Massenspektrometrie in der Proteinanalytik (Proteomik) - Proteomik Was versteht man unter Proteomik?
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- Massenspektrometrie in der Proteinanalytik (Proteomik) -
Proteomik
§ Was versteht man unter Proteomik?
§ Massenspektrometrie basierte Proteinanalytik
-2-
Current state of the art!
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3
http://phdcomics.com/noidea/
Was versteht man unter Proteomik/„Proteomics“?
Proteom:
§ The PROTEin complement of the genOME
(Mark Wilkins, 1994)
§ Die Gesamtheit aller Proteine in einem Lebewesen, einem
Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment, unter exakt
definierten Bedingungen und zu einem bestimmten Zeitpunkt
Proteomik:
§ The study of proteomes
(Mark Wilkins, Denis Hochstrasser, Ron Appel, 1996)
§ Die Erforschung von Proteinen und Proteinmodifikationen, der
Proteinexpression, dem Einfluss von Proteinen auf metabolische
Prozesse, Protein-Protein-Interaktionen
-4-
Projekte zur Entschlüsselung des humanen Proteoms
- ein Meilenstein in der Massenspektrometrie-basierten Proteinanalytik -
§ Veröffentlichung erster Entwürfe des humanen Proteoms im Jahr 2014
§ Erstmaliger, massenspektrometrischer Nachweis der Genprodukte für insgesamt 84% (Kim et al.) bzw.
92% (Wilhelm et al.) der annotierten, Protein-kodierenden Gene im menschlichen Genom
M-S Kim et al. Nature 509, 575-581 (2014) doi:10.1038/nature13302 M Wilhelm et al. Nature 509, 582-587 (2014) doi:10.1038/nature13319
Vom Genom zum Proteom
Das Dogma „ein Gen – ein Protein“ gilt schon länger nicht mehr
Mensch: rund 20,350 Gene, 1 Million mögliche Proteinformen?
-6-
Vom Genom zum Proteom
§ Ein Gen à verschiedene Proteine
§ Selbes Genom… unterschiedliches Proteom
http://www.bund-nrw-naturschutzstiftung.de/schmetterlinge_des_jahres/schmetterling_des_jahres_2009_tagpfauenauge/
-7-
Hauptanwendungen der Proteomik
§ Suche nach Proteinen, deren Auftreten oder Fehlen mit Krankheiten korreliert (z.B. bei Krebs)
§ Proteine als diagnostische Marker oder als Angriffspunkte für die Entwicklung von Therapeutika
§ Aufklärung von biologischen Wirkmechanismen
àIdentifizierung von Proteinen in Reaktionsketten
§ Erfassung von Medikamentennebenwirkungen Früherkennung durch Proteomanalyse
gesunder Probant kranker Probant
-8-
Proteinanalyse mittels Massenspektrometrie
Bottom-up Proteomics (kurze Peptide: 0.7 kDa < Mw < 3.0 kDa)
Protein Peptide Massenspektrometrie
(meist tryptisch)
m/z
Middle-down: Analyse von Peptiden „mittlerer“ Länge (3.0 kDa < Mw < 10 kDa)
Top-down: Analyse von intakten Proteinen inkl. Fragmentierung (z.B. 10 kDa < Mw < 30 kDa)
-9-
Proteinanalyse mittels Massenspektrometrie
Protein Proteolytic peptides Separation of peptides
(normally tryptic) by liquid chromatography
Ionization
Protein and peptide
identification by MS
database search
MS/MS
Analysis of peptide ions
by mass spectrometry
-10-
Verdauprotokolle zur Identifikation und Charakterisierung
von Proteinen
§ „Klassischer“ In-Gel-Verdau
§ „Klassischer“ In-Lösung-Verdau
Lysate preparation In-solution Digestion Peptide Enrichment/
Clean-up
LC-MS Analysis
- Reduction
- Alkylation
- Digestion
11Verdauprotokolle zur Identifikation und Charakterisierung
von Proteinen
Problem: Viele Schnittstellen im nativen Protein für Proteasen nicht zugänglich….
