DVG-Konsiliarlabor für Corynebacterium pseudotuberculosis
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DVG-Konsiliarlabor für
Corynebacterium pseudotuberculosis
Aufgaben und Herausforderungen
Reinhard Sting, Birgitta Polley, Lisa Schneider-Bühl, Jörg Rau
Am 01.07.2018 wurde das Chemische und
Veterinäruntersuchungsamt (CVUA) Stutt-
gart von der Deutschen Veterinärmedizini-
schen Gesellschaft (DVG) zum Konsiliar-
labor für Corynebacterium pseudotubercu-
losis ernannt. Im Folgenden stellt es sich
und seine Arbeit vor.
Seit über 20 Jahren beschäftigt sich Dr. Rein-
hard Sting am CVUA Stuttgart mit Coryne-
bacterium pseudotuberculosis (CPS), dem
Erreger der Pseudotuberkulose [1]. Zahlreiche
© Holger Axt, SHGD Freiburg
Publikationen, Forschungsprojekte, Doktor-
arbeiten und die enge Zusammenarbeit mit
Kolleginnen und Kollegen in vielen Ländern
sowie die Tätigkeit als Gutachter für einschlä-
gige Fachjournals machen ihn und das CVUA
Stuttgart zu gefragten Ansprechpartnern rund
um das Thema CPS. Die über Jahre aufgebau-
ten Sammlungen von Seren und Bakterieniso-
laten wurden bei der Etablierung hauseigener
und kommerzieller Tests u. a. zum serologi-
schen Nachweis von CPS intensiv genutzt.
In der diagnostischen Abteilung des CVUA
Stuttgarts arbeiten in den Bereichen Bakterio-
logie, Serologie, Molekularbiologie und Patho-
logie 10 Tierärztinnen und Tierärzte sowie
25 technische Mitarbeitende eng zusammen.
Hier findet sich ein hoch engagiertes und
© Holger Axt, SHGD Freiburg
fachlich kompetentes Team, das sich leiden-
schaftlich für die Qualitätssicherung der Erre-
gerdiagnostik einsetzt und gemeinsam zur Er-
füllung der Aufgaben und Ziele des Konsiliar-
labors beiträgt.
Klinischer Exkurs
Corynebakterien sind keulenförmige, gram-
positive Bakterien mit einem komplexen Zell-
wandaufbau, der ihnen ein Überleben in der
Umwelt und im Wirt ermöglicht. Der Erreger
der Pseudotuberkulose, Corynebacterium (C.)
pseudotuberculosis, ist ein potenzieller Produ-
© Wolfram Rietschel, Pferdeklinik Kirchheim
zent des Diphtherietoxins. Er wird daher zu-
sammen mit den Erregern der klassischen
Diphtherie, C. diphtheriae und C. belfantii,
sowie dem Zoonoseerreger C. ulcerans im
European Diphtheria Surveillance Network
(EDSN) überwacht.
Ein zentraler Virulenzfaktor und diagnos-
tisch wichtiges Antigen von CPS ist das Enzym
Abb. 1: Abszesse des Ln. retropharyngeus lateralis und Ln. mandibularis bei einer Ziege (oben), des Phospholipase D (PLD). Es spielt eine wichtige
Ln. parotideus eines Schafs (Mitte) und in der Haut sowie Arthritis bei einem Dromedar (unten) durch Rolle bei der Verbreitung des Erregers im Kör-
Corynebacterium pseudotuberculosis. per mittels Makrophagen sowie bei der Ent-
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stehung von Abszessen. Auf andere Tiere wird Methode [1,5]. Dabei ist es möglich, Antikör-
der Erreger meistens bei Wundinfektionen perreaktionen mit spezifischen CPS-Antigenen
über tragen. Im Verlauf der Pseudotuberkulose- sichtbar zu machen (Abb. 2). Das Verfahren
erkrankung führt die Bildung der eitrig- wird zurzeit im Konsiliarlabor etabliert und soll
käsigen Abszesse in den oberflächlichen und zukünftig für spezielle Fragestellungen einge-
inneren Lymphknoten zum klinischen Bild der setzt werden (Zuchttiere, Handel, Sanierungs-
Lymph adenitis caseosa, engl. caseous lymph - betriebe). Als Ansprechpartner bei der Abklä-
adenitis, CLA (Abb. 1). Erkrankte Tiere zeigen rung unklarer serologischer Ergebnisse steht
eine langsam fortschreitende Verschlechte- das Konsiliarlabor gerne mit dem Einsatz zu-
rung des Gesundheitszustands mit Abmage- sätzlicher Methoden zur Verfügung.
