Das Dämpfungsverhalten des Tibiaplateaus bei Gonarthrose im Endstadium
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Aus dem Department Chirurgie Klinik für Orthopädie und Unfallchirurgie des Universitätsklinikums Freiburg im Breisgau Das Dämpfungsverhalten des Tibiaplateaus bei Gonarthrose im Endstadium Inaugural - Dissertation zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt 2020 von Julius Maria Watrinet geboren in Bad Honnef
II Dekan (kommissarisch) Herr Prof. Dr. Lutz Hein Erstgutachter Herr Prof. Dr. Hermann Otto Mayr Zweitgutachterin Frau Prof. Dr. Monika Engelhardt Jahr der Promotion 2021
III Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis .................................................................................................... III Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................... VI 1. Einleitung ............................................................................................................ 1 1.1 Anatomie des Kniegelenks ................................................................................... 1 1.2 Osteoarthrose......................................................................................................... 2 1.3 Therapie der Gonarthrose ..................................................................................... 5 1.4 Die Rolle des Meniskus ......................................................................................... 6 1.5 Biomechanische Untersuchungen der Oberfläche des Tibiaplateaus ............. 6 1.6 Histologische Untersuchungen des Tibiaplateaus ........................................... 10 1.7 CT-OAM ................................................................................................................. 11 2. Zielstellung ....................................................................................................... 14 2.1 Hauptzielgröße ..................................................................................................... 14 2.2 Nebenzielparameter ............................................................................................. 14 2.3 Weitere Aspekte ................................................................................................... 15 2.4 Gliederung ............................................................................................................ 15 3. Materialien und Methoden ............................................................................... 16 3.1 Probenkollektiv .................................................................................................... 16 3.1.1 Materialliste .................................................................................................... 16 3.1.2 Chemikalienliste ............................................................................................. 17 3.1.3 Experiment Beschreibung .............................................................................. 17 3.1.4 Berechnung des IM ........................................................................................ 20 3.1.5 Erstellen des Mapping .................................................................................... 23 3.2 Histologische Beurteilung ................................................................................... 23 3.2.1 Materialliste .................................................................................................... 23 3.2.2 Chemikalienliste ............................................................................................. 24 3.2.3 Schnittpräparation des Tibiaplateaus ............................................................. 26 3.2.4 Protokoll Dehydrierung und Paraffinierung .................................................... 27
IV 3.2.5 Färbungen ...................................................................................................... 27 3.2.6 Schema Probenentnahme Versuchsgruppe .................................................. 30 3.2.7 Schema Probenentnahme Kontrollgruppe ..................................................... 31 3.2.8 Erstellen eines digitalen Bildes....................................................................... 31 3.2.9 Scoringsysteme .............................................................................................. 32 3.3 Computertomographie ........................................................................................ 35 3.3.1 Erstellen der CT- Osteoabsorptiometrie ......................................................... 35 3.3.2 Bestimmung der Knochendichte .................................................................... 35 3.4 Statistik ................................................................................................................. 36 4. Ergebnisse ........................................................................................................ 37 4.1 Biomechanik ......................................................................................................... 37 4.1.1 Mapping des IM in der Versuchsgruppe......................................................... 38 4.1.2 Mapping des IM in der Kontrollgruppe ........................................................... 39 4.1.3 Ergebnisse ..................................................................................................... 39 4.2 Knorpeldicke ........................................................................................................ 41 4.2.1 Mapping der Knorpeldicke in der Versuchsgruppe ........................................ 43 4.2.2 Mapping der Knorpeldicke in der Kontrollgruppe .......................................... 43 4.3 Histologie .............................................................................................................. 44 4.3.1 OARSI-Score.................................................................................................. 44 4.3.2 Mankin-Score ................................................................................................. 46 4.3.3 Aho-Score ...................................................................................................... 47 4.4 CT-OAM ................................................................................................................. 49 4.4.1 Mapping der CT-OAM in der Versuchsgruppe .............................................. 50 4.4.2 Mapping der CT-OAM in der Kontrollgruppe ................................................. 51 4.5 Korrelationen ........................................................................................................ 51 4.5.1 Konsistenz der Scores ................................................................................... 52 4.5.2 Korrelation des IM mit der Knorpeldicke, der Histologie und der CT-OAM .... 53 5. Diskussion ........................................................................................................ 54
