Welche Pipette ist die richtige für meine Anwendung?
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Nr. 50 – 2019
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Welche Pipette ist die richtige
für meine Anwendung? (BN 50) JANUAR 2019
Überwachung des Redoxpotenzials zur verbesserten anaeroben
SEITE 1
Fermentation mit Hilfe der BioFlo® 120 Bioprozess-Steuerungseinheit
YING YANG UND MA SHA, EPPENDORF INC., ENFIELD, CT, USA
> Fünf Wege zur Optimierung und Beschleunigung Ihrer PCR
Zusammenfassung Parameter Gerät/Sollwert
Bei der Fermentation stellt das Redox- Inokulationsdichte 1:100 (v/v)
potenzial einen wichtigen physiochemi- Arbeitsvolumen 3L
schen Faktor dar, welcher die Tendenz Sparger Macrosparger
des Kulturmediums, Elektronen aufzu- Begasungskontrolle 100 % konstanter Stickstofffluss von 0,1 vvm (0,3 sL/h), während der
ersten 4 Stunden durch submerse Begasung, nach 4 Stunden durch
nehmen, misst. Es ist in der Lage, die Begasung in den Kopfraum
Effizienz eines Bioprozesses direkt zu
Agitation Magnetantrieb; 50 rpm
beeinflussen. Ein Beispiel ist die anaero-
Temperatur 37 °C; durch Heizmanschette und Kühlschikanen kontrolliert
be Fermentation von Clostridium zur
Tabelle 1: Überblick über Prozessparameter und Sollwerte
> FCKW, FKW, KW? Einfach einen grünen Freezer, bitte!
Produktion von industriellen Lösungs-
mitteln. Lösungsmittelproduktion durch erhöhten sich sowohl das bakterielle halb des Konfigurations-Bereiches der
Clostridium Spezies erfolgt in zwei auf- Wachstum als auch die Butanolproduk- Steuerungssoftware getroffen werden.
einanderfolgenden Stoffwechselschrit- tion drastisch im Vergleich zu einem Wir kalibrierten die pH- und die Redox-
ten. In der frühen Phase der Kultur pro- Prozess ohne Steuerung des Redoxpo- sensoren außerhalb des Gefäßes mit
duziert die Acidogenese hauptsächlich tenzials. Diese Studie zeigt die Vorteile Hilfe von 2-Punkt Kalibrierungsmethoden
Essig- und Buttersäure. In der späten einer Überwachung des Redoxpoten- [3].
exponentiellen Wachstumsphase wech- tials während der Fermentation von
Das Redoxpotential des Fermentations-
selt der Stoffwechsel dann zur Solvento- C. beijerinckii klar auf.
mediums stellten wir mit 35 g/L Natrium-
genese – der Bildung von größtenteils
Material und Methoden sulfid Nonahydrat (Sigma-Aldrich®, USA)
organischen Lösungsmitteln, ein-
ein. Um die Einführung von Sauerstoff zu
schließlich Butanol [1]. Wir führten Batch-Fermentationen unter
> Backstage bei einem Eppendorf Webinar
verhindern, wurde die Lösung für 15 min
anaeroben Bedingungen durch. Die
Um den Elektronenfluss in die Richtung mit Stickstoff begast, bevor sie in das
Vorbereitung des Inokulums sowie die
der Butanolproduktion zu lenken, ist Gefäß gepumpt wurde. Der pH-Wert
Medienzusammensetzung wurden be-
die Regeneration des NAD(P)+ Vorrats der Lösung betrug 12,84. Um das Redox-
reits eingehend beschrieben [3].
innerhalb der Clostridium Spezies essen- potenzial bei etwa −500 mV zu halten,
tiell [1]. Das intrazelluläre Verhältnis von Anaerobe Bedingungen wurden durch schalteten wir 24 h, 32 h, 48 h und 120 h
NAD(P)H zu NAD(P)+ ist stark vom Re- stetes Begasen mit 0,1 vvm (Vessel nach dem Animpfen die vorkalibrierte
doxpotenzial abhängig; daher kann das Volumen pro Minute) Stickstoff erzielt. Pumpe ein, um dem Medium 2 – 3 mL
Redoxpotenzial dahingehend genutzt Wir führten zwei Batch-Fermentations- Natriumsulfidlösung hinzuzusetzen.
werden, sowohl die Anreicherung von läufe durch. Im ersten Lauf kontrollierten
Ergebnisse
Biomasse als auch die Lösungsmittel- wir das Redoxpotenzial nicht. Im zweiten
produktion zu modifizieren [2]. Lauf hingegen wurde das Redoxpotenzial Wir verglichen das bakterielle Wachs-
auf einen niedrigen, stabilen Wert von tum sowie die Butanolproduktion zweier
Wir kultivierten C. beijerinckii unter an-
−500 mV eingestellt. Die Prozesspara- Prozesse. In einem Prozess hielten wir
aeroben Bedingungen mit Hilfe einer
meter sowie die Einstellungen, welche das Redoxpotenzial relativ konstant bei
BioFlo 120 Bioprozess-Steuerungseinheit,
für beide Läufe galten, sind in Tabelle 1 −500 mV. In dem anderen Prozess be-
ausgestattet mit BioBLU® 3f Single-Use
zusammengefasst. einflussten wir das Redoxpotenzial auf
Vessels. Durch das Beibehalten eines
Application Notes
experimentelle Weise nicht.
Redoxpotenzials von etwa −500 mV In 24 h-Intervallen entnahmen wir 1 mL
Probenvolumen und quantifizierten die Redox und pH-Trends
Konzentrationen von sowohl Glucose
Zu Beginn der Fermentation betrug das
als auch Butanol [3]. Ebenso wurde die
Redoxpotenzial etwa 0 mV. Während
optische Dichte bei 600 nm (OD600) ge-
der ersten 24 h, und bei exponentiellem
messen, um das bakterielle Wachstum
Wachstum von C. beijerinckii, sank es
zu verfolgen.
drastisch ab, auf −500 mV. Wenn wir das
Überwachung des Redoxpotenzials für verbesserte anaerobe Fermentation · Verkürzte PCR-Lauf
Überwachung und Anpassung des Redoxpotenzial nicht auf experimentelle
Redoxpotenzials Weise änderten, schwankte es zwischen
−600 und −300 mV, beginnend 24 h
Wir verfolgten den pH-Wert und das
nach dem Animpfen (Abb. 2A).
Redoxpotenzial online mit Hilfe von
zwei ISM® pH/Redox Sensoren (Mettler Wenn wir der Kultur Natriumsulfid
Toledo®, Schweiz). Der gleiche Sensortyp Nonahydrat zusetzten, konnte ein relativ
kann eingesetzt werden, um entweder stabiles Redoxpotenzial von −500 bis
den pH-Wert oder das Redoxpotenzial − 400 mV beibehalten werden. Während
zeiten + erhöhte Ausbeute · Amber Conical Tubes: maximaler Probenschutz, gute Sichtbarkeit · etc.
Abb. 1: Bioprozess-Equipment zu messen, und die Wahl kann inner- der exponentiellen Wachstumsphase,
Your local distributor: www.eppendorf.com/contact
Eppendorf AG · Barkhausenweg 1 · 22339 Hamburg · Germany · E-Mail: eppendorf@eppendorf.com · www.eppendorf.com
2 EDITORIAL · LIEBE LESER
Impressum
Redaktion
Berrit Hoff (Projektleitung), Hanaë König,
Tanja Musiol, Natascha Weiß
Anschrift
Eppendorf AG
Barkhausenweg 1, 22339 Hamburg
Telefon: + 49 40 53 801- 0
Fax: + 49 40 53 801- 556
E-Mail: bionews@eppendorf.de
www.eppendorf.com/bionews
Beiträge von Lesern sind willkommen.
Für unverlangt eingesandte Manuskripte
Liebe Leser,
wird keine Verantwortung übernommen.
