(FFF) Field Flow Fractionation
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Field Flow Fractionation
(FFF)
15-1
Einleitung /
Historische Entwicklung
Entwickelt in den 60er Jahren von J. Calvin Giddings
hat einen außerordentlich weiten Einsatzbereich: von kleineren
Molekülen mit einigen hundert Da MW bis hin zu Kolloiden und
Partikeln bis zu 100 µm Durchmesser
ist eine Elutionstechnik ähnlich der Säulenchromatographie
ist keine chromatographische Technik im eigentlichen Sinne
(beruht nicht auf Verteilung zwischen zwei unmischbaren
Phasen)
Trennung beruht auf der unterschiedlichen Diffusions-
geschwindigkeit verschiedener Moleküle oder Partikel
15-2
1Definition und Einteilung
FFF nutzt die unterschiedlichen Diffusionsgeschwindigkeiten
unterschiedlich großer Moleküle oder Partikel unter der
Einwirkung eines zur Flußrichtung senkrecht wirkenden
Kraftfeldes zu deren Trennung aus.
Die Verwendung unterschiedlicher Kraftfelder gibt den
jeweiligen FFF-Techniken ihren Namen:
Verwendung von Sedimentation und Scherkräften (SFFF)
thermische Gradienten (T-FFF)
Verwendung eines cross-flow (CF-FFF)
Verwendung elektrischer Felder (EF-FFF)
Verwendung magnetischer Felder (MF-FFF)
15-3
Schematischer Aufbau der FFF
15-4
2Theoretische Grundlagen der
Trennung in der FFF (1)
Probe wird am Kopf der FFF-Trennstrecke aufgegeben
Probe verteilt sich in einer Zone einheitlicher Konzentration
über die gesamte Breite des Trennkanals
Fluß der mobilen Phase wird für eine definierte Zeit
(Relaxationszeit) abgestellt
Relaxationszeit abhängig von: Analyt, Art und Stärke des
angelegten Feldes, physikal. Dimensionen des Trennkanals
(kann von Sekunden bis ca. 1 Stunde dauern)
während der Relaxationszeit wirkt die Kraft F auf die Probe ein
und bewirkt eine Wanderung zu einer Wand des Trennkanals:
der "Anreicherungswand"
15-5
Theoretische Grundlagen der
Trennung in der FFF (2)
Die Wanderungsgeschwindigkeit u kann beschrieben werden als:
u = F/f = F (D/RT)
hierbei ist: f…Reibungskoeffizient
R…allgem. Gaskonstante
T…absolute Temperatur
D…Diffusionskoeffizient des Analyten
Prozeß setzt sich fort, bis ein dynamisches Gleichgewicht erreicht
ist, bei der die Anreicherung an einer Wand des Trennkanals ebenso
groß ist wie die Diffusion weg von dieser Wand
Ausbildung diskreter Zonen im Trennkanal parallel zu den
Längswänden mit exponentiellem Konzentrationsprofil und
Konzentrationsmaximum an der Wand des Trennkanals
15-6
3Schematische Darstellung des
Trennprozesses in der FFF
Separation Channel • { { •{
{• • • { • •
Sample { • {• { • {• w 1) Injection
mixture { {
• • • {• {
Sedimentation Field
• Diffusion 2) Relaxation
• { {• { {{••{ •
{• •{•• ••{•{{ • {•
{
Flow profile Field • •
l2 • •• •• •• 3) Separation
{ { { {{ { {
l1 {{ { { { { •• • • • •
Larger Smaller
Particles Particles 15-7
Theoretische Grundlagen der
Trennung in der FFF (3)
Das Konzentrationsprofil der einzelnen Analyten hat die
Schichtdicke l, die zugleich der mittlere Abstand des
Analyten von der Kanalwand ist:
l=D/u
Die Schichtdicke kann zweckmäßigerweise auf die Dicke
des Trennkanals w normiert werden:
λ=l/w
Beide Gleichungen können zusammengefaßt werden zu:
λ = RT / Fw
wobei λ ein dimensionsloser Retentionsparameter ist.