V 5.1 Instantaneous Modulus (IM) ................................................................................ 55 5.2 Automatisierte Dickenmessung des Gelenkknorpels des Tibiaplateaus ....... 57 5.3 Histologie .............................................................................................................. 58 5.4 CT – OAM .............................................................................................................. 59 5.5 Korrelationen ........................................................................................................ 60 5.6 Schwächen ........................................................................................................... 60 5.7 Schlussfolgerung ................................................................................................. 61 6. Ausblick ............................................................................................................ 62 7. Zusammenfassung ........................................................................................... 63 8. Literaturverzeichnis ......................................................................................... 64 9. Publikationen .................................................................................................... 73 10. Lebenslauf ........................................................................................................ 74 11. Anlageverzeichnis ............................................................................................ 76 11.1 OARSI-Score ......................................................................................................... 76 11.2 Mankin-Score ........................................................................................................ 77 11.3 Aho-Score ............................................................................................................. 78 11.4 Zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse für jede Probe.................... 79 12. Danksagung ...................................................................................................... 81 13. Eidesstattliche Versicherung .......................................................................... 82
VI Abkürzungsverzeichnis a - Radius der Kontaktregion C - Grad Celsius CT-OAM - Computertomographie-Osteoabsorptiometrie EDTA - Ethylendiamintetraessigsäure EM - Elastizitätsmodul g - Gramm G - Gauge H - Indentationstiefe h - Knorpeldicke HU - Hounsfield Unit IM - Instantaneous Modulus k - Korrekturfaktor, abhängig von a/h und v KT - Kendall’sches Tau MB - durch den Meniskus bedecktes Knorpelareal ml - Milliliter mm - Millimeter mm2 - Quadratmillimeter MPa - Megapascal MUB - durch den Meniskus unbedecktes Knorpelareal MW - Mittelwert N - Newton NaCl - Natriumchlorid NaOH - Natriumhydroxid OARSI - Osteoarthritis Research Society International P - p-Wert
VII p - load Pa - Pascal Pea - Korrelationskoeffizient nach Pearson PN - Probennummer S - Signifikanz s - Sekunden SD - Standardabweichung TEP - Totale Endoprothese USA - United States of America v - Poisson - Zahl W - Wert µm - Mikrometer
1 1. Einleitung 1.1 Anatomie des Kniegelenks Das Kniegelenk ist ein Roll-Gleitgelenk der unteren Extremität, in dem die knöchernen Strukturen Femur, Patella und Tibia mit sechs Freiheitsgraden artikulieren (Müller et al., 1982, Strasser, 1908). Die Kondylen des Femurs artikulieren mit dem Tibiaplateau, welches lateral im Vergleich kleiner und runder im Gegensatz zu medial größer und konvex geformt ist (Hirner and Weise, 2004). Zwischen den knorpelbedeckten Gelenkflächen liegen wie in Abbildung 1 dargestellt der äußere und innere Meniskus, welche die Gelenkfläche auf das Doppelte vergrößern und gleichzeitig die direkte Kongruenz des Kniegelenks wie in Abbildung 1 zu sehen erhöhen (Wirth and Abdolvahab, 2014b). Der Meniskus nimmt dabei Radialkräfte auf und vor allem die das Vorder- und Hinterhorn verbindenden radiären Kollagenfasern werden gespannt (Fehrmann and Mockenhaupt, 1991). Der in Abbildung 1 dargestellte Bandhalteapparat führt das Gelenk, hemmt Bewegung und erhält den Gelenkkontakt (Wirth and Abdolvahab, 2014a). In seiner Funktion ist das Kniegelenk einer Mischung aus statischer und dynamischer Beanspruchung ausgesetzt (Putz and Müller-Gerbl, 1996). Abbildung 1 Aufsicht auf das Tibiaplateau mit Bandstrukturen und Menisken. Die Menisken vergrößern die Kongruenz der Gelenkfläche (Schünke, 2018)
2 1.2 Osteoarthrose Osteoarthrose ist der häufigste Grund für Bewegungseinschränkung im Alter und seine Prävalenz ist weiter zunehmend (Bijlsma et al., 2011, Roemer et al., 2018, Schiphof et al., 2018). Es wird angenommen, dass die Osteoarthrose der Hauptgrund für eine körperliche Behinderung im Jahr 2050 sein wird (Mathiessen and Conaghan, 2017, Thomas et al., 2014). Ihre Folgen führen zu sozialen, psychologischen und ökonomischen Belastungen für Patienten mit großen finanziellen Konsequenzen (Gupta et al., 2005). Die Degeneration des Knorpels ist der zentrale Prozess der Osteoarthrose. Es kommt zur Erweichung und einer graduellen Ausdünnung des Gelenkknorpels bis zur Knochenglatze. Außerdem kommt es auf molekularer und zellulärer Ebene zu Veränderungen des Knorpels. Abbildung 2 Stadien der Gonarthrose in der anterior-posterior Röntgenaufnahme des Kniegelenks. Ein verengter Gelenkspalt, Osteophyten und Pseudozysten des subchondralen Knochens sind radiologische Zeichen der Gonarthrose. Grade 1 ist definiert als zweifelhafte Gelenkspaltverschmälerung mit eventuellen osteophytären Anbauten. Im Grad 2 sind definitiv Osteophyten vorhanden und eine Verschmälerung des Gelenkspalts ist möglich. Die Einteilung in die verschiedenen Grade ist in Tabelle 1 (Kellgren and Lawrence, 1957).
3 Tabelle 1 Darstellung der Kriterien zur Graduierung der Osteoarthrose in radiologischer Aufnahme nach Kellgren et al. 1957. Kellgren and Lawrence Score Grad 1 Fragliche Verschmälerung des Gelenksspalts und mögliche Osteophytenbildung Grad 2 Mögliche Verschmälerung des Gelenksspalts mit Osteophytenbildung Grad 3 Definitive Verschmälerung des Gelenkspalts mit moderater multipler Osteophytenbildung, Sklerose und eine mögliche Verformung der Tibia oder des Femurs Grad 4 Starke Verschmälerung des Gelenkspalts mit Bildung großer Osteophyten, einer ausgeprägten Sklerose und einer eindeutigen Verformung von Tibia und Femur Adaptiert und ins Deutsche Übersetz von Kellgren et al. (Kellgren and Lawrence, 1957) Die Gonarthrose im Speziellen ist eine fortschreitende irreversible degenerative Erkrankung des Kniegelenks, bei der anfangs häufig nur das mediale Kompartiment betroffen ist, es im Verlauf aber häufig zu einer bilateralen Manifestation kommt (Metcalfe et al., 2012). Alter, Geschlecht, Adipositas, Traumata und starke Benutzung stellen häufige Risikofaktoren dar (Grotle et al., 2008, Felson, 1988, Felson and Zhang, 1998). Die Gonarthrose ist in die Kategorie der langsam progredienten Arthrosen einzuordnen und traumatische Ereignisse liegen im Gegensatz zur Arthrose des Sprunggelenks beispielsweise eher selten vor (Günther et al., 1998, Valderrabano et al., 2006). Eine genetische Komponente spielt in der Entstehung der Gonarthrose ebenfalls eine Rolle wie Zwillingsstudien zeigen konnten (Valdes and Spector, 2011, Spector et al., 1996). Außerdem sind Achsfehlstellungen, immunologische Erkrankungen und metabolischen Störungen als Ursachen bekannt. Das komplexe Zusammenspiel aus Biomechanik, Stoffwechsel, Genetik sowie traumatischer und degenerativer Veränderungen resultiert letztendlich in einer Disbalance aus anabolen und katabolen Prozessen. Die Diagnose wird nach dem klinischen Erscheinungsbild und radiologischem Befund gestellt. Schmerz, Steifigkeit und Funktionsstörung sowie ein verengter Gelenkspalt, Osteophyten, und Pseudozysten sowie eine Sklerosierung des subchondralen Knochens sind dabei in Abbildung 2 dargestellte wegweisende Kriterien (Kellgren and Lawrence, 1957). Das MRT hat sich in er Diagnosestellung gegenüber dem Röntgenbild in zwei Ebenen nicht als überlegen erwiesen (Casula et al., 2014, Friemert et al., 2004).
