Maus-Genetik: Ein Update und Reminder - Thomas Rülicke Recommendations for health monitoring of rodent and rabbit colonies (FELASA 2014)
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Veterinärmedizinische Universität Wien
(Vetmeduni Vienna)
Maus-Genetik:
Ein Update und Reminder
Thomas Rülicke
Veterinärmedizinische Universität Wien
Recommendations for health monitoring of
rodent and rabbit colonies (FELASA 2014)
2
25.02.2019 1
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(Vetmeduni Vienna)
Reproducibility in Science
Improving the Standard for Basic and Preclinical Research
C. Glenn Begley and John P.A. Ioannidis
Circulation Research. 2015;116:116–126
“… estimates for irreproducibility based on empirical observations range
from 75% to 90%.”
“To a large extent, this reproducibility crisis in basic and preclinical
research may be as a result of failure to adhere to good scientific
practice and the desperation to publish or perish.”
“….standard scientific methodology (blinding, repeating experiments,
inclusion of positive and negative controls, use of validated reagents,
etc.), may stifle the creative, innovative act of discovery.”
3
Prüfschritte zur ethischen Beurteilung
von Tierversuchen
a. Legitimität = Zulässigkeit
b. Eignung
Ist der Versuchsaufbau und die Auswertung geeignet, den
Zweck des Versuches zu bewirken oder zumindest zu fördern?
c. Erforderlichkeit
d. Angemessenheit
25.02.2019 2
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Neue Wissenschaftskultur
Transparenz + Reproduzierbarkeit
1. Standards für Reporting
The ARRIVE Guidelines
Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments
5
Nomenklatur von Labornagern
Mouse Nomenclature Home Page
http://www.informatics.jax.org/mgihome/nomen/
Rat Genome and International Committee
Nomenclature Committee on Standardized Genetic
Nomenclature for Mice
2003
unified rules and guidelines for gene, allele and mutation
nomenclature
in
mouse and rat
Revision January 2016
25.02.2019 3
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Nomenklatur von Labormäusen
Inzucht C57BL/6JOlaHsd (Slash/Substamm)
B6
(Abkürzung)
Stammbezeichnung Laborcode des Züchters
Auszucht Crl:CD1(ICR) (Doppelpunkt)
Abstammung der Labornager
Ordnung Unterordnung Familie Gattung Art
Mus musculus
Mus Maus
domesticus
musculus
Muridae castaneus
Langschwänze R. norvegicus
Wanderratte
Rattus
Myomorpha R. Rattus
Mäuseverwandte Hausratte / Dachratte
Rodentia Cricetidae Mesocricetus M. auratus
(lat. rodere Wühler
Goldhamster
= nagen)
Meriones
M. unguiculatus
Gerbil
Histricomorpha Caviidea Cavia C. porcellus
Meerschweinchen
25.02.2019 4
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(Vetmeduni Vienna)
Die Maus als Labortier
Labormäuse und -ratten werden gezüchtet als:
Auszuchtstamm
Inzuchtstamm
klassischer Inzuchtstamm
coisogener Inzuchtstamm
congener Inzuchtstamm
consomer Inzuchtstamm
rekombinater Inzuchtstamm
rekombinant congener Inzuchtstamm
segregierender Inzuchtstamm
conplastischer Stamm
Hybridstamm
Auszuchtstamm
- Geschlossene Population, in der durch geeignete Massnahmen der
Inzuchtzuwachs gering und eine definierte (stammspezifische)
Merkmalsvariabilität konstant aufrechterhalten werden.
- Vermeidung von Selektion, Sublinienbildung und
genetischer Drift durch spezielle Zuchtsysteme.
- maximale Heterozygotie
-Beispiele: Crl:NMRI(Han), Naval Medical Research Institute 1937
Crl:CD1(ICR) Fox Chase Cancer Center 1948
25.02.2019 5
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Diversity Outbred (DO) Stock
11
Diversity Outbred (DO) Stock
The Collaborative Cross:
Mus m. domesticus
M.m. musculus
M.m. castaneus
25.02.2019 6
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Inzuchtstämme bei Maus (420) und Ratte (230)
Inzuchtstamm
FI nach
Generation I fortlaufender
BxS Paarung
• Isogene Linie
• Der Inzuchtkoeffizient FI drückt aus,
mit welcher Wahrscheinlichkeit ein
Proband an einem beliebigen Genort
beide Allele vom gleichen Vorfahren
geerbt hat.
