Emotionales Verhalten der jungen A53T-Synuclein Maus
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Emotionales Verhalten der jungen
A53T-Synuclein Maus
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Universitätsklinikum Erlangen
Klinik für Psychiatrie und Psychotherapie
Direktor: Prof. Dr. med. J. Kornhuber
Der Medizinische Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr.med.
vorgelegt von
Agnes HahnAls Dissertation genehmigt von der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Markus F. Neurath
Gutachter: Prof. Dr. Christian P. Müller
Gutachter: Prof. Dr. Johannes Kornhuber
Tag der mündlichen Prüfung: 12. Januar 2021Für meine Eltern
Inhaltsverzeichnis
1 Abstract .............................................................................................................. 1
2 Zusammenfassung ............................................................................................ 3
3 Einleitung............................................................................................................ 5
3.1 Die Parkinson-Krankheit ................................................................................ 5
3.2 α-Synuclein.................................................................................................. 10
3.3 A53T- Mausmodell Morbus Parkinson......................................................... 11
3.4 Komorbidität Depression ............................................................................. 12
3.5 Komorbidität Angststörung .......................................................................... 13
3.6 Fragestellung der vorliegenden Arbeit ......................................................... 14
4 Material & Methoden ........................................................................................ 16
4.1 Genehmigung Ethikkommission .................................................................. 16
4.2 Versuchstiere............................................................................................... 16
4.3 Genotypen ................................................................................................... 16
4.4 Tierhaltung .................................................................................................. 16
4.5 Versuchsablauf ............................................................................................ 17
4.6 Durchgeführte Versuche .............................................................................. 17
4.6.1 Open Field Test (OFT) .......................................................................... 17
4.6.2 Elevated Plus Maze (EPM) ................................................................... 19
4.6.3 Light-Dark Box Test (LDB) .................................................................... 20
4.6.4 Novelty Suppressed Feeding (NSF) ..................................................... 21
4.6.5 Forced Swim Test (FST) ....................................................................... 22
4.6.6 Sucrose Preference Test (SPT) ............................................................ 24
4.7 Chemikalien ................................................................................................. 25
4.8 Statistik & Darstellung der Ergebnisse ........................................................ 25
5 Ergebnisse ........................................................................................................ 26
5.1 Open Field Test ........................................................................................... 265.1.1 OFT – Zeit im Zentrum .......................................................................... 26 5.1.2 OFT – Zeit in der Peripherie.................................................................. 27 5.1.3 OFT – Laufstrecke im Zentrum ............................................................. 28 5.1.4 OFT – Laufstrecke Peripherie ............................................................... 28 5.1.5 OFT – Gesamtlaufstrecke ..................................................................... 29 5.1.6 OFT – Latenzzeit bis zum ersten Eintritt ins Zentrum ........................... 30 5.1.7 OFT – Eintritte ins Zentrum ................................................................... 31 5.2 Elevated Plus Maze ..................................................................................... 32 5.2.1 EPM - Zeit auf geschlossenen Armen ................................................... 32 5.2.2 EPM – Zeit auf offenen Armen .............................................................. 33 5.2.3 EPM – Zeit im Zentrum ......................................................................... 34 5.2.4 EPM - Relative Zeit auf offenen Armen ................................................. 35 5.2.5 EPM – Laufstrecke auf geschlossenen Armen ..................................... 35 5.2.6 EPM – Laufstrecke auf offenen Armen ................................................. 36 5.2.7 EPM – Laufstrecke im Zentrum............................................................. 37 5.2.8 EPM – relative Laufstrecke offene Arme ............................................... 38 5.2.9 EPM - Eintritte auf geschlossenen Armen............................................. 39 5.2.10 EPM - Eintritte auf offenen Armen ..................................................... 39 5.2.11 EPM - Eintritte im Zentrum ................................................................ 40 5.2.12 EPM – Latenz bis zum ersten Eintritt auf offene Arme ...................... 41 5.3 Light-dark Box ............................................................................................. 42 5.3.1 LDB - Zeit im hellen Kompartiment ....................................................... 42 5.3.2 LDB - Latenz bis zum Eintritt ins helle Kompartiment ........................... 43 5.3.3 LDB - Eintritte in das helle Kompartiment ............................................. 44 5.3.4 LDB – Laufstrecke im hellen Kompartiment .......................................... 45 5.4 Novelty Suppressed Feeding ...................................................................... 45 5.4.1 NSF - Latenz bis zur ersten Nahrungsaufnahme .................................. 46 5.4.2 NSF - Wegstrecke bis zur ersten Nahrungsaufnahme .......................... 47
5.5 Forced Swim Test........................................................................................ 47
5.5.1 FST - Latenz bis Floating ...................................................................... 48
5.5.2 FST - Gesamtdauer Floating................................................................. 49
5.6 Sucrose Preference Test ............................................................................. 49
5.6.1 SPT – Präferenz für Sucrose ................................................................ 50
6 Diskussion ........................................................................................................ 51
6.1 Zusammenfassung der Ergebnisse ............................................................. 51
6.1.1 Ängstliches Verhalten im OFT .............................................................. 51
6.1.2 Ängstliches Verhalten im EPM .............................................................. 52
6.1.3 Ängstliches Verhalten im LDB-Test ...................................................... 53
6.1.4 Ängstliches Verhalten im NSF .............................................................. 53
6.1.5 Erlernte Hilflosigkeit im FST .................................................................. 54
6.1.6 Anhedones Verhalten SPT.................................................................... 55
6.2 Zusammenfassung und Ausblick ................................................................. 55
6.3 Limitationen der vorliegenden Arbeit ........................................................... 59
7 Literaturverzeichnis ......................................................................................... 60
8 Abkürzungsverzeichnis ................................................................................... 67
9 Danksagung ..................................................................................................... 681 Abstract
Introduction: Parkinson´s disease is a common and complex neurological disorder.
Classical motor symptoms, depression and anxiety disorders all play a major role. The
degeneration of dopaminergic neurons in the substantia nigra is associated with
inclusions of alpha-synuclein as Lewy bodies in the basal ganglia, brainstem and
cortex. The main reason for the appearance of motor symptoms is the loss of
dopaminergic neurons. Non-motor symptoms such as depression and anxiety are
more likely associated with changes within the serotonergic innervation system. α-
Synuclein is the main component of Lewy bodies, which determines the
neuropathological characteristics of Parkinson's disease. The A53T mutation is a point
mutation at position 53, where an alanine has been replaced by tyrosine. As a result,
the mutated α-synuclein proteins accumulate and aggregate, leading to
neurodegenerative processes in the brain. The aim of this work is to show that the
A53T mutation, which expresses the human A53T mutant of α-synuclein, leads to a
reduction in anxiety and depression in young animals without changing the expression
of the motor phenotype of Parkinson´s disease. This study examined the difference
between the A53T mutants and the wildtype animals in terms of anxiety and
depression-associated behavior.
Methods: All experiments were performed with transgenic animals and age-/gender-
matched non-transgenic littermates. The Open Field Test, the Elevated Plus Maze, the
Light-Dark Box, the Novelty Suppressed Feeding, the Forced Swim Test and the
Sucrose Preference Test served as experiments to demonstrate anxiety and
depression behavior. Twenty-nine mice of both sexes aged 11-14 weeks were used
as test animals. Fifteen animals were carriers of the A53T mutation. These mice
expressed the human A53T mutant of the α-synuclein under the control of the platelet-
derived growth factor b promoter.
