DIE SARS-COV2 PANDEMIE AUS DER SICHT DES ZENTRALINSTITUTS FÜR MED. UND CHEM. LABORDIAGNOSTIK (ZIMCL) - CHRONIK DER IM ZIMCL DURCHGEFÜHRTEN ...
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Die SARS-CoV2 Pandemie aus der Sicht des Zentralinstituts für Med. und Chem. Labordiagnostik (ZIMCL) Chronik der im ZIMCL durchgeführten SARS-COV2 Diagnostik seit 03/2020
Etablierung und Durchführung verschiedenster
diagnostischer Methoden wie zB
• Nukleinsäurebasierter Methoden (PCR, NAT, LAMP
etc.)
• SARS-CoV2 Varianten-Diagnostik
• Unterstützung bei der Validierung von Antigen-
Schnelltests
• Validierung und Etablierung von SARS-CoV2
Antikörpertests
• VIPIT/VITT Antikörper Nachweis
Rückblick
Am 25.02.2020 war in der Presse
vom ersten Corona Fall in Innsbruck
zu lesen. Es waren 2 Mitarbeiter
des Hotel Europas. Das Hotel wurde
unter Quarantäne gestellt.
Einführung in Rekordzeit • Am 12. März 2020 Beauftragung zur Einrichtung einer SARS-CoV2 PCR für alle Häuser der tirol kliniken durch die ärztliche Direktion • Erster Befund einer SARS CoV2 PCR bereits am 27.3.2020 vom ZIMCL erstellt (Etablierungszeit: zwei Wochen !)
Zahlreiche organisatorische Maßnahmen und
Vorgaben
• Einrichtung einer räumlich getrennten Probenannahme für hoch infektiösen
Proben
• Einrichtung der Möglichkeiten zur Testanforderung
• Herausforderung: Analyse-Workflow so zu gestalten, dass trotzdem ein
normaler Klinikbetrieb weiter möglich bleibt
• Probenbearbeitung: täglich (Montag bis Sonntag) von 7 Uhr 30 bis 18 Uhr 30.
Jede Probe muss am Tag der Probenannahme anaylsiert und befundet werden.
Fachärztliche Befunderstellung: Tagesaktuell bis zur Fertigstellung der letzten
Analyse. Positive Befunde wurden während der 2. und 3. Wellen bis in die
frühen Morgenstunden durch den zuständigen Dienstarzt telefonisch
übermittelt.
• Möglichst kurze Zeit von der Probenannahme im ZIMCL bis zur Erstellung des
fachärztlichen Befundes (Turnaround-Zeit/TAT)
Neue COVID Abstrichproben-Annahme und Sicherheits-Werkbank
Erstellung eines neuen Anforderungs-Procedere
Erster Corona Befund ZIMCL
Erste händische Realtime-PCR (03/2020) Manuelle RNA-Extraktion, RT- PCR Ansatz und manuelle Auswertung anhand von PCR- Amplifikationskurven. Statistik März / April 2020: Ca. 350 PCR/Woche ca. 1% aller PCR in Ö 8% Positivitätsrate
Rohdaten-Interpretation der manuellen PCR
• Nicht automatisierte Methode
• zur Bewältigung großer Probenmengen wäre zusätzliches routiniertes
Personal erforderlich gewesenEinführung einer automatisierten SARS-CoV2 Hochdurchsatz PCR (Roche cobas 6800)
Zahlreiche organisatorische Maßnahmen erforderlich:
Sars-cov-2 PCR mittels ROCHE
COBAS 6800
Vollautomatisierte Hochdurchsatz RT-
PCR
Zwei Zielregionen (> daher zwei Ct-
Werte)
E-Gen (pan-Sarbecoviren, BB
Coronaviren)
Orf1a/b (SARS-CoV-2)
96 Proben gleichzeitig möglich
Testdauer 3 Stunden
Mehrere Läufe pro Tag möglichZahlreiche organisatorische Maßnahmen erforderlich: Einführung einer Pooling-Strategie • Meilenstein im Sommer 2020: • dringliche Erhöhung der Testkapazitäten durch Einführung einer Pooling-Strategie für PCR-Screening Proben. Reagentien für PCR Tests zu diesem Zeitpunkt nur sehr begrenzt verfügbar und von den Herstellern kontingentiert. • Einführung eines PCR-Poolverfahren (Fünffach-Pools) für Screening- Untersuchungen
Zahlreiche organisatorische Maßnahmen erforderlich: Einführung einer Pooling-Strategie • Vorteil deutliche Steigerung der Testkapazität bei geringem Materialverbrauch. • In logistischer und administrativer Hinsicht besondere Herausforderung dar. • In kurzer Zeit mussten sichere Verfahren zum Zusammenstellen der Pools und zum Auflösen der Pools etabliert und validiert werden