Ihre Ansprechpartner
Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH
Peter-Henlein-Str. 2
Vielen Dank für die zahlreichen guten Wünsche zum 25. Jubiläum der BioNews. Ihr
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Feedback hat uns sehr gefreut und spornt uns weiter an. Besonderen Anklang fanden
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übrigens die personalisierten Pipetten, die in unseren Jubiläums-Preisrätseln zu ge-
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> Für den Umgang mit problematischen Flüssigkeiten gibt es so manches Geheimrezept. E-Mail: vertrieb@eppendorf.de >
Dabei kommt es eigentlich nur darauf an, das für Ihren Anwendungsfall optimale Rüst-
Vertrieb Schweiz
zeug aus Pipette und Spitze zu bestimmen. Hierbei sind gute Kenntnisse über Pipettier-
Vaudaux-Eppendorf AG
techniken sowie über aktuelle Pipettiersysteme unerlässlich. Werden auch Sie zum
Im Kirschgarten 30
Pipettierexperten – oder gar zum Pipettier-Ninja! Wie Eppendorf Ihnen dabei helfen
4124 Schönenbuch/Basel
kann, erfahren Sie in unserem Leitartikel auf den Seiten 4 – 5.
Tel. (061) 4821414
Vor zehn Jahren war das (Eppendorf) New Brunswick™ Premium U570-G Ultratiefkühl- E-Mail: eppendorf@eppendorf.ch
gerät eines der allerersten Geräte mit grünem Kältemittel im Markt. Mit unserer lang-
Vertrieb Österreich
jährigen Erfahrung in Entwicklung, Herstellung, Logistik und Service sehen wir unser
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Konzept global bestätigt. Eine wachsende Zahl von Anwendern sieht „grüne“ Geräte
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Dennoch birgt diese Standardmethode Tücken und unterliegt zahlreichen Einfluss- E-Mail: office@eppendorf.at
faktoren. Der Bedarf, PCR-Durchläufe zu beschleunigen und zu optimieren, ist allgegen-
Hinweis
wärtig und kann auf verschiedene Weise angegangen werden. In unserem Artikel auf
Aus Gründen der besseren Lesbarkeit
den Seiten 12 – 13 zeigen wir Ihnen fünf Möglichkeiten auf.
haben wir im Text auf die konsequente
Neben weiteren Berichten zu Neuheiten und Neuigkeiten, z. B. zur Bioprozesstechnik, Nennung der männlichen und weiblichen
gibt es im Innenteil wieder vier detaillierte Application Notes. Form verzichtet. Es sind selbstverständ-
lich immer beide Geschlechter gemeint.
Die Einführung von Produkten kann in
Ihr Eppendorf BioNews-Team
verschiedenen Märkten zu unterschied
lichen Zeitpunkten erfolgen. Wir beraten
Sie gern.
Irrtum und technische Änderungen
vorbehalten.
Alle Rechte vorbehalten,
einschließlich der Grafiken und Bilder.
PS: Möchten Sie uns etwas mitteilen zur BioNews? Haben Sie Ideen und Wünsche? Dann schreiben Sie eine Mail an © Copyright Eppendorf AG, Januar 2019.
bionews@eppendorf.de. Wir freuen uns auf Ihr Feedback!
Klimaneutral gedruckt in Deutschland.
INHALT 3
6 8 9
IM BLICKPUNKT Welche Pipette ist eigentlich die richtige für meine Anwendung? 4–5
LABORPRAXIS FCKW, FKW, KW? Einfach einen grünen Freezer, bitte! 6
Alles für den Bioprozess – Online! 8
Fünf Möglichkeiten, PCR-Durchläufe zu optimieren und zu beschleunigen 12–13
NAHAUFNAHME CCCadvanced FN 1 motifs Zellkulturartikel
®
9
NEWS / TIPPS Viskose Lösungen mit der richtigen Technik pipettieren 5
Backstage bei einem Eppendorf Webinar 7
> >
Vorteile für Ihre Stammzellkultur 9
Rundum sorglos mit unserem Technischen Service 10
Reinigung und Wartung Ihrer Laborgeräte 11
Was unsere Leser sagen 11
Willkommen in Hamburg: Flavio Donato & Andrea Ablasser 14
SERVICE Warenzeichenhinweise 14
Gewinnspiel: Pipetten-3er-Pack zu gewinnen 15
YING YANG, MA SHA
(BN 50) JANUAR 2019 SEITE 1
Überwachung des Redoxpotenzials zur verbesserten anaeroben
Fermentation mit Hilfe der BioFlo® 120 Bioprozess-Steuerungseinheit
Zusammenfassung
YING YANG UND MA SHA, EPPENDORF INC., ENFIELD, CT, USA Überwachung des Redoxpotenzials zur verbesserten anaeroben 1– 2
Fermentation mit Hilfe der BioFlo® 120 Bioprozess-Steuerungseinheit
Parameter Gerät/Sollwert
Bei der Fermentation stellt das Redox- Inokulationsdichte 1:100 (v/v)
potenzial einen wichtigen physiochemi- Arbeitsvolumen 3L
schen Faktor dar, welcher die Tendenz Sparger Macrosparger
des Kulturmediums, Elektronen aufzu- Begasungskontrolle 100 % konstanter Stickstofffluss von 0,1 vvm (0,3 sL/h), während der
ersten 4 Stunden durch submerse Begasung, nach 4 Stunden durch
nehmen, misst. Es ist in der Lage, die Begasung in den Kopfraum
Effizienz eines Bioprozesses direkt zu
Agitation Magnetantrieb; 50 rpm
beeinflussen. Ein Beispiel ist die anaero-
Temperatur 37 °C; durch Heizmanschette und Kühlschikanen kontrolliert
be Fermentation von Clostridium zur
Tabelle 1: Überblick über Prozessparameter und Sollwerte
Produktion von industriellen Lösungs-
mitteln. Lösungsmittelproduktion durch
Clostridium Spezies erfolgt in zwei auf-
einanderfolgenden Stoffwechselschrit-
erhöhten sich sowohl das bakterielle
Wachstum als auch die Butanolproduk-
tion drastisch im Vergleich zu einem
halb des Konfigurations-Bereiches der
Steuerungssoftware getroffen werden.
Wir kalibrierten die pH- und die Redox-
ALISA GRUSCHKA, KERSTIN ISERMANN, ARORA PHANG
ten. In der frühen Phase der Kultur pro- Prozess ohne Steuerung des Redoxpo- sensoren außerhalb des Gefäßes mit
Verkürzte PCR-Laufzeiten bei erhöhter Ausbeute 3–4
duziert die Acidogenese hauptsächlich tenzials. Diese Studie zeigt die Vorteile Hilfe von 2-Punkt Kalibrierungsmethoden
Essig- und Buttersäure. In der späten einer Überwachung des Redoxpoten- [3].
exponentiellen Wachstumsphase wech- tials während der Fermentation von
Das Redoxpotential des Fermentations-
selt der Stoffwechsel dann zur Solvento- C. beijerinckii klar auf.
mediums stellten wir mit 35 g/L Natrium-
genese – der Bildung von größtenteils
mit Eppendorf Fast PCR-Consumables
Material und Methoden sulfid Nonahydrat (Sigma-Aldrich®, USA)
organischen Lösungsmitteln, ein-
ein. Um die Einführung von Sauerstoff zu
schließlich Butanol [1]. Wir führten Batch-Fermentationen unter
verhindern, wurde die Lösung für 15 min
anaeroben Bedingungen durch. Die
Um den Elektronenfluss in die Richtung mit Stickstoff begast, bevor sie in das
Vorbereitung des Inokulums sowie die
der Butanolproduktion zu lenken, ist Gefäß gepumpt wurde. Der pH-Wert
Medienzusammensetzung wurden be-
die Regeneration des NAD(P)+ Vorrats der Lösung betrug 12,84. Um das Redox-
reits eingehend beschrieben [3].