15-8
4Theoretische Grundlagen der
Trennung in der FFF (4)
Damit λ klein ist, muß das angelegte Feld stark sein, d.h.
die Energie der Wechselwirkung größer sein als die
thermische Energie: Fw > RT
Da in dem dünnen Kanal der Trennstrecke ein laminarer
Fluß herrscht, resultiert ein parabolisches Flußprofil
aufgrund der Viskosität der Lösung
Analytzonen, deren Abstand zur Kanalwand größer ist,
werden daher schneller durch den Trennkanal transportiert
als Analyten, die sich näher an der Kanalwand befinden
Es kommt zu einer Trennung der Analytzonen aufgrund
unterschiedlicher Transportgeschwindigkeiten durch den
Trennkanal 15-9
Theoretische Grundlagen der
Trennung in der FFF (5)
Wie in der Chromatographie kann ein Retentionsverhältnis r
für die FFF definiert werden:
r = Vo / V
hierbei ist: V°…Totvolumen des FFF-Kanals*
V …Elutionsvolumen des Analyten
(*Bestimmung entweder aus den Dimensionen des Trennkanals oder aus
der Elutionszeit einer nicht retardierten Spezies)
Theoretische Berechnung der Retentionsverhältnisse ist möglich
aus:
1
r = 6λ [coth ( )
2λ
- 2λ]
15-10
5Theoretische Grundlagen der
Trennung in der FFF (6)
Für stark retardierte Analyten (λ < 0,1) vereinfacht sich die
Gleichung zu:
r = 6λ
Damit erhält man folgenden allgemeinen Audruck für die
Retentionszeit tr in diffusionskontrollierter FFF:
tr = Fw t°
6RT
15-11
Theoretische Grundlagen der
Trennung in der FFF (7)
Bei größeren Partikeln (dp > 1 µm) Übergang zu einem anderen
Trennmechanismus: sterische FFF
charakterisiert durch eine Umkehr der Elutionsreihenfolge (je
größer die Partikel, umso schnellere Elution in der sterischen FFF)
Teilchen wandern sehr dicht an der Wand des Trennkanals
entlang.
Retentionsverhalten für diesen Trennmodus läßt sich beschreiben
durch:
tr = w t°
6γr
mit: r…Teilchendurchmesser
γ…dimensionsloser Faktor, γ ≈ 1
15-12
6Theoretische Grundlagen der
Trennung in der FFF (8)
Nachteile der sterischen FFF:
durch Kontakt mit der Wand kann es zu nicht-idealem
Retentionsverhalten kommen (Vergrößerung der Retentions-
zeit, völlige Adsorption der Analyten)
genaue Kontrolle der Oberflächenbeschaffenheit des
Trennkanals erforderlich
15-13
Beschreibung der Banden-
verbreiterung in der klassischen FFF
Für die Höhe eines theoretischen Bodens H(u) gilt in der FFF:
2 D χw2u
H(u) = + + ΣHi
ru D
wobei χ…dimensionsloser Parameter.
Wie in der klassischen van-Demter-Gleichung repräsentiert
der erste Term => Longitudinaldiffusion
der zweite Term => Ungleichgewichtseffekte
der dritte Term => weitere Beiträge zur Trennstufenhöhe wie
Relaxationsprozesse, Injektion, etc.
Der zweite Term liefert den größten Beitrag zu H(u), da bei Makro-
molekülen der Diffusionskoeffizient D sehr klein ist, der in den ersten
Term proportional, in den zweiten aber indirekt proportional eingeht.
