Identifizierung immundominanter Proteine bei chronischen Chlamydia trachomatis Infektionen mittels Immunoblot-Verfahren
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Universität Ulm
Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene
Ärztliche Direktor: Prof. Dr. med. S. Stenger
Identifizierung immundominanter Proteine
bei chronischen Chlamydia trachomatis Infektionen
mittels Immunoblot-Verfahren
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm
Vorgelegt von Sandra Kottke
Aus Berlin-Lichtenberg
2009
Amtierender Dekan: Prof. Dr. rer. Nat. Thomas Wirth 1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Andreas Essig 2. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Thomas Mertens Tag der Promotion: 28.10.2010
Inhaltsverzeichnis 1
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS ...................................................................................................... 1
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ............................................................................................ 3
1 EINLEITUNG .................................................................................................................. 6
1.1 Chlamydien ................................................................................................................ 6
1.2 Humanpathogene Chlamydien und ihre Klinik .......................................................... 8
1.2.1 Chlamydia trachomatis ...................................................................................... 8
1.2.2 Chlamydia pneumoniae .................................................................................... 11
1.2.3 Chlamydia psittaci............................................................................................ 11
1.3 Diagnostik von Chlamydia trachomatis Infektionen ............................................... 12
1.3.1 Direkte Nachweismethoden ............................................................................. 12
1.3.2 Indirekte Nachweismethoden ........................................................................... 14
1.4 Zielsetzung dieser Arbeit ......................................................................................... 16
2 MATERIAL .................................................................................................................... 18
2.1 Chemikalien und Reagenzien ................................................................................... 18
2.2 Enzyme ..................................................................................................................... 19
2.3 Antikörper ................................................................................................................ 19
2.4 Bakterienstämme und Zellen .................................................................................... 19
2.5 Flüssigmedien........................................................................................................... 19
2.6 Lösungen und Puffer ................................................................................................ 20
2.7 Geräte und Verbrauchsmaterialien ........................................................................... 21
3 METHODEN .................................................................................................................. 23
3.1 Zellkultur .................................................................................................................. 23
3.1.1 Kultur der Wirtszellen ...................................................................................... 23
3.1.2 Kultur von Chlamydien .................................................................................... 23
3.1.3 Reinigung der Chlamydien............................................................................... 25
3.2 Bestimmung der Chlamydien-Konzentration........................................................... 26
3.3 Lyophilisieren von Zellen ........................................................................................ 26
3.4 Immunoblot .............................................................................................................. 27
3.4.1 Herstellung der Gele......................................................................................... 27
3.4.2 Probenvorbereitung und Füllschema ................................................................ 28
3.4.3 Elektrophorese .................................................................................................. 28
Inhaltsverzeichnis 2
3.4.4 Semi-dry Elektroblotting .................................................................................. 28
3.4.5 Vorbereitung der Patientenseren ...................................................................... 29
3.4.6 Färben der Blotting-Membran .......................................................................... 29
3.5 Erhebung der Patientendaten .................................................................................... 30
3.5.1 Mikrobiologische und klinische Charakterisierung Patienten mit komplizierter
C.trachomatis Infektion ................................................................................... 31
3.5.2 Patienten ohne mikrobiologischen und klinischen Nachweis von Chlamydien
.......................................................................................................................... 33
3.5.3 Mikrobiologische und klinische Charakterisierung Patienten mit einem
niedrigen C.pneumoniae Antikörper-Titer ....................................................... 33
3.6 Immunoblot Auswertung mit dem Gelscan 5.1 Professional Programm der Firma
BioSciTec ................................................................................................................. 36
3.7 Statistische Auswertung ........................................................................................... 37
4 ERGEBNISSE ................................................................................................................ 39
4.1 Seren von Patienten mit chronisch aufsteigender C.trachomatis Infektion erkennen
eine Vielzahl von Chlamydien-Antigenen ............................................................... 39
4.1.1 Identifizierung chlamydien-spezifischer Banden mit Kontrolle durch HeLa-
Zellen................................................................................................................ 45
4.1.2 Chlamydien-spezifische Banden finden sich in allen
Molekulargewichtsbereichen ........................................................................... 45
4.1.3 Die Berechnung von Banden mit hohem Molekulargewicht ist unpräzise ...... 46
4.1.4 Chlamydien-spezifische Banden zeigen in der Regel eine stärkere
Bandenintensität als kreuzreagierende Banden ................................................ 46
4.1.5 Seren von Patienten mit aufsteigender C.trachomatis Infektion zeigen im
Immunoblot ein charakteristisches Bandenmuster........................................... 49
4.1.6 Bei Seren mit relativ geringen C.trachomatis Antikörper-Titer finden sich
weniger spezifische Banden ............................................................................. 52
4.2 Seren von Patienten mit zurückliegender C.pneumoniae Infektion erkennen auch
C.trachomatis Proteine............................................................................................. 54
4.2.1 Durch gleiche Familienzugehörigkeit gibt es viele homologe Proteine
zwischen C.trachomatis und C.pneumoniae .................................................... 56
4.3 Diagnostische Aussagekraft der Banden in Abhängigkeit des Kontrollkollektivs .. 59
5 DISKUSSION ................................................................................................................. 63
6 ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................... 82
7 LITERATURVERZEICHNIS ...................................................................................... 84