innerhalb der Clostridium Spezies essen- potenzial bei etwa −500 mV zu halten,
tiell [1]. Das intrazelluläre Verhältnis von Anaerobe Bedingungen wurden durch schalteten wir 24 h, 32 h, 48 h und 120 h
NAD(P)H zu NAD(P)+ ist stark vom Re- stetes Begasen mit 0,1 vvm (Vessel nach dem Animpfen die vorkalibrierte
MARTIN ARMBRECHT
doxpotenzial abhängig; daher kann das Volumen pro Minute) Stickstoff erzielt. Pumpe ein, um dem Medium 2 – 3 mL
Redoxpotenzial dahingehend genutzt Wir führten zwei Batch-Fermentations- Natriumsulfidlösung hinzuzusetzen.
werden, sowohl die Anreicherung von läufe durch. Im ersten Lauf kontrollierten
Ergebnisse
Biomasse als auch die Lösungsmittel- wir das Redoxpotenzial nicht. Im zweiten
Kostengünstige DNA-Bestimmung mit Qubit™-Assays
produktion zu modifizieren [2]. Lauf hingegen wurde das Redoxpotenzial Wir verglichen das bakterielle Wachs-
5–6
auf einen niedrigen, stabilen Wert von tum sowie die Butanolproduktion zweier
Wir kultivierten C. beijerinckii unter an-
−500 mV eingestellt. Die Prozesspara- Prozesse. In einem Prozess hielten wir
aeroben Bedingungen mit Hilfe einer
meter sowie die Einstellungen, welche das Redoxpotenzial relativ konstant bei
BioFlo 120 Bioprozess-Steuerungseinheit,
für beide Läufe galten, sind in Tabelle 1 −500 mV. In dem anderen Prozess be-
ausgestattet mit BioBLU® 3f Single-Use
im Eppendorf BioSpectrometer® fluorescence
zusammengefasst. einflussten wir das Redoxpotenzial auf
Vessels. Durch das Beibehalten eines
experimentelle Weise nicht.
Redoxpotenzials von etwa −500 mV In 24 h-Intervallen entnahmen wir 1 mL
Probenvolumen und quantifizierten die Redox und pH-Trends
Konzentrationen von sowohl Glucose
Zu Beginn der Fermentation betrug das
als auch Butanol [3]. Ebenso wurde die
Redoxpotenzial etwa 0 mV. Während
optische Dichte bei 600 nm (OD600) ge-
der ersten 24 h, und bei exponentiellem
messen, um das bakterielle Wachstum
Wachstum von C. beijerinckii, sank es
zu verfolgen.
drastisch ab, auf −500 mV. Wenn wir das
Überwachung und Anpassung des Redoxpotenzial nicht auf experimentelle
Redoxpotenzials
Wir verfolgten den pH-Wert und das
Weise änderten, schwankte es zwischen
−600 und −300 mV, beginnend 24 h
nach dem Animpfen (Abb. 2A).
RAFAL GRZESKOWIAK, SANDRINE HAMELS
Redoxpotenzial online mit Hilfe von
Eppendorf Amber Conical Tubes:
zwei ISM® pH/Redox Sensoren (Mettler Wenn wir der Kultur Natriumsulfid
7– 8
Toledo®, Schweiz). Der gleiche Sensortyp Nonahydrat zusetzten, konnte ein relativ
kann eingesetzt werden, um entweder stabiles Redoxpotenzial von −500 bis
den pH-Wert oder das Redoxpotenzial − 400 mV beibehalten werden. Während
Abb. 1: Bioprozess-Equipment zu messen, und die Wahl kann inner- der exponentiellen Wachstumsphase,
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Eppendorf AG · Barkhausenweg 1 · 22339 Hamburg · Germany · E-Mail: eppendorf@eppendorf.com · www.eppendorf.com
maximaler Probenschutz bei guter Sichtbarkeit
4 IM BLICKPUNKT · WELCHE PIPETTE IST EIGENTLICH DIE RICHTIGE FÜR MEINE ANWENDUNG?
SAMIRA SCHROEDER, EPPENDORF AG
Welche Pipette ist eigentlich die
richtige für meine Anwendung?
Für den Umgang mit problematischen Flüssigkeiten gibt es so manches überlieferte „Geheimrezept“. Die
Pipettenspitze wird abgeschnitten, um viskose Flüssigkeiten pipettierbar zu machen. Ethanol und Aceton werden
im Wettrennen mit der Zeit in Höchstgeschwindigkeit pipettiert, denn die Flüssigkeiten könnten heraustropfen.
Detergenzienreste in der Spitze werden auch mal hingenommen. So richtig präzise ist das alles nicht? Es geht
auch anders!
Seit 1961 die erste Mikroliterpipette auf Flüssigkeiten deutlich präziser verarbeiten. zise Pipettierergebnisse, unabhängig von
den Markt kam, haben sich Modelle und Die Herausforderung bei z.B. viskosen den physikalischen Eigenschaften einer
Techniken zwar weiterentwickelt, die meis- Flüssigkeiten wie Glycerol liegt darin, dass Flüssigkeit.
ten Pipetten basieren jedoch weiterhin auf sie sich aufgrund geringerer Fließfähigkeit
Anders als bei Luftpolsterpipetten ist
dem ursprünglichen Kolbenhubprinzip. schwer aufziehen lassen und unklar ist,
> Hierbei befindet sich zwischen Kolben wann die gewünschte Flüssigkeitsmenge
hier der Kolben der Spitze im direkten >
Kontakt mit der Flüssigkeit. Die Flüssig-
und Flüssigkeit ein Luftpolster. Luft- komplett aufgezogen ist. Schnell entstehen
keitsabgabe erfolgt direkt und ohne Luft-
feuchte, Temperatur und physikalische so auch Luftblasen und Flüssigkeitsrück-
polster und die Dichtlippe des Kolbens
Eigenschaften von Flüssigkeiten beein- stände bleiben an der Wand der Spitze
transportiert sämtliche Rückstände aus
flussen das Luftpolster und damit das zu zurück.
der Spitze. Da sich die Flüssigkeit in einer
pipettierende Volumen. Die auf Wasser
Zur Vorbeugung kann man langsam oder speziellen hermetisch abgedichteten
kalibrierten Luftpolsterpipetten sind für
revers pipettieren. Mehr Sicherheit und Spitze befindet, wird auch das Risiko von
die meisten Anwendungen hochpräzise,
Präzision bietet jedoch ein Direktverdrän- Aerosol-Kontamination verringert. So-
es gibt jedoch Ausnahmen.
gersystem. wohl der Anwender als auch die Pipette
Eine Luftpolsterpipette für alles? werden somit zusätzlich vor gefährlichen
Flüssigkeiten geschützt.
Häufiger als angenommen verwenden
Anwender nur eine einzige klassische
Luftpolsterpipette, unabhängig von der
zu pipettierenden Flüssigkeit. Bei Flüs-
sigkeiten mit einer anderen Viskosität, Kolben
Spitze mit
Flüchtigkeit, Oberflächenspannung oder Luft-
polster
integrier-
tem Kolben
Dichte als Wasser stößt die Luftpolsterpi-
pette jedoch an ihre Grenzen: Es tropft
und klebt, fließt langsam und Luftblasen Flüssig-
keit
Flüssig-
keit
entstehen.
Luftpolsterprinzip Direktverdrängerprinzip
Was tun? Schneller oder langsamer pipet-
tieren? Vorbenetzen? Revers pipettieren? Luftpolster- und Direktverdrängerprinzip im Vergleich
Anwender berichten von weiteren, teils
Präzise und sicher arbeiten mit dem
sehr individuellen Techniken, die darauf
Direktverdrängersystem
hindeuten, dass hier ein großer Leidens-
druck besteht. Sie sind es satt, sich mit abgeschnittenen
Spitzen zu behelfen und Kompromisse bei
Mit Luftpolsterpipetten bessere
der Präzision einzugehen? Direktverdrän-
Ergebnisse erzielen
ger wie beispielsweise das Multipette®/
Auch mit Luftpolsterpipetten kann man Combitips advanced® System vereinfachen Let it flow! Der neue ViscoTip ist spezialisiert auf hochviskose
bereits mit einigen Tricks herausfordernde den Pipettierprozess und sorgen für prä- Flüssigkeiten
WELCHE PIPETTE IST EIGENTLICH DIE RICHTIGE FÜR MEINE ANWENDUNG? · IM BLICKPUNKT 5
Tipp
Viskose Lösungen
mit der richtigen
Technik pipettieren
Im Labor begegnet man in der täglichen
Arbeit zahlreichen Flüssigkeiten unter-
schiedlichster Viskosität. Von leicht- über
mittel- bis hochviskos ist alles dabei.
