Immer schön beweglich bleiben: Move It - Eppendorf ...
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Nr. 53 – 2020
> >
Immer schön beweglich
bleiben: Move It® (BN 53) JULI 2020
Escherichia coli -Fermentation:
Scale-up vom Klein- zum Pilotmaßstab
SEITE 1
BIN LI UND MA SHA, EPPENDORF, INC., ENFIELD, USA
> epT.I.P.S.®: Upgrade für Design und Nachhaltigkeit
Zusammenfassung Bioblock BioFlo 320 BioFlo 610
1L 10 L 100 L
Die Maßstabsvergrößerung von Fermentationsprozessen ist ent-
Maximaler Gasfluss (SLPM) 4,2 20,0 150,0
scheidend für den Erfolg der industriellen Fermentation zur Gefäßtyp Glas Glas Edelstahl
Produktion bioaktiver Substanzen für den biopharmazeutischen Arbeitsvolumen (L) 0,2 – 1,0 3,5 – 10,5 32 – 100,0
Markt. Ein im Kleinmaßstab optimiertes Verfahren kann mit Vmax Höhe (mm)* 136,0 323,0 904,0
Hilfe von etablierten Scale-up Strategien in den Pilotmaßstab Gefäß Innendurchmesser (ID) (mm) 100,0 211,0 381,0
übertragen werden. Die Bioprozess-Systeme von Eppendorf Verhältnis Vmax Höhe : Gefäß ID pro Rührer 0,7 0,8 0,8
decken mit autoklavierbaren und Einwegbioreaktoren, sowie Rührertyp; Rührermaterial Rushton/Rushton-type; 316 L
Sterilize-in-Place (SIP) Gefäßen ein Arbeitsvolumen von weni- Anzahl der Rührer 2 2 3
ger als einem Liter bis zu 2.400 L ab. Eppendorf-Fermentations- Rührerdurchmesser (D) (mm) 46,0 84,4 165,1
> Dokumentieren Sie den Weg Ihrer Proben?
systeme wurden in Übereinstimmung mit Rührtank-Design- Verhältnis Rührerdurchmesser : Gefäß ID 0,4 0,4 0,4
standards aus der Bioverfahrensindustrie konzipiert. Auf Grund Max. Umdrehung (rpm) 1.600 1.200 500
Max. Umfangsgeschwindigkeit (m/s) 3,85 5,30 4,32
ihrer geometrischen Eigenschaften ermöglichen sie eine her-
vorragende Skalierbarkeit. Im Verlauf dieser Studie wurde die Tabelle 1: Proportional konzipierte Gefäße und Rührer in verschiedenen Maßstäben.
Maßstabsvergrößerung der E. coli-Fermentation evaluiert. *Vmax Höhe = Höhe vom Gefäßboden zum höchsten Stand der Flüssigkeitsoberfläche bei
höchstem Arbeitsvolumen des Gefäßes
Zunächst wurden für die Maßstabsvergrößerung kritische
verfahrenstechnische Parameter untersucht. Die erhaltenen Da Sauerstoff bei aerober Fermentation häufig den limitie-
Daten wurden eingesetzt, um ein E. coli-Verfahren nach der renden Faktor darstellt, ist es wichtig, dass die verwendeten
konstanten P/V-Maßstabsvergrößerungs-Strategie aus dem Gefäße in verschiedenen Größen vergleichbare OTR-Eigen-
Kleinformat (1 L) in das Pilotformat (100 L) zu übertragen. schaften aufweisen. Die (Rührer) Newton-Zahl ist eine mit
Hier zeigen wir die Scale-up Fähigkeiten der Eppendorf- verschiedenen Rührertypen assoziierte dimensionslose Zahl.
> Flexibel lernen: kostenfreie Webinare
Fermentationssysteme, vom Klein- über das Labor- bis hin zum Die OTR-Messungen wurden mit Hilfe eines bereits veröffent-
Pilotmaßstab. Die Fermentationsläufe in allen drei Größen- lichten, auf Sulfit-Abnahme beruhenden Protokolls durchge-
ordnungen erzielten über die Zeit sehr ähnliche Ausbeuten an führt [1]. Indem das Drehmoment des Rührers mit Hilfe eines
Biomasse, was auf eine ausgezeichnete Skalierbarkeit inner- Rotations-Drehmoment-Sensors gemessen wurde, wurden die
halb der Eppendorf-Fermenter schließen lässt. Newton-Zahl und die P/V-Werte bei verschiedenen Spitzen-
geschwindigkeiten auf die höheren Rührgeschwindigkeiten
Material und Methoden
berechnet, die normalerweise für die Fermentationsraten ein-
Ausstattung gesetzt werden. Da routinemäßige Fermentationsexperimente
unter hohen Begasungsbedingungen durchgeführt werden und
Abb. 1 zeigt die in diesem Projekt eingesetzten Eppendorf-
die Begasung das Drehmoment des Rührers stark herabsetzt,
Fermentationssysteme. Für den Prozess kritische Gefäß-
haben wir die Newton-Zahl (Np) bei einem hohen Gasfluss von
parameter sind in Tabelle 1 aufgelistet.
1,5 VVM sowie ohne Begasung bestimmt.
Bestimmung der Sauerstofftransferrate (OTR) und der
Bioreaktor-Aufbau und E. coli-Fermentation
Newton-Zahl (Np)
20 µL einer Zellbank-Stammkultur wurden zur Animpfung von
OTR ist die Rate, bei welcher Sauerstoff aus der Luft in die
500 mL TSB Medium in einer 2 L Schüttelflasche (VWR®, UK)
Flüssigkeit innerhalb eines Gefäßes übertragen wird.
eingesetzt und bei 37 °C und 200 rpm über Nacht in einem
Application Notes
Innova® 44 Schüttler inkubiert.
Kleiner Maßstab Labormaßstab Pilotmaßstab
Wir entschieden uns dazu, 90 % des maximalen Arbeitsvolu-
mens der drei Fermenter zu nutzen. E. coli wurden in einem
chemisch definierten Medium bei einem pH von 7,0 im Dauer-
Fermentationsmodus kultiviert, um ein konstantes Arbeitsvolu-
men beizubehalten.
Das Wachstumsmedium aller drei Fermenter wurde mit einer
Erhöhung von PCR-Ausbeute und -Spezifität · Generierung eines optimalen Bioreaktor-Inokulums
Impfkultur von 10 % des ursprünglichen Fermentationsmedium-
Volumens angeimpft. Antifoam 204 (Sigma-Aldrich®, USA)
DASGIP Paralleles
®
BioFlo 320
®
BioFlo 610:
®
wurde nur bei Schaumbildung eingesetzt. Das Zellwachstum
Bioreaktorsystem mit Bioprozess- Mobiler Fermenter
4-fach Bioblock Steuerungseinheit im Pilotmaßstab
wurde offline durch stündliche Probenentnahmen überwacht.
Verwendet mit 1 L Verwendet mit 10 L Verwendet mit 100 L
Sensorkalibrierung und Steuerung
Fermentationsgefäß Edelstahl-Rundboden- Sterilize-in-Place (SIP)
aus Glas gefäß Edelstahlgefäß
Die pH-Sensoren wurden außerhalb der Gefäße mit Hilfe der
Zwei-Punkt-Kalibrierungsmethode und Standardpuffern vor
im Schüttelkolben ∙ Vollständige Probenrückgewinnung in Conical Tubes ∙ etc.
Abb. 1: Die in diesem Projekt eingesetzten Eppendorf-Fermentationssysteme dem Autoklavieren geeicht. Der pH wurde durch den Zusatz
Your local distributor: www.eppendorf.com/contact
Eppendorf AG · Barkhausenweg 1 · 22339 Hamburg · Germany · E-Mail: eppendorf@eppendorf.com · www.eppendorf.com
2 EDITORIAL · LIEBE LESER
Impressum
Herausgeber
Eppendorf AG, Barkhausenweg 1,
22339 Hamburg, Deutschland
Telefon: + 49 40 53 801- 0
Fax: + 49 40 53 801- 556
E-Mail: bionews@eppendorf.de
www.eppendorf.com/bionews
Redaktionsteam
Berrit Hoff (Projektleitung),
Dr. Jan-Hendrik Bebermeier,
Dr. Tanja Musiol, Natascha Weiß
Gestaltung
Holger Paulsen Grafik-Design, Hamburg
Druck
Gebr. Klingenberg & Rompel in Hamburg
GmbH, Hamburg
Bildnachweis
Alle Bilder Eppendorf AG. Ausnahmen:
Liebe Leser,
S. 14 rechts: ETH Zürich; S. 24: Science/
AAAS; Application Note S. 4: MPI CBG,
Genotyping Facility, Dresden
Kontakt
das Corona-Virus SARS-CoV-2 berührt unser Leben nach wie vor, und wie lange dieser
Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH
Zustand anhalten wird, ist noch nicht absehbar. Weltweit sind zahlreiche Forscherteams
Peter-Henlein-Str. 2
unter Hochdruck dabei, wirksame Impfstoffe und Medikamente zu entwickeln. Dabei
50389 Wesseling-Berzdorf
gilt es, die größtmögliche Sicherheit für Mensch und Probenmaterial zu gewährleisten.