Abkürzungsverzeichnis 3 Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung ATP Adenosintriphosphat ATCC American Type Culture Collection APS Ammoniumperoxidasesulfat CPAF chlamydialer Proteasome-like Activity factor C.t. Chlamydia trachomatis CML chronisch myeloische Leukämie DNA Desoxyribonukleinsäure EK Elementarkörper ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay EIA Enzymimmunoassays EDTA Ethylendiamintetraacetat FCU first catch urine FITC Fluorescein Isothiocyanat °C Grad Celsius gw grenzwertig GTP Guanintriphosphat HSP Heat Shock Protein HSV Herpes Simplex Virus HLA-B27 Human Leukozyt Antigen B27 IgA Immunglobulin A IgM Immunglobulin M IgG Immunglobulin G IFU Inclusion forming units IfSG Infektionsschutzgesetzes cIAP-2 Inhibitor Apoptose Protein-2 IL-1ß Interleukin-1beta IL-6 Interleukin-6 pI Isoelektrischer Punkt KDO Keto-desoxy-oktonat kDa Kilo Dalton KBR Komplementbindungsreaktion LCR Ligase Chain Reaction
Abkürzungsverzeichnis 4 LPS Lipopolysaccharid m männlich MIP macrophage infectivity potentiator MHC Major Histocompatibility Complex MOMP Major outer membrane Protein MS Massenspektronomie MALDI-TOF matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight μg Mikrogramm MIF Mikroimmunofluoreszenztest μm Mikrometer ml Milliliter min Minute M Molar nm Nanometer NaCl Natriumchlorid neg negativ NF-κB Nuclear factor-kappa B NAT Nukleinsäureamplifikationsverfahren ORF open reading frame OMP2 Outer membrane Protein PID Pelvic inflammatory disease PBS Phosphat buffered saline pgp plasmid protein PCR Polymerase Chain Reaction pmp poly membrane protein pos positiv p.i. post infektionem RK Retikularkörper RFX-5 MHC II promoter X box regulatory factor 5 deficiency RNA Ribonukleinsäure rpm Rotation per minute SU Schwangerschaftsuntersuchung sek. Sekundär STD sexuell transmitted disease
Abkürzungsverzeichnis 5 SDS Sodiumdodecylsulfat ssp. subspecies h Stunde SDA Strand Displacement Amplification SPG PBS Puffer mit Saccharose Tab. Tabelle TMA Transcription-mediated Amplification TARP translocated actin recruiting phosphoprotein Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan TNF-α Tumor Nekrose Faktor-alpha USF-1 upstream stimulation factor 1 u.U. unter Umständen UTP Uridintriphosphat V Volt VD variable Domäne VS variables Segment w weiblich WHO World Health Organisation xg Zentrifugalbeschleunigung
1 Einleitung 6 1 Einleitung 1.1 Chlamydien Chlamydien sind 0,2-1 μm große, obligat intrazelluläre Erreger, die einen charakteristischen Vermehrungszyklus aufweisen. Nach der bisherigen Taxonomie ist Chlamydia die einzige Gattung der Familie der Chlamydiaceae. Bisher wurden die 3 humanpathogenen Spezies Chlamydia (C.) pneumoniae, C. trachomatis und C. psittaci voneinander abgegrenzt. 1999 wurde eine neue taxonomische Einteilung vorgeschlagen, wonach die Familie der Chlamydiaceae die Gattungen Chlamydia, Chlamydophila, Simkania und Parachlamydia umfasst. Diese Einteilung ist noch in Diskussion (55). Der Aufbau der Zellwand von Chlamydien ist dem der gramnegativen Bakterien ähnlich; es fehlt jedoch, die bei gramnegativen und grampositiven Bakterien in unterschiedlichem Ausmaß vorhandene Peptidoglykanschicht. Chlamydien sind auf eine eukaryonte Wirtszelle als Energiedonor angewiesen, um fehlenden Enzyme für die Synthese energiereicher Nukleotide wie ATP, GTP und UTP zu ersetzen. Früher wurden Chlamydien auch als Energieparasiten bezeichnet. Unabdingbar für das Verständnis der Diagnostik, Pathogenese und Therapie von Chlamydieninfektionen ist ihr einzigartiger intrazellulärer Entwicklungszyklus. Chlamydien liegen in einer extrazellulären infektiösen Form, den Elementarkörpern (EK) und in einer intrazellulären, stoffwechselaktiven Form, den Retikularkörpern (RK) vor (Abb.1). Die sogenannten Elementarkörper sind in der Lage durch Rezeptor-vermittelte Endozytose an die Wirtszellmembran zu adhärieren. EK besitzen kaum metabolische Aktivität; ihre Aufgabe besteht darin, in der extrazellulären Umgebung zu überleben, um dann die Wirtszelle zu infizieren. Im Zytosol der Zelle befinden sich die Chlamydien in einer Vakuole, die man auch Einschlusskörper nennt (Abb.1); die Fusion mit Lysosomen unterbleibt. Nach etwa 1-2 h post infektionem (pi) entwickeln sich die intrazellulär lokalisierten Elementarkörper zu metabolisch aktiven Retikularkörpern, die sich innerhalb der Vakuole durch Zweiteilung vermehren können. Nach ca. 18 Stunden beginnen sich die RK wieder in EK umzuwandeln, so dass innerhalb eines Einschlusskörpers Chlamydien in unterschiedlichen Entwicklungsstadien vorliegen können. Nach 36 bis 72 Stunden, abhängig von Chlamydienstamm und -spezies, rupturiert die Wirtszelle und die entstandenen Elementarkörper werden freigesetzt und können wiederum andere Zellen infizieren (30). Die
1 Einleitung 7
diesem Entwicklungszyklus zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen sind bis jetzt nur
im Ansatz verstanden.
Elementarkörper
Elementarkörper
Elementarkörper
Retikular-
körper
Nukleus
Einschlusskörper
Abb.1: Intrazellulärer Entwicklungszyklus der Chlamydien: Rezeptor-vermittelte Endozytose des EK,
Umwandlung zum RK, Entstehung des Einschlusskörpers mit Chlamydien in verschiedenen
Entwicklungsstadien und Ruptur der Wirtszelle mit Freisetzung der Chlamydien.
Quelle: Dtsch. Med. Wschr. 122 (1997), 971 – 975 © Georg Thieme Verlag Stuttgart
Weitestgehend ungeklärt ist wie Chlamydien ihr intrazelluläres Überleben sichern. In vitro
Experimente zeigen, dass Chlamydien Einfluss auf die Wirtszellapoptose nehmen, um ihren
Vermehrungszyklus zu beenden. Diskutiert wird, ob die Modulation der Wirtszellapoptose
eher durch chlamydiale Faktoren oder durch die Aktivierung eukaryonter
Transkriptionsfaktoren wie Nuclear factor-kappa B (NF-κB) erfolgt. Es wurde nachgewiesen,
dass Chlamydien eine erhöhte Freisetzung von Zytokinen wie Tumor Nekrose Faktor-alpha
(TNF-α), Interleukin-1beta (IL-1ß) und Interleukin-6 (IL-6) induzieren, die alle durch NF-κB
reguliert werden (73). Die Zelle muss aus Sicht der Chlamydien mindestens so lange am
Leben erhalten werden, bis der Entwicklungszyklus abgeschlossen ist. Der eukaryonte
Apoptose-Inhibitor (cIAP-2), dessen Expression durch Chlamydien experimentell induziert
werden kann, scheint bei der Auslösung der NF-κB abhängigen Inhibition der
Wirtszellapoptose maßgeblich beteiligt zu sein (72).1 Einleitung 8 In vitro wurde gezeigt, dass alle Chlamydienspezies durch Zytokine, Antibiotika und Nährstoffentzug in ein so genanntes Stadium der Persistenz getrieben werden können, in dem sich ihre Morphologie, metabolische Aktivität sowie Antigen- und Genexpression ändert. Persistierende Formen sind möglicherweise der Wirtszellabwehr und Antibiotikatherapie nur schwer zugänglich, so dass sich dadurch leichter chronische und rezidivierende Infektionen ausbilden könnten. Die klinische Relevanz persistierender Formen ist jedoch umstritten, da keine diagnostischen Verfahren zum Nachweis dieser persistierenden Chlamydienformen im Patientenmaterial zur Verfügung stehen (46). 1.2 Humanpathogene Chlamydien und ihre Klinik 1.2.1 Chlamydia trachomatis C.trachomatis ist ein weltweit verbreiteter Erreger okulogenitaler Erkrankungen. Aufgrund der antigenen Eigenschaften der Zellwandoberfläche bzw. Sequenzunterschiede des korrespondierenden ompA-Genes wird C.trachomatis in derzeit 19 Serovare bzw. Genotypen eingeteilt. Die C.trachomatis-Serovare A, B, Ba und C sind für das Trachom, eine der häufigsten Ursachen für vermeidbare Erblindung in den Tropen und Subtropen, verantwortlich. Die Erkrankung breitet sich in Gebieten, in denen extrem ungünstige Hygienebedingungen herrschen, bevorzugt aus. Die am stärksten betroffenen Regionen befinden sich in Nordafrika, dem mittlere Osten und den nördlichen Teil Indiens; prävalent ist die Erkrankung außerdem in der Sub-Sahara, Australien und Lateinamerika. Bei der Erstinfektion entwickelt sich eine follikuläre Konjunktivitis, die nach ödematöser Schwellung meist folgenlos abheilt. Reinfektionen, die Jahre später erfolgen können, führen zu einer follikulären Vernarbung, Liddeformierung und Trichiasis. Durch mechanische Irritation kommt es zur Progression; Pannusbildung und Cornea-Vernarbung sind die Folgen. In Gebieten, in denen diese Serovare endemisch sind, ist das Konjunktiva-Epithel von Kindern meist die Haupterregerquelle. Die Bakterien werden durch direkten Kontakt oder durch Fliegen von Auge zu Auge übertragen (20). Die C.trachomatis-Serovare D-K gehören in den Industrieländern zu den häufigsten sexuell übertragbaren Erregern. Es kommt zu schätzungsweise 100.000 Neuerkrankungen jährlich in der Bundesrepublik Deutschland. Die WHO schätzt die Neuerkrankungszahl auf 90 Millionen Fälle pro Jahr weltweit. Mit 5 bis 10 % ist die Prävalenz im Bereich der 15 - 29 Jährigen am höchsten.