4 Die Osteoarthrose wird als eine das ganze Knie betreffende multifaktorielle Krankheit verstanden, bei der mechanischer Stress, Störungen des Bandapparates, Knorpelschäden, Veränderungen des subchondralen Knochens und muskuläre Fehlfunktionen zusammenwirken (Egloff et al., 2012). Der Beginn der Arthrose ist durch eine Disbalance der Gelenkhomöostase gekennzeichnet, die durch eine Veränderung der Dynamik zwischen zerstörenden Gelenkkräften und Reparaturmechanismen gekennzeichnet ist (Helminen et al., 1992, Eyre, 2004, Torzilli et al., 1997). Häufig spielt dabei eine sekundäre, von mechanischem Stress abhängige Synovitis eine Rolle (Sellam and Berenbaum, 2010, Ayral et al., 2005, Goldring et al., 2011), bei der proinflamatorische Zytokine wie beispielsweise Tumornekrosefaktor (TN-) alpha oder Interleukin 1 nachgewiesen werden können (Partsch et al., 1997). Interessanter Weise führt mangelnde Bewegung zu eine verminderten Freisetzung des antiinflamatorischen Zytokins Interleukin 10, sodass eine beeinträchtigte Mobilität die Entzündungsprozesse begünstigt (Helmark et al., 2010). Verschiedene Studien unterstreichen ebenfalls die Rolle der mechanischen Belastung in der Kaskade der Gelenkdegeneration (Herzog et al., 1993, Sun, 2010). Im Vergleich zu anderen Gelenken wirken im Kniegelenk durch dessen Rollgleitbewegung mehr Scherkräfte (Treppo et al., 2000) und die Kraft verteilt sich auf eine relativ große Kontaktfläche zwischen dem femoralen und tibialen Knorpel (Brown and Shaw, 1983, Ihn et al., 1993, Kimizuka et al., 1980). Die leicht medial verlaufende Gelenkachse, welche vom Femurkopf bis zum Zentrum des Talus verläuft, führt zu einer physiologischen Mehrbelastung des medialen Kompartiments (Cooke et al., 2007, Andriacchi, 1994). Folglich beeinflusst eine Beinachsenfehlstellung die Kräfteverteilung innerhalb des Kniegelenks pathologisch und die Gelenkflächen werden unphysiologisch belastet (Tanamas et al., 2009). Während die verschiedenen Faktoren zu einer schleichenden Progredienz der Arthrose führen, kommt es immer wieder zu akuten Reizzuständen, der aktivierte Arthrose, die den Leidensdruck des Patienten erheblich erhöhen (Otte, 1969). Typischerweise reduziert sich die Knochendichte zu Beginn der Arthrose, um dann im Rahmen von Sklerosierungsprozessen im späteren Verlauf radiologisch nachweisbar wieder zuzunehmen (Intema et al., 2010). Vor allem in den Hauptbelastungszonen kommt es zu einer inhomogenen Verdickung des subchondralen Knochens (Milz and Putz, 1994, Madry et al., 2010). Es wird postuliert, dass durch die Knochendensitometrie nachgewiesene Sklerosierungsherde prognostisch für
5 Defektareale des Knorpels sein können (Doré et al., 2010). Die belastungsabhängig entstehenden Sklerosierungsherde können auch in der Computertomographie- Osteoabsorptiometrie (CT-OAM) nachgewiesen werden (Madry et al., 2010). Sie enthalten eine erhöhte Anzahl und Blutgefäßen und Nervenfasern, welche mit der Schmerzsymptomatik bei Osteoarthrose in Verbindung gebracht werden (Doré et al., 2010). Es wird angenommen, dass es einen Austausch zwischen Knochen und Knorpel über die kalzifizierte Grenzschicht hinweg gibt und es innerhalb dieser während der Osteoarthrose zu bedeutenden Veränderungen kommt (Goldring and Goldring, 2010, Sanchez et al., 2012). Es ist allerdings ungeklärt, ob die Veränderungen des subchondralen Knochens ursächlich oder als Folge von Knorpelschäden zu sehen sind. 1.3 Therapie der Gonarthrose Für die kurativ nicht therapierbare Gonarthrose, welche durch Schmerz und Funktionsminderung symptomatisch wird, gibt es verschiedene Therapieansätze. In der konservativen Therapie steht vor allem die Schmerzlinderung durch Analgetika und der Funktionserhalt im Vordergrund, wobei ein früher Therapiebeginn von Vorteil für den Patienten ist (Pendleton et al., 2000, Chu et al., 2012). Verschiedene konservative Therapieansätze wie beispielsweise die Anlage einer Knieorthese oder die manuelle Therapie können zu einer Verbesserung führen (Devos-Comby et al., 2006, Pollard et al., 2008). Die Injektion von Corticosteroiden ist ein verbreitetes Behandlungskonzept bei dem durch eine Reduktion der Synovialitis eine kurzfristige Symptomlinderung erzielt werden kann, bei der aber auch schwere Komplikationen auftreten können (McGarry and Daruwalla, 2011). Auch die Injektion von Hyaluronsäure oder „platelet rich plasma“, ein mit Thrombozyten angereichertes patienteneigenes Plasma, kann die Symptomatik vorrübergehend verbessern (Wang et al., 2004, Glynn et al., 2018). Nach dem Ausschöpfen konservativer Therapieoptionen ist ein chirurgisches Vorgehen indiziert, wobei die arthroskopische Ausräumung, auch bekannt als „Gelenktoilette“, keinen Vorteil mit sich bringt (Moseley et al., 2002). Chondrozytentransplantationen oder Umstellungsosteotomien, beziehungsweise eine Kombination der beiden, sind bei entsprechender Indikation ein vielversprechendes Therapierverfahren (Brittberg et al., 1994, Hangody et al., 2008). Die Implantation einer Endoprothese entspricht in der Regel dem totalen Gelenkersatz.
6 Obwohl die Arthroplastik ein großer Eingriff in die Gelenkfunktion ist, kehren die meisten Patienten zu sportlichen Aktivitäten zurück (Mayr et al., 2015). 1.4 Die Rolle des Meniskus Der in Abbildung 1 dargestellte mediale und laterale Meniskus spielt in der Druckverteilung eine zentrale Rolle im Kniegelenk. Asymptomatische Meniskusschäden sind in der Bevölkerung gerade bei Älteren in 20% der Fälle im MRT nachweisbar (Englund et al., 2008). Meniskusschäden können beispielsweise nach Traumata oder als Komorbidität der Gonarthrose entstehen und stellen einen Risikofaktor für die Ausbildung von Knorpelschäden dar (Berthiaume et al., 2005). Auch die Meniskektomie bei entsprechender Pathologie erhöht das Risiko der Gonarthrose deutlich (Rongen et al., 2017, Mezhov et al., 2014). Eine den Meniskus erhaltende Naht verringert dieses Risiko (Petty and Lubowitz, 2011). Mit Blick auf den Langzeitverlauf müssen invasive Maßnahmen individuell abgewogen werden, da eine Operation nicht zwingend die bessere Therapie ist (Beaufils et al., 2015). Der Meniskusersatz stellt einen neuen Therapieansatz dar, allerdings genügen die Transplantate den hohen biomechanischen Ansprüchen bis heute nicht, die Versagensrate ist hoch und die Studienlage dünn, sowie Langzeitergebnisse fehlen (Vaquero and Forriol, 2016, Dangelmajer et al., 2017). Für das Verständnis der Gonarthrose und der Entwicklung von Scaffolds für den Meniskus- und Knorpelersatz ist die Kenntnis der mechanischen Eigenschaften des Gelenkknorpels essentiell. 1.5 Biomechanische Untersuchungen der Oberfläche des Tibiaplateaus Schon lange ist das Knie Gegenstand der Forschung, doch bis heute gibt es kein kuratives Behandlungskonzept der Gonarthrose. Zur erfolgreichen Therapie ist die Kenntnis über die biomechanischen Eigenschaften des Knorpels essentiell. Insbesondere der Vergleich des Dämpfungsverhaltens der vom Meniskus bedeckten und unbedeckten Areale ist hierbei von Interesse. Es wird postuliert, dass für das erfolgreiche Design von Gewebeersatz die komplexen biomechanischen und biochemischen Knorpeleigenschaften erforscht und berücksichtigt werden müssen (McKee et al., 2011). Die biomechanischen Eigenschaften des tibialen Gelenkknorpels können durch Angabe des Instantaneous Modulus (IM) angegeben werden. Der IM ist eine Spezifizierung des Elastizitätsmoduls (EM). Der EM ist ein Maß für die Steifigkeit und
7 beschreibt die Verformung elastischer Stoffe unter Druck. Er wird als Proportionalitätskonstante der Spannung und der Dehnung angegeben und hat die Einheit [Pa] (Millow, 2010). Der IM beschreibt die unmittelbare elastische Antwort auf die Druckbelastung. Hayes et al. entwickelte ein Model zur Ermittlung des IM des Gelenkknorpels mittels sphärischem Indenter (Hayes et al., 1972). In vorangegangenen Studien zum Knorpel des Kniegelenks wurde die Methode „confined and unconfined compression“ benutzt, welche das Gewebe destruiert, sodass die gleiche Gewebeprobe nicht biomechanisch und histologisch untersucht werden kann (Kleemann et al., 2005, Wong and Sah, 2010). Durch die Entnahme von Probenzylindern wird die Oberfläche des Gelenks zerstört und möglicherweise werden mechanische Artefakte erzeugt (Hunziker et al., 2014). Außerdem gibt es Variationen innerhalb des Knorpels, sodass eine einzelne Probe eventuell nicht repräsentativ ist (Armstrong et al., 1995). Ein flächendeckendes Mapping der gesamten Gelenkfläche war so aufgrund der punktuellen Untersuchung nicht möglich. Eine nicht-destruktive Methode misst mit dem in Abbildung 3 dargestellten Tester die elektromechanischen Eigenschaften des Knorpels (Sim et al., 2014b, Sim et al., 2016). Die für diese Studie angewandte Messmethode erfolgt nicht-destruktiv, sodass die mechanischen und histologischen Daten im gleichen Punkt verglichen werden können.