rung und Leistungsabfall, die bis zum Tode Darüber hinaus sind der direkte Nachweis
führt („thin ewe syndrome“). Eine Heilung ist von CPS aus Abszessmaterial und eine ein-
praktisch nicht möglich, da die in den Abszes- deutige Identifizierung differenzialdiagnos-
sen eingekapselten Erreger einer Antibiotika- tisch infrage kommender Bakterien wichtig.
therapie nicht zugänglich sind. Die Pseudo - Hierbei erweist sich die MALDI-TOF MS als ein
tuberkulose kommt weltweit vor und ist eine sehr hilfreiches Werkzeug (Abb. 3). Zur Ergän-
der wichtigsten bakteriellen Infektionskrank- zung von kommerziellen Diagnostikdaten-
© CVUA Stuttgart
heiten bei kleinen Wiederkäuern sowie zuneh- banken werden eigene Referenzspektren wie
mend auch bei Kameliden. auch Einzelspektren zur Validierung über
Nach erfolgreicher Bekämpfung der Capri- einen direkten Austausch zur Verfügung ge-
nen Arthritis-Enzephalitis (CAE) der Ziegen ist Abb. 2: Nachweis von Antikörpern gegen Coryne- stellt. Ermöglicht wird dies durch die kosten-
es das nächste Ziel, die Pseudotuberkulose in bacterium pseudotuberculosis (Ganzzellextrakt) freie MALDI-User-Plattform „MALDI-UP“
Deutschland in den Ziegenzuchtbetrieben zu mittels Immunoblot. (https://maldi-up.ua-bw.de) [6].
tilgen. Dies ist ein lang andauernder Prozess Weiterhin sind Untersuchungen per FT-IR
mit besonderen Herausforderungen an die (Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie),
Diagnostik, da sich in einer Herde neben kli- weis aus. Unsere im Jahr 2019 durchgeführte Sequenzierungen des 16S rRNA- und rpoB-
nisch erkennbar infizierten Tieren ein nicht erste LVU mit 22 Teilnehmern aus vier Ländern Gens sowie der Einsatz der qPCR im CVUA
unbeträchtlicher Anteil subklinisch infizierter stieß auch über Deutschland hinaus auf Stuttgart etabliert und kommen regelmäßig
Tiere verbirgt (sog. „iceberg-disease“). Des- großes Interesse. Die sehr guten und weit- zur Charakterisierung von Corynebacterium-
halb sollte zur sicheren Aussage für das Ein- gehend übereinstimmenden Ergebnisse haben Isolaten zum Einsatz [7]. Zukünftig soll auch
zeltier auch immer der Status der gesamten gezeigt, dass sowohl der direkte als auch der die weiterführende Charakterisierung von
Herde bekannt sein. Neben der klinischen indirekte Nachweis von CPS in allen teil- CPS-Isolaten mittels Vollgenomsequenzierung
Untersuchung mit Palpa tion der Lymphknoten nehmenden Laboratorien fast immer sicher etabliert werden. Im CVUA Stuttgart ist durch
ist die laborgestützte Dia gnostik (Pathologie, gelingt. Es zeigte sich, dass die verwendeten die enge Zusammenarbeit der verschiedenen
Bakteriologie, Serologie) ein wesentliches ELISA-Tests für den Nachweis von Antikörpern Abteilungen und Bereiche ein großes diagnos-
Element einer wirksamen Pseudotuberkulose- gegen CPS bei Schafen, Ziegen und Kameliden tisches Angebot realisiert.