1 Einleitung 9 Eine 2004 durchgeführte Studie an Berliner Schulen konnte zeigen, dass bereits 3,6 % der bis 15 jährigen und 10 % der 17 jährigen Mädchen mit C.trachomatis infiziert sind. Der C.trachomatis Nachweis erfolgte mittels PCR eines Zervix-Abstriches. Die Mehrzahl der betroffenen Mädchen (75 %) gaben keine Beschwerden durch die Infektion an (35). Asymptomatisch verlaufende Chlamydien Infektionen sind heutzutage die häufigste Ursache der infektionsbedingten Sterilität. Zwischen 85 % und 90 % der Infektionen bei Männern und Frauen verlaufen asymptomatisch. Asymptomatische Infektionen können monatelang persistieren und aufsteigen (69). Es wird vermutet, dass bereits heute 100.000 Frauen in Deutschland durch eine chronische aufsteigende C.trachomatis Infektion keine Kinder auf natürliche Weise bekommen können (51). Fertilitätsdiagnostik und Infertilitätsbehandlung verursachen hohe Kosten. Neben einer Tubenfaktorinfertilität verursacht C.trachomatis eine ganze Reihe weitere Erkrankungen. Bei der Frau sind dies u. a. Zervicitis (Abb.2), Periappendizitis, Perihepatitis und Pelvic Inflammatory Disease (PID) mit Endometritis, Salpingitis (Abb.3) und Peritonitis (76,79). Infektionen während der Schwangerschaft erschweren die Nidation und erhöhen das Risiko einer Frühgeburt, einer ektopen Schwangerschaft oder auch einer Totgeburt. Ein besonderes Problem stellt die Chlamydienzervicitis (Abb.2) in der Schwangerschaft dar. Das Neugeborene infiziert sich unter der Geburt, weist dann oft unmittelbar danach eine Bindehautentzündung (sog. Einschlusskonjunktivitis) auf und kann im weiteren Verlauf durch Erregerausbreitung an einer atypischen Pneumonie erkranken. Es wird angenommen, dass 12,5 % aller im Krankenhaus aufgenommenen Pneumonien bei Säuglingen unter 3 Monaten durch C.trachomatis ausgelöst werden (12). Die Einschlusskonjunktivitis beim Erwachsenen ist selten, selbstlimitierend und häufig mit einer urogenitalen C.trachomatis Infektion assoziiert.
1 Einleitung 10
Abb.2: Zervicitis bei einer Frau mit Abb.3: Ein operativ entfernter Eierstock mit
C.trachomatis Infektion mit Salpingitis ausgelöst durch eine
chronische C.trachomatis Infektion
Primär verursacht C.trachomatis beim Mann Entzündungen der akzessorischen Sexualdrüsen
(Epididymitis, Prostatitis). Das klinische Bild einer Urethritis tritt nach einer Inkubationszeit
von 5 - 14 Tagen ein (42).
Die Zielzellen von C.trachomatis sind oberflächliche Zylinderepithelien wie sie in der
Endocervix, Urethra, Nebenhoden, Endometrium, Eileiter, Konjunktiva, Nasopharynx und im
unteren Respirationstrakt vorkommen. Es ist nicht bekannt, dass andere Zellen oder tiefer
liegende Schichten infiziert werden. Ein erhöhtes Risiko eine C.trachomatis Infektion zu
erwerben haben v.a. junge Frauen im Alter zwischen 15 und 25 Jahren. Neben der
beginnenden Sexualität, wechselnde Geschlechtspartner spielt auch der erhöhte
Östrogenspiegel in den ersten fertilen Jahren bei einer Frau eine Rolle. Durch den
Östrogenspiegel und einer ausgeprägten Portioektopie können Mikroorganismen leichter in
den Zervikalkanal eindringen. Zusätzlich ist das genitale Immunsystem noch nicht vollständig
ausgebildet. Diese Faktoren können zu einer erhöhten Infektanfälligkeit bei jungen Frauen
führen (77).
Durch die vielen asymptomatischen Infektionen und schwerwiegenden Folgen für Frauen,
stellt sich die Frage nach einer Screening-Untersuchung für C.trachomatis. Durch mehrere
Studien wurde gezeigt, dass ein Screening nur in einer Hochrisikogruppe effektiv gegenüber
Nutzen, Kosten und Aufwand ist. Die Risikogruppe enthält junge sexuell aktive Frauen unter
25 Jahre, Personen mit neuem oder mehreren Sexualpartnern, Patientinnen mit Zervixektopie
und Personen mit einer sexuell übertragbaren Erkrankung in der Vorgeschichte (53). Ein
Screening bei asymptomatischen Personen wird nicht empfohlen. In Deutschland gibt es1 Einleitung 11 keine allgemeine Screening-Untersuchung für C.trachomatis Serovar D-K und es besteht keine Meldepflicht. Eine typische Komplikation der C.trachomatis Infektion neben den aufsteigenden Infektionen ist die posturethritische Arthritis, die bei 1 % bis 3 % aller chlamydieninfizierten Patienten oder häufig bei HLA-B27-positiven Patienten auftritt. Seltener und für beide Geschlechter gleichermaßen zutreffend ist der Morbus Reiter, der auch durch andere Bakterien verursacht werden kann und mit einer Symptomtrias aus Urethritis, Konjunktivitis und Arthritis einhergeht (42). Die C.trachomatis-Serovare L1, L2, L2a und L3 verursachen das Lymphogranuloma venereum, eine meldepflichtige Geschlechtskrankheit. Im Unterschied zu den anderen Serovaren kann lymphatisches und subepitheliales Gewebe infiziert werden. Die Erkrankung kommt noch v.a. in Afrika, Zentral-Amerika und in den tropischen Gebieten Asiens vor; in den westlichen Industrieländern treten nur noch vereinzelte, überwiegend importierte Fälle auf. Klinisch zeigt sich das Bild eines Genitalulcus oder einer Genitalpapel. Meistens ist die Erkrankung mit einer inguinalen Lymphadenopathie, Fieber, Myalgien, Kopfschmerzen und einer Leukozytose assoziiert. Trotzdem sollte man bei unklaren Genitalulzera und geschwollenen Inguinallymphknoten an diese Erkrankung auch hier zu Lande denken (57). 1.2.2 Chlamydia pneumoniae C.pneumoniae ist ein weit verbreiteter Erreger von Infektionen des Respirationstraktes wie Sinusitis, Pharyngitis, Bronchitis bis hin zur Pneumonie (63). Retrospektive serologische Studien zeigen, dass sich 6 % bis 10 % der ambulant-erworbenen Pneumonien auf C.pneumoniae zurückführen lassen. Durch seroepidemiologische Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass man mit einer Durchseuchung der Bevölkerung in Deutschland von über 50 % rechnen kann, weltweit geht man davon aus, dass 60 % der erwachsenen Bevölkerung eine Exposition durchgemacht hat. Die meisten Infektionen erfolgen im Kindes- und Jugendalter durch Tröpfcheninfektionen. Viele Hinweise haben sich angehäuft, dass dieser Organismus auch in der Entwicklung von extrapulmonalen Erkrankungen, u.a. der Arterosklerose eine Rolle spielen könnte (66). Allerdings sind die Ergebnisse vieler Studien durch die Verwendung mangelhaft evaluierter diagnostischer Verfahren belastet (21). 1.2.3 Chlamydia psittaci C.psittaci ist der Erreger der Ornithose oder auch Papageienkrankheit. Die Häufigkeit der Ornithose in Deutschland ist mit 40 Fällen im Jahre 2002 laut Robert-Koch-Institut sehr