Doch wie unterteilt man Flüssigkeit in
Viskositätsklassen? Wie entsteht Viskosität?
Hier werden Sie zum Pipettierexperten
Und vor allem – wie pipettiere ich viskose
Flüssigkeit korrekt?
Mit dem ViscoTip® sogar spielend leicht
Cremes und Honig meistern
Sicherlich kennen auch Sie die Grenzen,
wenn es um das präzise Pipettieren
hochviskoser Flüssigkeiten geht. Dank
der jüngsten Ergänzung zur Familie der
> Combitips advanced für die Multipette >
kann jetzt auf umständliches Auswiegen
solcher Flüssigkeiten verzichtet werden.
Die neuartige ViscoTip Pipettenspitze ist
Auf diese Fragen wurde in unserem
spezialisiert auf hochviskose Flüssigkeiten
Webinar „Handling of Viscous Liquids –
wie z.B. Cremes, Honig oder hochprozen-
Basics, Techniques and Tricks“ einge
tiges Glycerol. Besonders geeignet ist das … und zum Pipettier-Ninja!
gangen, das wir Ihnen auch als Webinar-
System aus Multipette und ViscoTip für
Ihr erworbenes Wissen können Sie in Aufzeichnung ans Herz legen möchten.
Applikationen im Bereich der Lebens
unserem Online-Test überprüfen und
mittelanalytik, Kosmetik oder der petro- Im Vordergrund stehen insbesondere die
sich Ihr persönliches Zertifikat ausdru-
chemischen Industrie. verschiedenen Pipettiertechniken und
cken, welches Ihr Können beweist.
Pipettentypen, die für reproduzierbares und
Erfahren Sie mehr in unserem Webinar
Wir wünschen Ihnen viel Spaß dabei, akkurates Dosieren von viskosen Lösungen
„Handling of Viscous Liquids – Basics,
Ihre Kenntnisse und Fähigkeiten weiter notwendig sind. Darüber hinaus wird
Techniques and Tricks“ (s. Kasten) sowie
auszubauen. gezeigt, wie der Wechsel von klassischen
auf www.eppendorf.com/let-it-flow
Luftpolsterpipetten zu Direktverdränger
Keine Kompromisse bei Präzision und pipetten sich positiv auf das Pipettier
Richtigkeit ergebnis auswirkt. Erfahren Sie, wie Sie
die Präzision und Richtigkeit sowie die
Sie haben die Qualität Ihrer Pipettierergeb-
Geschwindigkeit des Pipettierens erhöhen
nisse in Ihrer eigenen Hand. Kombinieren
können, indem Sie die passende Pipette
Sie das für Ihren Anwendungsfall optimale
mit der richtigen Technik verwenden.
Rüstzeug aus Pipette und Spitze mit ver-
besserter Kenntnis von Pipettiertechniken. Das kostenfreie Webinar finden Sie unter
www.eppendorf.com/webinar/viscosity
Werden Sie zum Pipettierexperten …
Wir helfen Ihnen dabei, Ihre Pipettier-
kenntnisse auszubauen: mit weitergehen-
den Informationen, Problemstellungen
und Lösungen, Artikeln, Postern, Videos
und Application Notes. Zu finden unter
https://handling-solutions.eppendorf.
com/liquid-handling oder per QR-Code.
6 LABORPRAXIS · FCKW, FKW, KW? EINFACH EINEN GRÜNEN FREEZER, BITTE!
JAN-HENDRIK BEBERMEIER, EPPENDORF AG
FCKW, FKW, KW? Einfach einen
grünen Freezer, bitte!
Der Klimawandel ist eine Herausforderung für die Weltbevölkerung. Zusätzlich zu direkten CO 2 -Emissionen
fördern die in Kühlsystemen verwendeten Fluorkohlenwasserstoffe (FKW) die globale Erwärmung. FKWs sind
um ein Mehrfaches schädlicher als CO 2. Daher gibt es eine Verschiebung hin zu Kohlenwasserstoffen (KW),
auch bekannt als grüne Gase. Vor zehn Jahren war Eppendorf einer der „First Mover“ in Richtung grüner Gase
bei −86 °C.
Gase. Die Hauptvertreter sind Propan (R290) und Ethan (R170).
Laut IEC 60335-2-89 bedarf der Einsatz grüner Gase in Ultra-
tiefkühlgeräten keiner weiteren Sicherheitsvorschriften.
Das EU-Verbot schließt alle Kühlgeräte außer Geräten für Tempe-
> raturen unter −50 °C ein. Daher ist es zwar zulässig, in −86 °C
Ultratiefkühlgeräten weiterhin FKWs einzusetzen. Sinnvoller ist
es jedoch, FKW-haltige Kältemittel zu ersetzen, um dem Klima-
wandel entgegenzuwirken.
Daher plant Eppendorf, innerhalb der nächsten Jahre alle Ultra-
tiefkühlgeräte zu ersetzen, die noch klassische Kältemittel
verwenden. Aktuell wurde der Einsatz nachhaltiger, grüner
Kältemittel in den Modellen F740h, F740hi und F740hiw (mit
Wasserkühlung) unserer Flaggschiff-Serie CryoCube® F740
erfolgreich umgesetzt. Doch dies ist nur ein Teil einer langen
Geschichte.
Blick zurück ins Jahr 2008
In Nachhaltigkeitsdiskussionen steht häufig der Energieverbrauch
im Vordergrund. Doch selbst energieeffiziente Ultratiefkühlgeräte Das (Eppendorf) New Brunswick™ Premium
verbrauchen viel Energie, um rund um die Uhr und an sieben U570-G Ultratiefkühlgerät war eines der
Tagen der Woche extrem niedrige Temperaturen zu halten. allerersten Geräte mit grünem Kältemittel
Neben dem Energieverbrauch rückt daher auch das Kältemittel im Markt. Mit nun zehn Jahren Erfahrung in
in den Fokus. Entwicklung, Herstellung, Logistik und Service
sehen wir unser Konzept global bestätigt. Die meisten Ultratief-
Auf Grundlage des Montreal-Protokolls wurden vor einigen Jahren
kühlgeräte in Europa werden heutzutage als „grüne“ Variante
ozonschichtschädigende FCKW*-basierte Kältemittel (*Fluorchlor-
verkauft. Asien und Amerika ziehen nach. Eine wachsende Zahl
kohlenwasserstoffe) abgeschafft und durch alternative Verbindun-
von Anwendern sieht grüne Geräte als selbstverständlich an, so
gen wie Fluorkohlenwasserstoffe (FKW) ersetzt. Obwohl besser
dass mehr und mehr Freezer-Hersteller auf grüne Technologie
für die Umwelt, besitzen FKWs wie R508b und R404a ein hohes
umstellen. Willkommen im Green-Club!
Treibhauspotential (Global Warming Potential; Abk. „GWP”).
R404a hat z.B. einen GWP-Wert von 3922, was bedeutet, dass
Weitere Informationen unter
100 g dieser Substanz den gleichen GWP-Wert wie 392 kg CO2 -
www.eppendorf.com/freezers
Äquivalent besitzen.
Kohlenwasserstoffe
2014 kündigte die EU die Abschaffung aller nicht-Kohlenwasser-
stoff basierten Flüssigkeiten bis zum Jahr 2020 an (EU_517/2014).
