Massenspektrometrische Analyse von monoklonalen Antikörpern
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05. Oktober 2021 Moderne Trenn- und Detektionsmethoden für Antikörper und Proteine: Herausforderungen und Lösungsansätze in der BioLC Massenspektrometrische Analyse von monoklonalen Antikörpern Ein- und Zweidimensionale Ansätze Lars M. H. Reinders IUTA Institut für Energie- und Umwelttechnik e. V. UDE Universität Duisburg-Essen HSNR Hochschule Niederrhein An-Institut der
Einleitung
• Eindimensionale Antikörperanalytik
Intakte Proteine und Peptide
• Zweidimensionale Antikörperanalytik
Grundlagen und Einsatzmöglichkeiten
• Automatisierungsmöglichkeiten
Alternative Nutzungsmöglichkeit der 2D-HPLC-MS
mta-portal.de
• 100 therapeutische monoklonale Antikörper1
1: antibodysociety.org (Stand: 28.09.2021) 7 von 10 der umsatzstärksten Medikamente sind mAks2
2: wikipedia.de (Stand: 08.03.2020)
Duisburg, 05.10.2021 Lars M. H. Reinders | l.reinders@iuta.de 2
Immunglobulin G
• Primärstruktur
Heavy Chain
PGKGLEWVAR IYPTNGYTRY ADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED
TAVYYCSRWG GDGFYAMDYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG
GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT
VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA
KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS
KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP
ENNYKTTPPV LDSDGSFFLYS KLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT
QKSLSLSPG
Light Chain
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ
GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
LSSPVTKSFN RGEC
• Posttranslationale Modifikationen
Galactose
Mannose
N-Acetylglucosamine
Fucose
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Einsatz einer klassischen RP Methode
• Anwendungsbeispiel: Quantifizierung
Verwendung eines Diodenarray-Detektors
• Verwendung von hohen Säulentemperaturen
60°C und höher
• Einsatz von TFA-haltigen mobilen Phasen
Ionenpaarbildender Effekt mit basischen Gruppen
Reduziert Interaktionen mit Silanol-Gruppen
Analyt: 2,5 mg*mL-1 Bevacizumab als Avastin; Säule: Zorbax 300SB-C8 2,1x150 mm 5 µm; Vorsäule: Zorbax 300SB-C8, 2,1x12,5 mm 5 µm; Säulentemperatur: 80°C; Injektionsvolumen: 1 µL;
Flussrate: 1 mL*min-1; Mobile Phase A: H2O/IPA (98:2 v/v) + 0,1% TFA; Mobile Phase B: IPA/ACN/H2O (70:20:10 v/v/v) + 0,1% TFA; Gradientenprogramm B: 0-1 min 30-30%; 1-2 min 30-90%; 2-
4 min 90-90%; 4-4,5 min 90-30%; 4,5-6 min 30-30%; Detektionswellenlänge: 214 nm
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Einsatz von TFA in der Massenspektrometrie
• TFA neutralisiert positive Ladungen bei ESI+
Signalintensität nimmt um über 90% ab
• Einsatz von FA/TFA-Gemischen
Zunahme von Tailing
Teilweiser Ausgleich der schlechten Ionisierung
• Exakte Masse ist unabhängig von Peakform
Analyt: 0,5 mg*mL-1 Herceptin; Säule: Waters XBridge BEH 300 C4, 50x2,1 mm, 3,5 µm; Säulentemperatur: 70°C; Injektionsvolumen: 1 µL; Flussrate: 0,6 mL*min-1; Mobile Phase A: H2O +
Additiv; Mobile Phase B: IPA/ACN/H2O (70:20:10 v/v/v) + Additiv; Gradientenprogramm B: 0-1 min 20-20%; 1-3 min 20-45%; 3-5 min 45-45%; 5-5,1 min 45-99%; 5,1-7min 99-99%; Detektion:
