Welche genetischen Varianten beeinflussen die männliche Fruchtbarkeit und die Samenqualität bei Brown Swiss Stieren? - Maya Hiltpold 07.09.2021 ...

Animal Genomics, USYS

Welche genetischen Varianten beeinflussen
die männliche Fruchtbarkeit und die
Samenqualität bei Brown Swiss Stieren?
Maya Hiltpold
07.09.2021, AgroVet Strickhof

Wie und warum untersucht man die quantitative Genetik männlicher
Fruchtbarkeit bei Stieren?

• Künstliche Besamung -> ein Stier auf viele Kühe

• Zuchttauglichkeitsuntersuchung und Kontrolle der Samenqualität
• Non-return Rate

• SNP array Genotypen
• Whole-genome Sequenzen

• 3736 BSW Stiere aus der Schweiz, Deutschland und Österreich
 − Phänotyp: Fruchtbarkeit Stier (korrigierte und standardisierte Non-return Rate)
 − Genotyp: SNP array (teilweise) imputiert auf 777k Chip
• Haplotype basierte GWAS auf den Autosomen
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Korrigierte Non-return Rate

• Non-return Rate nach 56 Tagen (weitere Belegung gemeldet innerhalb 56 Tage nach erster
 Belegung)

• Schweiz: lineares gemischtes Modell = µ + + + + ( ) + +
 ℎ + + 
 − fixe Effekte: Besamungsmonat, Rind/Kuh, Kosten Samendose, Rasse Kuh x Rasse Stier,
 Besamungstechniker
 − zufällige Effekte: Herde, Stier, Residuen

• Deutschland und Österreich: Mehrmerkmals-BLUP-Tiermodell Zuchtwertschätzung weibliche
 Fruchtbarkeit
 − Fixe Effekte: Region x Jahr x Monat, Alter (Rind) oder Kalbealterklasse (Kuh), Betrieb, Besamer x Jahr, Stier
 x Besamungsart
 − Zufällige Effekte: Betrieb x Jahr, permanente Umwelt Kuh, genetischer Effekt Rind/Kuh

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Was ist eine GWAS?

• GWAS = genomweite Assoziationsstudie
 − Genetische Varianten werden auf einen Effekt auf ein Merkmal (Phänotyp) getestet

• Haplotyp = Abfolge genetischer Varianten

• Modell Haplotypen GWAS: lm(Phänotyp ~ Anzahl Haplotypen+as.matrix(Hauptkomponenten
 genomische Verwandtschaftsmatrix))
 Anzahl 0 1 2
 additiv 0 1 2
 rezessiv 0 0 1
 dominant 0 1 1

• Korrektur Signifikanzniveau für mehrfaches Testen (Bonferroni korrigiertes Signifikanzniveau =
 Signifikanzniveau 0.05 / Anzahl Tests)
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BTA1 -0.85 p
Quantitative trait loci für Fruchtbarkeit Stier beim BSW
 BTA6 -0.99 p
 Additives Modell

 BTA18 -0.29 p

 BTA25 -1.09 p
 Rezessives Modell

 BTA26 -0.52 p

 Chromosom
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BTA1 -0.85 p
Quantitative trait loci für Fruchtbarkeit Stier beim BSW
 BTA6 -0.99 p

 Effekt auf Frequenz Erwarteter
 Fruchtbarkeit Haplotyp Anteil BTA18 -0.29 p
 Stier in p Homozygote

BTA1 -0.85 0.18 0.0324
 BTA25 -1.09 p
BTA6 -0.99 0.26 0.0676

BTA18 -0.29 0.34 0.1156
 BTA26 -0.52 p
BTA25 -1.09 0.0081 0.0081

BTA26 -0.52 0.26 0.0676

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Wieso ist die Fruchtbarkeit in den homozygoten Stieren reduziert?