Tel. 01803 - 255911
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und reproduzierbar präzise Ergebnisse
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Und die Entwicklung geht stetig weiter. Unsere Kunden haben uns z.B. nach einer effi-
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zienten, sicheren und ergonomischen Lösung zum Mehrfachprobentransfer zwischen
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unterschiedlichen Formaten gefragt. Die Antwort hierauf ist „Move It ®“, eine neue
Tel. (01) 8901364 - 0
Generation von Mehrkanalpipetten mit justierbaren Spitzenabständen. Mehr dazu auf
E-Mail: office@eppendorf.at
Seite 4 –5. Die Notwendigkeit zu mehr Nachhaltigkeit macht auch vor dem Labor nicht
halt. Nach 17 erfolgreichen Jahren epT.I.P.S.® Pipettenspitzen im Markt machen wir Hinweise
mit einer Designüberarbeitung bei den Einweg-Racks einen messbaren Schritt bei der Ihre Beiträge sind willkommen. Für unver-
Einsparung von Kunststoff (Seite 6 – 7). Weitere Themen dieser Ausgabe behandeln die langt eingesandte Manuskripte wird keine
Probenidentifizierung und die Prozessverfolgung im Labor. Mehr dazu auf Seite 10 –11. Verantwortung übernommen. Die Einfüh-
rung von Produkten kann in verschiedenen
Ihren Laboralltag zu erleichtern und effizienter zu gestalten und Sie bei wichtigen
Märkten zu unterschiedlichen Zeitpunkten
Zukunftsfragen zu unterstützen – das treibt Eppendorf seit 75 Jahren an und wird es
erfolgen. Wir beraten Sie gern.
auch künftig tun. Ganz im Einklang mit unserer Mission, einen Beitrag zur Verbesse-
rung der Lebensbedingungen der Menschen zu leisten. Aus Gründen der besseren Lesbarkeit und
ohne jede Diskriminierungsabsicht wird
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im Text ausschließlich eine Form genutzt,
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die alle Geschlechter einbezieht.
Ihr Eppendorf BioNews-Team
Irrtum und technische Änderungen
vorbehalten. Alle Rechte vorbehalten,
einschließlich der Grafiken und Bilder.
Hinweis: Aufgrund der Corona-Krise wurde die Young European Investigators Markenhinweise auf Seite 14.
Conference (wir berichteten in der letzten Ausgabe) auf den 24. Juni 2021 verscho- © Copyright Eppendorf AG, Juli 2020.
ben. Mehr Info unter http://eppendorf.global/kwG Klimaneutral gedruckt in Deutschland.
INHALT 3
4 10 12
IM BLICKPUNKT Immer schön beweglich bleiben: Move It®! 4–5
LABORPRAXIS Vom Labor zum Regelkreis-Wachstumssystem 8
Dokumentieren Sie den Weg Ihrer Proben? 10 –11
INNOVATION Upgrade für Design und Nachhaltigkeit 6–7
NEWS / TIPPS Software-Update: Do It Yourself! 5
Für mehr Platz auf dem Labortisch 7
Gesicherte Performance, maximierte Lebensdauer 9
> >
Flexibel lernen: kostenfreie Webinare 12
Online-Shopping bei Eppendorf 12
Erfolgsfaktor Produktdesign 13
Relaunch der Eppendorf App 13
Eppendorf-Preisträger 2019/2020: Lauren Orefice & Randall Platt 14
SERVICE Markenhinweise 14
Gewinnspiel: neues Pipettiersystem zu gewinnen 15
BIN LI, MA SHA
(BN 53) JULI 2020 SEITE 1
Escherichia coli -Fermentation:
Zusammenfassung
Scale-up vom Klein- zum Pilotmaßstab
BIN LI UND MA SHA, EPPENDORF, INC., ENFIELD, USA Escherichia coli-Fermentation: 1– 2
Scale-up vom Klein- zum Pilotmaßstab
Bioblock BioFlo 320 BioFlo 610
1L 10 L 100 L
Die Maßstabsvergrößerung von Fermentationsprozessen ist ent-
Maximaler Gasfluss (SLPM) 4,2 20,0 150,0
scheidend für den Erfolg der industriellen Fermentation zur Gefäßtyp Glas Glas Edelstahl
Produktion bioaktiver Substanzen für den biopharmazeutischen Arbeitsvolumen (L) 0,2 – 1,0 3,5 – 10,5 32 – 100,0
Markt. Ein im Kleinmaßstab optimiertes Verfahren kann mit Vmax Höhe (mm)* 136,0 323,0 904,0
Hilfe von etablierten Scale-up Strategien in den Pilotmaßstab Gefäß Innendurchmesser (ID) (mm) 100,0 211,0 381,0
übertragen werden. Die Bioprozess-Systeme von Eppendorf Verhältnis Vmax Höhe : Gefäß ID pro Rührer 0,7 0,8 0,8
decken mit autoklavierbaren und Einwegbioreaktoren, sowie Rührertyp; Rührermaterial Rushton/Rushton-type; 316 L
Sterilize-in-Place (SIP) Gefäßen ein Arbeitsvolumen von weni- Anzahl der Rührer 2 2 3
ger als einem Liter bis zu 2.400 L ab. Eppendorf-Fermentations- Rührerdurchmesser (D) (mm) 46,0 84,4 165,1
systeme wurden in Übereinstimmung mit Rührtank-Design-
standards aus der Bioverfahrensindustrie konzipiert. Auf Grund
ihrer geometrischen Eigenschaften ermöglichen sie eine her-
Verhältnis Rührerdurchmesser : Gefäß ID
Max. Umdrehung (rpm)
Max. Umfangsgeschwindigkeit (m/s)
0,4
1.600
3,85
0,4
1.200
5,30
0,4
500
4,32
LIANE FUNKE, ANNE KRAUS, SYLKE WINKLER, FLORIAN HILBERS
vorragende Skalierbarkeit. Im Verlauf dieser Studie wurde die
Erhöhung von PCR-Ausbeute und -Spezifität
Tabelle 1: Proportional konzipierte Gefäße und Rührer in verschiedenen Maßstäben.
3–4
Maßstabsvergrößerung der E. coli-Fermentation evaluiert. *Vmax Höhe = Höhe vom Gefäßboden zum höchsten Stand der Flüssigkeitsoberfläche bei
höchstem Arbeitsvolumen des Gefäßes
Zunächst wurden für die Maßstabsvergrößerung kritische
verfahrenstechnische Parameter untersucht. Die erhaltenen Da Sauerstoff bei aerober Fermentation häufig den limitie-
Daten wurden eingesetzt, um ein E. coli-Verfahren nach der renden Faktor darstellt, ist es wichtig, dass die verwendeten
konstanten P/V-Maßstabsvergrößerungs-Strategie aus dem Gefäße in verschiedenen Größen vergleichbare OTR-Eigen-
mit dem Mastercycler® X50 mit 2D-Gradient
Kleinformat (1 L) in das Pilotformat (100 L) zu übertragen. schaften aufweisen. Die (Rührer) Newton-Zahl ist eine mit
Hier zeigen wir die Scale-up Fähigkeiten der Eppendorf- verschiedenen Rührertypen assoziierte dimensionslose Zahl.