ESI+ FA-Additiv: 0,1% FA in mobiler Phase A und B; FA/TFA-Additiv: 0,5% FA/0,02% TFA in mobiler Phase A und 0,5% FA/0,016% TFA in mobiler Phase B
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Dekonvolution
• Entstehung einer Ladungsverteilung
Antikörper stabilisieren 30-70 Ladungen
• Verwendung von Dekonvolutionsalgorithmen
Maximum Entropy, pMod, LFME, …
Umrechnung der Ladungsverteilung in Neutralmasse
• Ein Antikörper führt zu mehreren Signalen
Modifikationen an der Primärsequenz, z. B. Zucker
Analyt: 2,5 mg*mL-1 Rituximab als MabThera; Säule: Zorbax 300SB-C8 2,1 x 150 mm 5 µm; Vorsäule: Zorbax 300SB-C8, 2,1 x 12,5 mm 5 µm; Säulentemperatur: 80°C; Injektionsvolumen: 0,1
µL; Flussrate: 0,5 mL*min-1; Mobile Phase A: H2O+0,1% FA; Mobile Phase B: ACN/IPA/H2O (70:20:10 v/v/v) + 0,1% FA; Gradientenprogramm B: 0-2 min 5-5%; 2-3 min 5-50%; 3-6 min 50-50%;
6-6,5 min 50-90%; 6,5-9,5 min 90-90%; 9,5-10 min 90-5%; 10-14 min 5-5%
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Vergleich unterschiedlicher Chargen und Biosimilars
• Substanzverifizierung als intakter Antikörper
G0:G0F G0F:G0F G0F:G1F G1F:G1F G1F:G2F
n = 12 G0F:G2F
(Da) (Da) (Da) (Da) (Da)
Herceptin 147.914 ± 5 148.061 ± 5 148.222 ± 5 148.383 ± 5 148.545 ± 5
Lot 1
Herceptin 147.914 ± 6 148.061 ± 5 148.222 ± 5 148.384 ± 5 148.544 ± 5
Lot 2
Herzuma n/a 148.062 ± 5 148.222 ± 5 148.384 ± 5 148.546 ± 5
• Unterschiede zwischen Original und
Biosimilar sind erkennbar
Zur Publikation bei „Journal of Separation Science“ eingereicht
Reinders et al., „Analytical methods for characterization of biosimilar and originator of monoclonal antibodies based on the intact protein, its peptides, and functionality analysis“
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Auswirkungen von Ionensuppression
• Gründe für Ionensuppression
Ionenpaarreagenzien wie TFA
Nicht flüchtige Additive wie Salze
Coeluierende Analyten/Matrix
Verunreinigungen aus vorherigen Analysen
• Gute Laborpraxis
Festgelegte Wartungs- und Reinigungsintervalle
Absprache mit Mitnutzern des Analysengeräts
Vermeidung von nicht flüchtigen Additiven
Bei Unvermeidbarkeit, Einsatz der 2D-HPLC
Optimierung der Probenvorbereitung
Reinders et al.; GIT Labor-Fachzeitschrift 6/2020
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Optimierung der Salzfracht
• Probenvorbereitungsprotokolle in der
Bioanalytik inkludieren häufig Salz
Beispiel: Enzymatischer Verdau mit Trypsin
• Experiment
Variation der GuHCl-Konzentration im
Denaturierungspuffer
Ziel: Geringe Salzfracht, bei guter Empfindlichkeit
• Erkenntnis
Salzfracht kann auf 3 M GuHCl reduziert werden
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Enzymatische Umsetzung
• Tryptischer Verdau
Generierung von über 100 Peptiden
• Einsatz der Peptid-Analytik
Quantifizierung im Spurenbereich
Lokalisierung von Modifikationen
• Indirekte Detektion über spezifische Peptide
Analyt: 0,5 mg mL-1 Trastuzumab als Herceptin; Säule: Phenomenex Jupiter C18, 150 x 4,6 mm, 3 µm; Säulentemperatur: 70°C; Injektionsvolumen: 10 µL; Flussrate: 0,6 mL min-1; Mobile Phase