Results: There was no difference between the A53T mutants and the wildtype animals
in terms of anxiety and depression-associated behavior. A post-hoc analysis revealed
a gender effect. Male A53T animals showed less anxiety and more depressive
behavior than the female animals.
1Conclusion: The results of this study could not confirm the hypothesis. However, the
post-hoc analysis suggested that male A53T animals show less anxiety and more
depressive behavior. Within the scope of this work, an interesting gender-specific
influence on the change in anxious and depressive behavior of the A53T mutant
compared to wildtype animals could be identified. The A53T mutation not only seems
to influence motor, but also non-motor symptoms. This knowledge could have
implications in therapy, after repetition and verification of the experiments in humans.
22 Zusammenfassung
Hintergrund und Ziele: Die Parkinson-Krankheit ist eine komplexe und häufige
neurologische Störung. Klassische motorische Symptome wie Rigor, Ruhetremor und
Bradykinese/Akinese, aber auch Depression und Angststörung spielen eine große
Rolle. Die Degeneration dopaminerger Neuronen in der Substantia Nigra ist mit
Einschlüssen von alpha-Synuclein in Lewy-Körpern in den Basalganglien, Hirnstamm
und Kortex verbunden. Hauptverantwortlich für das Auftreten motorischer Symptome
ist der Untergang von dopaminergen Neuronen. Nichtmotorische Symptome, wie
Depression und Angstzustände sind eher mit Veränderungen innerhalb des
serotonergen Innervationssystems verbunden. α-Synuclein ist der Hauptbestandteil
von Lewy-Körpern, welches die neuropathologischen Eigenschaften der Parkinson-
Krankheit bestimmt. Die A53T-Mutation ist eine Punktmutation an Position 53, an der
ein Alanin durch ein Tyrosin ersetzt wurde. Infolgedessen akkumulieren und
aggregieren die mutierten α-Synuclein-Proteine, was zu neurodegenerativen
Prozessen im Gehirn führt. Ziel dieser Arbeit ist es zu zeigen, dass die A53T-Mutation,
welche die humane A53T-Mutante des α-Synuclein exprimiert, zu einer Verringerung
von Angst und Depression im jungen Tier führt, ohne die Ausprägung des motorischen
Phänotyps der Parkinson-Krankheit zu verändern.
Methoden: Alle Experimente wurden mit transgenen Tieren und alters-
/geschlechtsangepassten nicht-transgenen Wurfgeschwistern durchgeführt. Als
Experimente zum Nachweis von ängstlichem und depressivem Verhalten dienten der
Open Field Test, das Elevated Plus Maze, die Light-Dark Box, das Novelty Suppressed
Feeding, der Forced Swim Test sowie der Sucrose Preference Test. 29 Mäuse
beiderlei Geschlechts im Alter von 11-14 Wochen wurden als Testtiere verwendet. 15
Tiere waren Träger der A53T-Mutation. Diese Mäuse exprimierten die humane A53T-
Mutante des α-Synucleins unter der Kontrolle des von Blutplättchen abgeleiteten
Wachstumsfaktor-b-Promotors.
Ergebnis: Es zeigte sich kein Unterschied zwischen den A53T-Mutanten und den
Wildtyp-Tieren hinsichtlich Angstzuständen und depressionsassoziiertem Verhalten.
Eine Post-hoc-Analyse ergab einen Geschlechtereffekt. Männliche A53T-Tiere zeigten
weniger Angst und depressiveres Verhalten als weibliche Tiere.
3Schlussfolgerungen: Die Ergebnisse dieser Studie konnten die Hypothese nicht
bestätigen. Die Post-hoc-Analyse ergab jedoch, dass männliche A53T-Tiere weniger
Angst und eher depressiveres Verhalten zeigen. In Zusammenschau der Ergebnisse
konnte ein interessanter geschlechtsspezifischer Einfluss auf die Veränderung des
ängstlichen und depressiven Verhaltens der A53T-Mutante im Vergleich zu denen des
Wildtyp-Tiers identifiziert werden. Die A53T-Mutation scheint nicht nur die
motorischen, sondern auch die nicht-motorischen Symptome zu beeinflussen. Dieses
Wissen könnte für die Therapie genutzt werden, nachdem diese Effekte auch beim
Menschen verifiziert wurden.
43 Einleitung
3.1 Die Parkinson-Krankheit
Die Parkinson-Krankheit (PD) wurde erstmals durch den Londoner Arzt, James
Parkinson, beschrieben. Er verfasste seine Monografie im Jahre 1817 unter dem Titel
„An Essay on the Shaking Palsy“ (Parent 2018). Darin beschrieb er die klinischen
Symptome von Patienten, die mit einseitigem Tremor und vornübergebeugten Gang,
sowie einer generalisierten Verlangsamung und Kleinschrittigkeit anfange und bis hin
zum Tod führe (Parent 2018). Hiervon leitet sich der lateinische Name paralysis
agitans ab, welcher umgangssprachlich auch als „Schüttellähmung“ bekannt wurde
(Toodayan 2018). Die PD gehört zu den verheerendsten Erkrankungen des 21.
Jahrhunderts. Nach der Alzheimer-Demenz ist sie die zweithäufigste
neurodegenerative Erkrankung der Welt (Gaeta et al. 2019).
Die PD wird heute als progressive neurodegenerative Bewegungsstörung
beschrieben, bei der es zum Verlust dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra
(SN) kommt. Die SN ist Teil der Basalganglien, ein Kernkomplex im Bereich des
Gehirns, welcher eine wichtige Funktion bei der Regulation der Motorik hat. Hierzu
gehören anatomisch gesehen das Striatum, welches sich aus Nucleus caudatus und
Putamen zusammensetzt und der Globus pallidus. Funktionell zählt man den Nucleus
subthalamicus und die SN ebenfalls zu den Basalganglien. Man unterscheidet bei der
SN morphologisch eine dunkle Pars compacta (SNc) und eine rötliche Pars reticulares
(SNr). Die SN ist fundamental in das Verschaltungssystem derjenigen Hirnzentren
eingebunden, die Bewegungsimpulse und -abläufe kontrollieren und modulieren
(Trepel 2012). Eine Modellvorstellung zur Organisation der Basalganglienschleife
beschreibt Abbildung 1. Haupteingangsstation der Basalganglienschleife, welche ihren
Ursprung in den jeweiligen Cortex-Arealen findet, ist das Striatum.
Hauptausgansstation sind das Pallidum mediale und die SNr, die auf den Thalamus
projizieren und damit die Aktivierung des Motorcortex durch thalamokortikale
Verbindungen kontrollieren. Der direkte Weg führt zu einer Steigerung der motorischen
Aktivität. Kortikale Afferenzen zum Striatum wirken erregend auf die inhibitorischen
Projektionsneurone des Striatums, welches auf dem direkten Weg das Pallidum
mediale hemmt. Dies führt zur Disinhibition thalamischer Neurone, welche den
5Motorkortex verstärkt aktivieren. Der indirekte Weg führt zur Hemmung der
motorischen Aktivität. Das Striatum hemmt das Pallidum laterale. Dessen
inhibitorischen Fasern ziehen zum Nucleus subthalamicus. Dies führt über eine
verminderte Hemmung zur Aktivitätsverstärkung des Nucleus subthalamicus. Dessen
Abb. 1 Vereinfachte Darstellung der Basalganglien
mit wichtigen Verbindungsbahnen. (+) erregender
Einfluss, (-) hemmender Einfluss der Projektionen
auf die Zielgebiete. grüner Pfeil = indirekter Weg,
roter Pfeil = direkter Weg.