Fermentationssysteme, vom Klein- über das Labor- bis hin zum Die OTR-Messungen wurden mit Hilfe eines bereits veröffent-
Pilotmaßstab. Die Fermentationsläufe in allen drei Größen- lichten, auf Sulfit-Abnahme beruhenden Protokolls durchge-
ordnungen erzielten über die Zeit sehr ähnliche Ausbeuten an führt [1]. Indem das Drehmoment des Rührers mit Hilfe eines
Biomasse, was auf eine ausgezeichnete Skalierbarkeit inner- Rotations-Drehmoment-Sensors gemessen wurde, wurden die
halb der Eppendorf-Fermenter schließen lässt. Newton-Zahl und die P/V-Werte bei verschiedenen Spitzen-
geschwindigkeiten auf die höheren Rührgeschwindigkeiten
Material und Methoden
berechnet, die normalerweise für die Fermentationsraten ein-
Ausstattung
Abb. 1 zeigt die in diesem Projekt eingesetzten Eppendorf-
gesetzt werden. Da routinemäßige Fermentationsexperimente
unter hohen Begasungsbedingungen durchgeführt werden und
die Begasung das Drehmoment des Rührers stark herabsetzt,
RAFAL GRZESKOWIAK, SANDRINE HAMELS, BLANDINE VANBELLINGHEN
Fermentationssysteme. Für den Prozess kritische Gefäß-
haben wir die Newton-Zahl (Np) bei einem hohen Gasfluss von
Vollständige Probenrückgewinnung in
parameter sind in Tabelle 1 aufgelistet.
5–6
1,5 VVM sowie ohne Begasung bestimmt.
Bestimmung der Sauerstofftransferrate (OTR) und der
Bioreaktor-Aufbau und E. coli-Fermentation
Newton-Zahl (Np)
20 µL einer Zellbank-Stammkultur wurden zur Animpfung von
OTR ist die Rate, bei welcher Sauerstoff aus der Luft in die
500 mL TSB Medium in einer 2 L Schüttelflasche (VWR®, UK)
Eppendorf Protein LoBind Conical Tubes
Flüssigkeit innerhalb eines Gefäßes übertragen wird.
eingesetzt und bei 37 °C und 200 rpm über Nacht in einem
Innova® 44 Schüttler inkubiert.
Kleiner Maßstab Labormaßstab Pilotmaßstab
Wir entschieden uns dazu, 90 % des maximalen Arbeitsvolu-
mens der drei Fermenter zu nutzen. E. coli wurden in einem
chemisch definierten Medium bei einem pH von 7,0 im Dauer-
Fermentationsmodus kultiviert, um ein konstantes Arbeitsvolu-
men beizubehalten.
Das Wachstumsmedium aller drei Fermenter wurde mit einer
MAIKE RIEL, FRANK EIDEN, LARS BLANK, NICOLA FREYER, INES HARTMANN
Impfkultur von 10 % des ursprünglichen Fermentationsmedium-
Volumens angeimpft. Antifoam 204 (Sigma-Aldrich®, USA)
DASGIP® Paralleles BioFlo® 320 BioFlo® 610: wurde nur bei Schaumbildung eingesetzt. Das Zellwachstum
Bioreaktorsystem mit Bioprozess- Mobiler Fermenter
7– 8
4-fach Bioblock Steuerungseinheit im Pilotmaßstab
wurde offline durch stündliche Probenentnahmen überwacht.
Generierung eines optimalen Bioreaktor-Inokulums
Verwendet mit 1 L Verwendet mit 10 L Verwendet mit 100 L
Sensorkalibrierung und Steuerung
Fermentationsgefäß Edelstahl-Rundboden- Sterilize-in-Place (SIP)
aus Glas gefäß Edelstahlgefäß
Die pH-Sensoren wurden außerhalb der Gefäße mit Hilfe der
Zwei-Punkt-Kalibrierungsmethode und Standardpuffern vor
Abb. 1: Die in diesem Projekt eingesetzten Eppendorf-Fermentationssysteme dem Autoklavieren geeicht. Der pH wurde durch den Zusatz
Your local distributor: www.eppendorf.com/contact
Eppendorf AG · Barkhausenweg 1 · 22339 Hamburg · Germany · E-Mail: eppendorf@eppendorf.com · www.eppendorf.com
im Schüttelkolben
4 IM BLICKPUNKT · IMMER SCHÖN BEWEGLICH BLEIBEN: MOVE IT®!
STEFANIE RÖSEL & SAMIRA SCHROEDER, EPPENDORF AG
Immer schön beweglich bleiben:
Move It ®!
Müssen auch Sie regelmäßig Proben zwischen verschiedenen Gefäßformaten hin- und herpipettieren?
Schlimmstenfalls sogar mit Einkanalpipetten zwischen Tubes und 96- bzw. 384-Well-Platten? Eine ineffiziente,
umständliche und ermüdende Prozedur. Und wenn der Durchsatz steigt, sinkt die Performance. Mit den neuen
Adjustable Spacer-Pipetten „Move It“ können Sie mehrere Proben gleichzeitig transferieren und bis zu 3x
schneller fertig sein. Testkunden loben: „Move It sorgt für eine echte Performance-Steigerung im Labor“.
Herausforderung angenommen und Unsere Kunden haben uns daher nach
gemeistert einer effizienten und sicheren Lösung „Move It steht für
zum Mehrfachprobentransfer gefragt, maximale Effizienz“
Mehrkanalpipetten konnten lange Zeit
die gleichzeitig komfortables und ergo-
nur für das Vorlegen von Flüssigkeiten
nomisches Arbeiten ermöglicht. Goodbye, Einkanalpipette
> wie Mastermix, Puffer oder Zellkultur- >
medium verwendet werden. So blieb die Dieser Herausforderung haben sich die Mehrere Proben zwischen Reaktions
Einkanalpipette das Mittel der Wahl, um Eppendorf-Entwickler gestellt und mit gefäßen unterschiedlicher Formate trans-
individuelle Proben für PCR, ELISA, „Move It“ eine neue Pipettengeneration ferieren, anstatt mehrfach mit Einkanal
FACS & Co. in Reaktionsgefäße, Platten geschaffen. Ihr Credo: Doppelte Perfor- pipetten pipettieren? Nach Belieben
oder Agarosegele zu übertragen. mance durch maximale Effizienz und zwischen den Formaten hin- und her-
gleichzeitig sicheren wechseln? Kein Problem! Per Drehknopf
Beim Beladen von Mikrotiterplatten mit
Probentransfer. können Sie den Spitzenabstand bei
bis zu 384 Wells hieß das bis zu 384 Mal
Mehrkanalpipetten manuell anpassen –
pipettieren! Dies dauert lang, erfordert
einfach und schnell (Abb. 1). Übertragen
höchste Konzentration und ist ineffizient.
Sie gleichzeitig vier bis zwölf Proben von
Passieren beim Aufbringen Fehler, stim-
Reaktionsgefäßen in Mikrotiterplatten
men die Ergebnisse nicht mehr
oder Agarosegele.
mit den Proben überein.
Werden Sie 3x schneller
Mit Move It reduzieren Sie Ihre Bearbei-
tungszeit um bis zu 70 %. Vordefinierte
Einstellungen ermöglichen einfache und
schnelle Formatwechsel. Mithilfe der
integrierten Abstandskontrolle lassen
sich die Spitzenabstände schnell an Aus-
gangs-und Zielgefäße anpassen. Unsere
Testkunden resümieren: „Die Voreinstel-
lung der Spitzenabstände erleichtert den
Arbeitsablauf enorm. Zwischen ihnen
hin- und herzuwechseln geht einfach,
schnell und ohne hinsehen zu müssen.“
Arbeiten Sie ermüdungsfrei –
den ganzen Tag
Schnelle, effiziente Workflows erfordern
gleichzeitig eine komfortable Handhabung
Abb. 1: Einfacher und schneller Formatwechsel durch Anpassen der Spitzenabstände der Pipette. „Bei der Entwicklung von
IMMER SCHÖN BEWEGLICH BLEIBEN: MOVE IT®! · IM BLICKPUNKT 5
ipetten mit verstellbarem Spitzenab-
P Dies hat folgende Vorteile: Die direkte Erfahren Sie mehr
stand war der Kundenwunsch nach einer Verbindung reduziert die Größe des Luft-
Ab Sommer 2020 sind unsere Mehrkanal-
perfekten Balance in der Hand eine der polsters um ein Vielfaches und damit den
pipettiersysteme Eppendorf Xplorer® plus
größten Herausforderungen“, berichtet Einfluss von Motor- oder Handwärme, die
(elektronisch) und Eppendorf Research®
Peter Schmidt, Business Manager bei zu unpräzisen Pipettiervolumina führen
plus (mechanisch) mit „Move It“-Funktio-
Eppendorf. „Unsere Produktdesigner und die Reproduzierbarkeit beeinträchti-
nalität erhältlich.
haben speziell für diese Anforderung ein gen könnten. Die Temperatur bleibt sta-
ausgeklügeltes Designkonzept entwickelt. biler, Präzision und Reproduzierbarkeit Um mehr zu erfahren oder sich zu einer
Die Handhaltung bleibt natürlich und ent- werden erhöht. Produktdemo anzumelden, besuchen Sie
spannt, Ermüdungserscheinungen werden http://eppendorf.global/kjS
Auch Risiken durch „Kabelsalat“, poröse
auf ein Minimum reduziert. Anwender
Schläuche und Undichtigkeiten werden
brauchen weniger Pausen und können
vermieden. Durch die Reduktion beweg-
den ganzen Tag entspannt arbeiten.“
licher Teile ist die Pipette zudem weniger
Tipp
Kein Verbiegen anfällig für Verschleiß; sie ist langlebig
und Ihr Garant für dauerhafte Präzision.