Kohlenwasserstoffe sind auch bekannt als grüne oder natürliche
BACKSTAGE BEI EINEM EPPENDORF WEBINAR · NEWS 7
HANAË KÖNIG UND BERRIT HOFF, EPPENDORF AG
Backstage bei einem
Eppendorf Webinar
10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 … der Countdown läuft. Es kribbelt im Bauch. Gleich werde ich live geschaltet, und mehrere
hundert Menschen über die ganze Welt verteilt werden meiner Stimme lauschen und der Präsentation folgen.
3, 2, 1, und los! Nach der Begrüßung durch den Moderator starte ich mit der Präsentation. Nach den ersten drei
Folien ist das leichte Zittern in meiner Stimme fort, die Anspannung nimmt ab und der Spaß beginnt.
So beschreibt Hanaë König, erfahrene Webinar-Präsentatorin Die Webinare werden rechtzeitig beworben, um möglichst viele
bei Eppendorf, den Start eines Webinars. Ein Webinar ist auf- Interessenten zu erreichen. Zwei bis drei Wochen vor dem Live-
regend, birgt aber auch eine Menge Arbeit in der Vor- und Termin beginnt die heiße Phase. Hanaë: „Die Teilnehmerzahl
Nachbereitung. Die Planung beginnt bereits ein Jahr vor dem steigt und die erste Nervosität kommt auf, wenn ich die Zahl
Live-Event. Webinar-Themen basieren auf häufigen Frage der Anmeldungen sehe.“
stellungen an die Eppendorf-Support Hotline, auf typischen
>
Am Tag des Webinars geht Hanaë König die Präsentation noch
Problemen im Labor oder aktuellen Forschungsthemen.
einige Male durch und feilt am Text, den sie zu jeder Folie
Sobald das Thema feststeht, werden gemeinsam mit dem
sprechen wird. „Ich überlege auch, welche Fragen die Teilneh-
Webinar-Provider Datum und passende Uhrzeit fixiert. „Uns
mer im Anschluss haben könnten.“ Auch wenn sie schon viele
ist wichtig, dass weltweit möglichst viele Interessenten teil-
Webinare gehalten hat, das Lampenfieber bleibt. „Es ist wie eine
nehmen können. Das ist gar nicht so einfach, wenn man die
Radiosendung, nur zusätzlich mit Live-Fragen der Teilnehmer
unterschiedlichen Zeitzonen berücksichtigt“, so Hanaë König.
am Ende. Die Antwort muss ich blitzschnell wissen, um mich
„Wenn der Rahmen steht, mache ich mir Gedanken zu Inhalten, nicht zu blamieren.“ Ist das Webinar vorbei, ist sie erleichtert
Bildern und Anekdoten. Mein Ziel ist es, das Thema spannend zu und glücklich. Doch jetzt beginnt die aufwendige Nachberei-
gestalten und trotzdem viel Inhalt zu vermitteln. Und das Ganze tung. Alle Fragen, die aus Zeitmangel nicht live beantwortet
auf hilfreiche und leicht verständliche Weise. Die Teilnehmer werden konnten, erhält Hanaë König per Mail. Teilnehmer, die
sollen das Gefühl bekommen, etwas für ihren Laboralltag ge- sich für das Webinar registriert haben, können sich die Auf-
lernt zu haben“, ergänzt Hanaë König. zeichnung anhören und später noch Fragen übermitteln. „Bis zu
vier Wochen nach einem Webinar erreichen mich noch einzelne
Fragen“, so Hanaë König. „Im Anschluss daran werten wir das
Event aus, um für künftige Webinare zu lernen und uns stetig zu
verbessern.“
Ihr Fazit: „Ich glaube, alle Webinar-Präsentatoren bei Eppendorf
werden mir zustimmen – es macht riesigen Spaß, ein Webinar
vorzubereiten und zu halten. Die Interaktion mit den Teilnehmern
in der Fragezeit ist großartig, eine Herausforderung und ein
wunderbarer Einblick in die aktuellen Themen und Forschungen
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> Bioprozessanwendungen sind nicht nur zahlreich, sondern Prozessoptimierung in der Biosimilarproduktion durch Vergleich
>
auch sehr unterschiedlich. Diese Diversität findet sich auch in von Batch-, Fedbatch- und Perfusionskultur und diskutierten die
unserem neuen Internetbereich wieder. Sorgfältig aufbereitete Möglichkeiten der Multivariaten Datenanalyse bei der Prozess
Informationen in übersichtlichem Layout vermitteln Wissens- entwicklung. In unseren Webinaren lernen Anfänger etablierte
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(BN 50) JANUAR 2019 SEITE 1
Überwachung des Redoxpotenzials zur verbesserten anaeroben
Fermentation mit Hilfe der BioFlo® 120 Bioprozess-Steuerungseinheit
YING YANG UND MA SHA, EPPENDORF INC., ENFIELD, CT, USA
Zusammenfassung Parameter Gerät/Sollwert
Bei der Fermentation stellt das Redox- Inokulationsdichte 1:100 (v/v)
potenzial einen wichtigen physiochemi- Arbeitsvolumen 3L
schen Faktor dar, welcher die Tendenz Sparger Macrosparger
des Kulturmediums, Elektronen aufzu- Begasungskontrolle 100 % konstanter Stickstofffluss von 0,1 vvm (0,3 sL/h), während der
ersten 4 Stunden durch submerse Begasung, nach 4 Stunden durch
nehmen, misst. Es ist in der Lage, die Begasung in den Kopfraum
Effizienz eines Bioprozesses direkt zu
Agitation Magnetantrieb; 50 rpm
beeinflussen. Ein Beispiel ist die anaero-
Temperatur 37 °C; durch Heizmanschette und Kühlschikanen kontrolliert
be Fermentation von Clostridium zur
Tabelle 1: Überblick über Prozessparameter und Sollwerte
Produktion von industriellen Lösungs-
mitteln. Lösungsmittelproduktion durch rhöhten sich sowohl das bakterielle
e halb des Konfigurations-Bereiches der
Clostridium Spezies erfolgt in zwei auf- Wachstum als auch die Butanolproduk- Steuerungssoftware getroffen werden.
einanderfolgenden Stoffwechselschrit- tion drastisch im Vergleich zu einem Wir kalibrierten die pH- und die Redox-
ten. In der frühen Phase der Kultur pro- Prozess ohne Steuerung des Redoxpo- sensoren außerhalb des Gefäßes mit
duziert die Acidogenese hauptsächlich tenzials. Diese Studie zeigt die Vorteile Hilfe von 2-Punkt Kalibrierungsmethoden
Essig- und Buttersäure. In der späten einer Überwachung des Redoxpoten [3].
exponentiellen Wachstumsphase wech- tials während der Fermentation von
Das Redoxpotential des Fermentations-
selt der Stoffwechsel dann zur Solvento- C. beijerinckii klar auf.
mediums stellten wir mit 35 g/L Natrium-
genese – der Bildung von größtenteils
Material und Methoden sulfid Nonahydrat (Sigma-Aldrich®, USA)
organischen Lösungsmitteln, ein-
ein. Um die Einführung von Sauerstoff zu
schließlich Butanol [1]. Wir führten Batch-Fermentationen unter
verhindern, wurde die Lösung für 15 min
anaeroben Bedingungen durch. Die
Um den Elektronenfluss in die Richtung mit Stickstoff begast, bevor sie in das
Vorbereitung des Inokulums sowie die
der Butanolproduktion zu lenken, ist Gefäß gepumpt wurde. Der pH-Wert
> die Regeneration des NAD(P)+ Vorrats
Medienzusammensetzung wurden be-
der Lösung betrug 12,84. Um das Redox-
>
reits eingehend beschrieben [3].