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Zuchttauglichkeitsuntersuchung und Kontrolle Samenqualität

• Quarantäne vor Aufzucht oder Besamungsstation und tierärztliche Untersuchung

• Mindestens ein Ejakulat vor Freigabe Stier zur Produktion: Spermienmorphologie mit fixierten (toten
 & unbeweglichen Spermien)
 − Auszählung mit Phasenkontrast-Mikroskop von 200 Spermien
 − Wenn Stier ”klar” untauglich, Abbruch bei ca. 50 Spermien
 − Mindestens 75 % normale Spermien, maximal 20 % nicht kompensierbare Defekte
 − Wiederholung bis Stier tauglich oder bis Entscheid Schlachtung

• Frischsperma: jedes Ejakulat (ev. Doppelsprünge gemischt)
 − Konzentration, Volumen
 − Motilität, Score Schwanz- und Kopfanomalien (Mikroskop)
 − Entscheid: Verabeitung oder Verwerfen, Zielmenge Spermien pro Dose
• (Auftaukontrolle)
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Filtering Daten Samenqualität
Filtering Parameter Anzahl Stiere Anzahl Ejakulate
Rohdaten 1432 74,945
Alter Gewinnung Ejakulat > 400 und < 1000 Tage 1380 60,246

Intervall zum vorhergehenden Ejakulat bekannt (ohne 1379 59,353
erste Ejakulate)
Ejakulatvolumen verzeichnet 1366 58,846
Keine gemischten Ejakulate (Doppelsprünge) 1358 42,870
Nur verarbeitete Ejakulate 1311 38,370
Intervall zwischen Ejakulaten = 70 % 1285 34,510
Anomalienscore plausibel 1285 34,505
Spermien pro Dose >= 15 million (nicht gesext) 1285 34,278

Samengewinner und Stierenführer bekannt 1253 32,023

(imputierte) HD Genotypen verfügbar 1119 29,814
>= 8 Ejakulate pro Stier 902 28,856
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Wieso ist die Fruchtbarkeit in den homozygoten Stieren reduziert?
Ejaculate volume Sperm concentration Sperm motility Tail anomaly score Head anomaly score

Sperm per straw n morphological % normal sperm % major defects % minor defects
 examinations

% non-compensatory % compensatory % head shape defect % vacuoles % condensed DNA

% micro- / % loose heads % knobbed acrosome % detached acrosome % Dag defect
macrencephaly

% curled tail % middle-piece % abaxial tail % tail end loop % proximal
 knobbed cytoplasmic droplet

 Chromosome Chromosome
% distal cytoplasmic % underdeveloped % double form
droplet Routineanalyse Ejakulate (n = 902)
 Spermienmorphologie aus Zuchttauglichkeits-
 Maya Hiltpold untersuchtung (n = 575) 07.09.2021 10
 Chromosome Chromosome Chromosome

Ejaculate volume Sperm concentration Sperm motility Tail anomaly score Head anomaly score

 e f g h
Sperm per straw n morphological % normal sperm % major defects
 examinations BTA6 % minor defects

 BTA1

% non-compensatory % compensatory % head shape defect % vacuoles % condensed DNA

% micro- / % loose heads % knobbed acrosome % detached acrosome % Dag defect
macrencephaly

% curled tail % middle-piece % abaxial tail % tail end loop % proximal
 knobbed cytoplasmic droplet

 Chromosome Chromosome
% distal cytoplasmic % underdeveloped % double form
droplet

 Rezessives Modell
 Chromosome Chromosome Chromosome

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QTL auf BTA1 beeinträchtigt die Form der Spermienköpfe
 -10% +8%

 Heterozygote und Nichtträger Stiere: 520 von 561
 (92.7%)
 ⬌
 Homozygote Stiere: 21 von 34 (61.7%)
 sind tauglich zur künstlichen Besamung

 +5% x2 +5%

 Maya Hiltpold
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QTL auf BTA6 beeinträchtigt das Mittelstück der Spermien
 -6% +6% x2

 +5% -3.4% +6% +2.8 Millionen

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Welche genetischen Varianten sind mit den QTL assoziiert?

• BTA6 QTL

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Variants in / upstream SPATA16 sind assoziiert mit dem BTA1 QTL

 Haplotyp und imputierte Sequenz GWAS

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Was ist Imputation?