1 Einleitung 12 niedrig. Es handelt sich, um eine Zooanthroponose, die hauptsächlich bei Personen, die berufsbedingt oder in ihrer Freizeit mit Vögeln Kontakt haben, auftritt. Infizierte Vögel scheiden die Chlamydien mit respiratorischen Sekreten oder Fäkalien aus. Die Hauptmanifestation der Infektion ist eine atypische Pneumonie, die mit einer schweren systemischen Symptomatik einhergehen kann (37). Unbehandelt kann die Infektion tödlich verlaufen. Übertragungen von Mensch zu Mensch spielen praktisch keine Rolle. Der Erreger ist hoch kontagiös und wird nach der Biostoffverordnung in die Laborsicherheitsstufe 3 eingestuft (30). Seit dem 1.1.2001 mit in Krafttreten des Infektionsschutzgesetzes (IfSG) besteht namentliche Meldepflicht bei direkten oder indirekten labordiagnostischem Nachweis von C.psittaci. 1.3 Diagnostik von Chlamydia trachomatis Infektionen Angesichts der hohen Prävalenz von C.trachomatis Infektionen in der sexuell aktiven Bevölkerung sowie der Gefahr von chronisch aufsteigenden Infektionen mit schwerwiegenden Folgeerkrankungen, ist eine schnelle, sensitiven und spezifischen Labordiagnostik für diesen Erreger von erheblicher klinischer Relevanz für eine adäquate Therapie. Dabei stehen direkte und indirekte Nachweisverfahren zum Nachweis von urogenitalen C.trachomatis Infektionen zur Verfügung. 1.3.1 Direkte Nachweismethoden Bei den direkten Nachweisverfahren galt jahrelang der kulturelle Erregernachweis als Goldstandard (65). Im Laufe der Zeit wurde dieses Verfahren zunehmend durch sensitivere und besser standardisierbarere, kommerziell verfügbare Verfahren, die entweder auf einen Antigen- oder Nukleinsäurenachweis beruhen, abgelöst. Die Kultur wird insbesondere für forensische, wissenschaftliche und bestimmte klinische Fragestellungen z.B. Resistenzprüfungen bei unklarem Therapieversagen oder Neugeboreneninfektion durchgeführt. Das zu untersuchende Material wird auf Cycloheximid behandelte Epithelzellen gebracht und mit einem monoklonalen Fluorescein Isothiocyanat (FITC)-markierten murinen Antikörper, der sich in der Regel gegen das speziesspezifische Lipopolysaccharid (LPS)- Antigen richtet, gefärbt. Sofern sich viable, infektiöse Chlamydien Elementarkörper in der Probe befinden, werden diese nach frühsten 48 Stunden als grün-fluoreszierende Einschlusskörper sichtbar. Die Besonderheiten der Kultur liegen in der Empfindlichkeit des Erregers, der außerhalb seines natürlichen Habitats nur bedingt überleben kann. Die richtige Probenentnahme, ein
1 Einleitung 13 richtiger Probentransport in speziellen Transportmedien und Probenlagerung sowie eine richtige Probenkonservierung ist deshalb wichtig, um so die Erreger kulturell nachweisen zu können. Bei der Probenentnahme muss auf zellreiches Material mit möglichst wenig Begleitflora geachtet werden. Die Probe muss sofort nach der Entnahme in ein spezielles Transportmedium gebracht werden und gekühlt weitergeleitet werden. Als Probenmaterial eignen sich bei C.trachomatis Zervikalabstriche, Ureter-/Urethra-Abstriche oder Konjunktivalabstriche. Schließlich setzt dieses Verfahren ein hohes Maß an technischer und personeller Expertise voraus (8). Den Goldstandard für den Nachweis akuter C.trachomatis Infektionen stellen inzwischen die Nukleinsäureamplifikationsverfahren (NAT), deren Zielsequenzen auf dem ompA-Gen, dem kryptischen 7,5 kDa Plasmid oder der 23S-RNA von C.trachomatis liegen, dar. Dabei handelt es sich um Polymerase Chain Reaction (PCR), Ligase Chain Reaction (LCR), Strand Displacement Amplification (SDA) und Transcription-mediated Amplification (TMA) Verfahren. Die Ansprüche an Probentransport und Probenentnahme sind gering, da die Durchführung dieser Verfahren nicht unbedingt an die Präsenz viabler Erreger gebunden ist. Theoretisch lässt sich ein einzelnes Elementarkörperchen nachweisen. Ein weiterer Vorteil gegenüber der Kultur liegt in der um den Faktor 10 bis 1000fach erhöhten analytischen Sensitivität (8). Bei diesen Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren (NAT) wird ein kleiner Abschnitt der chlamydialen DNA innerhalb kurzer Zeit millionenfach vervielfältigt, um dann enzymatisch/photometrisch nachgewiesen zu werden. Als Materialien für die NAT eignen sich First catch urin (FCU) ein effizientes, bequemes und kosten-vorteilhaftes Screening- Material sowie so genannte self-collected vaginal swabs (34,64). Es scheint dabei keine Rolle zu spielen, ob die Patientinnen selbst oder der behandelnde Arzt den Abstrich entnehmen. Viele Studien beweisen die Zuverlässigkeit dieser Untersuchungsmaterialien beim Einsatz von NAT (18,45,67). Nachteilig ist der noch relativ kostenintensive und technische Aufwand. Auch birgt die hohe Sensitivität die Gefahr von Kreuzkontaminationen in sich, resultierend in falsch-positiven Ergebnissen. Umgekehrt können Enzyminhibitoren in den Proben zu falsch-negativen Ergebnissen führen. Es ist daher im besonderen Maße auf die Einhaltung interner und externer Qualitätskontrollen zu achten. Kommerzielle, standardisierte Tests sind bisher nur für C. pneumoniae verfügbar.
1 Einleitung 14 Ein bisher ungeklärtes Problem des PCR-Verfahren ist die Frage der DNA-Persistenz. Man geht davon aus, dass sich erregerspezifische DNA auch nach überstandener Infektion oder erfolgreich abgeschlossener Behandlung unter Umständen noch wochenlang nachweisen lässt (44). Somit eignen sich NATs nicht, eine Aussage zum Therapieverlauf zu machen. Ungeklärt ist auch inwieweit sich aufsteigende, chronische Infektionen durch nicht-invasive Probenentnahme mittels NAT nachweisen lassen. 1.3.2 Indirekte Nachweismethoden Bei der Diagnostik der Chlamydien Infektionen führt der direkte Erregernachweis häufig nicht zum Ziel. Eine zeitgemäße Chlamydiendiagnostik macht daher parallele serologische Untersuchungen unabdingbar. Die serologische Bestätigung einer Infektion verhindert falsch- negative Ergebnisse. Häufig sind die Keime bereits kurze Zeit nach der Infektion an den Eintrittspforten nicht mehr nachweisbar. Sie sind in tiefere Bereiche des Urogenital- oder Respirationstrakts vorgedrungen und entziehen sich so dem Direktnachweis. Die Erregernachweise werden falsch-negativ. Mit diesen so genannten serologischen Verfahren wird nachgewiesen, ob im Rahmen der Infektionsabwehr spezifische Antikörper gegen Chlamydien gebildet wurden. Die Bindung humaner Antikörper an erregerspezifische Antigene wird durch farbstoff-markierte Fluoreszenz beim Mikroimmunoflureszenstest (MIF) oder durch enzym-markierte Sekundärantikörper (Konjugate) wie bei Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) und Enzymimmunoassays (EIA) sichtbar gemacht. Generell ist die Serologie u. U. der einzige Zugang zur Erfassung persistierender Infektionen, bei denen der Antigennachweis versagt. Auch bei der Kontrolle einer antibiotischen Therapie liefert die Serologie wertvolle Informationen. So belegt ein deutlicher Abfall eines Antikörpertiters den Erfolg einer Behandlung. Bei den indirekten Nachweismethoden war früher die Komplementbindungsreaktion (KBR), die auf dem gattungsspezifischen LPS beruht, weit verbreitet. Die KBR eignet sich v.a. im Nachweis frischer Infektionen, d.h. zum Nachweis von IgM-Antikörpern. Bei einer Ornithose und akuten C.pneumoniae Infektionen kann es wegen Kreuzreaktionen aufgrund des gattungsgemeinsamen LPS-Antigens ebenfalls zum positiven Reaktionsausfall kommen. Dieses Verfahren wird deswegen trotz geringen Kosten heutzutage nur noch in seltenen Fällen bei Verdacht auf Ornithose genutzt (32). Gattungsspezifische ELISAs arbeiteten zunächst mit chlamydialen Vollantigenen, entweder in infizierten Zellen oder partiell aufgereinigt. Eine Differenzierung zwischen IgM-, IgA- und IgG-Antikörpern ist möglich. Es folgten Tests mit chemisch definierten, hochspezifischen
1 Einleitung 15
Antigenen an der festen Phase. Gute diagnostische Ergebnisse wurden und werden mit einem
ELISA erzielt (41), der unter Nutzung gentechnischer Verfahren rekombinant-hergestelltes
Chlamydien-spezifisches LPS als Antigen einsetzt (Chlamydien IgG-, IgA-, IgM- rELISA).