Das Pipettenoberteil ist 360° um die ei-
gene Achse drehbar. So können Sie das
Um das Kontaminationsrisiko für Ihre Software-Update:
Proben weiter zu reduzieren, können Sie
Display mit allen wichtigen Parametern
in jeder Position rasch und komfortabel
Ihre Move It-Pipette auch autoklavieren*. Do It Yourself!
*Eppendorf Research plus: vollständig autoklavierbar;
ablesen, ohne sich zu verbiegen (Abb. 2). Eppendorf Xplorer plus: Unterteil autoklavierbar Mit regelmäßigen Software-Updates hal‑
Dies unterstützt eine allzeit ergonomische
ten Sie Ihre elektronischen Pipetten und
Körperhaltung. Keine Sicherheitslücke
Dispenser immer auf dem neuesten Stand.
Eine bekannte Herausforderung beim So können zum einen „Bugs“ behoben, als
„Move It steht für Arbeiten mit Adjustable Spacer-Pipetten auch neue, wertvolle Features aufgespielt
> sicheren Probentransfer“ sind Motorvibrationen, die beim Anpassen und nebenbei die Lebensdauer Ihrer Geräte >
der Spitzenabstände entstehen können. verlängert werden.
Proben präzise und reproduzierbar Dabei können sich im schlimmsten Fall
übertragen Tropfen bilden, die wiederum Probenver-
lust und Kreuzkontamination begünstigen
Move It-Pipetten sind ohne Schläuche
können. Versuche müssen in so einem Fall
konzipiert (Abb. 3). Kolbenzylindersystem
wiederholt werden, Kosten entstehen und
und Konus sind direkt mit-
wertvolle Zeit geht verloren.
einander verbunden.
Move It-Pipetten arbeiten daher ohne
Motor. Die Spitzenabstände werden mit
einem manuell bedienbaren Drehknopf
völlig vibrationsfrei eingestellt – für einen
tropfenfreien, sicheren Probentransfer. Ab sofort können Sie diese Software-
Updates ganz bequem selbstständig an
Ihrem Arbeitsplatz durchführen. Starten
Sie den Update-Prozess auf der Eppendorf-
Homepage im Service & Support-Bereich
und laden sich das Update-Programm auf
Ihren Rechner. Verbinden Sie über die USB-
Schnittstelle ganz einfach Ihre Pipette*
oder den Dispenser mit dem Rechner und
starten den Update-Prozess. Schon wird
die neueste Software-Version auf Ihr Gerät
aufgespielt. Dieser Prozess dauert nur
wenige Minuten, und Sie können nachein-
ander so viele Geräte updaten wie Sie
mögen.
Bleiben Sie unabhängig und flexibel. Ver-
passen Sie keine Produktverbesserungen.
Mehr Info: http://eppendorf.global/kle
Abb. 2: Komfortable Lesbarkeit des Displays in jeder Körper- Abb. 3: Sicherer Probentransfer durch schlauchfreies *Alle Pipetten mit einem Push-ON/Off Key sind
haltung, da Pipettenunterteil um 360 ° drehbar System updatefähig.
6 INNOVATION · UPGRADE FÜR DESIGN UND NACHHALTIGKEIT
BRIGITTE KLOSE, EPPENDORF AG
Upgrade für Design
und Nachhaltigkeit
Schon bei der Entwicklung der epT.I.P.S.® Box für Pipettenspitzen im Jahr 2002 spielte Nachhaltigkeit eine Rolle.
Bis zu 100 Mal autoklavierbar, war diese Mehrweg-Box dazu bestimmt, mit epT.I.P.S. Pipettenspitzen (z.B. „Reloads“)
nachbefüllt zu werden. Ausschließlich für vorsterilisierte Pipettenspitzen wie z.B. ep Dualfilter T.I.P.S.® wurden
zusätzlich Einweg-Racks angeboten. Nach 17 erfolgreichen Jahren epT.I.P.S. Pipettenspitzen im Markt haben wir
im Rahmen einer Designüberarbeitung vor allem auf Nachhaltigkeit bei den Einweg-Racks und eine optimierte
Funktionalität bei den Mehrweg-Boxen geachtet.
Bewährtes bleibt Optimierte Funktionalitäten Spitzen ab 2,5 mL ist eine kleine Öffnung
geblieben, die aber keine Verbindung
Das neue Design unserer Boxen und Racks Das neue Design birgt jedoch auch Ver-
zum Innenraum der Box hat, in dem die
ist eine konsequente, moderne Weiterent- änderungen, welche die Handhabung
Pipettenspitzen sich befinden.
wicklung des vertrauten Markendesigns und Funktion deutlich verbessern. Die
> der epT.I.P.S. Pipettenspitzen. Wesentliche auffälligen Sichtschlitze auf der Rückseite Rechteckige Vertiefungen an den Seiten >
Merkmale wie die blaue Deckelfarbe der der Box sind weitgehend verschwunden. der Deckel von Racks und Boxen sorgen
Boxen und Racks sowie die Farbe des Diese Öffnungen, die bei einigen unserer für eine optimierte Stapelbarkeit. Im Ge-
Verschlussknopfes der Box sind erhalten Kunden immer wieder zu Ängsten bezüg- gensatz zum bisherigen Rack hat der neue
geblieben. Auch das prägnante horizon- lich möglicher Kontamination der Spitzen Deckel einen Verschluss. Gerade beim
tale Liniendesign auf der Frontansicht der in der Box geführt hatten, konnten nahe- sterilen Arbeiten sind die neuen Einweg-
Mehrweg-Box findet sich in modifizierter zu entfernt werden. Bei den zwei kleinen Racks immer wieder sicher verschließbar
Form auf der neuen Box und dem neuen Boxengrößen für Spitzen bis 1.250 µL sind und die Gefahr, die Pipettenspitzen ver-
Rack wieder. sie ganz verschwunden, bei der Box für sehentlich zu verlieren, ist nicht mehr ge-
Die Form des Verschlussknopfes der Box
ist hingegen moderner und die Farbe der
Boxen und Rack-Unterteile sichtbar heller
und leichter. Das Rack selbst ist nicht län-
ger doppelwandig und dadurch deutlich
verschlankt.
UPGRADE FÜR DESIGN UND NACHHALTIGKEIT · INNOVATION 7
geben. Die Unversehrtheit des Produktes In Zahlen ausgedrückt: Bei einem fiktiven Alternativen zu den üblicherweise ver-
wird durch einen neuen, ausschließlich Monatsbedarf von 100 Racks der mittleren wendeten Einweg-Kunststoffen auf
auf dem Verschluss platzierten Reinheits- Größe (z.B. Pipettenspitzen für 1.000 µL) Rohölbasis. Hierzu gehören Kunststoffe
sticker sichergestellt. werden für die Produktion 46,3 kg Poly- aus erneuerbarer Biomasse und biolo-
propylen (in Rohöl 84,7 Liter) pro Jahr gisch abbaubare Kunststoffe. Die größte
Es gibt kein umlaufendes Klebeband mehr,
eingespart. Herausforderung bei der Betrachtung
das gerade beim sterilen Arbeiten mit
dieser neuen Materialien besteht darin,
Handschuhen gerne an diesen kleben Die neue epT.I.P.S. Box ist wie ihre Vor-
sicherzustellen, dass ein Wechsel die
bleibt bzw. sie beschädigt. Auch weitere gängerin nachweislich bis zu 100 Mal
Qualität und Funktion des Produktes und
Bestandteile der epT.I.P.S. Racks, Reloads autoklavierbar. Mehr und mehr Kunden
damit die Qualität der Arbeitsergebnisse
und Boxen wurden optimiert. Neue über- nutzen daher die Mehrweg-Box für das
im Labor nicht beeinträchtigt.
sichtlich gestaltete Produktsticker mit Wiederbefüllen mit epT.I.P.S. Pipetten-
eindeutigen Piktogrammen des enthalte- spitzen in Reloads oder in Beuteln (Bulk) Bleiben Sie also neugierig und erwarten
nen Spitzentyps erleichtern die sichere in den Volumen von 10 µL bis 5 mL. Sie nur das Beste von Eppendorf – auch
Handhabung. wenn es um Nachhaltigkeit im Labor geht.