• “Auffüllen” von variablen genetischen Positionen, die im
 entsprechenden Individuum “leer” sind (z.B. weil nur SNP
 Chip mit tiefer Variantendichte vorhanden)

• Referenztiere mit Information an den entsprechenden
 variablen Positionen
 − Bevorzugt aus gleicher Rasse / Population

• Phasen der Genotypen

• Imputation

 https://sanogenetics.com/blog/what-is-imputation/
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Varianten in / upstream SPATA16 sind assoziiert mit dem BTA1 QTL

 Haplotyp und imputierte Sequenz GWAS Expression in Hoden Stier
 Varianten kompatibel mit Top-Haplotyp (rot)

 Missense variant

 SPATA16
 Mensch: globozoospermia (Dam et al. 2007 10.1086/521314, ElInati et al. 2006 10.1007/s10815-016-0715-3),
 Protein in Akrosom (Xu et al. 2003 10.1093/molehr/gag005)
 Mouse: spermatogenic arrest (Fujihara et al. 2017 10.3390/ijms18102208)
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Ist die missense in or upstream Variante von SPATA16 verantwortlich?
 Upstream variant
 Imputierte Sequenz GWAS &
 Missense variant
 Haplotypen GWAS
 Fruchtbarkeit Stier
 konditional für:
 • Top assoziierter Haplotyp
 Aminosäurensequenz von SPATA16

 • missense Variante

 r2 = 0.858

 • Top assoziierte upstream
 Variante

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Varianten in ENSBTAG00000019919 und downstream SYCE1 sind assoziiert
mit dem BTA26 QTL
 Haplotyp und imputierte Sequenz GWAS Expression in Hoden Stier
 Varianten kompatibel mit Top-Haplotyp (rot)

 Missense variant

ENSBTAG00000019919: homolog zu CFAP46, in Chlamydomonas reinhardtii essentiell für normale
Flagellenmotilität (Brown et al. 2012 10.1242/jcs.107151)
SYCE1: Synaptonemal Complex Central Element Protein 1, benötigt für Chromosomenpaarung in Meiose I
(Costa et al. 2005 10.1242/jcs.02402)
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Welche Variante ist verantwortlich für den BTA26 QTL?
 Downstream variant
 Imputierte Sequenz GWAS &
 Haplotypen GWAS
 Fruchtbarkeit Stier
 konditional für:
 Missense variant • Top assoziierter Haplotyp

 • missense Variante

 r2 = 0.598

 • Top assoziierte Variante

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Eine nonsense Variante in VWA3A und eine frameshift variante in
ENSBTAG00000006717 sind assoziiert mit dem BTA25 QTL
 Haplotyp und imputierte Sequenz GWAS Expression in Hoden Stier
 Varianten kompatibel mit Top-Haplotyp (rot)

 Nonsense variant

 Frameshift variant

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212 Varianten sind kompatibel mit dem Top-Haplotyp für den QTL auf BTA18

 Nonsense variant

 Frameshift variant

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Weitere Möglichkeiten zur Validierung

• Andere BSW Stiere, z.B. aus USA
 − Muss Population sein, in welcher Varianten auch vorkommen
 https://queries.uscdcb.com/eval/summary/scr_menu.cfm

• Untersuchung Effekt der genetischen Varianten auf weitere Spermienmerkmale, Befruchtung,
 Embryonalentwicklung
 − Bei “aufwändigen” Untersuchungen häufig Limitation Tierzahl

• Expressionsdaten Hoden BSW Stiere (expression QTL: Expression in Abhängigkeit vom Genotyp)
 − Projekt Xena Mapel

• Quantitatives qualitatives Merkmal
 − “Versagermuni”: erreichen Status ”tauglich” nicht -> 15 / 49 sind homozygot für upstream SPATA16 Variante
 (direkte und imputierte Sequenz)
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Schlussfolgerung

• Rezessive Varianten tragen substanziell zur quantitativen Variation von männlicher Fruchtbarketi
 beim BSW bei
 − Nicht-additive Vererbung berücksichtigen

• QTL auf BTA1 and BTA6 sind assoziiert mit reduzierter Spermienqualität
 − BTA1 stärkerer Effekt auf Spermienmorphologie, viele Stiere sind nicht tauglich für künstliche Besamung
 − BTA6 stärkerer Effekt auf Fruchtbarkeit Stier, subtiler und kompensatorischer Spermiendefekt

• QTL auf BTA18, 25, und 26: Grund für reduzierte Fruchtbarkeit unbekannt
 − ? ”ungemessene” Samenmerkmale, welche auf die Befruchtung oder frühen Embryonalverlust wirken

• Starke (kodierende) Kandidatenvarianten, jedoch ist die Kausalität schwierig zu ermitteln

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Vielen Dank für die Aufmerksamkeit!

Maya Hiltpold 07.09.2021 25

Maya Hiltpold

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