Evolution 1: Q-beta replicase: The Spiegelman-Monster

Evolution 1:
     Q-beta replicase: The Spiegelman-Monster
1. Was muss ein Evolutionsexperiment können?

2. Motivation für in vitro Experimente mit RNA Phagen

3. Qß-Bakteriophagen

4. Qß geeignet!

5. „Sol Spiegelman als Gott“: Selektionsdruck

6. Serial Transfer Methode

7. Messmethoden und Ergebnisse des Versuchs

Was muss ein Evolutionsexperiment
              können?
1. Amplifikation muss beobachtbar sein
    sich vermehrende Spezies

2. Mutation und Selektion muss stattfinden

3. Vorhandene Selektionsbedinungen sollten gut manipulierbar sein

4. In Überschaubaren Zeiträumen gültige Aussagen liefern

5. Ergebnisse sollten „einfach“
   quantitativ und qualitativ auszuwerten sein

Motivation für in vitro Experimente
         mit RNA Phagen
Was sind Bakteriophagen?
- Viren
- häufigste „Lebewesen“ auf der Erde (10^30 Virionen im
Meer)

1. Schnelle Replikation/Amplifikation
2. => viele Mutationen pro Zeit
3. Bakteriophagen sind sehr einfache, übersichtliche
Systeme
4. wenig Ressourcen nötig!

Qß-Bakteriophage

Qß Virus befällt Escherichia Coli Salmonellen (kurz E-Coli, das „Haustier der Molekularbiologen“)

Qß

Qß-Bakteriophage

Qß Virus befällt Escherichia Coli Salmonellen (kurz E-Coli, das „Haustier der Molekularbiologen“)

Qß

Warum Qß Replikationssystem zur Untersuchung elutionärer
Prozesse?
Qß basierendes Replikationssystem besteht (nur) aus:
- isolierter RNA dependent Qß RNA Polymerase: Qß Replikase
- isolierter Qß RNA
sowie
- mit radioaktivem Phosphor markierte RNA Bausteine (32P Ribonukleodide)
- Puffer Substanzen (=> PH-Wert stabilisierend)

Qß-Bakteriophage

Qß Virus befällt Escherichia Coli Salmonellen (kurz E-Coli, das „Haustier der Molekularbiologen“)

Qß

Warum Qß Replikationssystem zur Untersuchung elutionärer
Prozesse?
Qß basierendes Replikationssystem besteht (nur) aus:
- isolierter RNA dependent Qß RNA Polymerase: Qß Replikase
- isolierter Qß RNA
sowie
- mit radioaktivem Phosphor markierte RNA Bausteine (32P Ribonukleodide)
- Puffer Substanzen (=> PH-Wert stabilisierend)
                          ===> Also relativ einfaches Replikationssystem!

Qß-Bakteriophage
Ganzes Viruspartikel („Virion“)
                                                                Capsid(mit A-Protein)

                     Ein Viruspartikel enthält:

                     - Qß RNA
                      als Erbmaterial(einzelsträngig, 3500BP)
                     - Spezielle Replikase Proteine: RNA
                     dependent Qß RNA Polymerase
                     - Capsid Proteine, A-Protein
                     - keine DNA!

Qß geeignet!
1. Amplifikation muss beobachtbar sein
    sich vermehrende Spezies

Qß Replikase stellt anhand eines RNA Templates über doppelsträngige
Zwischenformen weitere RNA Kopien
unter Einbau der readioaktiven Ribonukleodide her.

=> exponentielle Amplifikation der Template RNA's
bis umgebende Ressourcen (Ribonukleodide) verbraucht!

Qß geeignet!
2. Mutation und Selektion muss stattfinden

RNA Replikase im allgemeinen schlampiger
als DNA Replikase:

=> keine replizierte RNA
                   entspricht 100% dem Vorgänger

„Sol Spiegelman als Gott“:
                  Selektionsdruck
Selektion auf schnelle Replikationsgeschwindigkeit!
"What will happen to the RNA molecules
if the only demand made on them is the Biblical injunction, multiply,
with the biological proviso that they do so as rapidly as possible?"

Serial Transfer Methode
Selektionsdruck hinsichtlich schneller Replikation – wie kann man diesen technisch verwirklichen?