innerhalb der Clostridium Spezies essen- potenzial bei etwa −500 mV zu halten,
tiell [1]. Das intrazelluläre Verhältnis von Anaerobe Bedingungen wurden durch schalteten wir 24 h, 32 h, 48 h und 120 h
NAD(P)H zu NAD(P)+ ist stark vom Re- stetes Begasen mit 0,1 vvm (Vessel nach dem Animpfen die vorkalibrierte
doxpotenzial abhängig; daher kann das Volumen pro Minute) Stickstoff erzielt. Pumpe ein, um dem Medium 2 – 3 mL
Redoxpotenzial dahingehend genutzt Wir führten zwei Batch-Fermentations- Natriumsulfidlösung hinzuzusetzen.
werden, sowohl die Anreicherung von läufe durch. Im ersten Lauf kontrollierten
Ergebnisse
Biomasse als auch die Lösungsmittel- wir das Redoxpotenzial nicht. Im zweiten
produktion zu modifizieren [2]. Lauf hingegen wurde das Redoxpotenzial Wir verglichen das bakterielle Wachs-
auf einen niedrigen, stabilen Wert von tum sowie die Butanolproduktion zweier
Wir kultivierten C. beijerinckii unter an-
−500 mV eingestellt. Die Prozesspara- Prozesse. In einem Prozess hielten wir
aeroben Bedingungen mit Hilfe einer
meter sowie die Einstellungen, welche das Redoxpotenzial relativ konstant bei
BioFlo 120 Bioprozess-Steuerungseinheit,
für beide Läufe galten, sind in Tabelle 1 −500 mV. In dem anderen Prozess be-
ausgestattet mit BioBLU® 3f Single-Use
zusammengefasst. einflussten wir das Redoxpotenzial auf
Vessels. Durch das Beibehalten eines
experimentelle Weise nicht.
Redoxpotenzials von etwa −500 mV In 24 h-Intervallen entnahmen wir 1 mL
Probenvolumen und quantifizierten die Redox und pH-Trends
Konzentrationen von sowohl Glucose
Zu Beginn der Fermentation betrug das
als auch Butanol [3]. Ebenso wurde die
Redoxpotenzial etwa 0 mV. Während
optische Dichte bei 600 nm (OD600) ge-
der ersten 24 h, und bei exponentiellem
messen, um das bakterielle Wachstum
Wachstum von C. beijerinckii, sank es
zu verfolgen.
drastisch ab, auf −500 mV. Wenn wir das
Überwachung und Anpassung des Redoxpotenzial nicht auf experimentelle
Redoxpotenzials Weise änderten, schwankte es zwischen
−600 und −300 mV, beginnend 24 h
Wir verfolgten den pH-Wert und das
nach dem Animpfen (Abb. 2A).
Redoxpotenzial online mit Hilfe von
zwei ISM® pH/Redox Sensoren (Mettler Wenn wir der Kultur Natriumsulfid
Toledo®, Schweiz). Der gleiche Sensortyp Nonahydrat zusetzten, konnte ein relativ
kann eingesetzt werden, um entweder stabiles Redoxpotenzial von −500 bis
den pH-Wert oder das Redoxpotenzial − 400 mV beibehalten werden. Während
Abb. 1: Bioprozess-Equipment zu messen, und die Wahl kann inner- der exponentiellen Wachstumsphase,
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SEITE 2 (BN 50) JANUAR 2019
Überwachung des Redoxpotenzials zur verbesserten anaeroben
Fermentation mit Hilfe der BioFlo® 120 Bioprozess-Steuerungseinheit
innerhalb der ersten 24 h der Kultur,
100
sank der pH-Wert in beiden Läufen von A
Ohne Redoxsteuerung
6,5 auf 5,1. Es ist wahrscheinlich, dass 0
Mit Redoxsteuerung
Acidogenese stattgefunden hatte und
--100
dass sowohl Essigsäure als auch Butter-
Redoxpotenzial (mV)
säure entstanden waren. In dem Lauf --200
ohne Redoxsteuerung blieb der pH-Wert
--300
mit 5,0 – 5,1 relativ niedrig, ohne sich
während des Laufes zu erholen, was wie- --400
derum auf ein Fehlen einer dominanten
--500
solventogenen Phase schließen ließ.
--600
Im Gegensatz dazu begann sich der pH-
Wert innerhalb der Redox-gesteuerten --700
0 20 40 60 80 100 120 140
Fermentation nach 24 h zu erholen und Zeit (Stunden)
erreichte nach 70 h einen Wert von 6,0.
Dann fiel er langsam auf 5,5 ab – ein
1,8
Wert, der bis zum Ende der Kultur er- B
1,6 Ohne Redoxsteuerung
halten blieb. Es ist wahrscheinlich, dass Mit Redoxsteuerung
der kurvige pH-Verlauf durch eine Ver- 1,4
änderung des mikrobiellen Stoffwechsels
1,2
hervorgerufen worden ist. Die Butanol-
produktion könnte Essigsäure verbraucht 1,0
OD600
haben und es könnte zu einer Produkt 0,8
verschiebung von Buttersäure zu Butanol
0,6
> gekommen sein. Die Verringerung der >
Säurekonzentration verursachte mit 0,4
großer Wahrscheinlichkeit den Anstieg 0,2
des pH-Wertes.
0,0
0 20 40 60 80 100 120 140
Bakterielles Wachstum Zeit (Stunden)
Innerhalb der ersten 24 h beobachteten
wir in beiden Kulturen vergleichbare ex- C 35 3,0
ponentielle Wachstumskurven. In dem Glucose, ohne Redoxsteuerung
30
Lauf ohne Redoxsteuerung verlangsamte Glucose, mit Redoxsteuerung 2,5
Butanol, ohne Redoxsteuerung
sich das Wachstum nach 24 h signifikant
Glucosekonzentration (g/L)
Butanolkonzentration (g/L)
25 Butanol, mit Redoxsteuerung
und erreichte nach 124 h einen Endwert 2,0
von 0,788 OD600 -Einheiten. Im Gegensatz 20
dazu wuchs C. beijerinckii robust weiter, 1,5
wenn ein Redoxpotenzial von −500 mV 15
beibehalten wurde. Die endgültige OD600 1,0
10
nach 124 h betrug 1,565. Dieser Wert ist
doppelt so hoch wie derjenige, der ohne 5
0,5
Redoxsteuerung erzielt wurde (Abb. 2B).
0 0,0
Fazit 0 20 40 60 80 100 120 140
Zeit (Stunden)
Wenn das Redoxpotenzial experimentell
auf einem relativ stabilen Wert von Abb. 2: A) Redoxpotenzial-Trends. In dem Lauf mit Redoxsteuerung wurde Natriumsulfid Nonahydrat 24 h, 32 h, 48 h und
120 h nach dem Animpfen hinzugefügt (Pfeile). B) C. beijerinckii Wachstumskurven. C) Glucose- und Butanolkonzentrationen
−500 mV beibehalten wurde, wurde im
Vergleich zu einem Lauf ohne Redox- Literatur
steuerung die doppelte Biomasse sowie [1] Wang S, Zhu Y, Zhang Y, and Li Y. Controlling thermosuccinogenes. Appl Biochem Biotechnol.
eine dreifach erhöhte Ausbeute an the oxidoreduction potential of the culture of 82: 91-101. 1999
Butanol erzielt (Abb. 2C). Dies dient als Clostridium acetobutylicum leads to an earlier
initiation of solventogenesis, thus increasing [3] Yang Y, Sha M. Redox Potential Monitoring
Beispiel einer Bioprozess-Optimierung solvent productivity. Appl Microbiol Biotechnol. for Improved Anaerobic Fermentation Using
durch Überwachung und Anpassung des 93: 1021-1030. 2012 the BioFlo® 120 Bioprocess Control Station
and BioBLU® 3f Single-Use Vessels. Eppendorf
Redoxpotenzials während der gesamten [2] Sridhar J, and Eiteman M. Influence of redox Application Note 358. 2018; erhältlich unter
Dauer einer Kultur. potential on product distribution in Clostridium www.eppendorf.com/appnote358
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Verkürzte PCR-Laufzeiten bei erhöhter Ausbeute
mit Eppendorf Fast PCR-Consumables
ALISA GRUSCHKA, KERSTIN ISERMANN, ARORA PHANG, EPPENDORF AG, HAMBURG
Zusammenfassung Humane genomische DNA (Roche®) wurde als Template für
die Fast PCR-Protokolle mit SpeedSTAR™ HS DNA Polymera-
In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die Eppendorf Fast PCR-
se (TaKaRa) oder dem 2x GeneAmp® Fast PCR Master Mix
Consumables eine einfache Umsetzung von einem Standard-
(Applied Biosystems®) eingesetzt.
