVA
künstlich geschaffenen aquatischen Lebensräu- schen entstehen. Über die Tröpfchen gelangen (Multiple-Locus Variable-Number of Tandem
men vor, besonders in Biofilmen (Abb. 1). Dort die Erreger tief in die Lungenalveolen, wo sie Repeat Analysis) sind anerkannte Methoden, um
leben und vermehren sie sich in aquatischen alveoläre Makrophagen infiltrieren und so die den Genotyp pathogener Bakterien zu bestim-
Protozoen-Arten, wie etwa Amöben1. Manche Pneumonie auslösen können. men. Die MLVA-Analyse basiert dabei auf der
Variation sogenannter VNTRs (variable number
of tandem repeats) an verschiedenen Genom-
Loci. Diese repetitiven DNA-Elemente sind Orte
häufiger DNA-Rekombinationen. Des Weiteren
begünstigen sie ein „Verrutschen“ der DNA-
Polymerase während der Replikation, was zu
Strangverschiebungen und somit Variationen in
der Länge der repetitiven Elemente führen kann.
Wenn dies mit einer gewissen Häufigkeit in der
Entwicklung/Geschichte einer Art aufgetreten
ist, können die Variationen an verschiedenen
Genom-Loci dazu genutzt werden, um Stämme
voneinander zu unterscheiden.
Mit Hilfe von PCR-Primern, die an die flan-
kierenden Regionen dieser repetitiven DNA-
Elemente binden, kann die Variation über die
Analyse der Länge des PCR-Produktes analysiert
werden (Abb. 2). Vor allem bei innerhalb der
Spezies genetisch sehr ähnlichen Bakterien
wie zum Beispiel Mycobacterium tuberculosis
oder Pseudomonas aeruginosa konnte mit Hilfe
dieses Werkzeuges eine Genotypisierung durch-
geführt werden, obwohl sich die Stämme mit
klassischen Methoden (wie zum Beispiel einer
Abb. 1. a. Typische Trinkwasser-Mikroflora gefärbt mit SybrGreen I. b. Immunfluoreszenzmikros- Serotypisierung) kaum voneinander unterschei-
kopische Aufnahme von L. pneumophila in Reinkultur. c. und d. Immunfluoreszenzmikro- den ließen. Der sicherheitstechnische Vorteil
skopische Aufnahme von L. pneumophila in Biofilmproben eines Kühlturms. 1. Antikörper: dieser Methode ist, dass MLVA-Daten via Inter-
anti-Legionella pneumophila 1:100, 2. Antikörper: DyLight 488 konjugierter anti-Maus- netdatenbanken weltweit unter Forschungsein-
Antikörper 1:250. Hintergrundfärbung: DAPI. Grüner Pfeil: L. pneumophila-Zelle. richtungen und Kliniken ausgetauscht werden
10 | 11. Jahrgang | Nr. 6/2010 LABORWELT
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Um Legionellen-Isolate zu erhalten, wurden
auf einem Filter konzentrierte Trinkwasser-
bakterien nach Behandlung mit einem sauren
Puffermedium auf Legionellen-spezifischem
Agar-Nährmedium inkubiert. Die nach einigen
Tagen sichtbaren Kolonien wurden in Kultur
genommen und die Art mittels 16S-rRNA-
Sequenzierung bestimmt. Auf diese Weise wur-
den 15 unterschiedliche Legionellen-Isolate aus
verschiedenen Kalt- und Warmwasserquellen
auf dem Gelände des Helmholtz-Zentrums in
Braunschweig gewonnen. Diese Isolate wurden
in zwei Multiplex-PCRs mit fluoreszenzmar-
kierten Primern analysiert und in verschiedene
Abb.2: Prinzip der VNTR-PCR. Wenn mehrere Genotypen eingeteilt.
Genom-Loci untersucht werden, wird
die Methode MLVA (Multiple-locus
variable number of tandem repeat In-situ-Genotypisierung in Trinkwasser
analysis) genannt.