          RNA Replikation lässt man im

Serial Transfer Methode
In jedem Schritt,
           also vor jedem Transfer zwei Analysen:

  1. Menge der gebildeten RNA

Serial Transfer Methode
In jedem Schritt,
           also vor jedem Transfer zwei Analysen:

  1. Menge der gebildeten RNA

  2. Menge an infektiöser RNA

Zu 1. Nachweis der Menge der geb. RNA
Ansäuern des Ansatzes mit Trickloressigsäure (TCA) mit dem Ergebnis, dass
polymerisierte P32 Nukleodide (RNA) ausflocken und unlöslich werden,
während nicht polymerisierte Monomäre weiterhin in Lösung bleiben
und durch Membranfiltration von den Polymeren abgetrennt werden können.
(„Ausflocken = RNA Stränge verhackeln sich“)
Bestimmung der auf dem Membranfilter hängengebliebenen Radioaktivität
(radioaktive Moleküle müssen Polymere sein, also RNA).
==> Messung der Strahlung ~ Bildung von RNA

Zu 2. Nachweis noch voll funktionsfähiger
Einheiten:
RNA Verdünnung wird mit zellwandlosen Bakterien versetzt (Protoplasten –
leicht eindringbar),
um festzustellen wieviel RNA Stränge noch infektiöse Partikel hervorbringen
konnten.
Protoplasten auf trüben Nährboden -> dort wo Infektion:
Protoplastenrasen durchsichtig.
=> Zählbar:
Anzahl Löcher (Plugs) entsprechen Anzahl infektiöser Einheiten.

Kontrolle:RNA Kopie in Vitro ohne Verluste
Qbeta RNA Replikase

                      Protoplast von E-Coli Zelle;
Qbeta RNA
                           RNA Nukleotide

                                        Funktionsfähige
                                        Virus RNA

                       Komplette funktionsfähige Viren
                       (infectious units)

 => RNA Replikasen aus Bakteriophage (Qbeta-Virus):
 Replizieren nur Qbeta RNA!

RNA Produktion

Messung RNA Länge
Durch Sedimentationsrate während Zentrifugation mit S(=Svedberg) als Maß für Rate

Großes S => schwer => großes Molekül

Reduktion der Genlänge

                            Kein Genom mehr
                            mit Orginallänge

   (Referenz markiert mit niederenergetischem ß-Strahler 3h (Trizium))

Bestimmung des Gewichts
      (Geschwindigkeit durch Gel ~ Länge ~ Gewicht)

Bestimmung des Gewichts
      (Geschwindigkeit durch Gel ~ Länge ~ Gewicht)

Bestimmung des Gewichts
      (Geschwindigkeit durch Gel ~ Länge ~ Gewicht)

Vergleich der Replikationsraten des
Endprodukts und der Ausgangs RNA

Ergebnisse:
“Spiegelman monster“:
Nach 74 Transfers nur noch
83% der Orginalgenomlänge(218 Nukleotiden);
nach wie vor reproduzierbar durch Replikase!

                     ===> MONSTERHAFT
                          (bzw. zwergenhaft!!!)

Erfolgreiche Methodik,
              um Evolution In Vitro zu untersuchen!

Eigen: 3SR Methode
3sr Methode:
Anhand eines HIV-1 RNA Template wird ein dazu komplementärer DNA Strang
erzeugt (Reverse HIV-1 Transkriptase (Retro Viruses))
Aus diesem DNA Strang wird Doppel DNA Strang gebaut (DNA Polymerase)
Diese Doppel DNA wird konventionell wieder in eine RNA transkribiert (RNA
Polymerase)
Eigen: Fluoreszenz von in Doppelstrang gezwickte Farbstoffe (während DNA
Polymerase) unmittelbar messbar (Interkalation).
Ressourcen waren im Überfluss da, nur die zugegebene Menge von RNA war
ausschlaggebend für das erhaltene Produkt
Deshalb bedeutet ein Transfer jedesmal nur innerhalb der exponentiellen Phase
durchgeführt (konstante Reproduktionsraten – maximalschnell) eine Selektion der
RNA Bildungsgeschwindigkeit:
Anders ausgedrückt: Diejenigen Mol. die schneller reproduzieren können nach
einigen dieser Transfers die übrigen verdrängen – ersetzen (Mengenverhältnis
verändert sich - „Herausverdünnung“). Man nahm dafür ein HIV Genom mit 220
Basen, von dem man wusste, dass es in vivo die Bindungsstellen für die reverse
RNA Transkriptase enthält.
Bei Eigen haben sich sehr schnell zwei Varianten in diesen seriellen Transfers
herausgebildet: „EP1“ und „EP2“, die nur noch 48 Basen lang waren.