Regulation! Metabolismus ! des ! - und !
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Regulation!
des !
Metabolismus !
und...!
Bakterielle Viren = Bacteriophagen !
Überblick! Transkription! ! !langsam (min)! Translation ! ! !langsam (min)! posttranslational ! !schnell (≤ sec)
Überblick!
1)Transkription ! ! !langsam (min)!
!Repression & Induktion durch DNA-Bindeproteine!
!negative Kontrolle - Repressor!
!positive Kontrolle - Aktivator!
!Operon vs. Regulon!
!
2) Translation ! ! !langsam (min)!
!
3) posttranslational ! !schnell (≤ sec)!
!kovalente & nicht-kovalente Enzymhemmung!
! ! !(Rückkopplung)
Induktion des Maltose Operons in E. coli!
Positive Kontrolle
(Maltose)
In E. coli sind die Gene für Maltosemetabolismus über das Chromosom verteilt;
jedes Gen ist reguliert vom Maltoseaktivatorprotein (REGULON)
Globale Regulationsmechanismen!
= Reaktion auf veränderte Umweltbedingungen
!betrifft Regulation vieler verschiedener Gene!
!
Bsp:!
!
wenn E.coli mehrere Zucker gleichzeitig als C-Quelle zur !
Verfügung hat, wird Glucose immer zuerst verbraucht!
!
reguliert durch Katabolitrepression:!
verhindert Synthese von katabolischen Enzymen, die zur!
Glucoseverwertung unnötig sind!
!
bei anderen Organismen andere Zucker von primärer Bedeutung!
Sinn der Katabolitrepression:!
beste C- und Energie-Quelle wird zuerst verbraucht
Katabolitrepression! Effekt: Diauxie! 2 exponentielle Wachstums-! phasen bei 2 C-Quellen! ! ß-Gal-Synthese von ! Katabolitrepression reguliert! !
Katabolitrepression!
Mechanismus:!
!
RNA-Polymerase bindet nur dann an DNA, wenn !
Katabolitaktivatorprotein (CAP) zuerst gebunden hat!
!
CAP = allosterisches Protein, bindet DNA nur in Gegenwart von!
!cAMP!
!
Glucose hemmt cAMP-Synthese und stimuliert cAMP-Transport!
aus der Zelle!
!
Regulation betrifft lac-Operon, mal-Regulon, und!
andere katabolische Operons in E. coli!
!
Zyklisches Adenosinmonophosphat (AMP)!
Adenylat-Zyklase
ATP cAMP + PPi
Interaktion des cAMP-Bindeproteins (CAP) mit DNA!
Positive Kontrolle
cAMP
C-α trace
CAP kontrolliert 7 E. coli Operons. !
CAP bindet DNA nur, wenn es cAMP gebunden hat. !Regulation des Lactose-Operons!
Transkript
– 35 Sequenz Pribnow-Box
negative Kontrolle durch lac-Repressor, aufgehoben durch !
!Lactose!
positive Kontrolle durch CAP, ausgelöst durch cAMP!Die stringente Antwort!
Übergang von aa-Überschuss zu aa-Mangel:!
!
Stop der Synthese von rRNA & tRNA!
!keine Ribosomenneusynthese, keine Translation!
!
!hemmt Proteinbiosynthese & DNA-Synthese!
!aktiviert Aminosäure-Biosynthese!
!
reguliert durch Guanosintetraphosphat ppGpp!
! !und Guanosinpentaphosphat pppGpp!
!Die stringente Antwort!
Guanosinetetraphosphat (ppGpp/pppGpp)
Guanosintetraphosphat ppGpp und !
Guanosinpentaphosphat pppGpp (Alarmone)!
!
akkumulieren bei Aminosäure-Mangel!
!
gebildet von RelA!Die stringente Antwort!
Bindung nicht-
beladener tRNA an
translatierende
Ribosomen führt zur
Alarmon-Synthese
durch RelA!Die stringente Antwort!
Die stringente Antwort, Bsp aus der Natur! Caulobacter crescentus
Die stringente Antwort, Bsp aus Medizin!
Weitere globale Kontrollsysteme in E.coli!
TABLE 8.1 A few of the global control systems known in Escherichia colia
System Signal Primary activity Number
of regulatory protein of genes
regulated
Aerobic respiration Presence of O2 Repressor (ArcA) 50+
Anaerobic respiration Lack of O2 Activator (FNR) 70 +
Catabolite repression Cyclic AMP concentration Activator (CAP) 300+
Heat shock Temperature Alternative sigma 36
(!32)
Nitrogen utilization NH3 limitation Activator (NRI) / 12+
alternative sigma (!54)
Oxidative stress Oxidizing agent Activator (OxyR) 30+
SOS response Damaged DNA Repressor (LexA) 20+Weitere globale Kontrollsysteme in E.coli:!
alternative Sigma Faktoren!