Traditionell wird Legionella pneumophila in 15
können statt potentiell infektiöse Isolate von Serogruppen eingeteilt, wobei Serotyp 1 als
Labor zu Labor verschicken zu müssen. Die Hauptkrankheitserreger gilt. Diese Klassifizie- Next Generation
Datenbanken, die nun zum Abgleich von neuen rung ist aber zu grob, um etwa die Ausbreitung
Isolaten zur Verfügung stehen, wachsen von Tag virulenter Serotyp 1-Stämme effizient zu über- Sequencing
zu Tag und sind zu einem wichtigen Hilfsmittel wachen und bis zur Quelle zurückzuverfolgen.
zur Analyse neuer, epidemiologisch relevanter Epidemiologische Studien erfordern stattdessen
Isolate einer Spezies geworden. Methoden, die jeden Serotyp sehr präzise in Ge-
Für Legionella pneumophila steht seit 2007 notypen unterteilen. Um eine hochauflösende
eine Datenbank zur Verfügung, die Daten zu Einordnung der Stämme zu ermöglichen, ist
acht verschiedenen Genom-Loci vorhält und eine PCR-basierte Typisierungsmethode wie die
Vergleiche zu bereits bekannten Legionellen- MLVA geeignet, wie mit Isolattypisierung gezeigt
Isolaten ermöglicht. Die von Pourcel et al.5 wurde. Die acht Loci umfassende Multiplex-PCR
entwickelte Methode zur Genotypisierung von wurde genutzt, um direkt mehrere Wasserpro-
Legionella pneumophila-Isolaten wurde von ben auf das Vorkommen und die Genotypen von
uns für die Anwendung auf Kapillarsequenzern
optimiert; dabei werden die unterschiedlichen
Primer-Paare fluoreszenzmarkiert und die so
Legionella pneumophila zu screenen. Die Ergeb-
nisse der Kapillarelektrophorese zeigten, dass es
mehrere Legionella pneumophila-Genotypen
SPRIworks
entstehenden PCR-Produkte über ihre Länge innerhalb einer Umweltprobe gab. Um diese Simplifies Next Generation Sequencing
nach Farbmarkierung mit einem Kapillarsequen- voneinander zu trennen, wurde eine neue Me-
zierer identifiziert5-7. thode entwickelt, die neben dem Nachweis von Fully Automated
Legionella pneumophila in einer Probe auch den
MLVA-Genotyp erfasst. Dabei werden anstelle Fragment Library System
Isolation und Genotypisierung mit MLVA fluoreszenzmarkierter VNTR-Primer, Primer mit For the next Generation Sequencers
einer Biotin-Markierung eingesetzt und acht
Die Isolation von Legionellen aus Umweltpro- einzelne PCR-Reaktionen durchgeführt (Abb.