8 Abbildung 3 Tester Biomomentum Mach-1 v500css. Dargestellt ist der Tester während eines Messvorgangs. An der Messeinheit befindet sich ein Indenter mit 1 [mm] Durchmesser, auf dem in X- und Y-Achse verschiebbaren Messtisch ist die Probe in einer Messkammer montiert. (Sim et al., 2014a) Das Indentationsverfahren (DIN EN ISO 14577) ist ein industrielles Testverfahren, welches zur Messung der Elastizität des Gelenkknorpels angewendet werden kann (Abedian et al., 2013). Die Untersuchungstechnik ist im Vergleich zu anderen Techniken eine schnelle nicht-destruktive Methode, welche bei der Untersuchung von menschlichem femoralem Kniegelenksknorpel die sensitivsten Ergebnisse erzielt (Sim et al., 2016). Dabei können durch das Erstellen eines reproduzierbaren Koordinatensystems die mechanischen Eigenschaften des gesamten Knorpels in Gänze kartiert dargestellt werden (Lavoie et al., 2014). Das projizierte Koordinatensystem ist in Abbildung 4 exemplarisch dargestellt. Der IM [Pa], die Maßeinheit für mechanische Spannung, wird nach Hayes entsprechen der folgenden Gleichung berechnet (Hayes et al., 1972). Dabei gleicht der Korrekturfaktor den Einfluss des Indenters auf die mechanische Messung aus und wird tabellarisch abgelesen, die vollständige Ableitung ist bei Hayes dargestellt (Hayes et al., 1972).
9 Abbildung 4 Tibiaplateau mit Markierungen der Lage der Menisken (blau) und digitalem Koordinatengitter (schwarz, nummeriert). Zu sehen ist, dass nur Punkte in relevanten und messbaren Arealen ausgewählt wurden. (Probe 43) P #1-v2 $ IM= × H 2ak % a ×v' h IM = Instantaneous Modulus P = load H = Indentationstiefe v = Poisson - Zahl a = Radius der Kontaktregion k = Korrekturfaktor des Indenters, abhängig von a/h und v h = Knorpeldicke Studien von Armstrong und Sim zeigen, dass die mechanischen Eigenschaften des Knorpels einen geeigneten Indikator für dessen Funktion darstellen und es eine Korr- elation zwischen histologischen Scores und den mechanischen Eigenschaften gibt (Sim et al., 2014b, Armstrong and Mow, 1982). Außerdem können mechanische Schäden nachgewiesen werden, die weder durch abnorme Werte in der Dickenmessung noch makroskopisch auffallen (Sim et al., 2014a). Durch reproduzierbare Messpunkte kann die Dicke des Knorpels valide durch die „needle
10 probe“ bestimmt werden (Jurvelin et al., 1995). Das Mach-1 Prüfgerät (Biomomentum Inc., Laval, Kanada) zeigt in Studien im Vergleich zu etablierten Messmethode des Gelenkknorpels von Mensch und Tier in anderen Testverfahren gute Ergebnisse und ist ein geeignetes Testverfahren (Sim et al., 2014a, Zhou et al., 2015, Legrand et al., 2017). Ein vollständiges Mapping des IM und der Knorpeldicke über das gesamte Tibiaplateau erfolgte bisher in einer kleinen Machbarkeitsstudie des Herstellers am Mausmodel (Sim et al., 2016). 1.6 Histologische Untersuchungen des Tibiaplateaus Die degenerativen Veränderungen des Gelenkknorpels können histologisch unter anderem mit Hilfe der Scoringsysteme OARSI, Mankin und Aho nachgewiesen werden (Pritzker et al., 2006, Sluijs, 1992, Aho et al., 2017b). Eine der ersten Pionierarbeiten zur Klassifikation von Arthrose leistete Collins 1949, in dem er in Untersuchungen an autopsierten Femurkondylen einen makroskopischen Score entwickelte, der die Veränderungen der Knorpeloberfläche, die Größe der Knorpelläsionen und die knöchernen Veränderungen in vier Gradienten einteilt (Collins, 1939, Collins, 1949). 1.6.1.1 Mankin Score Der Mankin Score (Mankin et al., 1971) wurde durch Untersuchungen degenerierter Hüftköpfe entwickelt und korreliert Histopathologien mit biochemischen Veränderungen des Gelenkknorpels im Zusammenhang mit Osteoarthrose. Der 14 Punkte Score vergleicht Safranin-O gefärbte Präparate und wird zur Klassifikation der Osteoarthrose in modifizierten Formen eingesetzt. Der Mankin Score ist auch unter dem Namen „Histologic Histochemical Grading System (HHGS)“ bekannt. Ostergaard et al. forderten allerdings ein neues Klassifikationssystem, da der Mankin Score womöglich schlecht reproduzierbar und valide ist (Ostergaard et al., 1997). 1.6.1.2 OARSI Score Im Jahr 2006 wurde der OARSI Score von Pritzker et al. veröffentlicht und seitdem 1162 (Stand Mai 2021) mal zitiert, was seine breite Akzeptanz innerhalb der wissenschaftlichen Gemeinde verdeutlicht (Pritzker et al., 2006). Der Score wurde ins Leben gerufen, da in ältere Scores die beginnende Arthrose nicht gut dargestellt und die Graduierung nicht linear verlief. Er folgt den fünf Prinzipien „Simplicity, Utility, Scalability, Extendability, Comparability” (Pritzker et al., 2006). In vergleichenden Studien stellten Custers et al und Pauli et al. sowohl eine hohe inter- und intra-
11 Oberserver Reproduzierbarkeit als auch eine starke positive Korrelation fest (Custers et al., 2007, Pauli et al., 2012). 1.6.1.3 Aho Score Ein hochaktuelles Scoringsystem von Aho et al. fokussiert sich nur auf die subchondrale Sklerose des Knochens als Reaktion auf ein besseres Krankheitsverständnis der Osteoarthrose, bei der das Remodelling des Knochens einen immer größeren Einfluss gewinnt (Aho et al., 2017a). Er hat signifikante Übereinstimmung mit dem OARSI Score. Weitere Möglichkeiten, wie beispielsweise die Optische Kohärenztomographie (OCT), bei der die Knorpelstruktur aus Interferenzsignalen rekonstruiert wird, wurden hier nicht eingesetzt (Nebelung et al., 2014). 1.7 CT-OAM Einen interessanten nicht invasiven Ansatz, die Langzeitbelastung des Kniegelenks durch eine veränderte Knochendichte zu quantifizieren, bietet die CT-OAM von Frau Prof. Müller-Gerbl (Müller-Gerbl et al., 1990). Carter et al. prägten 1987 erstmals den Begriff der „loading history“ für die durch Langzeitbelastung auftretenden knöchernen Veränderungen in Gelenken (Carter, 1987). Durch die „loading history“ wird das subchondrale Remodelling des Knochens – eine gesteigerte Mineralisierung des Knochens in belasteten Zonen beziehungsweise eine verminderte bei Immobilisation – beschrieben. Einflussfaktoren auf das Verteilungsmuster der subchondralen Knochendichte sind sowohl die Geometrie der Gelenkkörper als auch die Gelenkkräfte, die in zeitlicher Summation der Spannungsverteilung der Gelenkflächen auf die Mineralisierung des Knochens einwirken (Müller-Gerbl, 2010). Bullough et al. wiesen eine hohe Variabilität der Knochendichte und Knorpeldicke innerhalb des Tibiaplateaus im Tierversuch am Hund nach (Bullough et al., 1985). Ein etabliertes Verfahren zur bestimmen der Knochendichte ist das auf dünnen Gewebeschnitten basierende Knochendensitogramm nach Konermann (Konermann, 1970, Konermann, 1971). Im Gegensatz dazu ist die CT-OAM ein äquivalentes nicht invasives Verfahren. Es konnte wie in Abbildung 5 dargestellt gezeigt werden, dass Bereiche größerer
