DIE SARS-COV2 PANDEMIE AUS DER SICHT DES ZENTRALINSTITUTS FÜR MED. UND CHEM. LABORDIAGNOSTIK (ZIMCL) - CHRONIK DER IM ZIMCL DURCHGEFÜHRTEN ...

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DIE SARS-COV2 PANDEMIE AUS DER SICHT DES ZENTRALINSTITUTS FÜR MED. UND CHEM. LABORDIAGNOSTIK (ZIMCL) - CHRONIK DER IM ZIMCL DURCHGEFÜHRTEN ...
Die SARS-CoV2 Pandemie aus der
 Sicht des Zentralinstituts für Med.
und Chem. Labordiagnostik (ZIMCL)
Chronik der im ZIMCL durchgeführten SARS-COV2 Diagnostik seit 03/2020
DIE SARS-COV2 PANDEMIE AUS DER SICHT DES ZENTRALINSTITUTS FÜR MED. UND CHEM. LABORDIAGNOSTIK (ZIMCL) - CHRONIK DER IM ZIMCL DURCHGEFÜHRTEN ...
Etablierung und Durchführung verschiedenster
diagnostischer Methoden wie zB

  • Nukleinsäurebasierter Methoden (PCR, NAT, LAMP
    etc.)
  • SARS-CoV2 Varianten-Diagnostik
  • Validierung von Antigen-Schnelltests
  • Validierung und Etablierung von SARS-CoV2
    Antikörpertests
  • VIPIT/VITT Antikörper Nachweis
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Rückblick

            Am 25.02.2020 war in der Presse
            vom ersten Corona Fall in Innsbruck
            zu lesen. Es waren 2 Mitarbeiter
            des Hotel Europas. Das Hotel wurde
            unter Quarantäne gestellt.
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Einführung in Rekordzeit

• Am 12. März 2020 Beauftragung zur Einrichtung einer SARS-CoV2
  PCR für alle Häuser der tirol kliniken durch die ärztliche Direktion
• Erster Befund einer SARS CoV2 PCR bereits am 27.3.2020 vom
  ZIMCL erstellt (Etablierungszeit: zwei Wochen !)
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Zahlreiche organisatorische Maßnahmen und
Vorgaben
•   Einrichtung einer räumlich getrennten Probenannahme für hoch
    infektiösen Proben
•   Einrichtung der Möglichkeiten zur Testanforderung
•   Herausforderung: Analyse-Workflow so zu gestalten, dass trotzdem ein
    normaler Klinikbetrieb weiter möglich bleibt
•   Probenbearbeitung: täglich (Montag bis Sonntag) von 7 Uhr 30 bis 18
    Uhr 30. Jede Probe muss am Tag der Probenannahme anaylsiert und
    befundet werden. Positive Befunde wurden während der 2. und 3. Wellen
    bis in die frühen Morgenstunden durch den zuständigen Dienstarzt
    telefonisch übermittelt.
•   Möglichst kurze Zeit von der Probenannahme im ZIMCL bis zur Erstellung
    des fachärztlichen Befundes (Turnaround-Zeit/TAT)
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Neue COVID Abstrichproben-Annahme und
Sicherheits-Werkbank
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Erstellung eines neuen Anforderungs-Procedere
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Erster Corona
Befund ZIMCL
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Erste händische Realtime-PCR (03/2020)

Manuelle RNA-Extraktion, RT-
 PCR Ansatz und manuelle
 Auswertung anhand von PCR-
 Amplifikationskurven.
Statistik März / April 2020:
   Ca. 350 PCR/Woche
   ca. 1% aller PCR in Ö
   8% Positivitätsrate
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Rohdaten-Interpretation der manuellen PCR

            • Nicht automatisierte Methode
            • zur Bewältigung großer Probenmengen wäre zusätzliches routiniertes
              Personal erforderlich gewesen
Einführung einer automatisierten
SARS-CoV2 Hochdurchsatz PCR (Roche cobas 6800)
Zahlreiche organisatorische Maßnahmen erforderlich:

Sars-cov-2 PCR mittels ROCHE
COBAS 6800
  Vollautomatisierte Hochdurchsatz RT-
   PCR
  Zwei Zielregionen (> daher zwei Ct-
   Werte)
       E-Gen (pan-Sarbecoviren, BB
        Coronaviren)
       Orf1a/b (SARS-CoV-2)
  96 Proben gleichzeitig möglich
  Testdauer 3 Stunden
  Mehrere Läufe pro Tag möglich
Zahlreiche organisatorische Maßnahmen erforderlich:

Einführung einer Pooling-Strategie
• Meilenstein im Sommer 2020:
• dringliche Erhöhung der Testkapazitäten durch Einführung einer
  Pooling-Strategie für PCR-Screening Proben.
  Reagentien für PCR Tests zu diesem Zeitpunkt nur sehr begrenzt
  verfügbar und von den Herstellern kontingentiert.
• Einführung eines PCR-Poolverfahren (Fünffach-Pools) für Screening-
  Untersuchungen
Zahlreiche organisatorische Maßnahmen erforderlich:

Einführung einer Pooling-Strategie
• Vorteil deutliche Steigerung der Testkapazität bei geringem
  Materialverbrauch.
• In logistischer und administrativer Hinsicht besondere
  Herausforderung dar.
• In kurzer Zeit mussten sichere Verfahren zum Zusammenstellen der
  Pools und zum Auflösen der Pools etabliert werden
massive Steigerung der Testkapazität durch a)
Roche PCR, b) pooling (5-er Pools)
Turnarround-Zeit* SARS CoV2 PCR in Minuten
                                   TAT-RESULTAT [min]                   TAT-BEFUNDUNG* [min]
                            avg.         QUANTIL(10%)   QUANTIL(90%)   avg.         QUANTIL(10%)   QUANTIL(90%)
                  Apr.20           346            211            464          352            217            468
                  Mai.20           325            199            505          330            203            513
                  Jun.20           584            240           1144          609            246           1150
                   Jul.20          636            243           1128          652            256           1149
                  Aug.20           532            223           1283          545            234           1294
                  Sep.20           562            240            574          571            248            587
                  Okt.20           456            236            522          468            244            533
                  Nov.20           465            234            645          472            240            654
                  Dez.20           449            226            514          458            233            523
                  Jän.21           349            222            449          359            229            456
                  Feb.21           377            223            453          386            229            464
                  Mär.21           393            222            446          402            230            452
                  Apr.21           388            221            450          396            226            460

    *Zeit von der Probenannahme im ZIMCL bis zur Erstellung des fachärztlichen Befundes

     PCR-Ergebnisverfügbarkeit innerhalb von wenigen Stunden!
Turnaroundzeit (TAT)* SARS COV2 PCR in
Minuten
*Zeit von der Probenannahme im ZIMCL bis zur Erstellung des fachärztlichen Befundes

   03/2020: Initialer Anstieg der Turnaroundzeit wegen zunehmender Proben. Nach Einführung
   des automatischen Systems und Poolen der Proben kontinuierliches Absinken der TAT:
   Weiterer Abfall mit Einführung der flexibleren Zweitmethode (Hologic-NAT / isothermale RNA-
   Amplifikation)
                  700

                  600

                  500

                  400
        Minuten

                                                                                                                                             TAT-VAL-AVRG
                                                                                                                                             TAT-RES-AVRG
                  300

                  200

                  100

                   0
                        Apr.20   Mai.20   Jun.20   Jul.20   Aug.20   Sep.20   Okt.20   Nov.20   Dez.20   Jän.21   Feb.21   Mär.21   Apr.21
Personalsituation:
Bis 31. August 2020 mussten sämtliche diagnostischen
Maßnahmen zur SARS CoV2 Diagnostik bei ohnehin
angespannter Personalsituation ohne zusätzliches
Personal durchgeführt werden.
09/2020: Genehmigung zusätzlicher Stellen im zeitlichen
verlauf für die Bewältigung der SARS CoV2 Diagnostik in
der Pandemiezeit

                                    Beschäftigungsausmaß
       Einsatzgebiet    Eintritt
                                       Zum 31.05.2021
       Analytik        01.09.2020          100%
       Analytik        21.09.2020          100%
       Analytik        02.11.2020          100%
       Analytik        07.12.2020          100%

       Probenannahme   01.09.2020           35%
       Probenannahme   01.10.2020           35%
       Probenannahme   01.10.2020           50%
       Probenannahme   02.11.2020           40%
       Probenannahme   04.01.2021           40%
Um die ansteigend Probenzahl bewältigen zu
können und unabhängiger von einem Anbieter zu
werden mussten weitere zusätzliche Nukleinsäure
basierte Analysenmethoden (z.B. die NAT-Methode
der Firma Holocic, PCR-POCT Methode der Firma
Roche etc) zusätzlich eingeführt werden
SARS-COV-2 isothermale Amplifikation
Hologic Panther (NAT)
Isothermale Amplifikation
Hologic Panther