massive Steigerung der Testkapazität durch a) Roche PCR, b) pooling (5-er Pools)
Turnarround-Zeit SARS CoV2 PCR in Minuten
TAT-RESULTAT [min] TAT-BEFUNDUNG* [min]
avg. QUANTIL(10%) QUANTIL(90%) avg. QUANTIL(10%) QUANTIL(90%)
Apr.20 346 211 464 352 217 468
Mai.20 325 199 505 330 203 513
Jun.20 584 240 1144 609 246 1150
Jul.20 636 243 1128 652 256 1149
Aug.20 532 223 1283 545 234 1294
Sep.20 562 240 574 571 248 587
Okt.20 456 236 522 468 244 533
Nov.20 465 234 645 472 240 654
Dez.20 449 226 514 458 233 523
Jän.21 349 222 449 359 229 456
Feb.21 377 223 453 386 229 464
Mär.21 393 222 446 402 230 452
Apr.21 388 221 450 396 226 460
*Zeit von der Probenannahme im ZIMCL bis zur Erstellung des fachärztlichen Befundes
PCR-Ergebnisverfügbarkeit innerhalb von wenigen Stunden!Turnaroundzeit (TAT)* SARS COV2 PCR in
Minuten
*Zeit von der Probenannahme im ZIMCL bis zur Erstellung des fachärztlichen Befundes
03/2020: Initialer Anstieg der Turnaroundzeit wegen zunehmender Proben. Nach Einführung
des automatischen Systems und Poolen der Proben kontinuierliches Absinken der TAT:
Weiterer Abfall mit Einführung der flexibleren Zweitmethode (Hologic-NAT / isothermale RNA-
Amplifikation)
700
600
500
400
Minuten
TAT-VAL-AVRG
TAT-RES-AVRG
300
200
100
0
Apr.20 Mai.20 Jun.20 Jul.20 Aug.20 Sep.20 Okt.20 Nov.20 Dez.20 Jän.21 Feb.21 Mär.21 Apr.21Personalsituation: Bis 31. August 2020 mussten sämtliche diagnostischen Maßnahmen zur SARS CoV2 Diagnostik bei ohnehin angespannter Personalsituation ohne zusätzliches Personal durchgeführt werden.
09/2020: Genehmigung zusätzlicher Stellen im zeitlichen
Verlauf für die Bewältigung der SARS CoV2 Diagnostik in
der Pandemiezeit
Beschäftigungsausmaß
Einsatzgebiet* Eintritt
Zum 31.05.2021
Analytik 01.09.2020 100%
Analytik 21.09.2020 100%
Analytik 02.11.2020 100%
Analytik 07.12.2020 100%
Probenannahme 01.09.2020 35%
Probenannahme 01.10.2020 35%
Probenannahme 01.10.2020 50%
Probenannahme 02.11.2020 40%
Probenannahme 04.01.2021 40%
*CAVE: Vor Einsatz umfassende Schulung und Einarbeitung erforderlichUm die ansteigend Probenzahl bewältigen zu können und unabhängiger von einem Anbieter zu werden mussten weitere zusätzliche Nukleinsäure basierte Analysenmethoden (z.B. die NAT-Methode der Firma Holocic, PCR-POCT Methode der Firma Roche etc) zusätzlich eingeführt werden
SARS-COV-2 isothermale Amplifikation Hologic Panther (NAT)
Isothermale Amplifikation Hologic Panther Nukleinsäureamplifikationstechnik (NAT): isothermale Amplifikation Schnellere Ergebnisse (keine CT-Werte) Abarbeitung einzelner Proben möglich (Roche: nur im 96-Batch) Gerätetechnisch bis zu 1000 Tests pro Tag möglich
SARS-COV-2 POCT PCR Roche LIAT
Roche Liat POCT PCR POCT-Schnell-PCR für dringende Einzelproben, Testwiederholungen und Auflösen von positiven Screening-Pools Simultaner Nachweis von: SARS-CoV-2 Influenza A Influenza B „…wenn es (sehr) schnell gehen muss“
Einführung einer SARS-COV-2 PCR Mutanten/Varianten Screening-Diagnostik
27.Jänner 2021: Screening nach verschiedenen Varianten/Mutanten mittels PCR im ZIMCL Methode: Schmelzkurvenanalyse, wurde innerhalb einer 10 Tagesfrist etabliert. Einführung eines diagnostischen Algorithmus (UK, UK mit E484K, Südafrika, Brasilien, Indien etc.) Tagesaktuelle Befunderstellung (Montag bis Sonntag)
Ab Ende Jänner 2021: Screening nach verschiedenen Varianten/Mutanten mittels PCR im ZIMCL Sehr flexible Anpassungen der Strategie erforderlich, da ständig neue Varianten und Mutationen auftauchen Portfolio umfasst inzwischen >15 verschiedene Mutationen anhand derer nach Bedarf verschiedene SARS-CoV2 Varianten differenziert werden
Bsp. Einer Schmelzkurvenanalyse
von SARS-Cov2 Genmutationen
Fachliche Erfahrung bei der
manuellen Auswertung der
Kurven erforderlich.