Projektionen haben erregende Wirkung auf den Pallidum-mediale-Komplex und somit
bewirkt der indirekte Weg im Gegensatz zum direkten Weg eine Verstärkung der
Inhibition des Thalamus und damit eine verminderte Aktivierung motorischer kortikaler
Areale. Sowohl der direkte als auch der indirekte Weg werden in ihrer Aktivität durch
dopaminerge Neurone der SN, die zum Striatum ziehen, reguliert. Die SN wird durch
das Striatum kontrolliert und projiziert dopaminerg auf dieses zurück. Die SNc wirkt mit
dem Transmitter Dopamin über D1-Rezeptoren (Dopamin1-Rezeptoren) fördernd und
über D2-Rezeptoren (Dopamin2-Rezeptoren) hemmend auf das Striatum.
Dopaminrezeptoren sind die Andockstelle des Neurotransmitters Dopamin und können
grob in die Unterklassen D1 bis D5 eingeteilt werden (Drenckhahn 2008).
Die SN ist ein Areal im menschlichen Hirnstamm, welche eine auffallend dunkle
Färbung aufweist, der Locus coeruleus erscheint bläulich. In der SN wird der
katecholaminerge Neurotransmitter Dopamin und im Locus coeruleus das
Noradrenalin synthetisiert.
Tretiakoff beschrieb erstmals 1919 den Verlust von Pigmentierung in der SN und dem
Locus coeruleus bei verstorbenen Parkinson-Patienten (Lees et al. 2008). Seither gilt
6der Verlust der Pigmentierung der SN als neuropathologisches Kriterium der PD. Das
Verblassen der Dunkelfärbung wird durch die Degeneration dopamin- und
neuromelaninhaltiger Nervenzellen verursacht (Gerlach et al. 2007).
Es wäre jedoch falsch, die Pathophysiologie der PD auf einen Dopaminmangel zu
reduzieren. Sie ist auch durch die Bildung fibrillärer intraneuronaler Einschlüsse,
sogenannter Lewy-Körper, gekennzeichnet (Wood-Kaczmar et al. 2006). Im Jahr 1912
beschrieb Frederic Lewy erstmals abnormale Proteinaggregate, die in Nervenzellen
von Parkinson-Patienten nachgewiesen werden konnten. Lewy-Körperchen kommen
als hyaline eosinophile zytoplasmatische Einschlusskörperchen in den betroffenen
Hirnregionen vor. Die Ausbreitung der Lewy-Körper folgt im Gehirn einem räumlichen
Gradienten, dessen Beginn im dorsalen Vaguskern liegt (Braak et al. 2002).
Ultrastrukturell bestehen Lewy-Körperchen aus intermediären Filamenten, wobei
immunhistochemisch vor allem Ubiquitin und fehlgefaltetes α-Synuclein (SNCA)
nachgewiesen werden. Lewy-Körperchen breiten sich zunächst in Hirnstamm-Nuklei
sowie im Locus coeruleus und dann erst in der SN aus (Braak und Del Tredici 2017).
Der Nachweis von Lewy-Körperchen ist heute neuropathologische Voraussetzung für
die Diagnose der PD. Die SNCA-Einschlüsse sind typisch für die idiopathische und
familiäre PD (Spillantini 1999). Die PD beschreibt ein Bild mit den klinischen
Symptomen Bradykinese/Akinese, Rigor, Ruhetremor und posturaler Instabilität. Die
Kardinalsymptome, das „Parkinson-Trias“ sind: Ruhetremor (Zittern), Rigor (erhöhter
Muskeltonus mit Steifigkeit der Muskeln) und Akinese (Bewegungsarmut) (Trepel
2012). Zusätzlich leiden Patienten häufig auch an Funktionsstörungen des autonomen
Nervensystems, wie zum Beispiel Schlafstörungen, Magen-Darm-Störungen,
Obstipation, Hyposmie/Riechstörung, Farbdiskriminationsstörungen, Restless-Legs-
Syndrom, Schulterschmerzen, Apathie, Angstzustände, Affektlabilität, Apathie,
Impulskontrollstörungen, Anhedonie und Depressionen (Berrios et al. 1995). Durch
den Zelltod neuromelaninhaltiger Neurone der SN kommt es zu einem
Dopaminmangel, wodurch die klinischen Symptome resultieren. Physiologisch hemmt
die SN dopaminerg den motorikhemmenden Anteil des Striatums und wirkt dadurch
motorikfördernd. Durch Dopaminmangel an den Rezeptoren kommt es zum Wegfall
der Disinhibition und somit zur zunehmenden Hemmung der Motorik des Patienten,
welches zu den typischen Symptomen führt (Ozansoy und Başak 2013). Andere
betroffene Transmittersysteme sind das Noradrenalin und das Acetylcholin. Stark
vereinfacht dargestellt kommt es durch einen Mangel von Noradrenalin und Serotonin
7zur depressiven Symptomatik und durch ein Ungleichgewicht von Acetylcholin zu
Tremor und zur vegetativen Begleitsymptomatik (Gerlach et al. 2007).
Die PD lässt sich ätiologisch in vier Gruppen einteilen. Die erste Gruppe, das
idiopathische Parkinson-Syndrom (IPS), auch Morbus Parkinson genannt, macht mit
75% den größten Anteil der Parkinson-Syndrome aus. Hierbei kommt es zu einer
Degeneration der dopaminergen Neurone in der SN sowie des Locus coeruleus.
Hinsichtlich der klinischen Symptome wird das IPS in folgende Verlaufsformen
eingeteilt: akinetisch-rigider Typ, Äquivalenz-Typ, Tremordominanz-Typ und
monosymptomatischer Ruhetremor (Deutsche Gesellschaft für Neurologie 2016). Als
mögliche Ursache für die Entstehung des IPS gelten Alterungsprozesse,
Apoptosevorgänge, endogene Energiestoffwechselstörung in der SN, entzündliche
Reaktionen, genetische Faktoren, MPTP-ähnliche (1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-
tetrahydropyridin) Endo- oder Exotoxine, Protein-Aggregation und auch oxidativer
Stress (Gerlach et al. 2007).
Bei der zweiten Gruppe, der genetischen Form des Parkinson-Syndroms handelt es
sich um unterschiedliche autosomal-dominante und autosomal-rezessive erbliche
Formen. SNCA kodiert für das Protein α-Synuclein und war das erste Gen, welches
mit der vererbten Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht wurde. Mutationen in
SNCA, LRRK2 (Leucine-rich repeat kinase 2), VPS35 (vascular protein sorting 35),
EIF4G1 (eukaryotic translation initiation factor 4-γ 1), DNAJC13 (receptor-mediated
endocytosis 8) und CHCHD2 (coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 2)
vermitteln eine Form der PD, die autosomal dominant vererbt wird. Parkin, PINK1
(PTEN-induzierte Kinase 1) und DJ-1 (Protein Deglykase) sind mit einer rezessiv
vererbten Form der PD assoziiert (Kalia und Lang 2015). Obwohl die vollständige
Kenntnis der Funktionen dieser Gene noch nicht bekannt ist, werden abnormale
Proteinakkumulation, Proteinphosphorylierung, mitochondriale Dysfunktion und
oxidativer Stress als gemeinsamer Weg der Pathogenese der PD angenommen
(Wood-Kaczmar et al. 2006).