A: H2O + 0,1% FA; Mobile Phase B: ACN + 0,1% FA; Gradientenprogramm B: 0-1 min 5-5%; 1-61 min 5-45%; Detektion: ESI+ QTOF MS
Duisburg, 05.10.2021 Lars M. H. Reinders | l.reinders@iuta.de 10Enzymatische Umsetzung Analyt: 0,5 mg mL-1 Trastuzumab als Herceptin; Säule: Phenomenex Jupiter C18, 150 x 4,6 mm, 3 µm; Säulentemperatur: 70°C; Injektionsvolumen: 10 µL; Flussrate: 0,6 mL min-1; Mobile Phase A: H2O + 0,1% FA; Mobile Phase B: ACN + 0,1% FA; Gradientenprogramm B: 0-1 min 5-5%; 1-61 min 5-45%; Detektion: ESI+ QTOF MS Duisburg, 05.10.2021 Lars M. H. Reinders | l.reinders@iuta.de 11
Identifizierung von Modifikationen
Methionin
Methioninsulfoxid
Methioninsulfon
Reinders et al., Anal. Bioanal. Chem. (2018), 410, 2829-2836
Duisburg, 05.10.2021 Lars M. H. Reinders | l.reinders@iuta.de 12Quantifizierung von luftgetragenen Antikörpern
• Zubereitung von Darzalex® (Daratumumab)
Anstechen eines frischen Gebindes
Entnahme von 1 mL
Überführung in Vial
Keine Verwendung von Druckausgleichsystemen
• Probenahme nach Reinders et al. (2018)
Probenahme bei 2 L/min
Extraktion mittels PBS-Puffer
• LC-MS/MS Analytik
15 ng absolut
Reinders et al., Anal. Bioanal. Chem. (2018), 410, 2829-2836
Duisburg, 05.10.2021 Lars M. H. Reinders | l.reinders@iuta.de 13Was bedeutet mehrdimensionale Chromatographie?
D2-Pumpe
D1-Pumpe Autosampler D1-Trennsäule D1-Detektor
(Optional) Interface
D2-Trennsäule
D1-Chromatogamm D2-Chromatogamm
D2-Detektor
Duisburg, 05.10.2021 Lars M. H. Reinders | l.reinders@iuta.de 14Funktionsweise des Interface
1 2 3 4 5 6 7 8
• Zwei Arbeitsmodi
intensity
Heart-Cut: Eine Fraktion von D1 wird auf D2 überführt
1. HPLC + 1. Säule (a)
Comprehensive: Vollständige Überführung von D1 auf D2
D1 retention time
intensity
1 2 3 4 5 6 7 8
2. HPLC • Erhöhung
(b) der Peakkapazität
2. Säule Reduktion von Coelution und ggf. Ionensuppression
retention time (D2 raw chromatogram)
intensity
Abfall
D1
re
te
(c)
• Voraussetzung: 1D und 2D sind orthogonal
nt
io
n
tim
e D2 retention time
Unterscheidung in der Selektivität, z. B. HILIC und RP
D2 retention time
D1 retention time
(d)
Duisburg, 05.10.2021 Lars M. H. Reinders | l.reinders@iuta.de 15Orthogonalität Zur Publikation bei „Journal of Separation Science“ eingereicht Reinders et al., „Analytical methods for characterization of biosimilar and originator of monoclonal antibodies based on the intact protein, its peptides, and functionality analysis“ Duisburg, 05.10.2021 Lars M. H. Reinders | l.reinders@iuta.de 16
Anwendungsbeispiel: Heart-Cut
• Ziel: Charakterisierung der ADCC Aktivität
ADCC: Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
Abhängig vom Glykosylierungsprofil des mAk
• D1: Trennung nach Affinität zu FcyRIIIa
Affinitätschromatographie
• D2: Entsalzung
Umkehrphasenchromatographie
Geplant zur Einreichung bei „mAbs“
Reinders et al., „Development of a two-dimensional liquid chromatography high resolution mass spectrometry method for the characterization of monoclonal antibody in cell free culture supernatant
via FcR affinity chromatography“