l Full Library Construction Process in a Cartridge
ben ist zeitaufwändig und schwierig, denn die 3, S. 12). Sofern in einer PCR-Probe mehrere Ge-
Bakterien wachsen sehr langsam und stellen notypen vorhanden sind, entsteht ein Gemisch l Easy to Use and Operate Bench-top System
hohe Ansprüche an das Kulturmedium. Hinzu unterschiedlich langer PCR-Produkte. Um dieses l No More Gels - Built in SPRI Size Selection Chemistry
kommt, dass Legionellen auch auf Selektionsme- effektiv aufzutrennen, setzten wir eine Hoch-
dium oft überwachsen werden, wodurch sie oft spannungselektrophorese ein, die es erlaubt, l Run up to 10 Samples at a Time
supprimiert oder ihre Identifizierung erschwert auch PCR-Produkte voneinander zu trennen, die l Maximizes Sequencing Work-flow
werden. In Fällen einer Epidemie, ist daher das sich nur durch wenige Basen voneinander un-
Kultivierungsverfahren oft zu langwierig und terscheiden. Diese „Single Strand Conformation
zu wenig erfolgreich, um Genotyp und Virulenz Polymorphism (SSCP)-Analyse“ ist ein anerkann-
schnell und sicher zu ermitteln. Die Analyse tes elektrophoretisches Verfahren, das bereits er-
der DNA, die aus einer Probe (z.B. Wasserprobe folgreich zur Charakterisierung von mikrobiellen
oder klinischen Probe wie Sputum oder Lavage- Lebensgemeinschaften eingesetzt wurde9-11. Die
Flüssigkeit) gewonnen werden kann, könnte das Methodik basiert darauf, dass einzelsträngige
Isolierungsverfahren für Pathogene in Zukunft DNA-Moleküle eine individuelle Konformation
nicht nur ergänzen, sondern eventuell sogar einnehmen und demzufolge unterschiedliche
ersetzen. Für die Analyse von Wasserproben wer- Laufstrecken bei einer Gelelektrophorese zurück-
den dabei mehrere Liter Wasser durch feinporige legen11. Um ein einzelsträngiges PCR-Produkt zu
Membranen (Porenweite: 0,2µm) filtriert. Die so erhalten, wird dazu die PCR mit einem Biotin-
„geernteten“ Bakterien können auf dem Filter markierten Vorwärts-Primer durchgeführt. Das
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„ S p ü lk ü c h e 1 “ Heißwasser DNA
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„ S p ü lk ü c h e 2 “
zwei Einzelstränge geteilt, die auf ein SSCP-Gel Anwendungsmöglichkeiten
geladen werden. Nach Gelelektrophorese wer-
Marker1 1 3 33 35 13 17 19 34 1 3 33 35 13 17 19 34 1 3 33 35 13 17 19 34 Marker 2
den die aufgetrennten DNA-Amplicons mittels Mit Hilfe dieser Methode wurde, unseres Wis-
Lpms LpmsLpmsLpms LpmsLpms LpmsLpms LpmsLpmsLpms LpmsLpms LpmsLpmsLpms LpmsLpms LpmsLpms LpmsLpmsLpms LpmsLpms Lpms
Silberfärbung sichtbar gemacht. Die einzelnen sens nach, die erste Studie durchgeführt, bei der
Banden können ausgeschnitten und unter eine MLVA-Analyse direkt auf Umweltproben
Einsatz der Original-Primer-Paare sequenziert angewandt wurde, also ohne zuvor Isolate zur
werden. Genotypisierung gewinnen zu müssen12. Dieser
Die PCR-Produkte der einzelnen VNTR-Loci Ansatz ist nicht nur auf Trinkwasser beschränkt, * * *
*
wurden auf diese Weise aufgetrennt. Dieser sondern universell einsetzbar. Auch klinische
* *
* * *
experimentelle Ansatz wurde für zwei Umwelt- Proben wie Sputum oder Biopsie-Material *
* *
Isolate und die zugehörige Umwelt-DNA des können untersucht werden, sofern sich aus
Isolationsortes durchgeführt (Abb. 4). Die ent- diesen genomische Bakterien-DNA isolieren
standenen Banden wurden sequenziert, um lässt. Dadurch dass die Methodik nur auf dem
die Länge der Amplicons und deren Sequenz Nachweis der bakteriellen Nukleinsäuren ba-
genau zu bestimmen. Die zwei Legionella siert, können auch gefrorene Proben (etwa aus
pneumophila-Isolate zeigten bei der Analyse Biobanken) eingesetzt werden, um molekulare
meist eine klare Bande pro VNTR-Locus. In der Epidemiologie-Studien nach Ausbrüchen von
Umweltprobe konnten aber für drei VNTR-Loci Legionellosen durchzuführen. Ein zusätzlicher
zusätzliche Banden identifiziert werden. Ihre Vorteil dieses Ansatzes ist, dass keine potentiell
Sequenzierung ergab, dass es sich um Allele infektiösen Isolate generiert werden müssen,
der Genom-Loci handelt. Beispielsweise wur- um Legionella pneumophila nachweisen zu kön-
den an Locus 1 sowohl zwei als auch sieben nen. Die neue Methode kann daher dazu dienen,
Wiederholungen des gleichen VNTRs durch die Infektionspfade von Legionellosen besser
Sequenzierung nachgewiesen. Dies zeigt, dass zu verstehen und Strategien zu entwickeln, um * *
* *
mit der neuen molekularen Methode in einer zukünftigen Ausbrüchen vorzubeugen.