bekämpfung. überwiegend gut geeignet sind. Deutlich wur-
de auch, dass die Identifizierung von CPS- Aufbau einer zentralen und umfangreichen
Isolaten in fast allen Laboratorien mit hoher Isolate- und Serumsammlung
Aufgaben des Konsiliarlabors
Sicherheit gelingt. Der breite Einsatz der MALDI- Über die Jahre hinweg konnte am CVUA Stutt-
Seit Inkrafttreten des Tiergesundheitsgesetzes TOF MS (Matrix-assisted Laser Desorption/- gart durch die zahlreich eingesandten Proben
(TierGesG) im Mai 2014 müssen kommerzielle Ionization time-of-flight Massenspektrome- eine große Sammlung von Seren und Isolaten
Testkits zur Untersuchung auf Pseudotuber- trie) wirkt sich hier positiv aus. aufgebaut werden. Sie steht nun für Referenz-
kulose gemäß § 11 TierGesG nicht zugelassen Zur Validierung oder Verifizierung stellen und Kontrollmaterial bei der Routinediagnostik
werden, da es sich nicht um eine anzeige- oder wir auf Anfrage gerne definiertes Referenz- und bei Laborvergleichsuntersuchungen zur
meldepflichtige Tierkrankheit handelt. Hier- material zur Verfügung. Verfügung. Neben CPS-Isolaten und -Seren
durch besteht für diese Testkits ein Bedarf an unterschiedlicher Herkunft (Tierart, Region)
externer Qualitätssicherung, die wir als Konsili- Weiterentwicklung der Diagnostik gibt es auch eine umfangreiche Sammlung
arlabor übernehmen. Wir testen regelmäßig de- Als labordiagnostische Grundlage der Sanie- von weiteren verschiedenen Corynebakterien
finierte Seren mit den verfügbaren und vorge- rungsprogramme stehen nach wie vor serolo- und verwandten Bakteriengattungen zur Wei-
stellten Testsystemen und sind dabei auch in gische Tests und deren Weiterentwicklung im terentwicklung u. a. der CPS-Differenzialdia-
engem Kontakt mit den Herstellern. So sichern Vordergrund [1,2,3,4]. Die größte Herausfor- gnostik mithilfe molekularbiologischer und
wir eine gleichbleibende Qualität der kommer- derung stellt hierbei die besondere Eigen- spektroskopischer Methoden.
ziellen Diagnostika. Ein im CVUA Stuttgart etab- schaft von CPS dar, sich intrazellulär zu ver-
lierter und validierter ELISA (Enzyme-linked mehren. Dadurch kann es sein, dass Antikör- Fachliche Beratung
Immunosorbent Assay) [2,3] steht uns als zu- per erst spät oder nur sehr schwach gebildet Ergänzt werden die Aufgaben des Konsiliar-
sätzliches Diagnostikum zur Verfügung. werden. Wichtig ist deshalb der sensitive und labors durch die beratende Tätigkeit für Tier-
Um auch zwischen den Laboratorien ein spezifische Nachweis von Antikörpern gegen ärzte, Tiergesundheitsdienste, Tierhalter und
vergleichbares und hohes Niveau der Dia - CPS. Die Verwendung verschiedener ELISAs Zuchtverbände rund um die Diagnostik der
gnostik zu gewährleisten, richtet das Konsili- hat sich dabei in unseren Untersuchungen als Pseudotuberkulose und die Sanierung von
arlabor unter der Leitung von Dr. Reinhard sehr hilfreich erwiesen. Herden.
Sting und Dr. Birgitta Polley regelmäßig Labor- Auch die Immunoblot-Technik zeigt in der So haben der Schafherdengesundheits-
vergleichsuntersuchungen (LVU) zum direkten Pseudotuberkulosediagnostik vielversprechen- dienst Baden-Württemberg, die Universität
und indirekten (serologischen) Erregernach- de Ansätze als sensitive und spezifische Hohenheim und der Ziegenzuchtverband
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Baden-Württemberg zusammen mit dem CVUA
Stuttgart bereits vor der Ernennung zum Kon-
siliarlabor eine Richtlinie zur Bekämpfung der
Pseudotuberkulose in Ziegenbeständen er-
stellt, die seit 2016 in Kraft ist und die Grund-
lage der Pseudotuberkulosebekämpfung in
Baden-Württemberg bildet [4].