n1 = Anzahl der Generationen vom Vater zum
gemeinsamen Ahnen
n2 = Anzahl der Generationen von der Mutter
zum gemeinsamen Ahnen
Fai = Inzuchtkoeffizient des gemeinsamen Ahnen
25.02.2019 7
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Mouse Genomes Project
Referenzstamm: C57BL/6J
15
Ancestral haplotype map for an
18-Mb region on chromosome 4
grün=castaneus, (blau=molossinus), rot=musculus) and (gelb=domesticus)
Nature (2007) 448, 1050-1053
25.02.2019 8
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The Collaborative Cross:
a powerful systems genetics tool
Mus m. domesticus
M.m. musculus
M.m. castaneus
A/J
C57BL/6J
}
129S1/SvImJ ca. 90% der
NOD/ShiLtJ genetischen
NZO/HiLtJ Diversität von
CAST/EiJ Mus musculus
PWK/PhJ
WSB/EiJ
Threadgill & Churchill (2012)
Genetics, 190:291-294
Inzuchtstamm
Problem: Residualheterozygotie
spontane Mutationen
Letalequivalent
(Durchschnittswert rezessiver
fehlerhafter Allele bei Heterozygoten)
20 Generationen Inzucht 98.6%
150 Generationen Inzucht 99.9999%
25.02.2019 9
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Schnitt durch die Retina von Mäusen
unterschiedlicher GT
a = Pigmentepithel
b = Stäbchen und Zapfen
c = äußere Körnerschicht
d = innere Körnerschicht
Wildtyp
C3H/He rd1-Mutation
(Pde6b, Phosphodiesterase 6B)
ABJ/Le, BDP/J, BUB/BnJ, C3H/HeJ
C3H/HeOUJ ,C3H/HeSnJ, C3HeB/FeJ
CBA/J, DA/HuSn, FL/1Re, FVB/NJ
P/J, PL/J, SB/Le ,SJL/J, ST/bJ, SWR/J
WB/ReJ KitW/+, WC/ReJ KitlSl/+
Age-related hearing loss in C57BL/6J (B6)
mice associated with the ahl (Cdh23) locus
Exp. Anim. 61(2), 85–98, 2012
C57BL/6J, A/J, NOD/LtJ,
DBA/2J, BUB/BnJ, BALB/cByJ
20
25.02.2019 10Veterinärmedizinische Universität Wien
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Database Subject matter URL
Federation of International Strain information http://www.fimre.org
Mouse Resources
The Jackson Laboratory Strain resource https://www.jax.org/
Riken Bioresource Center Strain resource http://mus.brc.riken.jp/en/
European Mouse Mutant Strain resource https://www.infrafrontier.eu/
Archive (EMMA)
Mouse Genome Informatics Strain information http://www.informatics.jax.org/
Mouse Phenome Database Strain information http://phenome.jax.org/
Europhenome mouse Strain information http://www.europhenome.org/
phenotyping resource
MouseMine Strain information http://www.mousemine.org/mousemine/begin.do
The global ImMunoGeneTics MHC information http://www.imgt.org/IMGTrepertoireMHC
Web Resource
Rat Resource & Research Strain resource http://www.rrrc.us/
Center
The National BioResource Strain resource http://www.anim.med.kyoto-
Project - Rat u.ac.jp/nbr/Default.aspx
Rat Genome Database Strain information http://rgd.mcw.edu/
RatMine Strain information http://ratmine.mcw.edu/ratmine/begin.do
C57?
C57BLack/BOX?
The importance of exact mouse strain nomenclature
Carsten T. Wotjak, Trends in Genetics, Vol.19 (2003) 183-184
C57BL/6N C57BL/6 J
Snca+/+ Snca+/+
C57BL/6 OlaHsd J C57BL/6 Ico J J
C57BL/6 Bom
Sncam/m Snca+/+ Snca+/+
25.02.2019 11Veterinärmedizinische Universität Wien
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C57BL/6N vs. J
B6N
Crb1rd8 mutation,
white flecking on
the fundus oculi
B6J
Problem “Substämme” bei C57BL/6
f57 x m52
1951
25.02.2019 12Veterinärmedizinische Universität Wien
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Problem “Substämme”
J – The Jackson Laboratory
Crl – Charles River Laboratories
Rj – Janvier
Hsd – Envigo (Harlan)
Tac – Taconic
C57BL/6N vs. J- Differenzen
• 36 SNPs in coding regions:
• 32 missense mutations
• 2 frameshifts
• 1 nonsense
• 1 splice mutation
Simon et al (2013)
Genome Biology 14:R82
25.02.2019 13Veterinärmedizinische Universität Wien
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ZÜCHTEN ?
Verpaarung
SOPs !
AMS !