Die Unterscheidung speziesspezifischer Antikörper war dann zuerst mit dem
Mikroimmunfluoreszenztest möglich, der in den frühen 70er Jahren von Wang und Grayston
entwickelt wurde. Der Test gilt noch heute als „Goldstandard“ der Chlamydienserologie.
Aufgereinigte Elementarkörperchen der einzelnen Chlamydienspezies werden nebeneinander
auf einem Objektträger aufgetragen. Die Antigen-Antikörper Reaktion wird
fluoreszenzmikroskopisch sichtbar gemacht (Abb.4). Der MIF-Test kann sowohl IgG- als
auch IgM-Antikörper detektieren und daher bei der Unterscheidung zwischen kürzlich
durchgemachten oder länger zurückliegenden Infektionen hilfreich sein.
Entwickelt wurde der Test, um hauptsächlich C.trachomatis in Serotypen zu klassifizieren; er
ist inzwischen das serologische Verfahren der Wahl zum Nachweis einer C.trachomatis
Pneumonie bei Säuglingen, die mit einem erhöhten IgM-Antikörper Titer einhergeht (8). Die
Ergebnisse für andere Chlamydienspezies sind deshalb immer unter Vorbehalt zu
interpretieren (9,50).
Abb.4: MIF 40-fach erhöhter IgG-Antikörper Titer Abb.5: MIF unspezifische Reaktion
für C.pneumoniae, leuchtend grüne
Einschlusskörper
Der MIF-Test ist jedoch aufwändig, nicht automatisierbar und anfällig für subjektive Fehler.
Zusätzlich ist der Test nicht frei von Kreuzreaktivitäten. Die mikroskopische Testbeurteilung
erfordert ein äußerst geschultes Personal (Abb.4). Es stehen keine zusätzlich definierten
Kontrollseren zur Verfügung. Der Test ist lediglich semi-quantitativ. Bemühungen um eine
Standardisierung waren bisher wenig erfolgreich.1 Einleitung 16 Um die Probleme mit dem MIF-Test zu minimieren, wurden so genannte EIAs entwickelt. Sie ermöglichen einen mehr automatisierten Arbeitsablauf und dadurch ein objektiveres Ergebnis. Der Test basiert auf einem synthetisch hergestellten Peptid aus der variablen Domäne (VD) IV des C.trachomatis major outer membrane Protein (MOMP). Man hat herausgefunden, dass die VD IV C.trachomatis spezifisch für IgG- und IgA-Antikörper ist. Ein positiver Antikörpernachweis mittels EIAs kann einen serologischen Anhalt für eine aktive oder durchgemachte Infektion darstellen, es ist aber immer zusätzlich auf das klinische Bild, Anamnese und Alter des Patienten zu achten. Über die Dauer der Persistenz von C.trachomatis IgG-Antikörpern nach durchgemachter bzw. behandelter Infektion ist wenig bekannt. Man geht davon aus, dass sich spezifische IgG-Antikörper noch viele Monate nach Infektion nachweisen lassen (54). Der Test ist somit nicht zur Therapiekontrolle geeignet. 1.4 Zielsetzung dieser Arbeit Der C.trachomatis Infektionszeitpunkt ist mit serologischen Verfahren oft nur schwer bestimmbar, deswegen ist die Interpretation, ob die Antikörperantwort nur eine Folge einer früher durchgemachten und jetzt abgeheilten Infektion ist oder ob noch eine aktive Infektion besteht, schwierig. Dies gilt besonders für die Chlamydien Antikörper der Klasse IgG, deswegen geben die indirekten Nachweisverfahren keine genaue Sicherheit bei der Interpretation einer C.trachomatis Infektion. Eine weitere Möglichkeit, Chlamydien Antikörper speziesspezifisch zu differenzieren, bietet der Immunoblot. Zudem ermöglicht dieses Verfahren, das mit chromatographisch aufgetrennten chlamydialen Antigenen arbeitet, genauer zu bestimmen, gegen welche Antigene die Patientenantikörper im Einzelnen gerichtet sind. Die diagnostisch relevanten C.trachomatis Antigene/Proteine sind momentan zum Teil noch schlecht charakterisiert. Aus diesen Gründen wurde die vorliegende Studie zur Charakterisierung immundomianter Proteine mittels Immunoblot Verfahren bei chronischer C.trachomatis Infektion durchgeführt. Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Identifikation chlamydialer Proteine, die sich aufgrund ihrer Reaktivität und Speziesspezifität für den Einsatz in diagnostische Verfahren qualifizieren, um den zukünftigen Weg für einen sicheren Screening-Test zu ebnen. Für die Darstellung der immunreaktiven C.trachomatis Proteine wird als zweites Ziel ein Immunoblot-Verfahren etabliert. Aus diesem Verfahren kann man immundominante Chlamydienproteine bei Patienten mit chronischer C.trachomatis Infektion in Bezug auf ihr Molekulargewicht charakterisieren.
1 Einleitung 17 Das dritte Ziel lietg in dem Erkennen eines diagnostischen Musters bei Patientinnen mit einer komplizierten chronischen, d.h. aufsteigenden genitalen C.trachomatis Infektion. Es soll gezeigt werden, gegen welche Proteine bei einer chronisch aufsteigenden C.trachomatis Infektion Antikörper gebildet werden. Zusätzlich soll untersucht werden, ob sich dieses Bandenmuster eben nur bei chronischen C.trachomatis Infektionen erkennen lässt, nicht jedoch in anderen Kontrollgruppen (Patienten ohne Chlamydienkontakt, Patienten mit C.pneumoniae Infektion). Dadurch soll eine möglichst hohe diagnostische Spezifität und Sensitivität erreicht werden.