15-14
7Beschreibung der Banden-
verbreiterung in der klassischen FFF
Aus der Theorie läßt sich ableiten, daß:
lim χ = 24 λ3
λ→0
z.B.: Verdoppelung der Retention (=> t verdoppelt sich)
=> λ (oder r) wird halb so groß
=> χ fällt auf 1/8 des ursprünglichen Wertes
=> H(u) fällt auf ca. 1/8 des ursprünglichen Wertes
15-15
Optimierung der Trennleistung in der
klassischen FFF
Wie bei allen chromatographischen Trennverfahren gilt für die
Auflösung R:
2 (tR1 - tR2)
R=
tw1 - tw2
wobei tR1(R2)…Retentionszeit der Komponente 1 (2)
tw1(w2)…Peakbreite an der Basis der Komponente 1 (2),
ausgedrückt in Zeiteinheiten
Die Auflösung R kann auch ausgedrückt werden als:
R= 1/r1 - 1/r2
2(1/r1 √ N1 + 1/r2 √N2)
wobei r1(2)…Retentionsverhältnis der Komponente 1 (2)
N1(2)…Trennstufenzahl für die Komponente 1 (2) 15-16
8Optimierung der Trennleistung in der
klassischen FFF
Unter Verwendung des Retentionsverhältnisses r:
t°
ri =
t
und der Definition der Trennstufenzahl gemäß:
N = L/H
folgt:
N1 = (4t1/ tw1)2
Die Auflösung in der FFF:
steigt mit der Wurzel der reduzierten Trennkanal-Länge
nimmt mit zunehmender Geschwindigkeit der mobilen
Phase ab 15-17
Gerätetechnik der FFF (1)
Instrumentierung der FFF ähnlich der Instrumentierung
für HPLC:
♦ LM-Behälter
♦ Pumpe
♦ Injektionssystem
♦ FFF-Kanal
♦ Detektor
♦ Datenaufzeichnung und -auswertung
15-18
9Gerätetechnik der FFF (2)
Pumpen:
FFF-Kanäle bieten keinen hohen Flußwiederstand
Ö keine Hochdruckpumpe erforderlich, aber:
Ö pulsationsfreie Förderung mit konstanter Flußrate
erforderlich
Ö (Spritzenpumpen oder Kolbenpumpen mit Fluß-
dämpfer, keine peristaltische Pumpen)
Ö keine Gradientenpumpen erforderlich
Injektionssystem:
♦mit Spritze durch ein Septum
♦mittels eines 6-Wege-Ventiles 15-19
Gerätetechnik der FFF (3)
Flußmessung:
nicht gesondert erforderlich, am besten anhand von nicht
retentierten Analyten zu ermitteln
Detektoren:
wie in der HPLC: RI, Photometer (UV-DAD), Fluoreszenz;
auch Laserstreuungstechniken, die eine ungefähre Molekular-
gewichtsbestimmung ermöglichen (z.B. MALLS: multiple angle
laser light scattering) !
Kanäle:
in der Regel flache, lange Kanäle mit Dimensionen von z.B.
100 cm Länge × 2-3 cm Breite × 0.05-0.5 mm Dicke
Konstruktion hängt im Einzelfall von der individuellen FFF-
Technik ab 15-20
10Spezielle Varianten der FFF:
Thermische FFF
Trennkanal aus zwei metallischen Teilen, vorzugsweise
aus Kupfer
oberer Teil ist beheizt
unterer Teil ist gekühlt (beides thermostatisiert !)
Folie mit geringer thermischer Leitfähigkeit trennt die
beiden Schichten und begrenzt den Flußkanal
15-21
Spezielle Varianten der FFF:
Thermische FFF
1,2 = Einlaß- und Auslaßkapillaren, 3 = beheizte Kupferplatte,
4 = Elektrische Heizpatrone, 5 = Spacer, 6 = gekühlte Kupferplatte,
7,8 = Bohrungen für Umlaufkühlung, Bohrungen für Thermoelemente
15-22
11Spezielle Varianten der FFF:
Thermische FFF
1h 6h
87°C
1800000
7100000
97000
860000
411000
51000
20000
4000
200000
Inject
27°C
Beispiel der Trennung eines Gemisches von neun Polystyrol-Polymeren
in Ethylbenzol (gemessen nach 1 h bei konstantem Feld mit einer heißen
Wand von 87°C und einer Reduktion des Temperaturgradienten auf Null
über einen Zeitraum von 6 h mit einem parabolischen Abkühlprogramm.