zu einem Fast PCR-Protokoll ermöglichen, ohne dass die
Reaktionseffizienz beeinträchtigt wird. Polyethylen, aus dem Der PCR Reaktions-Master Mix für die SpeedSTAR HS DNA
die Fast PCR Tube Strips gefertigt werden, besitzt bessere Polymerase wurde mit Hilfe von 1 x Fast Buffer I, 0,2 mM
Wärmetransfereigenschaften als Polypropylen, das Material, dNTP-Mix, 0,5 µM eines jeden Primers, 30 ng DNA-Template
aus dem PCR-Consumables üblicherweise hergestellt werden. und 0,25 U der DNA-Polymerase in einem Gesamtvolumen
Unter Fast PCR-Bedingungen führt die verbesserte Wärme- von 10 µL angesetzt. Der PCR Reaktions-Master Mix für den
leitung verglichen mit Standard PCR-Consumables sowie mit GeneAmp Fast PCR Master Mix (2 x) wurde mit Hilfe von 1 x
Fast PCR-Consumables anderer Hersteller zu einer erhöhten Fast PCR Master Mix, 0,2 µM eines jeden Primers und 20 ng
Amplifikationsausbeute. Dies hilft dabei, die Arbeitsabläufe zu DNA-Template in 10 µL Gesamtvolumen angesetzt.
optimieren und die Effizienz im Labor zu steigern.
Die folgenden Primer wurden zur Amplifikation einer 536 bp
Einleitung Sequenz des humanen ß-Globin-Fragmentes eingesetzt:
Eine Verkürzung der Amplifikationszeit, und somit ein höherer
Vorwärts-Primer 5‘-GCT CAC TCA GTG TGG CAA AG-3‘
Durchsatz, sind für jedes Labor von Vorteil. Es ist bereits viel
Mühe in die Beschleunigung der PCR geflossen. Ein Ansatz
Rückwärts-Primer 5‘-GGT TGG CCA ATC TAC TCC CAG G-3‘
hierzu ist die Etablierung von Zwei-Schritt-Protokollen für den
Thermocycler. Weitere Entwicklungen zielen auf Thermocycler
Zyklus-Bedingungen:
mit höheren Temperierraten und spezielle Kits, welche Polyme-
rasen mit schnelleren Expansionsraten beinhalten, ab. Trotz SpeedSTAR™ GeneAmp®
allem ist eine signifikante Reduktion der Zykluszeiten häufig Protokoll Fast Protokoll
> nur mit Hilfe von spezieller Ausrüstung und angepassten Pro- >
zessen zu erreichen, was in einem Standardlabor nicht immer Initiale Denaturierung 94 °C / 60 s 96 °C / 15 s
einfach umzusetzen ist. Typische Endpunkt-PCR-Protokolle 96 °C / 2 s 96 °C / 1 s
dauern daher nach wie vor eine Stunde oder länger. Zyklen 35x
65 °C / 6 s 62 °C / 16 s
Ein Grund, weshalb Fast PCR- oder R apid PCR-Protokolle nicht Auf die Zyklen folgende
72 °C / 60 s 72 °C / 10 s
Elongation
im breiteren Maßstab angewendet werden, ist die Tatsache,
dass die Umsetzung eines etablierten PCR-Protokolls in ein Lagerung 10 °C 10 °C
Fast-Protokoll häufig die Ausbeute und die Spezifität der PCR
beeinträchtigt. Auch sind schnelle Protokolle oft mit sehr ge-
PCR-Reaktionen wurden mit den folgenden Consumables
ringen Reaktionsvolumina verbunden (< 5 µL), die sich aller-
durchgeführt:
dings selten für Standardanwendungen eignen. Der Einsatz
spezieller Fast PCR-Mastermixe reduziert zwar die Laufzeit,
Eppendorf Fast PCR Tube Strips
ihr volles Potenzial kann jedoch nur in Kombination mit einem
Fast Thermocycler ausgeschöpft werden. Der limitierende Eppendorf PCR Tube Strips
Faktor ist hierbei der Wärmetransfer vom Block in die Probe.
Bisher wurde diese Einschränkung hauptsächlich durch dün- ThermoFisher Scientific® ABI MicroAmp® Fast 8-Tube Strip, 0,1 mL
nere Gefäßwände umgangen. Der Ansatz der Eppendorf Fast 0,2 ml 8-Tube PCR Strips ohne Deckel,
PCR-Consumables besteht im Einsatz eines alternativen Mate- Bio-Rad®
low profile
rials mit besseren Wärmetransfereigenschaften, um die Lauf- 8-Well-Strip (0,2 ml, low profile),
zeiten zu verkürzen. Analytik Jena®
transparent mit Deckel
Material und Methoden
Die PCR-Produkte wurden mittels Agarosegelelektrophorese
Alle Experimente wurden auf Mastercycler® X50 Silberblock (GelRed®, Biotium®) nachgewiesen und mit Hilfe des Gel Doc
Modellen (X50s und X50i, Eppendorf) mit den folgenden Ein- XR+™ (Bio-Rad®) sichtbar gemacht.
stellungen durchgeführt:
Die ThermoFisher Scientific® GeneRuler™ 50 bp DNA-Leiter
wurde als Größenmarker eingesetzt.
Deckeltemperatur: 105 °C, Energiespar-Modus an
Ergebnisse und Diskussion
Temperaturmodus: Schnell
Signifikant reduzierte Laufzeiten können mit Hilfe von Fast
PCR-Reagenzien auf Thermocyclern mit schnellen Temperier-
Blockeinstellungen: Silver 96
raten erzielt werden.
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Verkürzte PCR-Laufzeiten bei erhöhter Ausbeute
mit Eppendorf Fast PCR-Consumables
Im Gegensatz dazu benötigen Standard
PCR-Consumables durch ihre schlechtere
Eppendorf Thermo Bio-Rad® Analytik Jena®
Wärmeleitfähigkeit eine höhere Lauf-
1000 bp
zeit. Polypropylen, das Standardmaterial A B C D E
für PCR-Consumables, begrenzt die Ge-
schwindigkeit des Wärmetransfers aus
500 bp
dem Thermoblock in die Probe sogar
bei ultra-dünnwandigen Gefäßen. Dies
führt unter Fast PCR-Bedingungen in
der Regel zu niedrigeren Amplifikations-
ausbeuten bei ebenfalls verminderter
Genauigkeit.
50 bp
Die hier dargestellten Ergebnisse zei-
gen die erfolgreiche Umsetzung eines
Standard PCR-Protokolls in ein Fast
PCR-Protokoll unter Zuhilfenahme der
Eppendorf Fast PCR Tube Strips aus
Polyethylen (Abb. 1). PCR-Protokolle mit
zwei verschiedenen Fast PCR-Reagenzien Eppendorf Thermo Bio-Rad® Analytik Jena®
1000 bp
wurden erfolgreich auf dem Mastercycler
A B C D E
X50s sowie dem X50i etabliert.