2 Material 18
2 Material
2.1 Chemikalien und Reagenzien
Chemikalien und Reagenzien Bezugsquelle
Ammoniumperoxidasesulfat (APS) Carl Roth GmbH, Karlsruhe, BRD
Aqua Spüllösung Select Delta-Pharm, Pfullingen, BRD
Bradford Protein Assay Quick Start Standard Set mit
Bovine Serum Albumin Bio-Rad Laboratories, USA
Ethanol Rotilabo Spritzflasche Carl Roth GmbH, Karlsruhe, BRD
Glyzin Carl Roth GmbH, Karlsruhe, BRD
High Range Rainbow Molecular Weight Marker Amersham Biosciences Europe
GmbH, Freiberg, BRD
Hydrogen Peroxid (Wasserstoffperoxid) Mallinckrodt Baker B.V., Deventer
Holland
Isopropanol Rotilabo Spritzflasche Carl Roth GmbH, Karlsruhe, BRD
Methanol 100 % Fluka BioChemika, Buchs,
Schweiz
Nonfat-dried milk Bovine Sigma-Aldrich-Chemie GmbH,
Steinheim, BRD
Polyoxyethylenesorbitan monolaurate (TWEEN 20) Sigma-Aldrich-Chemie GmbH,
Steinheim, BRD
Rotisilon C/D Carl Roth GmbH, Karlsruhe, BRD
SDS (Sodiumdodecylsulfat) Sigma Diagnostics, USA
Tetramethylethylenediamine TEMED Fluka BioChemika, Buchs,
Schweiz
Tris Puffer Sigma Diagnostics, USA2 Material 19
Trypsin/ EDTA Biochrom, Berlin, BRD
Tween 20 Merck KG, Darmstadt, BRD
2.2 Enzyme
3’3-Diaminobenzodine Tabletten a 10 mg, Sigma-Aldrich-Chemie GmbH, Steinheim,
BRD
2.3 Antikörper
Pathfinder-Antikörper: Fluoreszeinisothiocyanat gekoppelter monoklonaler Antikörper
gegen chlamydienspezifisches Lipopolysaccharid, Pathfinder Chlamydia Culture
Confirmation System, Bio-Rad Laboratories USA
Anti-Human IgG (γ-chain specific), Sigma-Aldrich-Chemie GmbH, Steinheim, BRD
2.4 Bakterienstämme und Zellen
Stamm-Bezeichnung Klinische Herkunft Bezugsquelle/ Referenz
C.trachomatis Zervixabstrich ATCC 887-VR
UW-31/Cx Serovar K Washington Research
Foundation, Seattle, USA
C.pneumoniae Konjunktivalabstrich ATCC 2282-VR
TW 183 Washington Research
Foundation, Seattle, USA
HeLa-Zellen 229 Zelllinie aus einem ATCC CCL2.1
Humanen Epitheloidzell- Rockville MD, USA
Carcinom Cervix uteri
2.5 Flüssigmedien
Zellkulturmedium: Quantum 101 HeLa-Zellkultur-Komplettmedium, PAA
Laboratories GmbH, Cölbe, BRD
Infektionsmedium
für C.trachomatis: Quantum 101 Komplettmedium mit 5 mg/ml Glucose, 40 μg/ml
Cycloheximid, 50 μg/ml Vancomycin, 20 μg/ml Gentamicin und
5 mM Hepes2 Material 20
2.6 Lösungen und Puffer
Anode1-Puffer 36,3 g Tris, 200 ml Methanol mit Aqua
bidest ad 1 Liter
Anode2-Puffer 3,03 g Tris, 200 ml Methanol mit Aqua
bidest ad 1 Liter
Kathode-Puffer 5,2 g 6-Aminohexansäure, 0,1 g SDS mit
Aqua bidest ad 1 Liter
Ladepuffer (2fach) 25 ml Sammelgelpuffer, 20 ml Glyzin, 4 g
SDS, 1 mg Bromphenolblau mit Aqua
bidest ad 1 Liter
Laufpuffer (10fach) 30,2 g Tris, 144 g Glyzin, 10 g SDS mit
Aqua bidest ad 1 Liter
Laufpuffer (1fach) 100 ml 10x Laufpuffer, 900 ml Aqua
bidest
PBS-Puffer 2 g KCl, 2 g KH2PO4, 80 g NaCl, 21,6 g
Na2HPO4 x 7 H2O, pH 7,2-7,4 einstellen,
mit Aqua bidest ad 1 Liter autoklavieren
Sammelgelpuffer 6,05g Tris, 40ml Aqua bidest, 0,4g SDS,
pH 6,8 mit Aqua bidest ad 1 Liter
SPG-Puffer 75 g Sucrose, 0,52 g KH2HPO4, 2,3 g
Na2HPO4 x 7 H2O
TBS (10fach) Puffer 88 g NaCl, 12 g Tris, 680 mg NaN3, pH 8
mit Aqua bidest ad 1 Liter
TBST (1fach) Puffer 100 ml 10x TBS, 900 ml Aqua bidest,
500 μl Tween 20
Trenngelpuffer 91 g Tris, 300 ml Aqua bidest, 2 g SDS,
pH 8,8 mit Aqua bidest ad 1 Liter2 Material 21
2.7 Geräte und Verbrauchsmaterialien
Geräte Bezugsquelle
Blotting Kammer Multiphor II Pharmacia, Ratingen, BRD
Brutschrank/ Inkubator Haereus, Hanau, BRD
Electrophoresis Power Supply-EPS 600 Pharmacia Hoefer, USA
Gel 14 x 12, 2 Spacer Mates, Glass Plates, Hoefer Scientific instruments, USA
clamps
Kühlschränke Haereus, Hanau, BRD
Liebherr, BRD
Lyophilisator vacuum concentrator Bachofer, USA
Mikroskope: Axioplan Zeiss, Oberkochen, BRD
ID 30 Zeiss, Oberkochen, BRD
Inverses-Fluoreszenz IMT-2 Olympus, Hamburg, BRD
Pipetboy plus INTEGRA Biosciences, Fernwald, BRD
Power Supply Model 200/2.0 Bio-Rad, USA
Roller Mixer SRT1 Stuart Scientific, Heidolph, UK
Sicherheitswerkbank, Klasse 2 Haereus, Hanau, BRD
Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg, BRD
Ultraschall ultra sonics Gen Probe, USA
Vortex Genie 2 Scientific Industries, USA
Waage AG 204 Mettler, Toledo, USA
Zentrifugen: Mini Spin Eppendorf, Hamburg, BRD
Varifuge 3.0R Haereus, Hanau, BRD
Biofuge 13 Haereus, Hanau, BRD2 Material 22
Avanti Centrifuge J-25 Beckmann Instruments GmbH, München,
BRD
Verbrauchsmaterialien Bezugsquelle
Blue Max (Bluecap-Behältnisse) 15 ml, 50 ml Falcon, Becton Dickison Labware,
Heidelberg, BRD
Chromatographiepapier
(Electrode Paper Novablot) Amersham Biosciences, Schweden
Einmal-Pipetten 5 ml, 10 ml, 25 ml Corning-Costar, Bodenheim, BRD
Eppendorf 1,5 ml Eppendorf, Deutschland
Immobilon-P Transfermembranes Milipore Corporation, USA
Zellkulturflasche 50 ml mit Schräghals, blauer Falcon, Becton Dickison Labware,
Gasaustauschkappe Heidelberg, BRD
Zellkulturplatte, 6 Vertiefungen, Flachboden Falcon, Becton Dickison Labware,
mit Deckel Heidelberg, BRD3 Methoden 23 3 Methoden 3.1 Zellkultur Als Antigen für die Durchführung der Immunoblot Untersuchungen sollen aufgereinigte Chlamydien Elementarkörper Präparationen eingesetzt werden. Dafür müssen zunächst die Bakterien in ausreichenden Mengen angezüchtet werden. Die Kultivierung von C.trachomatis und C.pneumoniae erfolgt in HeLa 229-Zellen. Die Arbeiten werden alle unter einer Klasse II Sicherheitswerkbank unter Laminar Air Flow Bedingungen verrichtet. 3.1.1 Kultur der Wirtszellen Die HeLa 229-Zellinie ist eine permanente, adhärente Zellinie, die ursprünglich aus dem Zervixkarzinom einer 31 Jahre alten Amerikanerin isoliert wurde. Die HeLa 229-Zellen werden unter möglichst keimarmen Bedingungen als Monolayer- Kulturen kultiviert. Zweimal pro Woche werden sie zur Subkultivierung passagiert, d.h. die Zellen werden mit Hilfe von 5 ml Trypsin/EDTA-Lösung für 3-5 Minuten bei 37 °C vom Boden des Kulturgefäßes abgelöst. Die gelösten Zellen werden in neues Medium aufgenommen und bei 1000 rpm (ca. 200 xg) für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, das Pellet mit neuem Medium resuspendiert und in ein neues Kulturgefäß überführt. Die restliche Zellsuspension wird 1:60 mit Kulturmedium verdünnt und auf eine 6-Lochplatte verteilt. Nach 3 Tagen Inkubation bildet sich auch hier ein konfluenter Zellrasen, der dann mit Chlamydien infiziert werden kann. Die HeLa 229-Zellen werden in einer Konzentration von 105 Zellen/ml in ihr Kulturmedium eingesät, pro Kulturflasche werden 30 ml Kulturmedium verwendet. Ein Teil der HeLa-Zellen wird als reine Zellsuspension bei -20 °C eingefroren, um später zelluläre Proteine von Chlamydienproteinen als Kontrolle beim Immunoblot unterscheiden zu können. 3.1.2 Kultur von Chlamydien Zur Vorbereitung einer Chlamydienkultur ist es erforderlich, die Zelldichte so einzustellen, dass am Tag der Chlamydieninokulation ein dichter Zellrasen (Monolayer) vorliegt. Nach lichtmikroskopischer Kontrolle, ob ein konfluenter Zellrasen in einer 6-Lochplatte vorliegt, werden 3 ml einer Chlamydien-Stocksuspension (Konzentration: ca. 108-109 Inclusion forming units (IFU)) in je eine Vertiefung pipettiert. Die Lochplatte wird 1 h bei
3 Methoden 24
1000 rpm zentrifugiert, anschließend für 1 h bei 37 °C im Brutschrank inkubiert und danach
das Medium gewechselt.