Umweltprobe mehr Legionella pneumophila-Ge-
notypen nachgewiesen werden können als mit
herkömmlichen Methoden. Die neue Methodik Literatur Abb. 4: Single-strand conformation poly-
erwies sich zudem als sehr sensitiv – mittels morphism (SSCP)-Gelelektrophorese
[1] Steinert, M., Hentschel, U. & Hacker, J. FEMS Microbiol.
real-time-PCR wurde gezeigt, dass auch geringe Rev 26, 149-162 (2002).
der einzelsträngigen PCR-Produkte
Konzentrationen von Legionella pneumophila [2] Yu, V.L. u. a. J. Infect. Diseases 186, 127-128 (2002). für alle acht VNTR-Loci. Aufgetragen
im Trinkwasser ausreichen (Anzahl Genome [3] Fraser, D.W. u. a. N. Engl. J. Med 297, 1189-1197 (1977). sind zwei L. pneumophila-Isolate
[4] Gaia, V. u. a. . J. Clin. Microbiol. 43, 2047 (2005).
pro ml), um das Bakteriums nachweisen und [5] Pourcel, C., Vidgop, Y., Ramisse, F., Vergnaud, G. & Tram, (SK1, SK2) und die korrespondierende
genotypisieren zu können12. C. J. Clin. Microbiol. 41, 1819-1826 (2003). Umweltproben-DNA (Heißwasser,
Spülküche). Pfeile markieren die
Hauptbanden für die einzelnen
VNTR-Loci; Sternchen markieren
VNTRs gleicher Sequenz mit ver-
schiedener Wiederholungszahl
(entsprechend unterschiedlicher
Lauflänge).
[6] Pourcel, C. u. a. J. Clin. Microbiol. 45, 1190-1199 (2007).
[7] Nederbragt, A.J. u. a. J. Microbiol. Methods 73, 111-117
(2008).
[8] Eichler, S., Weinbauer, M.G., Dominik, D. & Höfle, M.
Extraction of total RNA and DNA from bacterioplankton,
chapter 1.0.8. Molecular microbial ecology manual
103-120 (2004).
[9] Eichler, S. u. a. Appl. Environ. Microbiol. 72, 1858–1872
(2006).
[10] Henne, K., Kahlisch, L., Draheim, J., Brettar, I. & Höfle,
M.G. Water Science & Technology: Water Supply 8, 527
(2008).
[11] Schmalenberger A., Schwieger, F., & Tebbe, C. C. Appl.
Environ. Microbiol 67, 3557-3563 (2001).
[12] Kahlisch, L. Henne, K, Draheim, J., Brettar, I., & Höfle, M.
G. Appl. Environ. Microbiol. 76, 6186-6195 (2010).
Korrespondenzadresse
PD Dr. Manfred G. Höfle
Abt. Vakzinologie u. Angew. Mikrobiologie
Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung
(HZI)
Tel.: +49-(0)531-6181-4234
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UhrWissenschaft DNA-Methylierung
Erkennung von Neoplasien HR-HPV-Typen vor, ist eine Krebserkrankung
oder Krebsvorstufe praktisch ausgeschlossen4.