Sigma Faktor = Untereinheit der RNA Polymerase, die für !
! ! Promotorerkennung verantwortlich ist!
Konzentration in der Zelle reguliert durch Transkription/Translation!
!und Abbau !
Aktivität reguliert durch Anti-Sigma-Faktoren!Weitere globale Kontrollsysteme in E.coli:!
Hitzeschockantwort!
Sigma Faktor 32 instabil, t1/2 = 30 sec!
T Anstieg hemmt Sigma Faktor 32 Abbau!
hohe [Sigma Faktor 32] aktiviert Transkription von!
!Hitzeschockgenen!
!
Hitzeschockproteine:!
!auch induziert durch Chemikalien & Strahlung!
!3 Hauptklassen in E.coli: Hsp70, Hsp60, Hsp10!
!DnaK = Hsp70; verhindert Proteinaggregation!
!GroEL, GroES = Hsp60 & Hsp10, !
! ! ! propagieren Proteinfaltung!
!ausserdem Proteasen, die denaturierte Protein abbauen!
!meist hoch konserviert!
bei T-Senkung inaktiviert DnaK Sigma 32!Weitere globale Kontrollsysteme in E.coli:!
Kälteschockantwort!
ausgelöst durch verlangsamte Proteinbiosynthese!
!
Kälteschockproteine: !
!Helicasen, Nucleasen, ribosomengebun-!
!dene Proteine, reduzieren Synthese von Makromolekülen!
!!
ausserdem: Synthese kompatibler löslicher Stoffe als!
! ! !Gefrierschutz!Quorum Sensing!
= regulatorische Wege, die von der Dichte der Zellen der !
eigenen Art kontrolliert werden!
!
stellt sicher, dass eine ausreichende Mengen Zellen einer !
Spezies vorliegt, bevor eine bestimmte biologische Antwort!
ausgelöst wird!
!
verbreitet bei gram- Bakterien!
!
Mechanismus:!
Zellen synthetisieren und sezernieren !
!acyliertes Homoserinlacton (AHL)!
Konzentration in der Umgebung nur dann hoch, wenn viele!
!Zellen AHL ausscheiden!
hohe [AHL] führt zur Bindung an Transkriptionaktivator für!
!spezifische Gene!Quorum Sensing!
wichtig für!
Virulenzfaktoren (e.g.Toxine)!
Biofilmbildung!
Biolumineszenz !Quorum Sensing! Biolumineszenter Vibrio fischeri (produziert Luziferase)
Quorum Sensing: andere Beispiele!
Krankheitserreger: !
!
!Pseudomonas aeruginosa!
Quorum sensing führt zu Wachstum als Biofilm auf sezernierten!
Polysacchariden; steigert Pathogenität & verhindert Eindringen!
von Antibiotika!
!
!Staphylococcus aureus!
sezerniert Peptide, die Wirtszellen & Immunsystem schädigen !
!
auch in Archaea!Biofilme!
Biofilme!
Biofilme!
Attenuation! Regulation durch Kontrolle der Transkription nach deren Initiation! d. h. kontrolliert wird die Anzahl vollständiger Transkripte (mRNAs)! ! häufig bei Aminosäure-Biosynthese in gram- Bakterien! ! ! Bsp Tryptophan Operon in E. coli:! ! - Promoter & Operator für negative Kontrolle durch Rückkopplung! ! - zusätzlich am 5’ Beginn des Operons: Leadersequenz! ! - diese kodiert Leaderpeptid, das 2 Tryptophan Codons enthält & ! als Attenuator wirkt!
Attenuation am Bsp Tryptophan Operon!
stop
Translated leader sequence
+ Trp: Leaderpeptid wird synthetisiert, Transkription des!
!restlichen Operons terminiert!
-Trp: Leaderpeptid wird nicht synthetisiert, Transkription des!
restlichen Operons findet statt!Attenuation: Mechanismus -i!
in Prokaryoten finden Transkription & Translation gleichzeitig statt!
Attenuation findet statt, wenn die mRNA einen stem-loop bilden!
!kann, der mit der RNA-Polymerase interferiert!
!Attenuation: Mechanismus -ii! in Prokaryoten finden Transkription & Translation gleichzeitig statt.! Attenuation findet nicht statt, wenn die mRNA einen stem-loop bildet, der nicht mit der RNA-Polymerase interferiert! !