Das Chlamydienkultur-Infektionsmedium ist ein Flüssigmedium, das zur Optimierung der
Anzucht von Chlamydien auf HeLa-Zellen verwendet wird. Es enthält 3 ml Vancomycin,
3 ml Gentamycin, 7,5 ml Amphotericin B, 1 ml Cycloheximid, 2,5 ml Glucose und 2,5 ml
HEPES-Puffer in 500 ml Quantum 101-Medium. Das Cycloheximid soll den Metabolismus
der Wirtszelle inhibitorisch beeinflussen und das Wachstum der Chlamydien verbessern. Die
Antibiotikazugabe schützt vor Kontamination durch Pilze und andere Bakterien.
Nach 48 Stunden bei C.trachomatis und 72 Stunden bei C.pneumoniae wird, abhängig von
der Konzentration des Inokulums, eine Infektionsrate von 90 % erreicht. Die Kontrolle der
Infektionsrate wird anhand einer in der Zellkulturflasche mitgeführten Deckglaskultur
bestimmt. Das Deckglas wird mit einem FITC-konjugiertem monoklonalen Antikörper, der
gegen das Chlamydien LPS gerichtet ist, angefärbt. Die Chlamydien Einschlusskörper
erscheinen unter Fluoreszenz grün-leuchtend. Die Zellen werden zur besseren Darstellung des
Hintergrundes mit dem Farbstoff Evans blue gegengeführt und erscheinen rot im
Fluoreszenzmikroskop (Abb.6).
Abb.6: Chlamydien-Einschlusskörper in unterschiedlicher Größe in
HeLa 229-Zellen; 48 Stunden pi; Vergrößerung 600x3 Methoden 25
Der infizierte Zellrasen wird mit einem Zellschaber abgelöst und die Chlamydien durch 2
minütiges durchmischen mit sterilen Glasperlen auf einem Vortexer aus den HeLa-Zellen
freigesetzt. Das Chlamydiengemisch mit den Glasperlen wird bei -70 °C bis zur weiteren
Aufbereitung gelagert.
3.1.3 Reinigung der Chlamydien
Um für die Elektrophorese eine möglichst reine Chlamydien Elementarkörper Suspension
(Abb.7) zu erhalten, müssen durch verschiedene Zentrifugationsschritte HeLa-Zelltrümmern
entfernt werden. Durch Ultraschallbehandlung werden ca. 800 - 1200 ml einer Suspension
Chlamydien infizierter HeLa-Zellen 3 mal 10 Sekunden aufgebrochen, um dadurch die
intrazelluläre Chlamydien freizusetzen. Der Zelldetritus wird anschließend 10 min
abzentrifugiert bei 2000 rpm und 4 °C. Der Überstand wird weiter 90 min bei 10.000 rpm
zentrifugiert, um die darin enthaltenen EK zu pelletieren. Dadurch setzen sich die Chlamydien
im Pellet ab. Dieses gewonnene Pellet wird mit SPG-Puffer resuspendiert. Nach einem
weiteren Zentrifugationsschritt bei 10.000 rpm und Resuspension des Pellets mit SPG-Puffer
werden die gereinigten Chlamydien Elementarkörperchen in 1,5 ml Eppendorf Behältnisse
aliquotiert und bei -70 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert..
Abb.7: Chlamydien Elementarkörperchen nach Reinigung
Darstellung mit FITC-konjugierten anti-LPS Antikörper
Vergrößerung: 630x3 Methoden 26 3.2 Bestimmung der Chlamydien-Konzentration Um später bei der elektrophoretischen Auftrennung der Antigene sowohl von C.trachomatis, C.pneumoniae und HeLa-Zellen jeweils in gleicher Proteinmenge (10 μg) auf das Gel aufzutragen, wird zuerst in den Suspensionen die Proteinkonzentration bestimmt. Dafür wird der Bradford-Test, wegen seiner Unempfindlichkeit gegenüber störenden Ionen und Reduktionsmitteln, eingesetzt. Bei der Bindung von Coomassie brilliant blue G-250 an Proteine im sauren Milieu verschiebt sich das Absorptionsmaximum des Stoffes (465 nm ohne Protein, 595 nm mit Protein). Die Zunahme der Absorption bei 595 nm ist ein Maß für die Proteinkonzentration der Lösung. Die fertige Stammlösung bestehend aus Farbstoff, Ethanol und Phosphorsäure wird 1:5 mit Aqua bidest verdünnt, jeweils 1000 μl in die Küvetten abgefüllt und 20 μl Probenlösung oder Standardlösung hinzu pipettiert. Nach 10 min bei Raumtemperatur wird die Absorption bei 595 nm mit dem Spektralphotometer gemessen. Um anhand der gemessenen Absorptionswerte die Proteinmenge zu bestimmen, werden die Werte mit einer Eichgerade verglichen. 3.3 Lyophilisieren von Zellen Trotz Reinigung der EK-Suspension mittels Ultraschallbehandlung enthält die Suspension noch einen geringen Anteil an eukaryonte Wirtszellproteine, deshalb nutzt man lyophilisierte d.h. gefrier-getrocknete Zellen. Durch diese Methode werden kreuzreagierende Antikörper gegen eukaryonte Zellbestandteile aus den Patientenseren entfernt und chlamydienspezifische Antikörperreaktionen können elektrophoretisch sichtbar gemacht werden. Zur Herstellung lyophilisierter Zellpräparationen werden aus einer mit einem konfluenten HeLa-Monolayer bedeckte Zellkulturflasche durch Hinzugeben eines PBS-Puffer der Zellrasen gelöst und mit einem Zellschaber vollständig entfernt. Die Zellen werden bei 4 °C 5 min bei 3000 rpm zentrifugiert, das entstandene Pellet resuspendiert und der Zentrifugationsschritt wiederholt. Das gewonnene Pellet wird dann gewogen und pro Gramm Pellet 2 ml 0,1 M NaCl und die 4 fache Menge an eisgekühltem Aceton dazugegeben. Die Menge wird notiert und die Mischung 1 h auf Eis gekühlt. Danach wird die Suspension gemischt und jeweils 350 μl in einen Eppendorf Behältnis pipettiert. Diese Behältnisse werden für 5 min bei 4 °C bei 13000 rpm zentrifugiert, der Überstand mit einer Pumpe abgesaugt und mit der notierten Menge Aceton aufgefüllt. Damit sich das Pellet im Aceton lösen kann, wird es für 5 sek im Ultraschallbad behandelt. Nach 10 minütiger Lagerung auf
3 Methoden 27
Eis, wird noch einmal für 5 min bei 13000 rpm und 4 °C zentrifugiert, der Überstand
abgesaugt und die Pellets für 1 h in den Lyophilisator, der die letzte Flüssigkeit aus den Zellen
entzieht, gestellt. Die lyophilisierten Zellen werden bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C
gelagert.