12 biomechanischer Belastung auch im CT indirekt mittels unterschiedlicher Dichtewerte nachweisbar sind (Müller-Gerbl et al., 1992). Abbildung 5 Vergleich des Mineralisierungsmusters des Tibiaplateaus in Abhängigkeit von der Hauptbelastungszone bei unterschiedlichen Beinachsen. Teil a zeigt die gleichmäßige axiale Belastung, aus der eine gleichmäßige Mineralisierung in Teil c dargestellt resultiert. Bei einer varisierten Beinachse wie in Teil b dargestellt verändert sich das Mineralisierungsmuster dahingehend, das Bereich der Hauptbelastungszone stärker mineralisiert sind als weniger stark belastete Bereiche. (Müller- Gerbl, 2010) Im gesunden Kniegelenk erfolgt die Kraftübertragung gleichmäßig ohne große Spitzenbelastung, was in zwei zentrale Knochendichtemaxima im medialen und lateralen Kompartiment des Tibiaplateaus resultiert. Kommt es durch eine Kreuzbandruptur, einen Meniskusverlust oder eine Beinachsenfehlstellung, allesamt Arthrose begünstigende Pathologien, zu einer veränderten Kraftübertragung, resultiert dies in einer veränderte Mineralisierung (Müller-Gerbl, 2010). Bei einem Genu varum kommt es beispielsweise durch eine nach medial verlagerte Gelenkachse zu erhöhtem Druck im medialen Randbereich und Entlastungen im lateralen Kompartiment, was in einer erhöhten Mineralisierung des medialen Tibiaplateaus in der randständigen Zone und einer geringeren Knochendichte lateral resultiert (Maquet, 1976). In der Verlaufskontrolle von operativ korrigierten varischen Beinachsen konnte eine
13 Veränderung des Densitogramms im Sinne einer Normalisierung für die meisten Probanden innerhalb eines Jahres nachgewiesen werden (Müller-Gerbl, 2010). Für das Krankheitsverständnis der Gonarthrose ist die Einbeziehung des subchondralen Knochens von Bedeutung, was bis bist jetzt jedoch zu wenig Gegenstand der Forschung war (Madry et al., 2010, Geurts et al., 2016). Da die CT- OAM auch am Lebenden anwendbar ist, hat das Verfahren eine klinische Relevanz. In dieser Arbeit soll der Zusammenhang zwischen der chronischen Langzeitbelastung, quantifiziert durch den Mineralisierungsgrad, und dem IM als sekundärer Endpunkt untersucht werden. Es wurden in dieser Dissertation folgende Aspekte untersucht • Das Dämpfungsverhalten des Knorpels des Tibiaplateaus bei Gonarthrose im Endstadium wurde gemessen, nachdem ein geeigneter Versuchsaufbau entwickelt wurde. Dazu wurde das Gewebe bei der Implantation einer totalen Kniegelenksprothese gewonnen und innerhalb von 24 Stunden vermessen. Mit dem Mach-1 Tester der Firma Biomomentum wurde sowohl die Indentation als auch die Dicke des Knorpels in einem definierten Koordinatensystem gemessen. • Durch die vorangegangene Markierung der Lage der Menisken konnten die Messpunkte einer Probe folgenden Kategorien zugeteilt werden: mediales und laterales Kompartiment, Meniskus-bedeckte (MB) und Meniskus-unbedeckte Bereich (MUB) • Den Tibiaplateaus wurden in MB und MUB beider Kompartimente Probenzylinder entnommen. Nach Entkalkung dieser und Einbettung in Paraffin wurde die geschnittenen Präparate in Safranin-O und Giemsa gefärbt. Anschließend erfolgte die Beurteilung der Proben nach den Scores von Aho, Mankin und Oarsi.
14 2. Zielstellung In dieser Arbeit wurden die biomechanischen Veränderungen des humanen Gelenkknorpels und die Knorpeldicke des Tibiaplateaus bei Gonarthrose im Endstadium im Oberflächenmapping dargestellt und mit einer Kontrollgruppe verglichen. Dabei wurden die biomechanischen Eigenschaften durch den IM nach Hayes definiert. Darüber hinaus wurden die biomechanischen Veränderungen sowohl mit histologischen Scores des Gelenkknorpels und des subchondralen Knochens sowie die Knochendichte mittels CT-OAM verglichen. 2.1 Hauptzielgröße Den primären Endpunkt dieser Arbeit stellt die Ermittlung und Kartierung des IM nach Hayes dar (Hayes et al., 1972). Um die biomechanischen Eigenschaften zu testen wurden die Proben mit der Mach-1 Prüfmaschine von Biomomentum verwendet. Dabei fährt ein sphärischer Indenter mit einem Durchmesser von einem Millimeter mit einer festgelegten Geschwindigkeit auf die Probe herab und misst dabei den IM, bis das kraftgesteuerte Abbruchkriterium erreicht wird. Durch das neue Indentationsverfahren ist es nun erstmals möglich, die humane Tibia ohne Destruktion der Probe biomechanisch zu untersuchen. Dies lässt in der Kombination mit der Computertomographie die Möglichkeit zu, den gleichen Messpunkt mit allen drei Verfahren zu testen und so deutlich mehr Informationen über den Knorpel zu erhalten, als dies bisher möglich war. Außerdem ist die Auflösung der biomechanischen Ergebnisse mit bis zu 140 Messpunkten pro Probe deutlich differenzierter als in vergleichbaren Studien, in denen nur destruktiv mit der Methode „unconfined compression“ gemessen werden konnte. Dabei kann der IM bei knöcherner Oberfläche mit den derzeitigen Methoden noch nicht befriedigend gemessen werden, sodass die entknorpelten Areale bei Gonarthrose im Endstadium ausgeschlossen werden müssen. 2.2 Nebenzielparameter Als sekundäre Endpunkte wurden zum einen die Korrelation von biomechanischen mit histologischen Veränderungen sowie eine Korrelation der Ergebnisse mit der Knochendichtemessung in der CT-OAM definiert.