Nukleinsäureamplifikationstechnik (NAT):
 isothermale Amplifikation
Schnellere Ergebnisse
Abarbeitung einzelner Proben möglich
 (Roche: nur im 96-Batch)
Gerätetechnisch bis zu 1000 Tests pro Tag
 möglich
SARS-COV-2 POCT PCR
Roche LIAT
Roche Liat POCT PCR
 POCT-Schnell-PCR für
  dringende Einzelproben,
  Testwiederholungen und
  Auflösen von positiven
  Screening-Pools
 Simultaner Nachweis von:
    SARS-CoV-2
    Influenza A
    Influenza B
 „…wenn es (sehr) schnell
  gehen muss“
Einführung einer SARS-COV-2 PCR
Mutanten/Varianten Screening-Diagnostik
Ab Februar 2021: Screening nach verschiedenen
Varianten/Mutanten mittels PCR im ZIMCL
Methode:
 Schmelzkurvenanalyse, wurde
 innerhalb einer 10 Tagesfrist
 etabliert.
Einführung eines diagnostischen
 Screening-Algorithmus (UK, UK
 mit E484K, Südafrika, Brasilien,
 Indien etc.)
Ab Februar 2021: Screening nach verschiedenen
Varianten/Mutanten mittels PCR im ZIMCL
Sehr flexible Anpassungen der
 Strategie erforderlich, da ständig
 neue Varianten und Mutationen
 auftauchen
Portfolio umfasst inzwischen >15
 verschiedene Mutationen
 anhand derer nach Bedarf
 verschiedene SARS-CoV2
 Varianten differenziert werden
Bsp. Einer Schmelzkurvenanalyse
von SARS-Cov2 Genmutationen
                              Fachliche Erfahrung bei der
                              manuellen Auswertung der
                              Kurven erforderlich.

                              Atypische Muster durch
                              neue Varianten jederzeit
                              möglich

                              (Bsp: Nachweis der V1176F
                              Mutation, die bei der
                              brasilianischen Variante
                              B1.1.238 vorkommt)
Schmelzkurvenanalyse SASR Cov2 Genmutationen
Derzeitig aktuelle Liste von
relevanten Mutationen

                                                                                                 Italienisch,
                                                                                                                Californisch    Indien      ?
                                                                  Liechtenstein COH-               Nigeria?
Spike Prot. Genetic      UK        ZA       Brasil     Nigeria                         DK mink
                                                                  , tschechisch 20G                                            B.1.617.1          Assay
 Variation Variation                                                                              B 1.525        B 1.427/
                                                                                                                                 /2/3
                       B.1.1.7   B.1.351   B.1.1.28   B.1.1.238     B1.258     B.1.2   Clust V                    B 1.429                   R.1                 Mit der im ZIMCL
         del21765-
ΔHV69.70

 Δ Y144
             70
         del21991-
                         x

                         x
                                                                       x                  x                                                         53-0781
                                                                                                                                                                etablierten Methode
             93
 K417T     A22812C                            x                                                                                                                 können alle derzeit
 K417N     G22813T                 x                                                                                                                53-0787
 N439K
 Y453F
           C22879A
           A22920T
                                                                       x
                                                                                          x
                                                                                                                                                    53-0788
                                                                                                                                                    53-0783
                                                                                                                                                                bedeutenden
 E484K
 E484Q
           G23012A
           G23012C
                                   x          x                                                       x
                                                                                                                               (B.1.617.1
                                                                                                                                             x      53-0789
                                                                                                                                                                Varianten of Concern
                                                                                                                                 +3: X)
 N501Y
 A570D
           A23063T
           C23271A
                         x
                         x
                                   x          x                                                                                                     53-0780
                                                                                                                                                    53-0791
                                                                                                                                                                sicher erkannt werden.
 D614G     A23403G       x         x          x          x                                x                                        x         x      53-0782
 Q677H     G23593C                                                               x                    x                                            53-0796-96
 P681H     C23604A       x                               x                                                                       (x R)              53-0786
 D1118H    G24914C       x
 V1176F    G25088T                            x                                                                                                     53-0784
  F888L                                                                                               x                                            53-0798-96
  L452R                                                                                                              X             X               53-0793-96
SARS-Cov-2 Antigen Schnelltests - Performance
Parallel zur Etablierung der Nukleinsäure basierten Methoden wurden
Schnelltests für den patientennahen Gebrauch validiert
SARS-CoV-2 Antigen-Schnelltests
Potentielle Vorteile gegenüber PCR/NAT:
    Billiger
    Rascheres Ergebnis (
Serologische SARS-COV-2
Untersuchungen im ZIMCL
Fortlaufende Evaluierung von ca. 20
verschiedenen Antikörper-Assay im ZIMCL