Umgekehrt bedeutet die Infektion mit HPV
und invasiven Karzinomen aber nicht automatisch das Vorliegen oder die
Entstehung einer Krebsvorstufe. Tatsächlich
heilen die meisten HPV-Infektionen innerhalb
des Gebärmutterhalses von acht Monaten wieder aus. Nur etwa 10%
aller Infizierten entwickeln klinisch manifeste
Läsionen, die in eine therapiebedürftige Krebs-
vorstufe übergehen können.
Dr. Alfred Hansel und Prof. Dr. Matthias Dürst, Gynäkologische Molekularbiologie,
Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe, Universitätsklinikum Jena
Methylierungssignaturen
Die Methylierung von CpG-Inseln, insbesondere in Promotor-nahen Bereich von Genen, geht Entscheidend für eine vergleichende genom-
häufig mit einer Reduktion der Genexpression einher. Die Tatsache, dass die Modulation einzel- weite Methylierungsanalyse von Normal- und
ner Gene einen wesentlichen Beitrag zur Umprogrammierung in eine Krebszelle leisten kann, Tumorgewebe ist die Anreicherung der methy-
hat die Analyse der DNA-Methylierung im Zusammenhang mit der Tumorentstehung stark lierten DNA. Für diese Anreicherung können
forciert 1. Bei diesen Untersuchungen wurde auch deutlich, dass das Muster der methylierten entweder in rekombinanter Form erhältliche,
DNA-Bereiche spezifisch für bestimmte Tumorentitäten sein kann. Dies nährt die Hoffnung, Methylcytosin-bindende Proteine (Abb. 1)
Signaturen tumorspezifischer Marker definieren zu können, die in der Krebsdiagnostik Anwen- oder aber Antikörper gegen Methylcytosin
dung finden. In diesem Artikel wird die Vorgehensweise für die Identifizierung einer solchen verwendet werden. Die so angereicherte DNA
Methylierungssignatur dargestellt. Diese Methylierungssignatur soll perspektivisch in der wird dann in Arrayanalysen eingesetzt. Dazu
Zervixkarzinomvorsorge eingesetzt werden. werden die angereicherten DNAs durch Ultra-
schall oder DNA-Restriktion in Fragmente von
etwa 500 Bp zerkleinert und anschließend mit
Das Zervixkarzinom ist die zweithäufigs- Basis eines einmaligen Pap-Tests lediglich die Fluoreszenzfarbstoff markiert. Normal- und
te Krebserkrankung bei Frauen weltweit, Hälfte aller Krebsvorstufen erkannt werden. Tumor-DNA werden andersfarbig markiert, bei-
mit jährlich mehr als 530.000 registrierten Dagegen lag nur jedem fünften auffälligen de DNAs gemischt und auf Arrays hybridisiert.
Neuerkrankungen (Deutschland: 5.470) und Pap-Befund auch wirklich eine Krebsvorstufe In unseren ersten Experimenten haben wir
275.000 Todesfällen (D: 1.492)2. Das invasive zugrunde 3. Auffällige Pap-Befunde haben CpG-Island-Arrays der Firma Agilent eingesetzt.
Karzinom geht in der Regel aus Präkanzerosen aufwändige Abklärungsuntersuchungen zur Diese enthielten etwa 240.000 Sonden für die
unterschiedlicher Ausprägung (cervical int- Folge, die aufgrund des schlechten positiven etwa 27.000 CpG-Inseln des menschlichen
raepithelial neoplasia, CIN2 und CIN3) hervor. Vorhersagewerts des Pap-Tests in 80% der Fälle Genoms, darunter auch alle CpG-Inseln in Pro-
Krebs- und Krebsvorstufen-verdächtige Zellen eigentlich überflüssig sind. motorbereichen von Genen. Inzwischen stehen
lassen sich grundsätzlich mit dem von Geor- Arrayträger zur Verfügung, die auf gleicher Flä-
ge N. Papanicolou entwickelten, einfachen che Platz für zwei Arrays mit jeweils 400.000
zytologischen Abstrichverfahren (Pap-Test) HPV-Diagnostik Sondenspots bieten. Für eine Methylierungs-
erkennen. Seit der Einführung dieser Vorsor- signatur geeignete Markerregionen zeichnen
geuntersuchung in Deutschland (1971) ist die Mit der Entdeckung, dass High-risk (HR)- sich durch möglichst große Unterschiede in
Inzidenz des Zervixkarzinoms kontinuierlich humane Papillomviren (HPV)-Typen ursäch- der Signalintensität zwischen der verwendeten
gesunken, bleibt aber mit einer Neuerkran- lich an der Entstehung des Zervixkarzinoms Tumor- und Normal-DNA aus.