Lösung: Reduktion und Alkylierung
-12-Reduktion und Alkylierung erleichtert den Zugang zu
Schnittstellen
Denaturierung
Reduktion
Alkylierung
13Spezifitäten verschiedener Endoproteinasen
-14-Aufreinigen der Peptide und MS-Analyse
Entsalzung mit C18 Material LC-MS Analyse
mAU
MS
min
MS
MS/MS
-15-Verdauprotokolle zur Identifikation und Charakterisierung
von Proteinen
???
Reduction,
Alkylation,
Clean-up
Proteolytic Digest
Elution
Wiesniewski et al., Nat Methods 6, 359-362 (2009)
Doellinger et al., MCP
19(1), 209-222 (2020)
Hughes et al., Mol Sys Biol 10, 757 (2014)
Kulak et al., Nat Methods 11, 319-324 (2014)
16Verdauprotokolle zur Identifikation und Charakterisierung
von Proteinen
Pubmed Suche “sample preparation + proteomics + mass spectrometry”: 2.491 Hits
Reduction,
Alkylation,
Clean-up
Proteolytic Digest
Elution
Wiesniewski et al., Nat Methods 6, 359-362 (2009)
Kulak et al., Nat Methods 11, 319-324 (2014)
Hughes et al., Mol Sys Biol 10, 757 (2014)
17Verdauprotokolle zur Identifikation und Charakterisierung
von Proteinen
1 µg
FASP LC-MS
2 µg
3x
5 µg
SP3
10 µg
HeLa lysate
Urea/iST lysis buffer
20 µg
iST
-18-Verdauprotokolle zur Identifikation und Charakterisierung
von Proteinen
Proteins Peptides
5,000
FASP SP3 iST 40,000 FASP SP3 iST
4,000
No. of identified proteins
No. of identified peptides
30,000
3,000
20,000
2,000
10,000
1,000
0 0
20 10 5 2 1 20 10 5 2 1 20 10 5 2 1 20 10 5 2 1 20 10 5 2 1 20 10 5 2 1
HeLa protein amount [µg] HeLa protein amount [µg]
20µg 1µg
§ 20 µg – 5 µg: mit iST lassen sich die meisten
Proteine/Peptide identifizieren
§ 2 µg – 1 µg: SP3 und iST zeigen ähnliche
Performance
-19-Verdauprotokolle zur Identifikation von Proteinen
- Analyse von Zellen nach Isolierung mittels FACS -
A 25,000 BMDMs
4,000 25,000 80 FASP SP3 iST
Peptides
Proteins
Coefficient of variation [%]
No. of identified peptides
No. of identified proteins
20,000
3,000 60
15,000
2,000 40
10,000
1,000 20
5,000
0 0 0
FASP SP3 iST w/o N N w/o N N w/o N N
B TAMs Peptides C M1-like (FcR-mediated)
4,000 Proteins 25,000 phagocytosis
IL1RA
CXCL10
No. of identified peptides
20,000
No. of identified proteins
Arginase-1
3,000
Antigen
presentation Secreted protein Ym1
15,000 (+ proteasome)
2,000 MMGL
CD206
10,000 Macrophage scavenger
receptor types I and II
1,000
5,000 Matrix TGF-beta-1
Noy and Pollard, Immunity 41 (2014) metalloproteases
0 0 Cathepsins M2-like
Biol. repl. 1 Biol. repl. 2 Biol. repl. 3
30,000 cells 22,000 cells 30,000 cells
D
• SP3 combined with LC-IMS-MS allows the identification and quantification of around
3,000 proteins from TAMs isolated from murine tumors by FACS
Sielaff et al., J Proteome Res 16, 4060-4072 (2017) 20Proteinidentifikation mittels Massenspektrometrie
Protein A Protein B
Proteolytischer Verdau (Trypsin)
???
21Tryptischer Verdau
485 Da 378 Da 312 Da 536 Da 257 Da
22Tandemmassenspektrometrie (MS/MS)
• Ziel: Sequenzinformation des Peptids
• MS (MS1) à m/z des intakten Peptids
MS/MS à Zerlegung des Peptids in kleinere Fragmente, um seine Primärstruktur
zu bestimmen
23Was versteht man unter Tandemmassenspektrometrie (MS/MS)?
§ MS/MS: Verwendung zweier Masseanalysatoren (kombiniert in einem Instrument;
Tandem-Massenspektrometer) zur Isolierung von Ionen, Fragmentierung und Detektion von
Fragmentionen
Ionengemisch Isoliertes Ion Fragmente
Ionen-
MS-1 Kollisions MS-2
quelle
-zelle
Flugzeitanalysator
Kollisionszelle
Massenanalysator
Quadrupol
24Was versteht man unter MS/MS?