3.4 Immunoblot
Beim Immunoblot werden Proteingemische, die durch Gelelektrophorese in separate Banden
aufgetrennt werden, auf eine Membran transferiert und dort mit Hilfe von Primär- und
Konjugat-gekoppelten Sekundärantikörpern nach Substratzugabe durch enzymatische
Reaktionen sichtbargemacht.
3.4.1 Herstellung der Gele
Zur Trennung der Proteinproben werden zunächst Acrylamid haltige Gele gegossen. Es wird
mit einem 10 % igen (Prozentzahlen richten sich nach der Acrylamidmenge) Trenngel, in dem
die Proteine elektrophoretisch aufgetrennt werden und ein Sammelgel mit Taschen, um die
Proben einzufüllen, gearbeitet (Abb.8).
Abb.8: Trenn- und Sammelgel für Immunoblot
Das Trenngel wird aus 10 ml Acrylamid 30 %, 7,5 ml Trenngelpuffer, 12,5 ml Aqua bidest,
1 ml 10 % APS und 0,02 ml TEMED hergestellt. Das Sammelgel enthielt 1,3 ml Acrylamid
30 %, 2,5 ml Sammelgelpuffer, 6,1 ml Aqua bidest, 0,05 ml APS 10 % und 0,01 ml TEMED.
Das Gel wird zur vollständigen Härtung 24 h bei Raumtemperatur stehen gelassen.3 Methoden 28 3.4.2 Probenvorbereitung und Füllschema Aus der Proteinbestimmung nach Bradford ergab sich eine Menge von 9 μl HeLa-Zellen, von 12 μl C.pneumoniae und von 18 μl C.trachomatis, die dieselbe Menge an Protein (10 μg) enthalten. Damit die Chlamydiensuspensionen und die HeLa-Zellsuspension optimal im Gel aufgetrennt werden, wird zu jeder Probe die gleiche Menge an Probenpuffer pipettiert, daraus ergeben sich folgende Mengen: 18 μl HeLa-Zellen, 20 μl Rainbowmarker, 24 μl C.pneumoniae-Lösung und 36 μl C.trachomatis-Lösung. Die Proben werden zunächst bei 95 °C gekocht und dann 1 min bei 13.400 rpm zentrifugiert. Danach können die Proben aufgetragen werden, dabei wird folgendes Schema eingehalten: die ersten beiden Taschen enthielten nur Probenpuffer, die nächste HeLa-Zellen, dann C.trachomatis, C.pneumoniae, Rainbowmarker, HeLa-Zellen, C.trachomatis, C.pneumoniae, Rainbowmarker, HeLa-Zellen, C.trachomatis, C.pneumoniae und die letzten beiden Taschen wieder nur Probenpuffer. Mit diesem Laufschema lassen sich pro Gel jeweils 3 Patientenseren untersuchen. Neben den aufzutrennenden Proben wird ein vorgefärbter Molekulargewichtsmarker (Rainbowmarker) in das Trenngel gefüllt. Dieser Marker gewährleistet eine schnelle, abschätzende Molekulargewichtsbestimmung der auftretenden Proteinbanden. Dieser Marker zeigt bei 220 kDa, 97 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 30 kDa, 20,1 kDa und 14,3 kDa farbige Banden mit dem angegebenen Molekulargewicht an. 3.4.3 Elektrophorese Nachdem die Proben in die Geltaschen gefüllt wurden, kann die elektrophoretische Auftrennung beginnen. Zunächst wird das Gerät auf 180 V und 24 Watt eingestellt und läuft für 30 min. Diese Einstellung garantiert, dass die Proben gleichmäßig aus den Taschen in das Sammelgel fließen können. Nachdem alle Proben im Sammelgel erkennbar sind, kann das Gerät auf 600 V und 48 Watt hochgestellt werden. Die Auftrennung der Proben kann mit Hilfe der Lauffront (durch blaue Pufferfärbung) nachvollzogen werden. 3.4.4 Semi-dry Elektroblotting Der Transfer der aufgetrennten Proteine aus dem Gel auf eine Membran erfolgt nach dem “Semi-Dry-Verfahren“. Dazu werden Chromatographiepapier und Membran in einem Blotting-Puffer mindestens 10 min äqulibriert und mit dem Polyacrylamidgel folgendermaßen geschichtet: Die Membran wird anodisch auf zwei Lagen Chromatographiepapier gelegt, darauf folgt das Polyacrylamidgel, zwei weitere Lagen Chromatographiepapier und abschließend als oberste Schicht die Kathode (Abb.9). Die Blotdauer betrug 1,3 h bei 20 V.
3 Methoden 29
Im Anschluß wird die Membran mit Magermilch in TBST-Puffer zur Absättigung der freien
Bindungsstellen 2 h inkubiert.
Es wird die Immobilon-P Transfermembranes der Firma Milipore verwendet, die eine hohe
Bindekapazität für Proteine hat.
Abb.9: Schematische Darstellung des Aufbaus einer Blotting-Kammer
Nach der Absättigung mit Magermilch und einem Waschgang mit TBST-Puffer wird die
Membran in 3 Streifen geschnitten, die jeweils eine Spur von aufgetrennten
C.trachomatis Vollzell-Lysatproteinen, C.pneumoniae Vollzell-Lysatproteinen, HeLa-
Vollzell-Lysatproteinen und ein sichtbarer Teil des Rainbowmarkers enthalten. Die Membran
wird in verschiedene Glasschalen getrennt, damit auf jeden Streifen ein Patientenserum
aufgetragen werden kann.
3.4.5 Vorbereitung der Patientenseren
Bevor das Patientenserum mit den aufgetrennten Proteinen auf der Membran reagieren kann,
werden die Seren 24 h bei 4 °C mit lyophilisierten Zellen präabsorbiert, damit
Antikörperreaktionen, die nicht gegen Chlamydienproteine sondern gegen eukaryonte
Proteine gerichtet sind, entfernt werden können. Die Patientenseren mit den lyophilisierten
Zellen werden bei 20.000 rpm 5 min abzentrifugiert und 100 μl des Patientenserum ohne
lyophilisierte Zellen mit 10 ml TBST verdünnt (Verdünnung 1:100). Dann kann jeweils ein
Membranstreifen mit einem Patientenserum (1.Antikörper) für 24 h bei 4 °C inkubieren.
3.4.6 Färben der Blotting-Membran
Nach der Inkubation des 1. Antikörpers für 24 Stunden, wird der flüssige Überstand
verworfen und der Membranstreifen 3 mal 10 min mit TBST-Puffer gewaschen. Danach wird
der 2. Antikörper humanes IgG-Konjugat (50 μl IgG in 100 ml TBST-Puffer) jeweils 15 mlSie können auch lesen