Duisburg, 05.10.2021 Lars M. H. Reinders | l.reinders@iuta.de 17Anwendungsbeispiel: Heart-Cut
• Ziel: Charakterisierung der ADCC Aktivität
ADCC: Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
Abhängig vom Glykosylierungsprofil des mAk
• D1: Trennung nach Affinität zu FcyRIIIa
Affinitätschromatographie
• D2: Entsalzung
Umkehrphasenchromatographie
Geplant zur Einreichung bei „mAbs“
Reinders et al., „Development of a two-dimensional liquid chromatography high resolution mass spectrometry method for the characterization of monoclonal antibody in cell free culture supernatant
via FcR affinity chromatography“
Duisburg, 05.10.2021 Lars M. H. Reinders | l.reinders@iuta.de 18Anwendungsbeispiel: Comprehensive
• Ziel: Unterscheidung von Originator und
Biosimilar (monoklonale Antikörper)
• Einsatz der umfassenden LCxLC
Maximale Peakkapazität
D1: Umkehrphasenchromatographie
D2: Hydrophile Interaktionschromatographie
• Reduktion von Coelution
Unterschiede optisch erkennbar
Reduktion von Ionensuppression
Zur Publikation bei „Journal of Separation Science“ eingereicht
Reinders et al., „Analytical methods for characterization of biosimilar and originator of monoclonal antibodies based on the intact protein, its peptides, and functionality analysis“
Duisburg, 05.10.2021 Lars M. H. Reinders | l.reinders@iuta.de 19Tryptischer Online Verdau – Systemaufbau 1
Binary pump 1 • Trypsin-Säule (2.1 x 33 mm)
• A: Trypsin digestion buffer
• B: ACN Pure Flussrate 10 25 50
(µL min-1)
Waste Autosampler Waste
Column oven 1 (37°C) Kontaktzeit 10 4 2
(min)
Trypsin-column
Column oven 2 (60°C)
C18-column • Peptide werden auf C18
fokussiert
Binary pump 2
• A: H2O + 0.1% FA
Diverter-Valve • B: ACN + 0.1% FA 6-Way-Valve
of the MS Position 1
Position 1
Detector
• DAD
• Mass spectrometer
Akzeptiert bei „Analytical and Bioanalytical Chemistry“
Reinders et al., „Development of a multidimensional online method for the characterisation and quantification of monoclonal antibodies using immobilized flow-through enzyme
reactors“
Duisburg, 05.10.2021 Lars M. H. Reinders | l.reinders@iuta.de 20Tryptischer Online Verdau – Systemaufbau 2
Binary pump 1 • Spülen der C18-Säule
• A: Trypsin digestion buffer Elution von Salzen
• B: ACN Pure
Equilibrieren mit Laufmittel
Waste Autosampler Waste
Column oven 1 (37°C)
Trypsin-column
Column oven 2 (60°C)
C18-column
Binary pump 2
• A: H2O + 0.1% FA
Diverter-Valve • B: ACN + 0.1% FA 6-Way-Valve
of the MS Position 2
Position 1
Detector
• DAD
• Mass spectrometer
Akzeptiert bei „Analytical and Bioanalytical Chemistry“
Reinders et al., „Development of a multidimensional online method for the characterisation and quantification of monoclonal antibodies using immobilized flow-through enzyme
reactors“
Duisburg, 05.10.2021 Lars M. H. Reinders | l.reinders@iuta.de 21Tryptischer Online Verdau – Systemaufbau 3
Binary pump 1 • Analyse
• A: Trypsin digestion buffer
• B: ACN Pure
Waste Autosampler Waste
Column oven 1 (37°C) • Methodenentwicklung via
Trypsin-column Flussrate (Kontaktzeit)
Verdaubedingungen
Column oven 2 (60°C)
Puffer
C18-column Temperatur
Binary pump 2
• A: H2O + 0.1% FA