Die Temperatur der kalten Wand betrug stets 27°C.) 15-23
Spezielle Varianten der FFF:
Sedimentations-FFF
♦ Trennkanal ist in Form eines Rings im Rotor einer
Zentrifuge ausgebildet
♦ durch die Rotation des Trennkanals wird eine
gleichmäßige Beschleunigung auf die Analyten
ausgeübt
15-24
12Spezielle Varianten der FFF:
Sedimentations-FFF
15-25
Spezielle Varianten der FFF:
Sedimentations-FFF
Anordnung für die Sedimentations-FFF: 1= Rotor, 2= Haltering, 3= Schrauben,
4= äußere Wand des Kanals, 5= innere Wand des Kanals, 6= Kanal,
7= Dichtungen, 8= rotierend gelagerte Durchführung, 9= Einlaß- und
Auslaßkapillare, 10= Halterung, 11= stationärer Teil der Durchführung, 15-26
12= Einlaßkapillare, 13= Kugellager, 14= Schrauben, 15= Auslaßkapillare.
13Spezielle Varianten der FFF:
Sedimentations-FFF
Trennung aufgrund
sterischer Effekte in der
Sedimentations-FFF.
(Sieben-Komponenten-
Gemisch von Polystyrol-
Latex-Kügelchen unter
Einwirkung eines Feldes
von 345 g bei einem Fluß
von 2,28 L/h.)
15-27
Spezielle Varianten der FFF:
Elektrische FFF
♦ Körper des Trennkanals besteht aus Kunststoff
(Plexiglas)
♦ durch eine semipermeable Membran getrennt,
befinden sich in den beiden angrenzenden Kammern
Elektrolytlösungen, an die die Arbeitsspannung
angelegt wird
♦ alternativ: Graphitplatten, an denen die Spannung
angelegt wird und die gleichzeitig als Kammerwabnd
dienen
15-28
14Spezielle Varianten der FFF:
Elektrische FFF
Trennkanal für die Elektrische FFF; 1 = oberes Elektrodenabteil; 2 = Elektrode;
3 = Membran; 4 = Elektrolyt-Einlaß; 5 = Einspritzzone; 6 = Einlaß Carrier;
7 = Spacer; 8 = Membran; 9 = unteres Elektrodenabteil; 10 = Elektrolyt-Einlaß;
11 = Elektrode; 12 = Elektrolyt-Auslaß; 13 = Carier-Auslaß; 14 = Elektrolyt- 15-29
Auslaß.
Spezielle Varianten der FFF:
Elektrische FFF
Injection Exit
port port
U=
5V
15-30
15Gerätetechnik der FFF:
Crossflow-FFF
♦ Ausführung des Trennkanals ähnlich wie bei der
elektrischen FFF
♦ Membran muß einen Crossflow erlauben
♦ Crossflow muß - ebenso wie der longitudinale Fluß -
exakt kontrolliert werden, am besten durch zwei
Pumpen am Ein- und Ausgang des Crossflows
15-31
Gerätetechnik der FFF:
Sterische FFF
Ausführung des Trennkanals ähnlich wie bei der
Sedimentations-FFF
im einfachsten Fall Trennung der Partikel durch
Sedimentation im natürlichen Gravitationsfeld
↑
λ
Beziehung zwischen dem
Retentionsparameter λ und dem
Partikeldurchmesser d für Latex-
Teilchen mit vergleichbarer
elektrophoretischer Mobilität.
Die durchgezogene Linie wurde
durch Ausgleichsrechnung über
die offenen Datenpunkte
erhalten. Die angelegte
Spannung (es handelt sich hier
um Elektrische FFF) war 1,60 V,
der Fluß 0,5 mL/min.
15-32
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