kungsrate von 11 pro 100.000 Frauen zu hoch. beteiligt sind, war der Startschuss für die Mit unseren Array-Analysen konnten wir 272
Dies ist einerseits darauf zurückzuführen, dass molekulare Diagnostik in der gynäkologischen CpG-Inseln identifizieren, die in Zervixkarzino-
eine konsequente jährliche Teilnahme an dem Krebsvorsorge gegeben. Annähernd 100% men gegenüber zervikalen Zellabstrichen von
Vorsorgeprogramm nur von etwa der Hälfte aller Zervixkarzinome enthalten HR-HPV- HPV-positiven, aber histopathologisch unauf-
der sexuell aktiven Frauen wahrgenommen DNA. Verschiedene zuverlässige Verfahren für fälligen Frauen verstärkt methyliert waren.
wird. Andererseits belegt eine Reihe von Stu- den Nachweis von HPV-DNA sind inzwischen
dien qualitative Mängel bei der zytologischen kommerziell verfügbar. Dabei hat ein negatives
Krebsvorsorge. Im Rahmen einer Multicenter- Testergebnis eine besonders hohe Wertigkeit: Methylierungsspezifische PCR
Studie mit 60.000 Patientinnen konnte auf Liegt keine Infektion mit den krebsauslösenden
Voraussetzung für eine diagnostisch bedeu-
tende Methylierungssignatur ist die Validie-
rung der in den Array-Analysen identifizierten
Kandidatengene. Als geeignetes Verfahren
gilt die methylierungsspezifische (MS)-PCR.
In isolierter DNA lässt sich die Methylierung
durch Bisulfitkonversion „fixieren“. Bei dieser
chemischen Behandlung werden in der DNA
nur Cytosine sulfoniert, die unmethyliert sind.
Durch eine anschließende Desaminierung und
Desulfonierung werden diese Cytosine zu Ura-
cilen umgesetzt, welche in PCR-Experimenten
Abb. 1: : DNA-Methylierung im Bereich eines Gens in Normal- (oben) und Tumor-DNA (unten). wie Thymine mit Adeninen paaren und ent-
In Tumor-DNA steht einer globalen Demethylierung meist eine spezifische Methylie- sprechend komplementiert werden. Sind die
rung in CpG-Inseln gegenüber, die besonders häufig in Promotorbereichen liegen. Oligonukleotidprimer für die Bindung an die me-
14 | 11. Jahrgang | Nr. 6/2010 LABORWELT
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cross-reactivities
Be m
spec ore
ific
Abb. 2: Methylierung von sechs Markergenen in DNA aus Abstrichproben von HPV-negativen
Frauen, HPV-positiven, aber histopathologisch unauffälligen Frauen, Frauen mit CIN3-
Läsionen und Frauen mit Zervixkarzinom
thylierten DNA-Regionen nach Bisulfitbehand-
lung optimiert, können diese Regionen in einer Kombination von HPV-DNA-Nachweis
methylierungsspezifischen PCR nachgewiesen und Methylierungssignatur
werden. Kits für die Bisulfitbehandlung von DNA
werden von unterschiedlichen Herstellern ange- Durch einen negativen HPV-DNA-Test kann
boten (SIGMA, Zymo-Research, QIAGEN, Epige- das Vorliegen einer Krebsvorstufe oder eines
nomics, Epigentek), sie funktionieren alle nach Zervixkarzinoms praktisch ausgeschlossen Reliable results with economical
dem beschriebenen Prinzip. An die chemische werden. Es liegt daher nahe, die hervorragende solutions! Bulk available,
Behandlung schließt sich eine Bindung der DNA Sensitivität des HPV-Tests mit der Spezifität please contact us for details!