Reduce & Reuse – auch bei unseren wei-
Unser Beitrag zur Nachhaltigkeit im teren Neuentwicklungen für Eppendorf Mehr zum optimierten Handling
Labor Laborverbrauchsprodukte wird dies unsere erfahren Sie in unserem Video unter
Maßgabe sein. Das Potential einerseits http://eppendorf.global/kla
Eppendorf ist sich seiner sozialen Ver-
für die Verringerung von Rohstoffen für
antwortung in Bezug auf Nachhaltigkeit Tipp: Auch bei unseren Pipettenspitzen hat
die Produktion und andererseits für die
und Umwelt bewusst, kennt aber auch sich etwas getan! Für Ihre elektronische
Wiederverwendung von Produkt-Darrei-
die entscheidende Rolle von Kunststoff- Pipette Eppendorf Xplorer ®/Eppendorf
chungsformen ist noch nicht erschöpft.
Verbrauchsprodukten im Labor. Viele Xplorer ® plus und manuelle Eppendorf
Aufgaben im Rahmen von Forschung Wir betreiben weiterhin einen hohen Reference® 2 Pipette oder Eppendorf
und Entwicklung könnten heute nicht in Zeit- und Investitionsaufwand für die Research® plus 2,5 mL gibt es jetzt auch
> der Qualität, Präzision und Reproduzier- Erforschung von umweltfreundlicheren ep Dualfilter T.I.P.S. 0,25 – 2,5 mL. >
barkeit erfüllt werden, wenn es nicht
Gefäße, Pipettenspitzen oder Platten aus
Kunststoff gäbe. Das Gleichgewicht
zwischen den Anforderungen moderner Tipp
Wissenschaft und der Sorge um die Um-
welt in Bezug auf Kunststoffabfälle ist
eine zentrale Herausforderung für das
Für mehr Platz auf dem Labortisch
Management eines biowissenschaftlichen
Ist das Platzangebot in ihrem Labor begrenzt oder suchen Sie nach einer ergonomischen Auf-
Labors.
stellmöglichkeit für Ihre Eppendorf-Tischzentrifuge? Mit den neuen Rolltischen von Eppendorf
Wir bei Eppendorf haben es uns zur Auf- sparen Sie kostbaren Platz auf Ihrem Labortisch und können Ihre Centrifuge 5804/5804 R,
gabe gemacht, dem Prinzip „Reduce & 5810/5810 R, 5910 R oder 5920 R ganz einfach in ein anderes Labor bringen und genau dort
Reuse“ zu folgen, wo immer es möglich ist. verwenden, wo Sie sie benötigen.
Bei den neu entwickelten Verpackungs-
Ganz gleich, ob Sie sich für die niedrigere Ausführung für die Aufbewahrung Ihrer Zentrifuge
formen Einweg-Racks und Mehrweg-
unter dem Labortisch oder die höhere Ausführung für ergonomisches Be- und Entladen der
Boxen haben wir dieses Ziel bereits er-
Rotoren und Proben entscheiden, beide Rolltische zeichnen sich durch ein besonders stabiles
reicht. Die neuen Racks sind so gestaltet,
Design für die sichere Zentrifugation aus und sind mit Schwerlastrollen und Bremsen ausge-
dass je nach Größe des Racks 20 % bis
stattet. Beide Varianten erfüllen die anspruchsvollen Eppendorf-Standards für Sicherheit und
35 % weniger Polypropylen* benötigt wird.
Zuverlässigkeit.
Mehr Informationen unter http://eppendorf.global/krB
*Polypropylen (PP) ist ein durch Ketten
polymerisation von Propen hergestellter
thermoplastischer Kunststoff. Es gehört zur
Gruppe der Polyolefine und ist teilkristallin
und unpolar. Seine Eigenschaften ähneln
Polyethylen, es ist jedoch etwas härter und
wärmebeständiger.
Propen (Propylen) ist ein farbloses brennba-
res Gas. Es wird durch thermische Spaltung
(Steamcracken) der bei der Erdölverarbei-
tung anfallenden Leichtbenzine erhalten.
8 LABORPRAXIS · VOM LABOR ZUM REGELKREIS-WACHSTUMSSYSTEM
DAVID SOLBACH, EPPENDORF AG BIOPROCESS CENTER, JÜLICH
Vom Labor zum Regelkreis-
Wachstumssystem
Um wettbewerbsfähig zu bleiben, muss die moderne Biotechnologie robust, reproduzierbar und kosteneffizient
sein. Erhöhte Produktivität bedeutet in der Regel einen Ausbau von Arbeitseinrichtungen. Für biologische Kultur-
anwendungen trifft dies nur teilweise zu; eine Vielzahl von Zellen kann in Bioreaktoren/Fermentoren kultiviert
werden, was Platz spart und gleichzeitig die Qualität und die Ausbeute des Prozesses stark erhöht. Die ersten
Zellen, die eingesetzt werden, um den Bioreaktor anzuimpfen, haben jedoch bereits einen langen Weg hinter sich.
Prozessentwicklung Temperatur können mit Hilfe von Soft- weg einer Zelle, der im Gefrierschrank
ware-Lösungen überwacht, gesammelt beginnt und zum großen Bioreaktor führt,
Die Kultivierung von Zellen in Flaschen
und ausgewertet werden. verläuft reibungslos, wenn alle Schritte gut
oder auf Platten stellt einen der ersten
geplant und die verschiedenen Systeme
Schritte auf dem langen Wachstumsweg Ansatzvergrößerung (Up-Scaling)
aufeinander abgestimmt sind. Software-
> einer Zelle dar. Schüttler und Inkubatoren
Der nächste Schritt in der Entwicklung der Lösungen wie z.B. VisioNize®-onboard
>
sind nützliche Werkzeuge in der frühen
Zellkultur ist die Ansatzvergrößerung hin sorgen für durchgängige Benutzerfreund-
Phase der Prozessentwicklung sowie zum
zu Bioreaktoren im größeren Maßstab, um lichkeit über verschiedene Geräte hinweg.
Testen verschiedener Einzelparameter wie
Batch-zu-Batch Variationen zu vermeiden. Dieses enge Zusammenspiel zwischen den
z.B. Temperatur und Nährstoffvorrat. Ob-
Sprechen wir bei den ersten Schritten noch Geräten vereinfacht den Arbeitsablauf und
wohl die Online-Überwachung aller Pro-
von Volumina von wenigen Millilitern bis verringert Fehlerquellen.
zessparameter nicht möglich ist, stehen
Litern, werden industrielle Verfahren in
moderne Schüttler und Inkubatoren zur Um mehr über Up-Scaling und die Er
großen Pilot- und Produktionsmaßstäben
Verfügung, die in der Lage sind, Umwelt- höhung der Produktivität Ihres Prozesses
von 2.000 Litern und mehr durchgeführt.