Bei der dritten Gruppe, dem Atypischen Parkinson-Syndrom, auch Parkinson-Plus-
Syndrom genannt, handelt es sich um die Ausbildung eines Parkinson-Syndroms
aufgrund einer anderen neurodegenerativen Erkrankung. Multisystematrophie (MSA),
Demenz vom Lewy-Körper-Typ (DLK), progressive supranukleäre Blickparese (PSP)
und die kortikobasale Degeneration (CBD) können zum Atypischen Parkinson-
Syndrom führen. Bei diesen Erkrankungen kommt es zum Untergang dopaminerger
8Neurone und dadurch neben anderen Leitsymptomen auch zur Ausbildung eines
Parkinson-Syndroms (Levin et al. 2016).
Die vierte Gruppe stellen die symptomatischen (sekundären) Parkinson-Syndrome
dar. Die häufigste Ursache ist medikamenteninduziert. Aber auch andere Faktoren,
unter anderem vaskuläre, posttraumatische, toxin-induzierte, tumorbedingte und
entzündliche oder metabolische Ursachen tragen zur Unterfunktion der nigro-striatalen
Achse bei. Die neurodegenerativen Parkinson-Syndrome, IPS und atypischen
Parkinson-Syndrome werden heute in Synucleinopathien und Tauopathien
klassifiziert.
Zu den wichtigsten Differenzialdiagnosen der PD gehören: essenzieller Tremor,
Normaldruckhydrozephalus, vaskuläres Parkinson-Syndrom (subkortikale vaskuläre
Enzephalophathie) und Depression (Deutsche Gesellschaft für Neurologie 2016).
Die PD gilt neben der Alzheimer-Demenz als zweithäufigste neurodegenerative
Erkrankung, mit etwa einer halben Millionen Erkrankten in den Ländern der
Europäischen Union. In Europa werden die Prävalenz- und Inzidenzraten für die
Parkinson-Krankheit auf ungefähr 108-257/100000 bzw. 11-19/100000 pro Jahr
geschätzt. In Industrieländern liegt die geschätzte Prävalenz der PD in der
Allgemeinbevölkerung bei 0,3%. Der Häufigkeitsgipfel liegt zwischen dem 50. und dem
60. Lebensjahr (Tysnes und Storstein 2017). Das Alter gilt als einer der
Hauptrisikofaktoren für die Entwicklung einer PD. Der Prozentsatz der Betroffenen in
der Bevölkerung steigt von 1% nach 60 Jahren auf 3% nach 80 Jahren an. Die
Erkrankung ist bei Männern häufiger als bei Frauen. Bei etwa 5-10% der Patienten
wird eine genetische Ursache gefunden (Balestrino und Schapira 2020). Anamnese
und eine klinische Untersuchung sind hier die zentralen diagnostischen Maßnahmen.
Standard bei Erstdiagnose ist ein MRT, CT und L-Dopa-Test, gegebenenfalls ein
DaTSCANTM (Dopamin-Transporter-Szintigraphie) oder ein IBZM-SPECT (123 Iod-
Iodobenzamid -Single-Photonen-Computer-Emissions-Tomographie) (Gennaro
Pagano et al. 2016). Trotz Kenntnis der zugrundeliegenden zellulären Dysfunktionen,
sind deren Entstehungsmechanismen noch unverstanden. Daher ist es bisher auch
nicht möglich, den Ausbruch der Krankheit zu verhindern. Die Behandlung der PD ist
rein symptomatisch. Als Basis-Therapie der Parkinson-Krankheit gilt die Dopamin-
Substitution mittels L-Dopa und die Gabe von Dopaminagonisten, um das
Dopamindefizit in den Basalganglien auszugleichen. Außerdem werden Medikamente
eingesetzt, die den Abbau des Dopamins im Gehirn inhibieren und auf diese Weise
9ebenfalls die Menge an verfügbarem Dopamin erhöhen. Hierzu gehören MAO-B-
Hemmer (Monoaminoxidase-B-Hemmer), COMT-Inhibitoren (Catechol-O-
Methyltransferase-Inhibitoren), NMDA-Antagonisten (N-Methyl-D-Aspartat-
Antagonisten) und Anticholinergika. Ansätze wie elektrische Stimulation (Deep Brain
Stimulation), chirurgische Ablation überaktiver subthalamischer Kerne und
Gentherapie sind Gegenstand derzeitiger Forschungsprojekte (Gerlach et al. 2007).
Eine ergänzende Therapiestrategie könnte der Nutzen von pleiotropen Wirkungen der
Mutation A53T sein. Unter Pleiotropie versteht man die Kontrolle mehrerer Merkmale
durch ein Gen. Dies sind positive Nebeneffekte unabhängig von ihrer Hauptwirkung
des Gens.
3.2 α-Synuclein
Die Untersuchung familiärer Formen der PD hat zur Entdeckung von über einem
Dutzend mit der Krankheit verbunden Genloci geführt. PARK 1 wurde von
Polymeropoulos 1997 als erster Genlocus der familiären PD identifiziert
(Polymeropoulos et. al. 1997). Seit 1997 konnten bisher 13 Genloci (PARK 1-13)
identifiziert werden. Die erste Beschreibung von PARK 1, eine Missense-Mutation in
α-Synuclein (SNCA) kodierendes Gen, wurde im Jahr 1997 in einer Familie mit
autosomal dominanter PD gemacht. Das SNCA-Gen ist auf Chromosom 4q22.1
lokalisiert und wird autosomal-dominant vererbt. Bisher wurden die 3 Missense-
Mutationen: A53T, A30P und E46K beschrieben. SNCA ist der Hauptbestandteil von
Lewy-Körpern, welche als Proteinablagerungen das neuropathologische Merkmal der
Parkinson-Krankheit bestimmen (Polymeropoulos et. al. 1997). Seit der Entdeckung
von SNCA ist es das am intensivsten untersuchte Gen, das mit der PD assoziiert ist
(Kasten und Klein 2013). SNCA ist ein präsynaptisches Protein, das für die Freisetzung
und die synaptischen Funktionen (Devine et al. 2011) von Dopamin im gesunden
Gehirn von entscheidender Bedeutung ist (Moore et al. 2005). Das Protein ist ein
Mitglied der Synuclein-Proteine. Es besteht aus 140 Aminosäuren und wird im
menschlichen Zentralnervensystem exprimiert. Es ist der Hauptbestandteil der Lewy-
Körper, welche Neurodegeneration verursachen (Spillantini 1999). Unter
physiologischen Bedingungen wird SNCA im gesamten ZNS exprimiert und ist
angereichert in Membranen und vesikulären Strukturen (Kahle et. al. 2001). Die
genaue physiologische Funktion von SNCA ist bisher weitgehend unbekannt. SNCA
10ist aber nicht auf das dopaminerge System bei Parkinson beschränkt, sondern betrifft
auch andere Neurotransmittersysteme (Ozansoy und Başak 2013). SNCA besitzt in
seiner physiologischen Form eine Tertiärstruktur, welche in Abhängigkeit von
Umgebung oder von krankheitsassoziierten Mutationen deutliche
Konformationsänderungen eingehen kann. Diese in der Konformation geänderten
fibrillären Formen sind Bestandteil der Lewy-Körper (Caughey und Lansbury 2003). Es
sind 2 Punktmutationen der α-Helix von SNCA bekannt, die die familiäre Parkinson-
Krankheit verursachen. Die erste Mutation (A53T) befindet sich an Position 53, wo ein
Alanin durch Thyrosin ausgetauscht wird. Die A53T-Mutation wurde in einer
italienische-griechischen Familie mit genetischer PD entdeckt (Polymeropoulos et. al.