Zuchtziel
Selektion Bewertung
Übereinstimmung mit dem •Analyse
Authentizität
stammspezifischer Marker
stammspezifischen Profil (morphologische, biochemische,
•immunologische,
Integrität genetische)
Animal Management System
Commercially available:
• eMouseLab (http://e-mouselab.com/Default.aspx)
• LabTracks (http://www.locustechnology.com/labtracks.html)
• mLIMS (https://bioinforx.com/lims2/product_mlims.php)
• PyRAT Animal Facility Software (http://www.mousehouse.io)
• SoftMouse Internet Colony Management Software
(www.softmouse.net)
• AniBio from Noraybio (www.noraybio.com)
• Mausoleum (http://www.maus-o-leum.de/)
• Tick@lab (https://www.a-tune.com)
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25.02.2019 14Veterinärmedizinische Universität Wien
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Zucht von Inzuchtstämmen
Nukleus-Kollonie (NC)
• B x S Paarung mit Pedigree
• genetische Kontrolle NC
• selbst reproduzierend
Expansionskolonie (EC) EC
• B x S Paarung mit Pedigree
• Reproduziert von NC
Produktionskolonie (PC)
• B x S Paarung (?) PC
• Reproduziert von EC
und selbst bis zur 3. Generation
Maßnahmen zur Sicherung
der Integrität und Authentizität von Labortierstämmen
Phänotypisches Monitoring
• Pigmentierung: Fellfarbe
• Verhalten
• pathophysiologische
Stammeigenschaften: z.B. Diabetes, Bluthochdruck
• Zuchtparameter Kolonieindex (durchschnittliche
Nachkommenzahl pro Weibchen
und Woche)
25.02.2019 15Veterinärmedizinische Universität Wien
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Maßnahmen zur Sicherung
der Integrität und Authentizität von Labortierstämmen
Genetisches Monitoring
• zytologische Merkmale: Karyotyp, Chromosomenbanding
• immunologische Marker: MHC, Oberflächenantigene
(Hauttransplantation)
• biochemische Marker: Enzympolymorphismen
• molekulargenetische Marker: RFLP, SSLP, SNP
Spontane Fellfarbmutationen in C57BL/6J
«Coisogene Stämme»
C57BL/6J
C57BL/6J- at C57BL/6J-Tyrc
25.02.2019 16Veterinärmedizinische Universität Wien
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Maßnahmen zur Sicherung
der Integrität und Authentizität von Labortierstämmen
Allgemeine Empfehlungen
• Genetische Stabilitätsprogramme
Restocking aus archivierten Embryonen (ca. alle 5 Generationen)
Restocking aus anerkannten Referenzinstituten
• Etablierung eines effizienten Marker Sets
ZÜCHTEN ?
Verpaarung Zuchtziele bei GMOs:
• Etablierung
• Homozygotie
• Mehrfachmutanten
• Vermehrungs- / Erhaltungszucht
Zuchtziel • Zucht zur Archivierung einer Linie
Selektion Bewertung
• genetischer Hintergrund
25.02.2019 17Veterinärmedizinische Universität Wien
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PHENOTYPE
of
Complex Biological Traits
GENOTYPE INTERACTION
ENVIRONMENT
(mutation)
+
GENOTYPE
GENETIC BACKGROUND
(of related interacting genes)
+
EPIGENETICS
Phenotype of Egfrtm/tm mice
on different genetic backgrounds
Sibilia and Wagner, Science 1995
Background / Viability Specific phenotypes
129/Sv
midgestation Placental defects
Lung immaturity
C57BL/6 Open eyes (EOB)
birth Skin defects
Brain degeneration
Skin and hair defects
C3H;MF1 Bone defects
day 20 Heart defects
25.02.2019 18Veterinärmedizinische Universität Wien
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Genetic modifiers of the phenotype of
mice deficient in MnSOD (Sod2tm1Cje)
Chr 13
DBA/2J
AKR/J
-Nnt+/+
BALB/cJ
C57BL/6NCrl
Nnt C57BL/6J -Nntm/m
(∆ Exon 7-11)
Ting-ting Huang et al., Human Molecular Genetics, 2006, Vol. 15: 1187–1194
Recommendations concerning genetic background
Banbury Conference on Genetic Background in Mice. Neuron 19: 755-59 (1997)
The genetic background of the mutants should
always be described in detail.
Any background used should be easily recreated
from available strains or stocks.
Transgenic and gene-targeted mice should be generated
and maintained in inbred genetic backgrounds.