bedingungen streng zu kontrollieren und mit Hilfe von Bioreaktoren zu erfahren,
zu steuern und somit reproduzierbares Bei jedem Schritt puffert eine zuverlässige laden Sie unser e-book RESOLVING
Wachstum gesunder Zellen zu gewährleis- Software Variationen in Echtzeit ab, indem CULTIVATION BOTTLENECKS: THE
ten. Die in diesem ersten Schritt gewonne- sie Veränderungen nachvollzieht und auto- BIOPROCESSING JOURNEY herunter
nen Zellen ermöglichen das Hochskalieren matisch reagiert. Der lange Wachstums- http://eppendorf.global/kjT
und die Prozesssteuerung, die die moder-
ne biotechnologische Industrie antreibt. Vorkultur Vorbereitung des Bioreaktors
> Vorkulturen zur Animpfung von Bioreaktoren werden > Sterilisierung von Bioreaktor und Sensoren
Produktion im Kleinformat in Schüttlern oder Inkubatoren herangezogen > Verbindung mit der Bioprozess-Steuerungsstation
> Zusatz von Medium
> Eingabe der Sollwerte in die Steuerungs-Software
Doch bevor die Zellen schließlich in der
Lage sind, große Mengen des gewünsch-
Animpfung
ten Produktes in einem Bioreaktortank zu
erzeugen, gilt es, die größten Vorteile
Kultivierungszeitraum
der parallelen Bioreaktoren im Klein- und > Schütteln der Kultur
Labormaßstab zu nutzen: Überwachung > Steuerung der Prozessparameter anhand der Sollwerte
> Fütterung der Kultur, falls erforderlich
in Echtzeit sowie die parallele Überwa- > Probenentnahme, falls erforderlich
chung mehrerer Bioreaktoren mit unter-
schiedlichen Verfahren, wobei alle wich- Ernte der Kultur Einsatz der Kultur zum Animpfen
tigen Parameter systematisch getestet oder des Produktes des nächstgrößeren Bioreaktors
werden können, um einen effizienten,
reproduzierbaren und zuverlässigen Pro- Reinigung des Bioreaktors Nachfolgende
zess aufzubauen. Kulturbedingungen wie > Sterilisierung von Bioreaktor Verarbeitung Kultivierungszeitraum
und Sensoren
z.B. Rührgeschwindigkeit, pH, gelöster > Reinigung aller Komponenten
der Kultur
Sauerstoff, Nährstoffkonzentration und
(BN 53) JULI 2020 SEITE 1
Escherichia coli -Fermentation:
Scale-up vom Klein- zum Pilotmaßstab
BIN LI UND MA SHA, EPPENDORF, INC., ENFIELD, USA
Zusammenfassung Bioblock BioFlo 320 BioFlo 610
1L 10 L 100 L
Die Maßstabsvergrößerung von Fermentationsprozessen ist ent-
Maximaler Gasfluss (SLPM) 4,2 20,0 150,0
scheidend für den Erfolg der industriellen Fermentation zur Gefäßtyp Glas Glas Edelstahl
Produktion bioaktiver Substanzen für den biopharmazeutischen Arbeitsvolumen (L) 0,2 – 1,0 3,5 – 10,5 32 – 100,0
Markt. Ein im Kleinmaßstab optimiertes Verfahren kann mit Vmax Höhe (mm)* 136,0 323,0 904,0
Hilfe von etablierten Scale-up Strategien in den Pilotmaßstab Gefäß Innendurchmesser (ID) (mm) 100,0 211,0 381,0
übertragen werden. Die Bioprozess-Systeme von Eppendorf Verhältnis Vmax Höhe : Gefäß ID pro Rührer 0,7 0,8 0,8
decken mit autoklavierbaren und Einwegbioreaktoren, sowie Rührertyp; Rührermaterial Rushton/Rushton-type; 316 L
Sterilize-in-Place (SIP) Gefäßen ein Arbeitsvolumen von weni- Anzahl der Rührer 2 2 3
ger als einem Liter bis zu 2.400 L ab. Eppendorf-Fermentations- Rührerdurchmesser (D) (mm) 46,0 84,4 165,1
systeme wurden in Übereinstimmung mit Rührtank-Design- Verhältnis Rührerdurchmesser : Gefäß ID 0,4 0,4 0,4
standards aus der Bioverfahrensindustrie konzipiert. Auf Grund Max. Umdrehung (rpm) 1.600 1.200 500
Max. Umfangsgeschwindigkeit (m/s) 3,85 5,30 4,32
ihrer geometrischen Eigenschaften ermöglichen sie eine her-
vorragende Skalierbarkeit. Im Verlauf dieser Studie wurde die Tabelle 1: Proportional konzipierte Gefäße und Rührer in verschiedenen Maßstäben.
Maßstabsvergrößerung der E. coli-Fermentation evaluiert. *Vmax Höhe = Höhe vom Gefäßboden zum höchsten Stand der Flüssigkeitsoberfläche bei
höchstem Arbeitsvolumen des Gefäßes
Zunächst wurden für die Maßstabsvergrößerung kritische
verfahrenstechnische Parameter untersucht. Die erhaltenen Da Sauerstoff bei aerober Fermentation häufig den limitie-
Daten wurden eingesetzt, um ein E. coli-Verfahren nach der renden Faktor darstellt, ist es wichtig, dass die verwendeten
konstanten P/V-Maßstabsvergrößerungs-Strategie aus dem Gefäße in verschiedenen Größen vergleichbare OTR-Eigen-
Kleinformat (1 L) in das Pilotformat (100 L) zu übertragen. schaften aufweisen. Die (Rührer) Newton-Zahl ist eine mit
Hier zeigen wir die Scale-up Fähigkeiten der Eppendorf- verschiedenen Rührertypen assoziierte dimensionslose Zahl.
Fermentationssysteme, vom Klein- über das Labor- bis hin zum Die OTR-Messungen wurden mit Hilfe eines bereits veröffent-
Pilotmaßstab. Die Fermentationsläufe in allen drei Größen- lichten, auf Sulfit-Abnahme beruhenden Protokolls durchge-
> ordnungen erzielten über die Zeit sehr ähnliche Ausbeuten an führt [1]. Indem das Drehmoment des Rührers mit Hilfe eines >
Biomasse, was auf eine ausgezeichnete Skalierbarkeit inner- Rotations-Drehmoment-Sensors gemessen wurde, wurden die
halb der Eppendorf-Fermenter schließen lässt. Newton-Zahl und die P/V-Werte bei verschiedenen Spitzen-
geschwindigkeiten auf die höheren Rührgeschwindigkeiten
Material und Methoden
berechnet, die normalerweise für die Fermentationsraten ein-
Ausstattung gesetzt werden. Da routinemäßige Fermentationsexperimente
unter hohen Begasungsbedingungen durchgeführt werden und
Abb. 1 zeigt die in diesem Projekt eingesetzten Eppendorf-
die Begasung das Drehmoment des Rührers stark herabsetzt,
Fermentationssysteme. Für den Prozess kritische Gefäß
haben wir die Newton-Zahl (Np) bei einem hohen Gasfluss von
parameter sind in Tabelle 1 aufgelistet.
1,5 VVM sowie ohne Begasung bestimmt.
Bestimmung der Sauerstofftransferrate (OTR) und der
Bioreaktor-Aufbau und E. coli-Fermentation
Newton-Zahl (Np)
20 µL einer Zellbank-Stammkultur wurden zur Animpfung von
OTR ist die Rate, bei welcher Sauerstoff aus der Luft in die
500 mL TSB Medium in einer 2 L Schüttelflasche (VWR®, UK)
Flüssigkeit innerhalb eines Gefäßes übertragen wird.
eingesetzt und bei 37 °C und 200 rpm über Nacht in einem
Innova® 44 Schüttler inkubiert.
Kleiner Maßstab Labormaßstab Pilotmaßstab
Wir entschieden uns dazu, 90 % des maximalen Arbeitsvolu-
mens der drei Fermenter zu nutzen. E. coli wurden in einem
chemisch definierten Medium bei einem pH von 7,0 im Dauer-
Fermentationsmodus kultiviert, um ein konstantes Arbeitsvolu-
men beizubehalten.
Das Wachstumsmedium aller drei Fermenter wurde mit einer
Impfkultur von 10 % des ursprünglichen Fermentationsmedium-
Volumens angeimpft. Antifoam 204 (Sigma-Aldrich®, USA)
DASGIP® Paralleles BioFlo® 320 BioFlo® 610: wurde nur bei Schaumbildung eingesetzt. Das Zellwachstum
Bioreaktorsystem mit Bioprozess- Mobiler Fermenter
4-fach Bioblock Steuerungseinheit im Pilotmaßstab
wurde offline durch stündliche Probenentnahmen überwacht.