1997). Eine weitere Mutation (A30P) befindet sich an Position 30, wo Alanin gegen
Prolin ausgetauscht wird. Die A30P-Mutation wurde einige Jahre später in einer
deutschen Familie entdeckt. Die Akkumulation und Aggregation dieser mutierten
SNCA-Proteine führt zur Neurodegeneration im Gehirn (Krüger et al. 1998). Bei A53T-
Mutationsträgern kommt es zu einem frühen Krankheitsbeginn der PD mit einer
raschen Progression und zusätzlicher Demenz (Deusser et al. 2015). Die A30P-
Mutation weißt eine Klinik entsprechend dem IPS auf, mit
Durchschnittserkrankungsalter von 60 Jahren und den Kardinalsymptomen
Bradykinese/Akinese, Rigor, Ruhetremor und posturale Instabilität (Krüger et al. 1998).
Patienten mit der E46K-Mutation zeigten neben Symptomen der PD auch atypische
Symptome der Demenz mit kortikalen und subkortikalen Lewy-Körpern (Zarranz et. al.
2004).
3.3 A53T- Mausmodell Morbus Parkinson
Die bisher vorhandenen Tiermodelle zu Erforschung der PD weisen jeweils einige
Teilaspekte auf, die den pathologischen Veränderungen im Menschen ähneln. Ein
Modell, welches den vollständigen humanpathologischen Verlauf der Erkrankung
abdeckt, existiert bisher nicht. Das für die vorliegende Arbeit verwendete Modell ist die
Linie A53T, eine Mauslinie, die erstmals 2003 von Hashimoto und Kollegen
beschrieben wurde (Hashimoto et al. 2003). Die A53T-Mutation führt, wie bereits oben
beschrieben, zu einer Punktmutation des SNCA und ist mit einem früheren
Krankheitsbeginn und einer raschen Progression der PD verbunden (Kasten und Klein
2013). In dieser Linie wird A53T-mutiertes humanes α-Synuclein unter Kontrolle eines
11PDGF-β-Promotors (Platelet Derived Growth Factor) in hohen Mengen überexprimiert.
Somit weist dieses Mausmodell mit der Überexpression von SNCA einen Teilaspekt
der Parkinson-ähnlichen Pathologie auf. Die Mutation führt zu einer Aggregatbildung
und zur Zunahme von SNCA-positiven granulären Einschlüssen im Gehirn, welche als
typisch für die PD beschrieben werden. Es konnte eindeutig gezeigt werden, dass die
beobachteten motorischen Defizite durch die Degeneration neuromuskulärer
Kontaktstellen verursacht wurde (van der Putten, H. et. al. 2000). Der motorische
Phänotyp der A53T-Mäuse, die das mutierte SNCA exprimieren, entwickeln im Alter
von ungefähr 9 bis 16 Monaten motorische Symptome (Paumier et. al. 2013).
3.4 Komorbidität Depression
Wie bereits beschrieben stehen Depression und Angststörungen als Begleitsymptome
in Zusammenhang mit der PD (Piredda et al. 2020). Depressionen gehören zu den
häufigsten psychiatrischen Störungen bei der PD (Lemke 2002). Das Krankheitsbild
der Depression gilt als weltweites Gesundheitsproblem und geht mit einer stark
eingeschränkten Lebensqualität sowie erhöhter Mortalität und Morbidität einher (Üstün
et al. 2004). Die Depression ist eine affektive Störung. Zur Diagnosestellung bedarf es
dem Vorliegen mehrerer Symptome über mindestens zwei Wochen. Charakteristisch
sind Hauptsymptome wie depressive und gedrückte Stimmung, Interessensverlust und
Freudlosigkeit, Verminderung des Antriebs mit erhöhter Ermüdbarkeit und
Aktivitätseinschränkung. Als Zusatzsymptome werden nach ICD-10 (International
Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems) verminderte
Konzentration und Aufmerksamkeit, vermindertes Selbstwertgefühl und
Selbstvertrauen, Schuldgefühle und Gefühle der Wertlosigkeit, negative und
pessimistische Zukunftsperspektiven, Suizidgedanken, Schlafstörungen und auch
verminderter Appetit gezählt (Härter et al. 2017). Die depressive Symptomatik bei
Parkinson-Patienten beinhaltet häufig Dysphorie, Gereiztheit, Irritabilität, Traurigkeit,
Pessimismus und Suizidgedanken. Depressionen in Zusammenhang mit der PD treten
in etwa bei 40 bis 50 Prozent der Patienten auf (Tysnes und Storstein 2017). Sie
beeinträchtigen deutlich die Lebensqualität und werden oftmals nicht adäquat
diagnostiziert (Lemke 2002). Es besteht keine lineare Beziehung zwischen
Depressionen und Dauer, sowie der Schwere der PD. Das Auftreten depressiver
Störungen kann somit nicht allein als sekundäre Reaktion auf die motorischen
12Einschränkungen durch die PD gewertet werden. Bei der PD kommt es überwiegend
zu chronischen Verläufen einer Depression. Das Auftreten von Angst und Depression
passiert bei der PD oft vor den motorischen Krankheitszeichen.
Bei Patienten mit PD werden Depressionen oft erst spät erkannt und sind schlechter
versorgt. Es sollte daher genauer auf motorische Parkinson-Symptome geachtet
werden (Lemke 2002). Pathophysiologisch ist die Depression bei der PD am ehesten
als primäre Konsequenz degenerativer Veränderungen in monoaminergen
Neurotransmittersystemen und frontokortikaler Dysfunktionen zu sehen (Marsh 2013).
3.5 Komorbidität Angststörung
Angst ist die natürliche Reaktion des Menschen auf Gefahren (Wittchen und Jacobi
2007). Angst bezeichnet eine Reaktion auf Gefahrenreize, die sich in körperlichen
Reaktionen wie Herzrasen, Schwitzen sowie in psychischen Symptomen wie
Unwohlsein oder Unruhe zeigt (Bandelow et al. 2015). Angst vor realen Bedrohungen
ist sinnvoll. Bei pathologischer Angst, wie sie bei Angststörungen auftritt, kommt es zu
übertriebenen und unrealistischen Reaktionen. Alle Angststörungen haben ein
übersteigertes Angstempfinden gemeinsam, welches zu starken Einschränkungen der
Lebensqualität führt (Wittchen und Jacobi 2007). Die erlebte Angst und die
körperlichen Angstsymptome entstehen durch Überreaktion des Körpers, bei Fehlen
einer wirklichen äußeren Bedrohung (Bandelow et al. 2015). Aus Untersuchungen geht
hervor, dass bei 19% der Patienten mit Depression zusätzlich eine Angststörung
vorliegt (Jacobi et al. 2004). Bei Angststörungen handelt es sich um multifaktorielle
Erkrankungen, die auf neurobiologische, genetische und psychosoziale Faktoren
zurückzuführen ist.