• Rückkreuzung der Founder-Linie auf den wt Background
• Rekonstitution der induzierten Mutation
25.02.2019 19Veterinärmedizinische Universität Wien
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Qualitätssicherung
genetisch modifizierter Tiere
• Random Mutations
• Akkumulation spontaner Mutationen in pluripotenten ES-Zellen
Deletionen, Duplikationen, copy number variation
(Liang et al., PNAS, 2008)
• Endonuclease mediated gene targeting
CRISPR/Cas9
mosaicism
off-target mutagenesis
on-target mutagenesis
(large deletions, complex genomic rearrangements
Kosicki M et al., Nature Biotechnology, 2018)
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Background check of genetically modified lines
25.02.2019 20Veterinärmedizinische Universität Wien
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Congener Inzuchtstamm
Kontamination kongener Stämme
Genetische Kontamination mit Donorstammallelen
mit Allelen vom Donorstamm
10
9
Contamination (%)
8
7
6
5
4
3
2
1
0
1 6 11 16
Rückkreuzungs-Generationen
% Kontamination ohne Linkage % Kontamination mit Linkage
Congener Inzuchtstamm
~ 20 cM ~ 40 Mb
~ 10 cM ~ 10 cM
35
30
Locu s Distanz in cM
25
20
15
10
5
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Ge ne r atio ne n
R.Korn 29.11.99 17
25.02.2019 21Veterinärmedizinische Universität Wien
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Background check of genetically modified lines
Nomenklatur für gentechnisch
veränderte Labortiere
NHEJ C57BL/6N-Tg (PDCD5-GFP) 675 Biat
B6N;129P2-Adktm6Zbz (targeted mutation of Adenosin kinase on a
mixed background)
HR
C57BL/6N- Tyk2tm1(K923E)Biat (targeted point mutation of tyrosine kinase 2,
HDR Lys→Glu of AS 923)
C57BL/6N-Chd8em1Biat (endonuclease-mediated Mutation of
chromodomain helicase DNA binding protein 8)
25.02.2019 22Veterinärmedizinische Universität Wien
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Neue Wissenschaftskultur
Transparenz + Reproduzierbarkeit
1. Standards für Reporting
The ARRIVE Guidelines
Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments
2. Dissemination (als Förderbedingung)
Federation of International Mouse Resources (FIMRe)
45
www.findmice.org/
46
25.02.2019 23Veterinärmedizinische Universität Wien
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EMMA archiving & worldwide shipping
of mice, cooled & frozen material
The European Mouse Mutant Archive
https://www.infrafrontier.eu/search
MGI associated phenotypes
48
25.02.2019 24Veterinärmedizinische Universität Wien
(Vetmeduni Vienna)
The European Mouse Mutant Archive
https://www.infrafrontier.eu/
Eine ‘non-profit’ Organisation
Archivierung und Bereitstellung von Mausmutanten
Drittgrößte Archiv weltweit (> 6800 Mauslinien)
Axenic Service (keimfreie Mäuse)
Derzeit ‚Model Development Service’ für Genome Editing via CRISPR/Cas9
in der Ratte (Sprague Dawley background)
The European Mouse Mutant Archive
https://www.infrafrontier.eu/
EMMA nodes
1: Consiglio Nazionale delle Ricerche, Istituto di Biologia Cellulare (CNR-IBC),
Monterotondo, Italy
2: Centre National de la Recherche Scientifique, Transgénèse et Archivage
d’Animaux Modèles
(CNRS-TAAM), Orleans, France
3: Medical Research Council, Mammalian Genetics Unit (MRC-MGU), Harwell,
UK
4: Karolinska Institutet, Department of Cell and Molecular Biology (KI-CMB),
Stockholm, Sweden
5: Fundação Calouste Gulbenkian, Instituto Gulbenkian de Ciência, Oeiras,
Portugal
6: Helmholtz Zentrum München, Institute of Experimental Genetics (HMGU-IEG),
München, Germany
7: European Molecular Biology Laboratory, European Bioinformatics Institute
(EMBL-EBI), Hinxton, UK
8: Genome Research Limited, Wellcome Trust Sanger Institute (WTSI), Hinxton,
UK
9: GIE-Centre Européen de Recherche en Biologie et en Médecine, Institut
Clinique de la Souris
(GIE-CERBM-ICS), Illkirch, France
10: Consejo Superior de Investigaciones Scientificas, Centro Nacional de
Biotecnología (CNB-CSIC), Madrid, Spain
11: Biomedical Sciences Research Center Alexander Fleming (Fleming),
Vari/Athens, Greece
12: Institute of Molecular Genetics (IMG), Prague, Czech Republic
13: University of Oulu, Oulu, Finland
14: Veterinärmedizinische Universität Wien, Vienna, Austria
15: Tel Aviv University, Tel Aviv, Israel
16: Netherlands Cancer Institute, Amsterdam, The Netherlands
25.02.2019 25Veterinärmedizinische Universität Wien
(Vetmeduni Vienna)
51
Danke!
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