Verwendet mit 1 L Verwendet mit 10 L Verwendet mit 100 L
Sensorkalibrierung und Steuerung
Fermentationsgefäß Edelstahl-Rundboden- Sterilize-in-Place (SIP)
aus Glas gefäß Edelstahlgefäß
Die pH-Sensoren wurden außerhalb der Gefäße mit Hilfe der
Zwei-Punkt-Kalibrierungsmethode und Standardpuffern vor
Abb. 1: Die in diesem Projekt eingesetzten Eppendorf-Fermentationssysteme dem Autoklavieren geeicht. Der pH wurde durch den Zusatz
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SEITE 2 (BN 53) JULI 2020
Escherichia coli- Fermentation:
Scale-up vom Klein- zum Pilotmaßstab
18 160
16 Bioblock (1 L) Bioblock (1 L)
140
y = 0,3067x3 + 0,0388x 2 − 0,0837x + 0,0528 R 2 = 1 BioFlo 320 (10 L)
14 BioFlo 320 (10 L) BioFlo 610 (100 L)
y = 0,125x3 + 0,035x 2 − 0,0773x + 0,0517 R 2 = 1 120
12 BioFlo 610 (100 L)
y = 0,0461x3 + 0,0025x 2 − 0,0093x + 0,0079 R 2 = 1 100
P/V [kW/m3 ]
10
OD600
80
8
60
6
40
4
2,42 20
0 0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Rührerspitzengeschwindigkeit [m/s] Zeit [h]
Abb. 2: Bestimmung der konstanten P/V-Werte für das Scale-up bei einem Gasfluss von Abb. 3: Biomassen-Wachstumskurven der Fermentationen in allen drei Systemen. Die
1,5 VVM Fermentationen wurden bei einem konstanten P/V-Wert von 2,42 kW/m³ durchgeführt,
welcher aus Abb. 2 bestimmt wurde.
von 25 % (v/v) NH4OH mit Hilfe einer Pumpe (zugewiesen als in der Lage, den Leistungsverbrauch der Rührer pro Volu-
„Base“) automatisch bei 7,0 beibehalten. Die Totzone für die men Flüssigkeit zu berechnen (P/V, W/m3).
pH-Steuerung wurde auf 0,05 eingestellt.
Die Np-Werte bei 1,5 VVM Luftfluss wurden zur Berechnung
Die Sensorkalibrierung für gelösten Sauerstoff (DO) wurde eingesetzt. Die maximal erreichbaren P/V aller dreier Forma-
mit einem analogen polarographischen DO-Sensor und der te betrug ~2,42 kW/m3. Wir wählten diesen Wert als den kon-
> Zweipunkt-Kalibrierungsmethode durchgeführt. stanten P/V-Wert, welcher sodann die Maßstabsvergröße- >
rung regulierte (Abb. 2). Die Rückberechnung der
Ergebnisse und Diskussion
Rührgeschwindigkeit aus diesem P/V-Wert ergab Rührge-
Alle drei Fermentationssysteme wurden nach den gleichen schwindigkeiten von 822, 600 bzw. 433 rpm für den Bioblock
geometrischen Grundsätzen für Gefäß und Rührer konzipiert, (1 L), BioFlo 320 (10 L) und den BioFlo 610 (100 L).
was eine gute Grundlage für die nachfolgende Maßstabs
Wir erstellten drei Fermentationsläufe und entnahmen stünd-
vergrößerung darstellte. Die Auswahl von Gerätschaften ver-
lich Proben, um das Zellwachstum zu überwachen (OD600 Wert).
schiedener Größen mit hohen OTR-Fähigkeiten ist ebenfalls
Wie in Abb. 3 gezeigt, waren die Wachstumskurven für alle
wichtig. So sind die verschiedenen Formate in Bezug auf ihre
drei Fermentationsläufe sehr ähnlich, was darauf schließen
Höchstleistung miteinander vergleichbar, und Erfolge im
lässt, dass mit Hilfe der konstanten P/V-Scale-up-Strategie
Kleinformat können im Großformat wiederholt werden. Alle
eine hervorragende Skalierbarkeit erzielt werden konnte.
drei Systeme erzielten hohe OTR-Werte von ~350 mmol/L/h
oder höher. Dies ermöglichte die Durchführung von Scale-up Fazit
Fermentationsläufen bei höherer Kapazität, was entsprechen-
Die Eppendorf-Fermenter, vom Bioblock zum BioFlo, sind von
de Biomassen-Wachstumskurven bei sehr hoher bakterieller
geometrisch und proportional ähnlichem Rührtank-Design. Alle
Dichte lieferte.
drei Systeme sind in der Lage, hohe OTR Werte zu liefern und
Maßstabsgerechte Geometrie und entsprechend hohe OTR- sind somit ideal zur hochgradig dichten aeroben skalierbaren
Werte bieten die Grundlage und den Rahmen für Fermentations- Fermentation geeignet. Die Beibehaltung eines konstanten
experimente mit hohen Zelldichten zur Maßstabsvergrößerung; P/V-Wertes bei unterschiedlichen Gefäßgrößen während des
allerdings stellen sie nicht die eigentliche Maßstabsvergröße- Fermentations-Scale-up von 1 L bis auf 100 L ergab nahezu
rungs-Strategie dar. Verschiedene Strategien wurden zur Maß- identische E. coli-Wachstumskurven. Dies lieferte einen zuver-
stabsvergrößerung der Fermentation eingesetzt, einschließlich lässigen Beleg für die Skalierbarkeit der Eppendorf-Fermen-
des Konstanthaltens der Rührergeschwindigkeit, gemessen am tationssysteme. Die Np-Werte der Rührer können auch für
Umfang des Rührers. Die zuverlässigste Methode bleibt jedoch weitere Scale-up- oder Scale-down-Studien zwischen Rührtank-
nach wie vor die konstante Leistung (P/V). Diese Methode be- Fermentern von Eppendorf und anderen Herstellern eingesetzt
nötigt die Bestimmung der Newton-Zahlen der Rührer (Np). Die werden.
Rührer Np-Werte für Eppendorf-Fermentationsgefäße betragen
Literatur
~10 ohne Begasung und ~5 mit 1,5 VVM Durchperlung mit Luft.
[1] How to Measure and Calculate OTR Using a New Brunswick™ Fermenter.
Das Beibehalten konstanter P/V zwischen den Gefäßen stellt 2013, Applications Training Document, Eppendorf, Inc.
eine der am breitesten akzeptierten Strategien für Scale-up Die vollständige Application Note 306 können Sie unter
Ansätze dar. Mit Hilfe der gemessenen Np-Werte waren wir http://eppendorf.global/kq0 herunterladen.
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Erhöhung von PCR-Ausbeute und -Spezifität
mit dem Mastercycler® X50 mit 2D-Gradient
LIANE FUNKE, ANNE KRAUS, SYLKE WINKLER, MPI CBG, GENOTYPING FACILITY, PFOTENHAUERSTR. 108, 01307 DRESDEN
FLORIAN HILBERS, EPPENDORF AG, HAMBURG
Zusammenfassung
Diese Application Note beschreibt den Einsatz des 2D-Gra-
dienten zur Eliminierung unspezifischer Produkte sowie zur
Erhöhung der Produktausbeute in der PCR. Der 2D-Gradient
ermöglicht einen Temperaturgradienten während des Dena-
turierungs- UND des Annealingschrittes – in einem einzigen
PCR-Lauf. Dies erlaubt das gleichzeitige Testen von 96 ver-
schiedenen Bedingungen in einem Lauf und beschleunigt
somit die Ermittlung der optimalen Temperaturkombination,
um sowohl Zeit als auch Ressourcen zu sparen.
Einleitung
Die PCR kommt routinemäßig in Forschung, Diagnostik und
Industrie zum Einsatz. Sie wurde 1983 entdeckt und war zu
der Zeit ein mühseliger und langwieriger Prozess, der große
Mengen an Ressourcen erforderte [1,2]. Es war daher nicht
überraschend, dass der Entdeckung der PCR die Entwicklung
des ersten Thermocyclers folgte [3] und sich über Peltier-
beheizte und -gekühlte Metallblöcke [4], einen beheizbaren
Deckel [5] und einen Temperaturgradienten (für bis zu 12 ver-
Abb. 1: Prinzip des 2D-Temperaturgradienten. Der traditionelle Gradient des Annealing
schiedene Annealingtemperaturen in einem Lauf auf einem schrittes ist auf dem unteren Teil der Abbildung dargestellt, während die zweite Dimension
96-Well-Cycler) [6] bis hin zum aktuellen Mastercycler X50 durch den Zusatz eines Temperaturgradienten im Rahmen des Denaturierungsschrittes er-
> fortsetzte.
reicht wird. Dies resultiert in 96 verschiedenen Bedingungen auf einer einzigen PCR-Platte. >
Bei der Annealingtemperatur handelt es sich um die Tempera- Erstens: Eine Erhöhung der Spezifität der Amplifikation des
tur, die üblicherweise optimiert wird. Im Gegensatz dazu stand Gens aus dem Plasmidkonstrukt.
die Denaturierungstemperatur bislang nicht im Blickpunkt, da
Zweitens: Eine Erhöhung der Ausbeute des murinen Gens.
der Einfluss der Annealingtemperatur als deutlich höher ein-
geschätzt wird. Unterschiedliche Denaturierungstemperaturen, Drittens: Wir konnten zeigen, dass eine Veränderung der
insbesondere bei GC-reichen Templates, können jedoch die Denaturierungstemperatur ein Scheitern der Ampli-
Ausbeute steigern und sollten bei der PCR-Optimierung be- fikation eines der beiden spezifischen Zielprodukte
rücksichtigt werden. Unser Ziel ist es zu zeigen, dass die in einer genetisch modifizierten Zebrafisch-Linie
Optimierung der Denaturierungstemperatur in der Tat für zur Folge hat.
viele PCR-Reaktionen von Vorteil ist. Der 2D-Gradient des
Diese Kurzversion konzentriert sich auf einen der drei ge-
Mastercycler X50 bietet erstmals die Möglichkeit, beide
nannten Vorteile: die Erhöhung der Ausbeute.