Angststörungen werden laut ICD-10-Katalog in Agoraphobie (F40.0), Soziale Phobien
(F40.1), Spezifische (isolierte) Phobien (F40.2), Sonstige phobische Störungen
(F40.8), Phobische Störungen (F40.9), Panikstörung (F41.0), Generalisierte
Angststörung (F41.1) sowie Angst und depressive Störung (F41.2) eingeteilt (DIMDI -
Deutsches Institut für Medizinische Dokumentation und Information 2019). 14,2% der
deutschen Bevölkerung im Alter von 18 bis 65 Jahren leiden im Zeitraum von einem
Jahr unter einer klinisch relevanten Angststörung (Wittchen und Jacobi 2007). Die
durchschnittliche Punktprävalenz von Angststörungen bei PD liegt bei 31% (Broen et
13al. 2016). Bei etwa 40-50% der Patienten mit PD liegt eine Depression oder
Angststörung vor (Lemke 2002). Es ist bisher ungeklärt, ob Angststörungen und
Depression primär oder sekundär mit dem Krankheitsgeschehen der PD in
Zusammenhang stehen.
3.6 Fragestellung der vorliegenden Arbeit
Depression und Angststörung scheinen eine wesentliche Rolle im Rahmen der PD zu
spielen. Neuropsychiatrische Symptome wie depressive Verhaltensweisen und
Angstzustände treten oft vor den motorischen Symptomen auf (Deusser et al. 2015).
Die Degeneration von Neuronen der dopaminergen SN bei der PD ist mit Einschlüssen
von SNCA in Lewy-Körpern verbunden. Diese Akkumulation von SNCA ist nicht auf
das dopaminerge System bei PD beschränkt, sondern betrifft alle
Neurotransmittersysteme (Gerlach et al. 2007). Die Degeneration von dopaminergen
Neuronen ist hauptsächlich verantwortlich für die motorischen Symptome der PD. Der
Verlust von serotonergen Neuronen oder ihrer Projektionen in den Hippocampus,
sowie Veränderungen in der Serotoninfreisetzung werden mit den nichtmotorischen
Symptomen wie Depression und Angstzuständen in Verbindung gebracht (Kohl 2016).
Deusser et al beschrieben in ihrer Arbeit einen Einfluss von SNCA Akkumulation auf
die serotonerge Innervierung, welche für Depressionen eine wichtige Rolle spielt
(Deusser et al. 2015).
Eine Studie (Mitteilung Prof. Dr. Christian P. Müller, Dr. Lyubov Kalinichenko) mit
älteren Mäusen (8 Monate) der Linie A53T zeigte, dass die A53T-Tiere im Gegensatz
zu den Wildtyp-Kontrollen weniger neuropsychiatrische Symptome wie Depression
und Angst zeigen. Der motorische Phänotyp, welcher typischerweise im Alter von 9
bis 16 Monaten zu beobachten ist, wurde dabei nicht verschoben. Dies lässt darauf
schließen, dass die A53T-Mutation im Hinblick auf Depression und Angst einen
protektiven Effekt im Alter für die Tiere zeigt. Die untersuchten älteren Tiere waren
hinsichtlich ihres emotionalen Verhaltens deutlich weniger beeinflusst als die Wildtyp-
Tiere. Die Tiere zeigten ein weniger ängstliches und depressives Verhalten. Dieser
Effekt selbst war auch geschlechtsspezifisch.
Diese Daten veranlassten mich dazu, in der vorliegenden Arbeit das emotionale
Verhalten der jungen A53T-Tiere zu untersuchen. Dabei sollte geklärt werden,
14inwieweit sich die Ergebnisse der älteren A53T-Tiere (8 Monate) mit jüngeren Tieren
(11-14 Wochen) replizieren lassen, und ob es einen Zusammenhang des Alters der
Tiere mit dem verminderten Auftreten von Depression und Angst gibt. Die Hypothese
der vorliegenden Arbeit ist, dass die A53T-Mutation zu einer Verringerung von Angst
und Depression im jungen Tier führt. Es wird erwartet, dass die Mutation auch im
jungen Tier zu weniger Angst und Depression führt, ohne die klinischen Symptome,
die die Motorik beeinflussen, zu verschieben. Um diese Hypothese zu untersuchen
wurde auf bekannte Tierversuchsparadigmen zurückgegriffen, welche antidepressive
und anxiolytische bzw. gegenteilige Effekte gut darstellen. Die gewählten Versuche
Open Field Test, Elevated Plus Maze, Light Dark Box Test, Novelty Suppressed
Feeding, Forced Swim Test und Sucrose Preference Test wurden zur Darstellung
eines depressions-artigen, bzw. Angst-assoziierten Verhaltens verwendet. Es sollte
demnach ein Unterschied zwischen den Wildtyp-Tieren und den A53T-Mäusen
beobachtbar sein. Die A53T-Mutanten müssten in den verwendeten Messparametern,
welche mit depressiven oder anxiolytischen Verhalten assoziiert sind, eine
Abweichung in Richtung weniger Angst und Depression zeigen.
154 Material & Methoden
4.1 Genehmigung Ethikkommission
Alle durchgeführten Versuche wurden mit transgenen Tieren und alters-/
geschlechtsangepassten nicht-transgenen Wurfgeschwistern nach entsprechender
Genehmigung durch die Regierung Mittelfranken durchgeführt. Die Tiere wurden
gemäß den europäischen Richtlinien und NIH-Richtlinien (National Institute of Health)
für die humane Behandlung von Tieren und Mäusen nach Beendigung der Versuche
durch zervikale Dislokation getötet.
4.2 Versuchstiere
Insgesamt wurden 29 Mäuse beider Geschlechter getestet. Die verwendeten Mäuse
hatten ein Alter von 11-14 Wochen. Das gewählte Alter diente der Vorbeugung von
Verzerrung der Versuche durch einen gegebenenfalls sehr früh ausgebildeten
motorischen Phänotyp der PD in den A53T-Tieren.
4.3 Genotypen
Die Versuche wurden mit transgenen Tieren und alters-/geschlechtsangepassten
Wildtyp-Wurfgeschwistern durchgeführt. Bei den Genotypen handelt es sich um
heterozygote A53T-Mutanten. Diese Tiere exprimierten die humane A53T-Mutante α-
Synuclein unter der Kontrolle des von Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor-b-
Promotors (Linie8) (Hashimoto et al. 2003).
4.4 Tierhaltung
Die Haltung der Tiere erfolgte in der offenen Tierhaltung des Franz-Penzoldt-Zentrums
in Erlangen (FPZ). Die Mäuse wurden in transparenten Kunststoffkäfigen mit
Edelstahlgitter (E. Becker & Co GmbH, Castrop Rauxel, D), einer Raumtemperatur von
21-23°C, einer Luftfeuchtigkeit von 45-60%, und einem Tag- und Nachtrhythmus von
1612h Licht und 12h Dunkelheit (hell von 07:00 bis 19:00 Uhr) gehalten. Die Tiere wurden
ohne Begrenzung mit Futter und Trinkwasser versorgt. Während der Versuche wurden
die Tiere in gemischten Gruppenkäfigen mit je 2 bis 5 Tieren gehalten. Für den letzten
Versuch wurden die Tiere in Einzelkäfige umgesetzt.
4.5 Versuchsablauf
4.6 Durchgeführte Versuche
Tabelle 1 Versuchsablauf
Novelty Suppressed Feeding (Gruppe A)
Novelty Suppressed Feeding (Gruppe B)
Open field Test (Gruppe A)
Open field Test (Gruppe B)
Sucrose Preference Test
Sucrose Preference Test
Sucrose Preference Test
Sucrose Preference Test
Sucrose Preference Test
Sucrose Preference Test
single housing 2 bottles
Elevated Plus Maze
Forced Swim Test
Forced Swim Test
Light-Dark box
Experiment
Tötung
Tag 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
Tabelle 1 gibt einen Überblick über den zeitlichen Ablauf der durchgeführten Versuche.