Ausblick
Für eine erfolgreiche Arbeit als Konsiliarlabor
für Corynebacterium pseudotuberculosis sind
wir auf die Hilfe von und die Zusammenarbeit
mit der Tierärzteschaft angewiesen. Uns ist
daher der Dialog mit praktizierenden Tier -
ärzten, Untersuchungslaboratorien, Tierge-
sundheitsdiensten, Veterinärämtern und Tier-
haltern sehr wichtig.
Die Einsendung von Blutproben, von CPS-
Isolaten und ungewöhnlichen Bakterieniso -
laten für Abklärungsuntersuchungen ist uns
daher sehr willkommen. Besonders wertvoll
sind Abszessmaterial und Serumproben des-
© CVUA Stuttgart
selben Tieres. Dankbar sind wir auch für Zu-
sendungen von CPS-Isolaten und Seren für
den weiteren Ausbau der Isolate- und Serum-
sammlung. Bei Fragen wenden Sie sich gerne Abb. 3: MALDI-TOF MS-Mustervergleich mit Referenzspektren am Beispiel des Feldisolats „C. pseudotu-
an uns. berculosis CVUAS 3353“ (Ziege, Abszess).
Danksagung
[3] Sting R, Schneider-Bühl L, Wagner H, [7] Rau J, Eisenberg T, Peters M, Berger A,
Wir danken Claudia Geiger für ihre ausge- Maget J, Polley B, Bürstel D, Axt H (2017): Kutzer P, Lassnig H, Hotzel H, Sing A,
zeichnete Arbeit bei der Umsetzung der Immu- Clinical and serological investigations on Sting R, Contzen M (2019): Reliable diffe-
noblot-Technik. Juliane Rieger danken wir für caseous lymphadenitis in goat breeding rentiation of a non-toxigenic tox gene be-
die hervorragende Arbeit bei der Etablierung herds in Baden-Wuerttemberg. Berl aring Corynebacterium ulcerans variant
eines Inhouse-ELISA sowie für ihren umfang- Muench Tieraerztl Wochenschr 130, frequently isolated from game animals
reichen Beitrag bei der Erstellung dieses 136–143. DOI 10.2376/0005–9366– using MALDI-TOF MS. Vet Microbiol 237,
Artikels. 16024. 108399. DOI: 10.1016/j.vetmic.2019.
[4] Ziegenzuchtverband Baden-Württemberg 108399.
(2016): Richtlinie des Ziegenzuchtverban-
Literatur des Baden-Württemberg zur Bekämpfung
[1] Sting R, Steng G, Spengler D (1998): Se- der Pseudotuberkulose in Ziegenbestän- Korrespondierende Autoren
rological studies on Corynebacterium den. www.ziegen-bw.de.
pseudotuberculosis infection in goats [5] Hoelzle LE, Scherrer T, Muntwyler J, Dr. Reinhard Sting
using enzyme-linked immunosorbent as- Wittenbrink MM, Philipp W, Hoelzle K Fachtierarzt für
say. J Vet Med B 45, 209–16. (2013): Differences in the antigen Mikrobiologie,
[2] Sting R, Wagner B, Turan AS, Stermann M, structures of Corynebacterium pseudotu- Tel. +49 711 3426–1693,
Reule M, Eichner M, Beyer W (2012): Se- berculosis and the induced humoral im- reinhard.sting@cvuas.bwl.de
rological studies on Corynebacterium mune response in sheep and goats. Vet
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Baden-Wuerttemberg (Germany) and se- 10.1016/j.vetmic.2013.02.031.
Dr. Birgitta Polley
roreactions on antigens used for newly [6] Rau J, Eisenberg T, Männig A, Wind C,
developed enzyme-linked immunosor- Lasch R, Sting R (2016): MALDI-UP – An Fachtierärztin für
Mikrobiologie,
bent assays (ELISA). Berl Muench Tier- internet platform for the exchange of
Tel. +49 711 3426–1661,
aerztl Wochenschr 125, 67–75. DOI: MALDI-TOF mass spectra. Aspects of
birgitta.polley@cvuas.bwl.de
10.2376/ 0005–9366–125–67. Food Control and Animal Health 01, 1–17.
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