500 bp
> >
50 bp
Abb. 2: SpeedSTAR Protokoll (oben), GeneAmp Fast PCR Protokoll (unten)
Fazit
Die überlegenen Wärmetransfer-Eigen- Mehr Details finden Sie in der Appli
schaften von Polyethylen ermöglichen cation Note 400; erhältlich unter
die problemlose Umsetzung von Stan- www.eppendorf.com/appnote400
dard PCR-Protokollen zu Fast PCR-
Abb. 1: Eppendorf Fast PCR Tube Strips
Protokollen bei gleichzeitig erhöhten
Amplifikationsausbeuten. Gemeinsam
Während das Standard-Protokoll in der
mit Fast PCR-Reagenzien ist es möglich,
Regel eine Stunde benötigt, konnte das
den Vorteil von hohen Temperierraten
Fast PCR-Protokoll innerhalb von 12 min
auf schnellen Thermocyclern wie dem
(SpeedSTAR) bzw. 16 min (GeneAmp)
Mastercycler X50s bzw. X50i voll aus-
vollendet werden. Dies stellt eine Reduk-
zunutzen sowie die Zykluszeiten ohne
tion der Laufzeit von über 70 % dar.
arbeitsaufwendige Optimierung um mehr
Zusätzlich veranschaulicht der Vergleich als 70 % zu reduzieren. Dies ermöglicht
zwischen Eppendorf Fast PCR Tube es dem Anwender, die Zeit bis zum
Strips, Standard PCR-Consumables und PCR-Ergebnis zu verkürzen sowie den
anderen Fast PCR-Consumables die über- Probendurchsatz mit Hilfe von Thermo-
legene PCR-Leistung der Eppendorf blöcken und Consumables im Standard-
Fast PCR-Consumables aus Polyethylen format zu erhöhen und somit die Not-
anhand höherer Amplifikationsausbeuten wendigkeit für spezielle Gerätschaften
(Abb. 2). zu eliminieren.
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Kostengünstige DNA-Bestimmung mit Qubit™-Assays
im Eppendorf BioSpectrometer® fluorescence
MARTIN ARMBRECHT, EPPENDORF AG, HAMBURG
Zusammenfassung zenz-Farbstoff und Fluorimeter beruhen. Die Bedienung des Qubit erfolgt
Einige der Qubit-Assays, wie der Qubit analog zu den Angaben in der Kit-Ver-
Für diese Application Note wurden ver-
dsDNA HS Assay Kit, können auch suchsvorschrift. Für die Messung am
schiedene Konzentrationen von dsDNA-
unabhängig vom Qubit-Fluorimeter im BioSpectrometer wird die vorprogram-
Proben mit dem Qubit dsDNA-Assay im
Eppendorf BioSpectrometer fluorescence mierte Qubit-HS Methode verwendet
Eppendorf BioSpectrometer fluorescence
durchgeführt werden. Zur Optimierung [1, 2]. Für eine Messung in der UVette
bestimmt. Für die Messungen wurden
der Methode im BioSpectrometer wurden werden je 100 µL und für die µCuvette
die UVette® und die Eppendorf µCuvette®
hierzu verschiedene Evaluierungsschritte je 5 µL eingesetzt.
G1.0 verwendet. Um die Probenkonzen-
unternommen, wie zum Beispiel die
tration zu bestimmen, sind verschiedene Ergebnisse
Anwendung verschiedener Regressions-
Regressionsmöglichkeiten der Standard-
analysen der Standardkurve. Entspre- Die Methodenevaluierung des Qubit
kurve angewendet worden. Zusätzlich
chende Messungen wurden sowohl in dsDNA HS Assay Kit am BioSpectrome-
wurden die Resultate mit parallel im
der UVette als auch in der Eppendorf ter fluorescence zeigt, dass sowohl die
Qubit-Gerät durchgeführten Messungen
µCuvette G1.0 durchgeführt und die UVette als auch die µCuvette verwendet
der gleichen Proben verglichen. Wir zei-
Qualität der jeweiligen Messergebnisse werden können. Die Regressionsanalysen
gen, dass der Qubit-Assay sowohl mit der
mit der des Qubit-Fluorimeters vergli- [1] für die UVette machen deutlich, dass
UVette als auch der Eppendorf µCuvette
chen [1]. wie beim Qubit eine 2-Punkt Kalibrierung
G1.0 verwendet werden kann. In beiden
(Lineare Interpolation) ausreichend ist.
Fällen lassen sich die Assays mit erheb- Die wichtigsten Ergebnisse hierzu sollen
lich geringerem Probenvolumen als im hier vorgestellt werden. Abbildung 1 zeigt einen entsprechenden
Qubit-Gerät durchführen. Bei Verwen- Vergleich zwischen Messungen in der
Methoden
dung des BioSpectrometer fluorescence UVette (BioSpectrometer) und dem
mit der UVette wird nur die Hälfte an Für die Messungen im Qubit-Gerät Qubit-System. Dabei werden jeweils die
Qubit-Reagenz benötigt und somit die werden die im Kit mitgelieferten dsDNA- Präzision der Messreihe (A) und die Ab-
> Reichweite des Kits verdoppelt. Standards verwendet und entsprechend weichung vom Zielwert (B) miteinander >
hergestellt (0 und 500 ng/mL). Die Be- verglichen.
Einleitung
dienung des Qubits erfolgt analog zu den
Die UVette-Ergebnisse sind im Vergleich
Neben der klassischen Methode, Nuklein- Angaben in der Kit-Versuchsvorschrift.
zum Qubit bezüglich Präzision (Abb. 1A)
säure-Konzentrationen über Absorptions- Im BioSpectrometer werden ebenfalls
absolut vergleichbar und in Hinblick auf
messungen bei 260 nm zu bestimmen, die im Kit enthaltenen Standards verwen-
das Erreichen des Zielwertes sogar bes-
haben sich auch Quantifizierungsmetho- det. Durch entsprechende Verdünnungen
ser als die Messungen im Qubit (Abb. 1B).
den mittels Fluoreszenz etabliert. Ab- mit dem Qubit-Puffer werden weitere
sorptionsmessungen sind zwar einfacher Konzentrationsstufen hergestellt (0, 50, Dabei kann bei Messungen in der UVette
durchzuführen, da man die Probe direkt 100, 250, 500 ng/mL). Dadurch können die Hälfte der verwendeten Reagenzien
und ohne Standardkurve bestimmen verschiedene Regressionsmöglichkeiten eingespart werden. Statt 200 µL werden
kann, andererseits stößt man bei der der Standardkurve am BioSpectrometer für die UVette nur 100 µL benötigt.
photometrischen Methode hinsichtlich erprobt werden. Es werden jeweils
Auch die µCuvette kann für den Assay
Genauigkeit und Präzision gerade bei vier Messreihen mit unterschiedlichen
verwendet werden. Hier zeigt die
sehr gering konzentrierten Proben an Probenkonzentrationen (s. Tabelle 1)
Methodenevaluierung, dass die besten
die mögliche Nachweisgrenze. hergestellt. Jede Konzentrationsstufe
Ergebnisse bei quadratischer Regression
wird jeweils fünfmal gemessen.
Eine gebräuchliche Anwendung zur Be- erzielt werden [1]. Die Ergebnisse be-
stimmung von z.B. dsDNA sind die Qubit- Abhängig vom Messsystem werden un- züglich Präzision und Abweichung vom
Methoden von Thermo Fisher Scientific, terschiedliche Proben- bzw. Standard- Zielwert sind in Abbildung 2A bzw. 2B
welche auf einem System aus Fluores- volumina hergestellt (s. Tabelle 2). dargestellt.
Ausgangs Endkonzentration [ng/mL] Proben- oder Standard- Puffervolumen für Messvolumen
konzentration (nach 1:20 Verdünnung volumen [µL] Verdünnung [µL] [µL]
[µg/mL] mit Qubit-Reagenz)
Qubit™ 10 190 200
10 500
5 250 Eppendorf BioSpectrometer®
5 95 100
+ UVette®
2 100
Eppendorf BioSpectrometer®
2 38 5 (40*)
1 50 + Eppendorf µCuvette® G1.0
Tabelle 1 Tabelle 2: Messvolumina in den *Zur Vermeidung von Pipettierfehlern werden bei der µCuvette
verschiedenen Messsystemen Proben und Standards in einem 40 µL Ansatz hergestellt. Für die
eigentliche Messung werden aber nur 5 µL benötigt.
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