4.6.1 Open Field Test (OFT)
Der OFT ist ein oft verwendetes Versuchsmodell zur Darstellung des
Erkundungsverhaltens von Testtieren. Er dient der Untersuchung für angstähnliches
und emotionales Verhalten (Seibenhener und Wooten 2015). Der Test basiert auf
verhaltensbiologischen Beobachtungen, die zeigen, dass Mäuse einen inneren
Konflikt zwischen der Neugier, eine neue Umgebung zu erkunden, und der Angst vor
hellen, offenen Flächen haben (Prut und Belzung 2003). Mit dem OFT lässt sich
sowohl die Gesamtlaufstrecke als auch die Zeit messen, welche das Versuchstier im
Zentrum verbracht hat. Die im Zentrum verbrachte Zeit ist ein anerkannter Parameter
für das Angstverhalten des Versuchstiers (Treit und Fundytus 1988). Aufgrund der
Anzahl der getesteten Tiere wurde der Test auf 2 Tage verteilt. Eine Einteilung der
Gruppen erfolgte nach dem Zufallsprinzip. Der Test wurde in einer quadratischen
17Abb.2 Open Field Test, an Position x wurde
das Versuchstier eingesetzt
Kunststoffbox durchgeführt (51 x 51 cm). Innerhalb der Box wurde ein Quadrat mit
gleichem Abstand zu allen Seiten als Zentrum definiert (41 x 41 cm, Abbildung 2). Der
Versuchsaufbau befand sich in einem abgetrennten Raum mit konstanter Helligkeit
(100 lx), möglichst geringen Umgebungsgeräuschen und gleichbleibender
Raumtemperatur. Vor der Testdurchführung wurden die Tiere in ihren Käfigen für 45
Minuten zur Akklimatisation in das Testlabor gebracht. Das Aufzeichnen der
Ergebnisse erfolgt über eine an der Decke montierten Kamera (Digital USB 2.0 SMOS
Camera, Stoelting). Die Videoaufnahmen wurden mit Biobserve Viewer III (Biobserve,
Bonn, Deutschland) aufgezeichnet und ausgewertet. Die Software misst die
Bewegungen der Mäuse in der Peripherie und im Zentrum der Versuchsbox. Die
Mäuse wurden einzeln in der gleichen Ecke platziert, mit Sicht auf die umgebende
Wand. Jedes Tier hatte 20 Minuten Zeit die Open-Field-Test-Box, ohne weitere
äußeren Einflüsse, zu erkunden. Da die Tiere trotz aller aversiven Reize nach wenigen
Minuten eine Gewöhnung an die Umgebung zeigen, ist der Test zeitlich begrenzt und
kann grundsätzlich nicht widerholt werden. Die gemessenen Parameter wurden in 5-
Minuten-Blöcke zusammengefasst und ausgewertet. Gemessen wurden die
Laufstrecke im Zentrum und in der Peripherie sowie die Gesamtlaufstrecke, Anzahl
der Eintritte und Aufenthaltszeit im Zentrum, sowie die Latenzzeit bis zum ersten
Eintritt ins Zentrum. Nach Beendigung des Versuchsdurchlaufs wurde das getestete
Tier wieder in den Gruppenkäfig zurückgesetzt und die Testbox wurde mit 70%
Ethanollösung gereinigt.
184.6.2 Elevated Plus Maze (EPM)
Die Methodik des EPM basiert ebenfalls auf einer Konfliktsituation des Versuchstieres
zwischen angeborener Scheu vor offenen ungeschützten und erhöhten Flächen sowie
auf dem natürlichen Erkundungsverhalten in einer neuen Umgebung (Hogg 1996). Ein
ängstliches Verhalten spiegelt sich in weniger Aufenthalten auf den offenen Armen
wider (Pellow et al. 1985). Das vierarmige Labyrinth befand sich 50 cm erhöht vom
Boden. Von der Mitte des Labyrinths gehen zwei offene gegenüberliegende Arme
(Länge jeweils 30 cm) und zwei geschlossene gegenüberliegende Arme (Länge
jeweils 30 cm, Höhe der Wände 15 cm) ab. Die 4 Arme kreuzen sich jeweils
rechtwinklig im Mittelpunkt (5 x 5 cm) der Plattform (Abbildung 3). Der Versuchsaufbau
befand sich in einem abgetrennten Raum mit konstanter Helligkeit (100 lx), möglichst
geringen Umgebungsgeräuschen und gleichbleibender Raumtemperatur. Vor der
Testdurchführung wurden die Tiere für 45 Minuten zur Akklimatisation in das Testlabor
Abb.3 Elevated Plus Maze, an Position x
wurde das Versuchstier eingesetzt
gebracht. Das Aufzeichnen der Ergebnisse erfolgt über eine an der Decke montierten
Kamera (Digital USB 2.0 SMOS Camera, Stoelting). Die Videoaufnahmen wurden mit
Biobserve Viewer III (Biobserve, Bonn, Deutschland) aufgezeichnet und ausgewertet.
Die Software misst die Bewegungen der Mäuse innerhalb der geschlossenen und der
offenen Arme. Die Mäuse wurden zu Beginn des Versuchs auf den Mittelpunkt der
Plattform gesetzt, mit Kopf in Richtung einer der geschlossenen Arme. Das
Versuchstier hatte 5 Minuten Zeit, seine Umgebung ohne äußere Einflüsse zu
explorieren. Ein Eintritt oder Austritt in einen der Arme wurde dann gezählt, wenn die
Maus mit 2 Pfoten den jeweiligen Bereich betreten hatte. Gemessen wurde die Anzahl
der Eintritte der offenen und der geschlossenen Arme und die darin tatsächlich
19verbrachte Zeit. In diesen Parametern spiegelt sich ein Angstverhalten wider. Nach
Beendigung des Versuchsdurchlaufs wurde das getestete Tier wieder in den
Gruppenkäfig zurückgesetzt und die LDB wurde mit 70% Ethanollösung gereinigt.
4.6.3 Light-Dark Box Test (LDB)
Der LDB dient der Beurteilung von angstähnlichem Verhalten bei Nagetieren. Er
basiert auf dem Vermeidungskonflikt zwischen dem Drang, neuartige Flächen zu
erkunden, und einer Abneigung gegen helle offene Flächen (Arrant et al. 2013).
Hierbei handelt es sich um eine natürliche Konfliktsituation. Der Konflikt besteht aus
der Tendenz zur Erforschung und der anfänglichen Tendenz das Unbekannte zu
Abb.4 Light-Dark Box, an Position x wurde
das Versuchstier eingesetzt
vermeiden. Eine gesteigerte Aktivität des Versuchstieres im hellen Kompartiment kann
einen anxiolytischen Effekt einer Behandlung bzw. einer Mutation darstellen (Bourin
und Hascoët 2003). Der Versuchsaufbau besteht aus einer Box mit einem hellen und
einem dunklen Kompartiment. Das helle Kompartiment besteht aus zwei Drittel der
Gesamtfläche (51 x 51 cm), das Dunkle aus einem Drittel der Gesamtfläche. Das helle
Kompartiment hat die Maße 35 x 51 cm, das dunkle Kompartiment hat die Maße 16 x
51 cm (Abbildung 4). Beide Bereiche sind über einen Durchgang von 4 x 6 cm in der
Mitte verbunden. Das helle Kompartiment bestand aus weißen Plastikwänden und
einem weißen Boden, die konstante Helligkeit lag bei 100 lx. Das dunkle Kompartiment
bestand aus dunkelgrauen Plastikwänden und wurde während des Versuches
verschlossen, so dass hier nur eine Helligkeit von 1-2 lx vorlag. Der gesamte
20Testaufbau befand sich in einem abgetrennten Testraum mit konstanter Helligkeit (100
lx), möglichst geringen Umgebungsgeräuschen und gleichbleibender
Raumtemperatur. Vor der Testdurchführung wurden die Tiere für 45 Minuten zur
Akklimatisation in das Testlabor gebracht. Für den Test wurde jedes Versuchstier in
eine Ecke des dunklen Kompartiments gesetzt und das Kompartiment wurde von oben
durch einen Deckel verschlossen. Das Tier hatte 5 Minuten Zeit, die LDB zu erkunden.