Attenuation: Mechanismus!
in Prokaryoten finden Transkription & Translation gleichzeitig!
!statt!
Attenuation findet nur statt, wenn die mRNA einen stem-loop
!bildet, der mit der RNA-Polymerase interferiert!
!Attenuation: andere Beispiele!
Isoleucin
bitte lernen Sie die 3-Buchstaben Abkürzungen für Aminosäuren!!
(z. B. auf der letzten Seite von Alberts et al., Molekulare !
Zellbiologie; in jedem Biochemie-Lehrbuch)Attenuation: the movie!
Signaltransduktion ! = Weiterleitung von Signalen aus der Umwelt in der Zelle über Sensor in der Cytoplasmamembran an regulatorische ! Maschinerie in der Zelle! ! meist 2-Komponenten-Systeme:! Sensorkinase in der Zellmembran + Response-Regulatorprotein! ! Sensorkinase:! hochkonserviert! detektiert Umweltsignal! Autophosphorylierung an His! Übertragung des Phosphats auf Response-Regulator! ! Response-Regulator:! DNA-Bindeprotein, das Transkription reguliert!
Signaltransduktion ! Regulation über Rückkopplung beteiligt: Phophatase, die Response-Regulator dephosphoryliert! ! die Sensorkinase kann auch Phosphatase-Aktivität haben;! alternativ Dephosphorylierung durch zusätzliches Protein! ! Dephosphorylierung läuft mit konstanter Geschwindigkeit! langsamer als Phosphorylierung! konstitutiv!
Signaltransduktion: 2-Komponenten-System !
(O2, pH, T, Licht, Nährstoffe)
1
autokatalytisch
2Beispiele für 2-Komponenten-Systeme !
TABLE 8.3 Some two-component regulatory systems from Escherichia coli that
regulate transcription
System Environmental Sensor Response Activity of response
signal kinase regulator regulatora
Arc System O2 ArcB ArcA Repressor/Activator
Nitrate and Nitrate and NarX and NarL Activator/Repressor
nitrite nitrite NarQ
anaerobic NarP Activator/Repressor
regulation(Nar)
Nitrogen NH4+ NRII, the NRI, the Activates RNA
utilization (Ntr) product of product of polymerase at
glnL glnG promoters requiring
!54.
Pho regulon Inorganic PhoR PhoB Activator
phosphate
Porin Osmotic EnvZ OmpR Activator/Repressor
regulation pessure
In E. coli ~ 50 verschiedene Zweikomponentensysteme
nur wenige in Archaea
keine in parasitären Bakterien
gibt es auch in mikrobiellen Eukaryoten (S. cerevisiae)Chemotaxis in E. coli!
Bakterien sind zu klein, um Konzentrations-Gradienten entlang
einer Zelle zu erkennen; deshalb: !
- Detektion von zeitlichen Gradienten beim Schwimmen!
- in Richtung Chemo-Attractant nimmt Taumeln ab, Geraden zu!
- Chemorezeptoren an der Zytoplasmamembran kontrollieren!
!Flagellenrotation!Regulation der Chemotaxis !
Schreckstoff! MCP=!
Picture?! (Repellent)! Methylakzeptor-!
Chemotaxisprotein!
5 MCPs in E. coli; jedes erkennt andere Verbindungen!
CheW ist die Sensorkinase!
anziehende Stoffe verringern CheA-P, abstossende erhöhen CheA-P!Regulation der Chemotaxis !
Schreckstoff! MCP=!
Picture?! (Repellent)! Methylakzeptor-!
Chemotaxisprotein!
- CheA-P überträgt P auf Response-Regulator CheY, der Geisselrotation steuert!
- CheY-P bindet an Geisselmotor und induziert Taumeln!
- CheZ dephosphoryliert CheY-P (konstitutiv)!Regulation der Chemotaxis !
Schreckstoff! MCP=!
Picture?! (Repellent)! Methylakzeptor-!
Chemotaxisprotein!
Anpassung:!
- CheR methyliert MCP (konstitutiv), CheB-P demethyliert MCP!
- CheA-P überträgt P auf CheB (langsam)!
- methyliertes MCP bindet nicht an anziehende Stoffe, besser an Schreckstoffe!Regulation der Chemotaxis ! Komplexe aus mehreren ! spezifischen Rezeptoren in IM, ! His-Kinase CheA, Adaptor CheW! ! Effektor diffundiert ins Periplasma,! bindet Rezeptor (direkt oder BP)! ! Output: ! Menge von P-CheY! bindet an Flagellenmotor, ! induziert CW Rotation (= Taumeln) Sourjik & Wingreen, Curr Op Cell Biol, 2012
Regulatorische RNAs ! Regulation durch kleine RNAs (sRNAs)! 40-400 Nukleotide! 1. sRNA im Signalerkennungspartikel! 2. sRNAs binden an mRNA durch komplementäre Basenpaarung = Antisense-RNAs, verhindern Translation, Abbau der mRNA! !