15 Zur histologischen Klassifizierung der Arthrose wurden mit dem Mankin und OARSI Score zwei etablierte Tests verwendet. Darüber hinaus wurden in dieser Studie mit dem Aho-Score sowie der CT-OAM zwei Untersuchungsverfahren ausgewählt, die sich auf die subchondrale Sklerose fokussieren. Die Sklerosierung ist zum einen ein Diagnosekriterium der Arthrose, zum anderen ein Parameter für die Langzeitbelastung des Kniegelenks. So konnte der Grad der Sklerose mit den biomechanischen und histologischen Testergebnissen verglichen werden. 2.3 Weitere Aspekte Durch die genannten Testverfahren ist es möglich, die typischen Zeichen der medialen Gonarthrose nachzuweisen und durch biomechanische Eigenschaften zu ergänzen. Darüber hinaus wurden Unterschiede zwischen MB und MUB herausgearbeitet, da allseits akzeptiert ist, dass der Meniskus einen großen Einfluss auf die Entstehung der Arthrose haben kann. Für die gezielte Weiterentwicklung von Therapieverfahren der Arthrose ist eine möglichst differenzierte Kenntnis über die Eigenschaften des Gelenkknorpels in Korrespondenz mit dem Meniskus und dem Gelenkmilieu erforderlich. Ein wichtiger Schritt dorthin ist die Identifikation von Frühformen der Arthrose, für welche die Kenntnis über biomechanische Eigenschaften des Knorpels von elementarer Bedeutung sind. 2.4 Gliederung Die Arbeit ist folgendermaßen aufgebaut: Nach der Einführung in Kapitel 7 wird in Kapitel 8 die Zielsetzung der Arbeit erläutert. In Kapitel 9 werden die verwendeten Materialien und Methoden erläutert. Anschließend werden in Kapitel 10 die Ergebnisse präsentiert. In Kapitel 11 folgt die Diskussion im Vergleich zur aktuellen Forschungslage. Kapitel 12 gibt einen Ausblick auf Forschungsbereiche von Interesse. Abschließend wird in Kapitel 13 die Arbeit zusammengefasst. Es folgen das Literaturverzeichnis (Kapitel 14), der Anhang (Kapitel 15), die Danksagung (Kapitel 16) und die Eidesstattlich Versicherung (Kapitel 17).
16 3. Materialien und Methoden 3.1 Probenkollektiv Für die Studie wurden 25 Probanden mit medialer Gonarthrose mit 13 Kontrollen verglichen. Die Tibiaplateaus wurden bei Implantation einer totalen Endoprothese bei Patienten mit Gonarthrose im Endstadium mit deren Zustimmung gewonnen. Die 13 Spenderknie, welche aus Amerika stammen und zu denen keine persönlichen Daten vorliegen, wurden uns freundlicher Weise von der Firma Arthrex, München, zur Verfügung gestellt. Dort werden die Kadaver wiederum von der Firma Science Care, Phoenix, Arizona, USA, bezogen, welche das Gewebe mit der Fresh-frozen-Technik konserviert. Von der Firma Arthrex wurden die Kadaver für Praxiskurse benutzt. Bei der Auswahl wurden Knie, die makroskopisch Beschädigungen am Knorpel oder arthrotische Veränderungen zeigten, nicht berücksichtigt. Die Proben wurden auf gleiche Weise wie die Versuchsgruppe explantiert. Für die Verwendung der Körperspender liegt ein genehmigtes Ethikvotum der Uniklinik Freiburg (registration number: 305/10) vor. Bestimmung der mechanischen Eigenschaften des Tibiaplateaus nach Explantation 3.1.1 Materialliste Tabelle 2 Materialliste für die Bestimmung des IM Prüfmaschine Hersteller Firmensitz Mach-1 v500 css Biomomentum Laval, Kanada Motion Controller ESP301-3N Newport Irvine, Kalifornien Multiaxial load cell FT16225 ATI Industrial Apex, North Carolina Automation Kalibriergewicht: Mach-1 499.53 Biomomentum Laval, Kanada Gramm MA327 Integrated Imaging Solutions - FLIR Richmond, Kanada Kamera Firefly MV FMVU- 13S2C-CS Indenter Radius 1mm, MA680 Biomomentum Laval, Kanada
17 Einmalkanüle STERICAN 18G, B. Braun Melsungen Melsungen, 0,425x25mm, 4657683 AG Deutschland Messkammer MA626 Biomomentum Laval, Kanada 3.1.2 Chemikalienliste Tabelle 3 Liste der bei der Bestimmung des IM verwendeten Chemikalien Chemikalie Hersteller Bestellnummer NaCl 0,9% Fresenius Medical Care F00004550 Antibiotikum Pen Strep gibco 15140-122 3.1.3 Experiment Beschreibung 3.1.3.1 Bestimmung des Instantaneuos Modulus (IM) Bei der Implantation eines vollständigen Oberflächenersatzes des Kniegelenks wird das Tibiaplateau standardmäßig reseziert. Dabei wird nach Präparation der Strukturen das Tibiaplateau mit Hilfe eines Sägeblocks von der distalen Tibia abgetrennt und als Ganzes entnommen. Zur Aufbewahrung wurde die Probe in einer Mischung aus Natriumchlorid 0,9% und einer Antibiotikamischung aus Penicillin und Streptomycin bei vier Grad gelagert. Nach Fotodokumentation der Probe wird die Lage des Meniskus - sofern vorhanden – mit Hilfe eines Gewebestifts eingezeichnet. Zur biomechanischen Untersuchung wird die Probe durch zwei Schrauben von unten mit dem knöchernen Anteil am Boden der Messkammer fixiert, sodass die ventrale Seite des Tibiaplateaus auf den Betrachter gerichtet ist. Die Messkammer wird in die Mach- 1 Prüfmaschine, Biomomentum Laval, Kanada, eingespannt und durch einen Plexiglasring komplettiert. Die Mach-1 Prüfmaschine „v500 css“ und der Motion Controller werden gestartet. Am angeschlossen PC wird nach Start des Betriebssystems das Programm „Mach-1-Motion“, mit dem sich die Mach-1 Prüfmaschine steuern lässt, ausgeführt. Die Messdose FT16225 wird mit einem geeichten Gewicht von 500g vor dem Messen jeder einzelnen Probe kalibriert. Das Programm „Mach-1-MappingToolbox“, mit dem das Mapping auf Grundlage eines Bildes erstellt werden kann, wird gestartet. Die Kamera „Firefly“ erzeugt ein Livebild, das in der „Mach-1-MappingToolbox“ angezeigt wird. Es werden die Messpunkte im Positionsraster auf die Probe projiziert und danach alle ungeeigneten Punkte entfernt.