Atypische Muster durch
neue Varianten jederzeit
möglich
(Bsp: Nachweis der V1176F
Mutation, die bei der
brasilianischen Variante
B1.1.238 vorkommt)Schmelzkurvenanalyse SASR Cov2 Genmutationen
Derzeitig aktuelle Liste von
relevanten Mutationen
Italienisch,
Californisch Indien ?
Liechtenstein COH- Nigeria?
Spike Prot. Genetic UK ZA Brasil Nigeria DK mink
, tschechisch 20G B.1.617.1 Assay
Variation Variation B 1.525 B 1.427/
/2/3
B.1.1.7 B.1.351 B.1.1.28 B.1.1.238 B1.258 B.1.2 Clust V B 1.429 R.1 Mit der im ZIMCL
del21765-
ΔHV69.70
Δ Y144
70
del21991-
x
x
x x 53-0781
etablierten Methode
93
K417T A22812C x können alle derzeit
K417N G22813T x 53-0787
N439K
Y453F
C22879A
A22920T
x
x
53-0788
53-0783
bedeutenden
E484K
E484Q
G23012A
G23012C
x x x
(B.1.617.1
x 53-0789
Varianten of Concern
+3: X)
N501Y
A570D
A23063T
C23271A
x
x
x x 53-0780
53-0791
sicher erkannt werden.
D614G A23403G x x x x x x x 53-0782
Q677H G23593C x x 53-0796-96
P681H C23604A x x (x R) 53-0786
D1118H G24914C x
V1176F G25088T x 53-0784
F888L x 53-0798-96
L452R X X 53-0793-96SARS-Cov-2 Antigen Schnelltests - Performance Parallel zur Etablierung der Nukleinsäure basierten Methoden anfängliche Unterstützung bei der Validierung von Schnelltests für den patientennahen Gebrauch. Die Anwendung der SARS-CoV2 Antigen-Schnelltests liegt nicht im Verantwortungsbereich des ZIMCL.