Antisense-RNAs! sRNAs ~40-400 Nukleotide
Regulatorische RNAs ! Regulation durch kleine RNAs (sRNAs)! 40-400 Nukleotide! 1. sRNA im Signalerkennungspartikel! 2. sRNAs binden an mRNA durch komplementäre Basenpaarung = Antisense-RNAs, verhindern Translation, Abbau der mRNA! 3. Riboswitches:! am 5’-Ende von mRNAs! können kleine Moleküle binden Bindung verhindert Translation! != Rückkopplungsmechanismus, z.B. in der Thiamin-Synthese! !
Regulatory RNAs: riboswitches! (Vitamine)
Regulatorische RNAs ! Regulation durch kleine RNAs (sRNAs)! 40-400 Nukleotide! 1. sRNA im Signalerkennungspartikel! 2. sRNAs binden an mRNA durch komplementäre Basenpaarung = Antisense-RNAs, verhindern Translation, Abbau der mRNA! 3. Riboswitches:! am 5’-Ende von mRNAs! können kleine Moleküle binden Bindung verhindert Translation! != Rückkopplungsmechanismus, z.B. in der Thiamin-Synthese! 4. CRISPR als antivirales Verteidigungssystem (Brock, S. 328)! !
Bakterielle Viren !
φRsG1
Viruses infecting a cell of Rhodobacter sphaeroides
Duchrow, M., G. W. Kohring and F. Giffhorn.
1985. Virulence as a consequence of genome instability of a novel temperate bacteriophage RsG1,
of Rhodobacter sphaeroides Arch. Microbiol. 142, 141-147.Virus Klassifikation 1. Anhand der Wirtszellen: Bakterien, Pflanze, Tier 2. Anhand des Genoms im Viruspartikel (Virion) 3. Es gibt ein formales System der Virusklassifikation, das Viren in verschiedene Taxa einordnet (Ordnungen, Familien, Gattung/ Art), Virusfamilien haben das Suffix –viridae (Polioviridae)
Haupttypen von Bakterienviren (Bacteriophagen)!
Das Nucleocapsid von φ6 ist von einer Membran umgeben.Warum binden Phagen an Pili?!
!
!
!
!
!
!
!
!
Wenn der Pilus retrahiert, kann der Phage!
das Bakterium infizieren.!Bestimmung von Phagentitern!
Bacteriophagen ! 2 prinzipielle Lebenszyklen:! ! virulent: lysieren Wirte nach Infektion! ! temperent: Phagengenom wird zusammen mit Wirtsgenom! ! ! !repliziert, ohne den Wirt zu töten!
Replikationszyklus ! virulenter Phage! Phagen: 20-60 min! Animal viruses: 8-40 h! !
Virulente Bacteriophagen, Bsp T4! > 25 Strukturproteine! ds DNA Genom! ringförmig permutiert, d.h. lineare DNA wird verpackt, ! entstanden durch Öffnung eines Rings, an verschiedenen Stellen! am Ende der DNA: 3-6 kb terminale Wiederholungssequenzen! ! Replikation:! zuerst Replikation injizierter, linearer DNA, dann! Concatemerbildung durch Rekombination an den Enden! Verpackung durch Schneiden mit Endonuclease! “ein Kopf voll” DNA wird verpackt! !
Virulente Bacteriophagen, Bsp T4!
Restriktionsenzyme5-Hydroxymethylcytosin gibt es nur in DNA
geradezahligen T-Phagen!
Glykosylierung von Hydroxymethylcytosin verhindert!
Schneiden durch Wirts-Endonucleasen!Virulente Bacteriophagen, Bsp T4! Zeitverlauf einer in T4 Infektion !
Temperente Bacteriophagen!
Lysogenie:!
!
die meisten Virusgene werden nicht exprimiert!
Virusgenom (‘Prophage’) wird mit Wirtsgenom repliziert und an!
!Tochterzellen weitergegeben!
unter spezifischen Bedingungen wird Virusbildung induziert!
!
Lysogene sind immun gegen Infektion vom selben Phagentyp!Temperente ! Bacteriophagen!
Temperente Bacteriophagen, Bsp Lambda!
Head diameter ~ 65 nmSeminar, Do 16.05, hier um 17:15!
Prof. Elke Deuerling!
!
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2
“Protein folding and transport in the cell”!
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