18 Ein skalierter Ursprung (scaled origin position) und ein skalierter Referenzpunkt (scaled origin position) werden definiert. Danach wird ein sogenanntes „Mappingfile“ erstellt, durch welches der Messpunkt im Nachhinein reproduziert werden kann. Der Indenter mit einem Kugeldurchmesser von 1 [mm] wird angeschraubt und mit dem Steuerungstool der „Mach-1-Motion“-Software der Ursprung angefahren. Die X-Achse und die Y-Achse werden über dem definierten Ursprung jeweils auf den Wert „0“ Abbildung 6 Tibiaplateau mit Markierungen der Lage der Menisken (blau) und digitalem Koordinatengitter (schwarz, nummeriert). Zu sehen ist, dass nur Punkte in relevanten und messbaren Arealen ausgewählt wurden. (Probe 43) zurückgesetzt. Mit Hilfe der Koordinaten des Referenzpunkts werden die Koordinaten der Messpunkte berechnet und exportiert. Mit dem Modus „scan alles ok“ werden nun die einzelnen Punkte zur Kontrolle angefahren. Fällt diese positiv aus, wird die Messkammer mit NaCl-Lösung aufgefüllt, bis die Probe vollständig unter dem Flüssigkeitsspiegel liegt. Der Indenter wird einen Millimeter unter die Wasseroberfläche gefahren und die Z-Achse sowie die Kraftmessung werden auf den Wert „0“ zurückgesetzt, um keinen Messfehler durch den Auftrieb im Wasser zu erzeugen. Der Indentationsmodus wird mit folgenden Einstellungen gestartet: a. Z-Contact Velocity, mm/s = 1.0000 b. Contact Criteria, N = 0,1015 c. Scanning grid, mm = 0,5000 d. Indentation Amplitude = 0,3000 e. Indentation Velocity, mm/s = = 0,100
19 f. Relaxation Time, s = 10.000 Nun werden für jeden Punkt einzeln die Messungen durchgeführt. Es werden zuerst durch vier Punkte, die 0,5 mm vom Messpunkt entfernt sind und auf X-Achse oder Y- Achse liegen, virtuelle eine Fläche aufgespannt und die Neigung der Oberfläche am Messpunkt berechnet. Dann erfolgt die Messung der automatischen Indentation. Der Abbruch der Messung erfolgt Kraftkontrolliert bei 7 N. Dieses Vorgehen wird für jeden der Messpunkte einzeln wiederholt. Die Messdaten werden elektronisch protokolliert. Die Testung wurden basierend auf mechanischen Versuchen (DIN EN ISO 14577) ausgeführt 3.1.3.2 Messung der Knorpeldicke Direkt im Anschluss an die Messung des IM wird die Dicke des Knorpels gemessen. Dazu werden alle Einstellungen, die in 3.1.3.1 beschrieben wurden, übernommen. Statt dem Indentationsmodus wird nun der Modus „Knorpeldicke“ ausgewählt. Zuvor wird der Indenter maximal nach oben gefahren und eine 26G-Kanüle der Firma B. Braun, Melsungen, Deutschland, am Indenter installiert. Dabei ist darauf zu achten, dass die Kanüle senkrecht nach unten zeigt. Dann wird der vorprogrammierten Methode „Knorpeldicke“ mit folgenden Einstellungen gestartet: Find contact: a. Direction: positiv b. Stage Velocity, mm/s: 0.5000 c. Contact Criteria, N: 7,0000 d. Stage Repositioning: 2X Load Resolution Move absolut a. Position, mm: 0.0000 b. Velocity, mm/s: 3.0000 Für jeden Probenpunkt werden die Koordinaten gescannt. Dann senkt sich die Nadel mit einer Geschwindigkeit von 0.5 mm pro Sekunde auf der Z-Achse auf die Probe ab. Mit Hilfe der Kraftmessdose wird bei einer Kraft von sieben Newton das Absenken abgebrochen und die Nadel fährt den nächsten Probenpunkt an. Es werden alle Punkte der Messung des IM angefahren und die Messung der Knorpeldicke erfolgt an der exakt gleichen Koordinate. Das Abbruchkriterium wurde entgegen des Testprotokolls von Biomomentum nicht erst bei zehn Newton, sondern bereits bei
20 sieben Newton gewählt, da es in Vorversuchen zu Verformungen und Beschädigungen der Nadel bei Knochenkontakt durch zu hohe Kräfte kam. 3.1.4 Berechnung des IM Die Berechnung des IM erfolgt durch die Software „Mach-1-Analysis Version 4.1.0.17“ unter Verwendung der Gleichung von Hayes et al. (Hayes et al., 1972). Es wird die Textdatei, die zuvor in 3.1.3.2 durch die Software „Mach-1-Motion“ bei der Messung der Dicke erstellt wurde, geöffnet. Die einzelnen Messpunkte werden einzeln auswählbar als Graph dargestellt. Auf der Y-Achse wird die Kraft in Newton und auf der X-Achse die Verschiebung des Indenters auf der Z-Achse in Millimetern angeben. Mit einem Messtool wird die Knorpeldicke bestimmt: Dafür wird wie in Abbildung 7 exemplarisch dargestellt ein erster Cursor (1) an den Punkt gesetzt, an dem die Nadel den Knorpel berührt und so erstmals eine Kraft gemessen wird, die der Nadel entgegenwirkt. Der zweite Cursor (2) wird an den Punkt gesetzt, an dem die entgegenwirkende Kraft plötzlich sehr stark ansteigt. Der starke Kraftanstieg kommt dadurch zustande, dass die Nadel nun auf den Knochen drückt, der einen deutlich höheren Widerstand als der Knorpel hat. Aus der Differenz der Cursorpositionen auf der X-Achse lässt sich nun auf die Knorpeldicke in Millimetern schließen. Diese Differenz wird von „Mach-1-Analysis“ als Delta X (mm) angegeben. Die Software LabView 17.0 mit dem Protokoll „Normal Indentation_analysis“ des Herstellers Biomomentum wird gestartet. Nun wird die IM-Datei, die in 3.1.3.1 mit der „Mach-1-Motion“ Software automatisiert erstellt wurde, in der Software geladen. Die Software gibt dann nach Aufforderung folgende Werte an:
21 Abbildung 7 Ein Screenshot der Mach-1 Analysis Software während der Auswertung der Dickenmessung. Im Graphen ist die Messung der Kraftmessdose auf der Y-Achse im Vergleich zur Indentationstiefe auf der X-Achse zu sehen. Der Graph beschreibt dabei die Krafteinwirkung auf die Nadel sowohl beim hinabfahren (unterer Teil des Graphs) als auch beim herauffahren (oberer Teil des Graphen). Im roten Kasten ist die Kurve der Kraftzunahme in Abhängigkeit der Indentationstiefe in der Indentationsphase und die Cursor 1 und Cursor 2 zu sehen. Cursor 1 wird am Punkt des initialen Widerstands bei primärem Knorpelkontakt gesetzt. Cursor 2 wird am Umschlagpunkt gesetzt, an dem der gemessene Widerstand nach primärem Knochenkontakt deutlich ansteigt Die Differenz zwischen den beiden Cursors auf der X-Achse ergeben die Knorpeldicke (Delta X [mm]). In der linken Spalte können einzelne Messpunkte ausgewählt werden und die Messparameter ausgelesen werden. (PostionID; ScanX (mm); ScanY(mm); FCZ-NI (mm); MaxLoad (N); Equilibrium Load (N); Surface Angle (Degrees); Load@Xmm). Noch vor dem Indentationsversuch wurde über vier Punkten, welche sich in einem Abstand von 1 [mm] vom Messpunkt befanden und in einem Winkel von 90 Grad zueinanderstanden, eine Fläche aufgespannt, mit der die Neigung der Knorpeloberfläche bestimmt wurde. Mit Hilfe des
22 sogenannte „Surface Angle Degrees“ und der gemessenen Knorpeldicke wird die tatsächliche Knorpeldicke berechnet: Abbildung 8 Schematische Darstellung zur Herleitung der tatsächlichen Knorpeldicke, da die Nadel nicht immer orthogonal auf den Knorpel trifft. Unter zu Hilfenahme des in der Intendationphase ermittelten Winkel unter der oben dargestellten Annahme, dass = 1 ist, kann die tatsächliche Dicke (D1) in Multiplikation mit dem Cosinus des Winkels 1 ermittelt werden. ! ∗ ( ) = " ! = ( ) " = ( ) ( ) = ( ) Die korrigierte Dicke wird in LabVIEW für jeden Messpunkt importiert. Dann kann das „Shear Modulus (MPa)“, das „Instataneous Modulus“ und der „mean square error“ berechnet werden. Zur Berechnung des IM wird die Formel nach Hayes verwendet. Alle mit LabView berechneten Daten werden in einem gemeinsamen Datenblatt in OriginPro 2016 hinterlegt.