Temperaturen in einem PCR-Lauf zu optimieren und somit
96 verschiedene Bedingungen in einem einzigen PCR-Lauf Material und Methoden
abzudecken (Abb. 1).
Alle Experimente wurden auf einem Mastercycler X50s
Man könnte meinen, dass auch die Analyse von 96 verschie- (Eppendorf) bei einer Deckeltemperatur von 105 °C, im
denen Bedingungen mühsam sei und Zeit und Ressourcen Energiesparmodus und im Temperaturmodus „Standard“
koste. Aus diesem Grund haben wir uns entschieden, den durchgeführt. Für den Block wurde „Silver 96“ gewählt.
Aufwand mit Hilfe eines etablierten Pipettier- und Temperier-
Eppendorf twin.tec® PCR Plates 96 (semi-skirted und skirted)
schemas zu minimieren und daher eine effiziente Anzahl an
wurden in allen Experimenten eingesetzt. Die Platten wurden
verschiedenen Temperaturkombinationen beizubehalten
mit Eppendorf PCR Film oder Eppendorf Heat Sealing Film
(s. vollständige Application Note Nr. 423*).
versiegelt.
Die vollständige Application Note zeigt, dass die Modulierung
Murines Gen B
der Denaturierungstemperatur tatsächlich das Ergebnis der
PCR verändert, d.h. die Spezifität und/oder Ausbeute des Der 10 µL Reaktionsansatz enthielt 5 µl REDExtract-N-Amp™
PCR-Produktes werden erhöht. Drei verschiedene, im Labor PCR ReadyMix™ (Sigma Bestellnummer R4775), 3,2 µL ultra-
häufig eingesetzte Zielsequenzen wurden optimiert: ein pures Wasser, 0,4 µM Forward Primer Gen B (5’-AAA GTC
Plasmidkonstrukt, ein Gen der Maus und ein Zebrafisch-Gen. GCT CTG AGT TGT TAT-3’), 0,4 µM Reverse Primer Gen B
Mit Hilfe dieser drei Templates waren wir in der Lage, drei (5’-GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG-3’), 30 ng genomische
verschiedene Vorteile aufzuzeigen. DNA (aufgereinigt mittels eines Isopropanol-Protokolls).
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Erhöhung von PCR-Ausbeute und -Spezifität
mit dem Mastercycler® X50 mit 2D-Gradient
Das folgende PCR-Programm wurde für die Amplifikation Fazit
verwendet:
Wir konnten anhand von drei unterschiedlichen Ursprungs-
organismen mit verschiedenen Zielgenen darlegen, dass die
Initiale Denaturierung 95 °C 120 s
Denaturierungstemperatur einen wesentlichen Einfluss auf
Zyklen 35x Gradient 98 – 90 °C 30 s das PCR-Ergebnis hat – sei es Spezifität, Ausbeute oder falsch
negative Ergebnisse. Eine Optimierung der Annealing- und
Gradient 50 – 70 °C 30 s
der Denaturierungstemperatur ist jedoch bei der Verwendung
72 °C 60 s von konventionellen Thermocyclern mit 1D-Gradienten zeit-
aufwändig und langwierig. Ein solcher Ansatz würde mindes-
Abschließende Elongation 72 °C 60 s tens 8 verschiedene PCR-Läufe benötigen, um das gewünschte
Lagerung 15 °C Halten
Ergebnis zu liefern.
Der Mastercycler X50 mit seinem 2D-Gradienten reduziert
Die eingesetzten Temperaturkombinationen sind im Ergebnis die Optimierungszeit auf eine einzige PCR, da alle Gradienten
teil dargestellt. Die PCR-Produkte wurden mittels Agarosegel- gleichzeitig auf einem Thermoblock gefahren werden können.
Elektrophorese analysiert (1,5 % Agarose in 1 x TAE. Lauf:
Danksagung
45 min bei 100 V in 1 x TAE).
Wir möchten dem Genotyping Service des MPI-CBG für die
Ergebnisse und Diskussion
Zuverfügungstellung der Mäuse- sowie der Zebrafisch-gDNA
Die Optimierung einer PCR stellt u.U. ein Ressourcen-intensives danken. Wir danken ebenfalls der Protein Expression Purifi-
Verfahren dar; insbesondere dann, wenn das gewünschte Pro- cation and Characterization (PEPC) Gruppe des MPI-CBG für
dukt nicht erscheint oder wenn unerwünschte, unspezifische die Isolierung der hauseigenen Taq DNA Polymerase und für
Banden nicht verschwinden. Ein möglicher Grund ist eine nicht den 10 x PCR Puffer-Mix.
ausreichend optimierte Denaturierungstemperatur – denn
*Download unter http://eppendorf.global/kpZ
normalerweise wird diese als „einfach nur heiß“ angesehen.
> Diese Arbeit zeigt, dass eine Modulation der Denaturierungs- Literatur
>
temperatur tatsächlich in der Lage ist, die Spezifität, die Aus- [1] Rabinow P, Making PCR. A Story of Biotechnology. University of
beute und im Extremfall sogar die An- oder Abwesenheit Chicago Press; 1996.
spezifischer Banden zu beeinflussen. [2] Saiki RK et al., Enzymatic Amplification of β-globin Genomic Se-
quences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Ane-
Murines Gen B mia. Science 1985; 230:1350-54.
Dieses Ziel-Amplifikat hat eine Größe von 600 bp und ist in [3] Mr. Cycle: An Automated PCR Prototype. https://www.the-scientist.
allen Proben mit Ausnahme von einer enthalten. Keine unspe- com/foundations-old/mr-cycle-an-automated-pcr-prototype-47003
zifischen Banden sind zu erkennen; daher ist eine Optimierung [4] US patent US603236B2, 1990
an dieser Stelle nicht notwendig. Ein 2D-Gradient zeigt jedoch [5] US patent US7504241B2, 1990
Variationen bei der Ausbeute auf, sobald die Denaturierungs-
[6] European patent EP 1 426 110 A3, 1997
temperatur moduliert wird. Im Temperaturbereich zwischen
96,5 °C und 90,2 °C ist die Produktausbeute akzeptabel; die
höchste Ausbeute wird allerdings bei einer Denaturierungs-
temperatur im Bereich von 91,5 °C bis 90 °C und einer Anneal
ingtemperatur von 56,2 °C erzielt (Abb. 2). Die ursprünglich
gewählte Denaturierungstemperatur betrug 94 °C, d.h. das
Produkt liegt im akzeptablen Bereich – es handelt sich jedoch
nicht um die optimale Denaturierungstemperatur. Dies führt
sodann zu einer verminderten Produktausbeute, welche mit
Hilfe eines 2D-Gradienten problemlos optimiert werden kann.
Dies zeigt, dass nicht nur die Annealingtemperatur, sondern
auch die Denaturierungstemperatur der Optimierung bedarf.
Beide Faktoren beeinflussen die Produktausbeute. Die Optimie-
rung beider Temperaturbedingungen könnte sogar ohne eine
Erhöhung der Anzahl der PCR-Zyklen in einem Lauf zu einer
besseren Ausbeute führen und somit signifikant zur Einsparung
von Zeit und Ressourcen beitragen. Die Optimierung lässt sich
mittels 2D-Gradient in einem einzigen PCR-Lauf erzielen. Ohne
2D-Gradient sind mindestens 8 PCR-Läufe nötig, um die gezeig- Abb. 2: Agarosegel-Analyse des murinen Gens B. Dieses Experiment zeigt eine erhöhte
Ausbeute sofern die Denaturierungstemperatur verringert wurde. Diese Daten zeigen, dass
ten Ergebnisse zu erzielen. die optimale Ausbeute bei einer Denaturierungstemperatur von ca. 91 °C erzielt werden kann.
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