SARS-CoV-2 Antigen-Schnelltests Potentielle Vorteile gegenüber PCR/NAT: Zumindest anfänglich deutlich billiger Rascheres Ergebnis (
Serologische SARS-COV-2 Untersuchungen im ZIMCL
Fortlaufende Evaluierung von ca. 20
verschiedenen Antikörper-Assay im ZIMCL
Verschiedene eingesetzte
Testverfahren im zeitlichen
Pandemie-AblaufSARS-CoV-2 Serologie – fortlaufende Validierungen Bis zu ca. 20 SARS-CoV-2 Serologie Assays wurden fortlaufend auf ihre Tauglichkeit hin überprüft ELISAS, (E)CLIA, CMIA, LFIA, Pseudo-Neutralisations-Assay, Blot… Langzeit-Archivierung von Seren Mit dem inzwischen vorhandenen Probenarchiv können künftig am Markt erscheinende Assays relativ rasch evaluiert / validiert werden
Beispiel SARS-COV-2 Validierung am Siemens Advia Center XP Das Gerät (Siemens Advia Centaur XP) wurde vom Hersteller eigens für die COVID-Antikörper-Evaluierungs-Studien bereitgestellt und vom ZIMCL nach ausführlicher Validierung in der Phase 1 der Routinediagnostik quantitativer SARS-CoV-2 IgG verwendet
Beispiel SARS-COV-2 Validierung am
Siemens Advia Center XP
Test-Validierung:
Offline-Abarbeitung von über 2000 Validierungs-Messungen: Spezifität,
Sensitivität, Präzision, Richtigkeit
Standord des Gerätes im 3. Stock abseits der Routine-Chemie (5. Stock)
erschwert den Einsatz in der Routine-Diagnostik
Routinemäßig verwendete Tests:
Sommer 2020: COV2T Assay (gesamt AK gegen S1-RBD, qualitativ), COV2G
Assay (IgG gegen S1-RBD, qualitativ)
Herbst 2020: sCOVG Assay (verbesserter COV2G-Test bzgl. Sensitivität;
Ausgabe quantitativ in U/ml bzw. später BAU/ml)Wissenschaftliche Aufarbeitung und Publikation der
durchgeführten Methoden-Evaluierungen
“Evaluation of four commercial, fully
automated SARS-CoV-2 antibody tests
suggests a revision of the Siemens SARS-CoV-
2 IgG assay”
Irsara et al. CCLM. DOI: 10.1515/cclm-2020-
1758Evaluation of four commercial, fully automated SARS-CoV-2 antibody tests suggests a revision of the Siemens SARS-CoV-2 IgG assay Irsara et al. CCLM. DOI: 10.1515/cclm-2020-1758
Evaluation of four commercial, fully automated SARS-CoV-2 antibody tests suggests a revision of the Siemens SARS-CoV-2 IgG assay Irsara et al. CCLM. DOI: 10.1515/cclm-2020-1758
Evaluation of four commercial, fully automated SARS-CoV-2 antibody tests suggests a revision of the Siemens SARS-CoV-2 IgG assay Irsara et al. CCLM. DOI: 10.1515/cclm-2020-1758
Clinical validation of the Siemens quantitative SARS-CoV-2 spike IgG assay
(sCOVG) reveals improved sensitivity and a good correlation with virus
neutralization titers
Irsara et al. CCLM. DOI: 10.1515/cclm-2021-0214
Assays müssen, insbesondere
unter so neuen Gegebenheiten wie
der COVID-Pandemie, unbedingt
durch unabhängige Labors validiert
werden
Im realen Leben
(unterschiedliche
Patientenkollektive!) schauen die
Performance-Charakteristiken oft
anders aus als im Beipackzettel…Clinical validation of the Siemens quantitative SARS-CoV-2 spike IgG assay (sCOVG) reveals improved sensitivity and a good correlation with virus neutralization titers Irsara et al. CCLM. DOI: 10.1515/cclm-2021-0214
12/2020: Verfügbarkeit des 1. internationalen WHO Standard für COV AK
03/2021: Auftreten von Vakzin-induzierte immun-thrombotische
Thrombozytopenie nach Impfung
Einführung einer VIPIT/VITT Diagnostik-Strategie im ZIMCLMethode zum Nachweis von HIT-Antikörpern im ZIMCL seit langem etabliert. Nach Bekanntwerden der ersten Fälle von VIPIT (Nebenwirkung von AstraZeneca Impfstoffen) umgehend Beginn des Nachweises der auslösenden Antikörper gegen PF4 begonnen werden. Derzeit an sieben Tagen in der Woche zeitnahe durchgeführt. > schnelle Diagnostik und Erkennung dieser Fälle in Westösterreich gewährleistet.
VITT (Vakzin-induzierte immun-thrombotische
thrombozytopenie)
Thrombosen an atypischen Stellen
(Sinusvenen, Mesenterialvenen)
Typischerweise bei jüngeren Frauen
Antikörper gegen PF4 (Thrombozyten)
Rasche Diagnose nötig
Therapie: hochdosierte i.v.
Immunglobuline (1g/kg Tag für 2 Tage)Fazit: eine der größten
Herausforderung an das ZIMCL und
und die medizinische Labordiagnostik
… to be continued
© Zentrallinstitut für Med. Chem. Labordiagnostik (ZIMCL)
Stand: 06/2021Sie können auch lesen