Das Aufzeichnen der Ergebnisse erfolgt über eine an der Decke montierten Kamera
(Digital USB 2.0 SMOS Camera, Stoelting). Die Videoaufnahmen wurden mit
Biobserve Viewer III (Biobserve, Bonn, Deutschland) aufgezeichnet und ausgewertet.
Diese Software misst die Bewegungen und die Eintritte in den hellen Bereich. Ein
Eintritt in das helle Kompartiment wurde dann gewertet, wenn das Tier dieses mit
beiden Vorderläufen betreten hatte. Gemessen und ausgewertet wurde die verbrachte
Zeit in beiden Kompartimenten, die Latenzzeit bis zum ersten Eintritt in das helle
Kompartiment, die Gesamtanzahl der Eintritte in das helle Kompartiment und die
Gesamtlaufstrecke. Nach Beendigung des Versuchsdurchlaufs wurde das getestete
Tier wieder in den Gruppenkäfig zurückgesetzt und die Apparatur wurde mit 70%
Ethanollösung gereinigt.
4.6.4 Novelty Suppressed Feeding (NSF)
Der NSF ist ein Angst- und Depressionsbezogener Verhaltenstest. Er bewertet die
Anhedonie einer Situation, in der ein Konflikt zwischen Nahrungsmittelbelohnung und
Angst besteht (Powell et al. 2012). Anhedonie steht für die Unfähigkeit Freude und
Abb.5 Novelty Suppressed Feeding, an
Position x wurde das Versuchstier eingesetzt
21Lust zu empfinden. Der Test ist vor allem ein Paradigma für chronische Angst
(Samuels und Hen 2011). Der Test misst die Latenz der Maus beim Annähern und
Fressen von Futter in einer neuen und potenziell gefährlichen Umgebung nach einem
längeren Zeitraum von Nahrungsentzug. Zur Durchführung des Tests wurden die
Versuchstiere 24h vorher auf Nahrungsentzug gesetzt. Trinkwasser stand den Tieren
weiterhin ohne Einschränkung zur Verfügung. Vor der Testdurchführung wurden die
Tiere für 45 Minuten zur Akklimatisation in das Testlabor gebracht. Der Test fand in
einer quadratischen Kunststoffbox statt (51 x 51 cm, Abbildung 5). Der Testaufbau
befand sich in einem abgetrennten Testraum mit konstanter Helligkeit (100 lx),
möglichst geringen Umgebungsgeräuschen und gleichbleibender Raumtemperatur.
Das Testtier wurde gleichzeitig mit einem Stück Futter in die Box gesetzt. Das einzelne
Futterpellet wurde in die Mitte der Box gelegt und das Testtier in eine Ecke gesetzt,
mit dem Gesicht zur Wand. Das Aufzeichnen der Ergebnisse erfolgt über eine an der
Decke montierten Kamera (Digital USB 2.0 SMOS Camera, Stoelting). Die Latenz, um
sich dem Futter zu nähern und tatsächlich zu fressen, wurde händisch anhand der
Videoaufnahmen ausgewertet. Der Test hatte eine Höchstdauer von 20 Minuten.
Sobald das Testtier das erste Mal gefressen hatte, wurde der Versuch beendet.
Gemessen wurde die Zeit bis zum ersten Fressen der Maus. (Mielenz et. al. 2018)
Nach Beendigung des Versuchsdurchlaufs wurde das getestete Tier wieder in den
Gruppenkäfig zurückgesetzt und das NSF wurde mit 70% Ethanollösung gereinigt.
4.6.5 Forced Swim Test (FST)
Der FST nach Porsolt oder auch Behavioural Despair Test (Verhaltenstest über
Hoffnungslosigkeit) misst die Reaktion von Nagetieren auf die Gefahr des Ertrinkens.
Dieses Versuchsmodell dient zur Darstellung von depressivem Verhalten. Das
Floating, welches die Bewegungslosigkeit nach einer bestimmten Latenz des Tieres
ausdrückt, wird als depressives Verhalten gewertet (Porsolt et al. 1977; Porsolt et al.
1978). Der Versuch fand an 2 aufeinanderfolgenden Tagen statt. An dem zweiten Tag
beginnen die Tiere früher mit dem Floating, was als erlernte Hilflosigkeit bezeichnet
wird. Diese geht mit kognitiven Defiziten und Verhaltensänderungen einher, welche
auch bei einer Depression zu finden sind (Porsolt et al. 2001). Das Testtier wurde
einzeln in einen zylindrischen Glasbehälter gesetzt, welcher mit Wasser (Temperatur
27°C) gefüllt war. Die Wassertiefe wurde mit 12 cm so gewählt, dass sich das Tier
22Abb.6 Forced Swim Test, die Glaszylinder
waren 12cm hoch mit 27°C warmen Wasser
gefüllt. Wir verwendeten 3 Glaszylinder
parallel nebeneinander.
nicht mit dem Schwanz am Boden befand und auch nicht aus dem Glasbehälter
entfliehen konnte (Abbildung 6). Sobald die Maus ins Wasser gesetzt wurde, begann
die Aufzeichnung mit einer Kamera (Digital USB 2.0 SMOS Camera, Stoelting). Es
wurde die Zeit bis zum ersten Floating und die gesamte Zeit des Floatings gemessen.
Als Floating wurde die Zeit definiert, in welcher das Tier keinerlei Bewegung zeigte und
nur auf der Oberfläche schwamm. Einzig eine leichte Bewegung eines einzelnen
Hinterlaufs zur Stabilisierung, nicht aber zur Fortbewegung, wurde akzeptiert. Die
Videos wurden händisch ausgewertet. Der FST bestand aus zwei Teilen. Teil A fand
an Tag 1 statt. Das Testtier wurde hier für 15 Minuten in den Glasbehälter gesetzt. Teil
B fand an dem darauffolgenden Tag 2 statt. Das Testtier wurde für 5 Minuten in den
Glasbehälter gesetzt. Der Testaufbau befand sich an beiden Tagen in einem
abgetrennten Testraum mit konstanter Helligkeit (100 lx), möglichst geringen
Umgebungsgeräuschen und gleichbleibender Raumtemperatur. Vor der
Testdurchführung wurden die Tiere für 45 Minuten zur Akklimatisation in das Testlabor
gebracht. Als Parameter wurde die Zeit bis zum ersten Floaten und die Gesamtzeit
des Floatings an Tag 2 erfasst. Nach Beendigung des Versuchsdurchlaufs wurde das
getestete Tier auf ein Papierhandtuch gesetzt, abgetrocknet und dann wieder in den
Gruppenkäfig zurückgesetzt. Das verwendete Wasser in den Glasbehältern wurde
nach jedem dritten Tier gewechselt und neu temperiert.
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