Diverter-Valve • B: ACN + 0.1% FA 6-Way-Valve
of the MS Position 2
Position 2
Detector
• DAD
• Mass spectrometer
Akzeptiert bei „Analytical and Bioanalytical Chemistry“
Reinders et al., „Development of a multidimensional online method for the characterisation and quantification of monoclonal antibodies using immobilized flow-through enzyme
reactors“
Duisburg, 05.10.2021 Lars M. H. Reinders | l.reinders@iuta.de 22Signal von Rituximab nach IMER
• Tryptischer Verdau von denaturiertem
Rituximab
Intaktes Rituximab zeigte lediglich einen geringen
Umsatz
• Signalverhalten von Rituximab
Starker Abbau nach 2 min
Nach 2 min annähernd konstant
• Erkenntnisgewinn
Großteil an Rituximab bereits nach 2 min umgesetzt
Akzeptiert bei „Analytical and Bioanalytical Chemistry“
Reinders et al., „Development of a multidimensional online method for the characterisation and quantification of monoclonal antibodies using immobilized flow-through enzyme
reactors“
Duisburg, 05.10.2021 Lars M. H. Reinders | l.reinders@iuta.de 23Monitoring des spezifischen Peptids für Rituximab
• Erwartet: Steigende Signalintensität
Konstantes Signal, sobald vollständiger Umsatz
• Beobachtet: Sinkende Signalintensität
• Erklärung
TRIS-Puffer zersetzt sich zu Formaldehyd
Formaldehyd reagiert mit Peptiden
Ohne TRIS-Puffer erwartetes Verhalten
Akzeptiert bei „Analytical and Bioanalytical Chemistry“
Reinders et al., „Development of a multidimensional online method for the characterisation and quantification of monoclonal antibodies using immobilized flow-through enzyme
reactors“
Duisburg, 05.10.2021 Lars M. H. Reinders | l.reinders@iuta.de 24Ergebnisse der Methodenvalidierung
• Bewertung der Validierung
Vergleichbare Wiederfindung
Verdau Offline IMER Reduktion der Verdauzeit um 98%
Peptide FSGSGSGTSYSLTISR Verschlechterung der Quantifizierungsgrenze
Verdauzeit (min) 1260 20 Deutlicher Carry-Over bei IMER
LOQ (ng) 0,3 50
Wiederfindung (%) 99 ± 3 100 ± 9
Carry-Over (%) n. d. 15 • Einsatz hängt von Anwendungsfall ab
Zeitvorteil vs. Sensitivität
Akzeptiert bei „Analytical and Bioanalytical Chemistry“
Reinders et al., „Development of a multidimensional online method for the characterisation and quantification of monoclonal antibodies using immobilized flow-through enzyme
reactors“
Duisburg, 05.10.2021 Lars M. H. Reinders | l.reinders@iuta.de 25Take home message
• Analytik von intakten Proteinen
Weniger Probenvorbereitungsschritte
Große Strukturen und Modifikationen können charakterisiert werden
• Peptid-Analytik
Zahlreiche Vorbereitungsschritte
Identifizierung und Quantifizierung kleiner Modifikationen
• Methodenübertragung von HPLC-DAD auf HPLC-MS
Gefahr der Ionenunterdrückung durch Zusatzstoffe und/oder nichtflüchtige Salze
• 2D-HPLC in der Bioanalytik
Umfassende Charakterisierung der Probe möglich (LCxLC)
Bietet die Möglichkeit der Online-Entsalzung
Möglichkeit zur Automatisierung der Probenvorbereitung
Duisburg, 05.10.2021 Lars M. H. Reinders | l.reinders@iuta.de 26Fragen und Diskussion
Lars M. H. Reinders
l.reinders@iuta.de
giantmicrobes.com
02065 / 418 - 296
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