[Glu1] - Fibrinopeptide B
EGVNDNEEGFFSAR
1. Messung m/z Vorläuferionen 2. Messung m/z der Fragmente
M2+
Selection
Fragmentation
m/z m/z
25Tryptischer Verdau
- Terminologie -
26Identifikation der Peptide mittels Fragmentation
Glücklicherweise fragmentieren Peptide an vorhersehbaren Stellen entlang des
Peptidrückgrats
27Identifikation der Peptide mittels Fragmentation
§ Schema der Fragmentierung von Peptiden (Nomenklatur nach Roepstorff und Fohlmann)
§ Nach der Separation mittels LC werden Peptidionen selektiert und fragmentiert
28Wie errechnet sich die Masse eines Peptides?
- Masse aller AS-Reste plus Wasser und Proton(en)
29Identifikation der Peptide mittels Fragmentation
Atrophin-1 according to Roepstorff P, Fohlman J., Biomed Mass Spectrom 11, 601 (1984)
30Identifikation der Peptide mittels Fragmentation
Atrophin-1
31Datenabhängige Akquisition (D(ata) D(irected) A(nalysis))
mittels MSMS
32Datenabhängige Akquisition (D(ata) D(irected) A(nalysis))
mittels MSMS
33Datenabhängige Akquisition (D(ata) D(irected) A(nalysis))
mittels MSMS
34Datenabhängige Akquisition (D(ata) D(irected) A(nalysis))
mittels MSMS
35Identifikation der Peptide mittels MS/MS und
Datenbanksuche
-36-Identifikation der Peptide mittels MS/MS und
Datenbanksuche
37Identifikation der Proteine mittels gefundener Peptide
MS/MS
MS
Abgleich der Fragmentionenspektren
(Peptidinformation) mit der
MS/MS
MS
(Protein)datenbank (in silico-Verdau)
38Proteinanalyse mittels Massenspektrometrie
Samples Proteolytic peptides Separation of peptides
(normally tryptic) by liquid chromatography
healthy
healthy disease disease
Ionization
Protein and peptide
identification by
MS
database search
MS/MS
Analysis of peptide ions
by mass spectrometry
-39-Welche Informationen liefert die Proteomanalytik?
ppm
Protein X
XP_001687515 12000
XP_001681772
XP_001681156
XP_001686933
XP_001684564
XP_848004 10000
XP_001685107
XP_001682546
XP_001682249
XP_001683283
XP_001686588 8000
XP_001686589
XP_001684904
XP_001684903
XP_001687745
XP_001684202 6000
XP_001687217
XP_001684851
XP_001687716
XP_001685762
XP_001685766 4000
XP_001686778
XP_848137
XP_848136
XP_001684402
XP_001682015
2000
XP_001683872
XP_001683873
XP_001684985
XP_001686361
XP_001685287
0
XP_001685619
XP_001683861
1
2
3
4
5
k1
k2
k3
k4
k5
nd
nd
nd
nd
nd
XP_001682258
an
an
an
an
an
XP_001683399
su
su
su
su
su
kr
kr
kr
kr
kr
XP_001682260
ge
ge
ge
ge
ge
XP_001682018
XP_001685995
XP_001685176
XP_001686777
XP_001687216
XP_001685627
XP_001682598
XP_001682597
XP_843114
XP_001682028
XP_001682024
XP_001686392
XP_847842
à Art und Menge der in einer Probe enthaltenen Proteine
XP_847843
XP_847841
XP_001682560
XP_001682561
XP_843113
XP_001683224
à Pro Messung werden bis zu 5.000-10.000 Proteine identifiziert
XP_001686005
XP_001683437
XP_001682681
XP_001684978
XP_001682682
à Unterscheidung zwischen verschiedenen Proben
XP_001681307
XP_001683724
XP_001685029
XP_001682582
XP_001682581
XP_001682580
XP_001684128
XP_001684680
XP_001685090
-40-
XP_001686874
XP_001682475
XP_001687173
XP_001682476
XP_001686709
XP_001681361Sie können auch lesen