23 3.1.5 Erstellen des Mapping Zur Darstellung der automatisiert erhobenen Messdaten kann das so genannte Mapping verwendet werden. Dazu wird das Mappingfile, welches in 3.1.3.1 mit der Mach-1-Mappingtoolbox erstellt wurde, in OriginPro 2016 importiert. In den ersten beiden Spalten ist die Koordinate jedes Messpunkts hinterlegt. In der dritten Spalte kann die Dicke oder der IM eingetragen werden. Anschließend wird die Tabelle wieder als ASCII exportiert. Nach dem Öffnen der Mappingdatei in der Mach-1- Mappingsoftware kann den einzelnen Messpunkten abhängig von beispielsweise ihrem IM nach einer vorher festgelegten Skala verschiedene Farbtöne zugeordnet werden. Die Software spannt dann zwischen drei beieinanderliegenden Messpunkten eine Fläche auf und färbt diese nach dem Durchschnittswert der drei Messpunkte. So wird für die gesamte Probe eine Übersicht erstellt, anhand derer schnell die gemessene Eigenschaft in diesem Punkt abgelesen werden kann. Zum Schluss wird sowohl das Mapping als auch die Skala exportiert. 3.2 Histologische Beurteilung 3.2.1 Materialliste Tabelle 4 Geräte für die histologische Auswertung der Präparate Laborgerät Hersteller Firmensitz Pressluft Bohrmaschine, Swiss Depuy Synthes West Chester, USA 511.11 Fräsenkopf, Innendurchmesser Depuy Synthes West Chester, USA 5,5 mm Infusionssystem, ProSet Intrafix® B. Braun Melsungen Melsungen, SafeSet AG Deutschland Einmalkanüle STERICAN 27G, B. Braun Melsungen Melsungen, 0,40 x20mm, 4657683 AG Deutschland Einbettkassetten R. Langenbrinck Emmendingen, Deutschland Gewebeprozessor, TP 1020 Leica Wetzlar, Deutschland
24 Paraffinworkstation, EG 1150 H Leica Wetzlar, Deutschland Mikrotom, RM2255 Leica Wetzlar, Deutschland Klinge, Surgipath DB 80 LX Leica Wetzlar, Deutschland adhäsive Objektträger, Paul Marienfeld GmbH Lauda-Königshofen, 76x26x1mm REF 0810001 & Co. KG Deutschland Mikroskop, BX53 Olympus Shinjuku, Japan Tango Desktop Märzhäuser Wetzlar, Deutschland Software Stream Motion 1.9.4 Olympus Soft Imaging Münster, Deutschland Solutions 3.2.2 Chemikalienliste Tabelle 5 Chemikalienliste für die Entkalkung, Dehydrierung und Paraffinierung der Präparate Chemikalie Firma Bestellnummer Infusionslösung: Formalin 4% Histofix Roth P087.4 Destilliertes Wasser Entkalkungslösung 1. 140g EDTA Roth 3957.3 2. 13g NaOH Roth 6771.1 3. 1000ml destilliertes Wasser Ethanol 99%, vergällt mit Liquid Production GmbH 1004067326000 MEK Xylol VWR International 28975.291 Roti®-Plast Paraffin, für Roth 6642.5 die Histologie
25 3.2.2.1 Färbung Giemsa Tabelle 6 Chemikalienliste der Giemsa Färbung Chemikalie Firma Bestellnummer Giemsa’s azur eosin Merck 1.09204.0500 methylene blue solution Eisessig 100% Merck 1.00063.1011 Entellan Merck 1.07961.0100 3.2.2.2 Färbung Safranin-O Tabelle 7 Chemikalienliste der Safranin-O Färbung Chemikalien Firma Bestellnummer Weigert Lösung 1. Ferric-Hematoxylin Waldeck A 2E-032 A 2. Ferric-Hematoxylin Waldeck B 2E-052 B Fast Green Merck 1.04022.0025 Eisessig 100% Merck 1.00063.1011 Safranin-O Merck 11.5948.0025 Entellan Merck 1.07961.0100
26 3.2.3 Schnittpräparation des Tibiaplateaus Zur Herstellung der histologischen Präparate aus den Tibiaplateaus wurde mit einer Pressluft Bohrmaschine Swiss 511.11 von Depuy Synthes und dem zugehörigen Fräsaufsatz senkrecht zur Gelenkfläche ein Zylinder mit einem Durchmesser von 5,5 mm entnommen. Um eine Zerstörung des Gewebes und eine Überhitzung der Bohrmaschine zu verhindern wurde sowohl der Bohraufsatz als auch die Probe mit Infusionslösung beträufelt und gekühlt. Pro Tibiaplateau wurden wie in Abbildung 9 insgesamt vier Gewebeproben entnommen, sowohl im medialen als auch im lateralen Kompartiment jeweils eine Probe pro MB und MUB. Abbildung 9 Entnahmestellen der Gewebeproben für die Histologie. Mit 1 markiert ist die erste Entnahmestelle des Gewebezylinders im medialen MB. Es folgen von links nach rechts die Entnahmestellen des medialen und lateralen MUB. Mit 4 gekennzeichnet ist die Entnahmestelle des lateralen MB. Bei der Entnahme wurde neben den eingetragenen Bereichen auch darauf geachtet, dass die Entnahmestellen im messbaren Bereich der Prüfmaschine lagen. Die gewonnenen Gewebeproben wurden über Nacht bei 4°C in Histofix gelagert. Nach dem Spülen mit destilliertem Wasser wurden die Gewebeproben über einen Zeitraum von zwei bis drei Wochen bei 37°C in einer Entkalkungslösung gelagert. Mit einer 27G Kanüle der Firma B. Braun wurde der Entkalkungsgrad abhängig vom Widerstand des Gewebes beurteilt. Bei geringem Widerstand war die Entkalkung ausreichen und es aus wurde die Entkalkungslösung aus den Proben mit 70% Ethanol ausgewaschen. Unter Zuhilfenahme des Gewebeprozessors TP 1020 (Leica, Wetzlar, Deutschland) wurden die Proben in einer aufsteigenden Ethanolreihe, bestehend aus zwei 70% Ethanol-Lösungen, einer 80% Ethanol-Lösung, einer 96% Ethanol Lösung und drei 100% Ethanol-Lösungen für jeweils eine Stunde nach Protokoll sieben Stunden (3.2.4)
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