an eine Säule und die Aufreinigung und Elution einer Methylierungssignatur zu verbinden. Bei
der DNA an. Da diese nach Bisulfitbehandlung dieser Vorgehensweise wird zuerst der HPV-Test
einzelsträngig und stark fragmentiert vorliegt, durchgeführt. Nur bei HPV-positiven Abstrichen
ist eine geeignete Bindematrix bei der nach- wird dann in Form eines Reflextest eine MS-PCR Liquid Plate Sealer®
folgenden Reinigung besonders wichtig. Diese durchgeführt. Mit diesem Algorithmus kann for long-term stability
macht sicherlich auch den Hauptunterschied eine Sensitivität von 93% und eine Spezifität economically priced
zwischen den verfügbaren Kits aus. von mehr als 99% für CIN3 und Zervixkarzinome
Bei der methylierungsspezifischen PCR wird in der primären Krebsvorsorge erreicht werden.
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besonderer Wert auf das Design der PCR-Primer Dieser vielversprechende Ansatz wird innerhalb
gelegt. Diese sollen nur an tatsächlich in den des über EXIST-Forschungstransfer geförderten Be m
Primerbinderegionen zuvor methylierte DNA Projekts „onCGnostics“ weiter optimiert. stab ore
binden, so dass die Amplifikation dieser Regi-
le
onen die Methylierung in der Probe anzeigt.
Wird in einem MethyLight-Verfahren zusätzlich Literatur
eine fluoreszenzmarkierte Sonde eingesetzt,
die ebenfalls methylierbare Cytosine enthält, [1] Ballestar E, Esteller M (2008) Epigenetic gene regulation in
cancer. Adv. Genet. 61: 247-267.
erhöht dies die Spezifität der PCR. Allerdings [2] Robert Koch-Institut (2010) Krebs in Deutschland 2005/2006.
werden dann auch möglicherweise nur partiell Robert Koch-Institut, Berlin.
methylierte DNA-Proben nicht detektiert. [3] Cuzick J, Clavel C, Petry KU, Meijer CJ, Hoyer H, Ratnam S,
Szarewski A, Birembaut P, Kulasingam S, Sasieni P, Iftner T.
Bis dato konnten wir durch MS-PCR eine (2006) Overview of the European and North American stud-
Methylierungssignatur, bestehend aus sechs ies on HPV testing in primary cervical cancer screening. Int J
Genen, validieren, die für den Nachweis von Cancer119(5):1095-101.
Zervixkarzinomen und deren Vorstufen geeignet
[4] Hoyer H, Scheungraber C, Kühne-Heid R, Teller K, Greinke,
Leistritz S, Ludwig B, Dürst M, Schneider A (2005) Cumula- Your coated ELISA plates
ist (Abb. 2). tive 5-year diagnoses of CIN2, CIN3 or cervical cancer after are stable for years.
Sofern mindestens eines der Gene methyliert concurrent high-risk HPV and cytology testing in a primary
screening setting. Int J Cancer 116(1):136-143.
vorliegt, erreicht das Verfahren eine Sensitivität
für den Nachweis von CIN3 und Zervixkarzino-
men von mehr als 93%. Allerdings sind unter die- Korrespondenzadresse
sen Bedingungen auch 10% der HPV-infizierten
Frauen ohne klinischen Befund sowie 8% der Prof. Dr. Matthias Dürst
nicht-infizierten Frauen positiv. Gynäkologische Molekularbiologie
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