                                Verschiedene eingesetzte
                                Testverfahren im zeitlichen
                                Pandemie-Ablauf
SARS-CoV-2 Serologie – fortlaufende
Validierungen

Bis zu ca. 20 SARS-CoV-2 Serologie Assays wurden fortlaufend auf
 ihre Tauglichkeit hin überprüft
ELISAS, (E)CLIA, CMIA, LFIA, Pseudo-Neutralisations-Assay, Blot…
Langzeit-Archivierung von Seren
Mit dem inzwischen vorhandenen Probenarchiv können künftig am
 Markt erscheinende Assays relativ rasch evaluiert / validiert werden
Beispiel SARS-COV-2 Validierung am
Siemens Advia Center XP

Das Gerät (Siemens Advia Centaur XP) wurde vom Hersteller eigens
 für die COVID-Antikörper-Evaluierungs-Studien bereitgestellt und
 vom ZIMCL nach ausführlicher Validierung in der Phase 1 der
 Routinediagnostik quantitativer SARS-CoV-2 IgG verwendet
Beispiel SARS-COV-2 Validierung am
Siemens Advia Center XP
Test-Validierung:
    Offline-Abarbeitung von über 2000 Validierungs-Messungen: Spezifität,
     Sensitivität, Präzision, Richtigkeit
    Standord des Gerätes im 3. Stock abseits der Routine-Chemie (5. Stock)
     erschwert den Einsatz in der Routine-Diagnostik
Routinemäßig verwendete Tests:
    Sommer 2020: COV2T Assay (gesamt AK gegen S1-RBD, qualitativ), COV2G
     Assay (IgG gegen S1-RBD, qualitativ)
    Herbst 2020: sCOVG Assay (verbesserter COV2G-Test bzgl. Sensitivität;
     Ausgabe quantitativ in U/ml bzw. später BAU/ml)
Wissenschaftliche Aufarbeitung und Publikation der
durchgeführten Methoden-Evaluierungen
                              “Evaluation of four commercial, fully
                              automated SARS-CoV-2 antibody tests
                              suggests a revision of the Siemens SARS-CoV-
                              2 IgG assay”
                              Irsara et al. CCLM. DOI: 10.1515/cclm-2020-
                              1758
Evaluation of four commercial, fully automated SARS-CoV-2 antibody
tests suggests a revision of the Siemens SARS-CoV-2 IgG assay
Irsara et al. CCLM. DOI: 10.1515/cclm-2020-1758
Evaluation of four commercial, fully automated SARS-CoV-2 antibody
tests suggests a revision of the Siemens SARS-CoV-2 IgG assay
Irsara et al. CCLM. DOI: 10.1515/cclm-2020-1758
Evaluation of four commercial, fully automated SARS-CoV-2 antibody
tests suggests a revision of the Siemens SARS-CoV-2 IgG assay
Irsara et al. CCLM. DOI: 10.1515/cclm-2020-1758
Clinical validation of the Siemens quantitative SARS-CoV-2 spike IgG assay
(sCOVG) reveals improved sensitivity and a good correlation with virus
neutralization titers
Irsara et al. CCLM. DOI: 10.1515/cclm-2021-0214

                                                      Assays müssen, insbesondere
                                                      unter so neuen Gegebenheiten wie
                                                      der COVID-Pandemie, unbedingt
                                                      durch unabhängige Labors validiert
                                                      werden
                                                       Im realen Leben
                                                      (unterschiedliche
                                                      Patientenkollektive!) schauen die
                                                      Performance-Charakteristiken oft
                                                      anders aus als im Beipackzettel…
Clinical validation of the Siemens quantitative SARS-CoV-2 spike IgG assay
(sCOVG) reveals improved sensitivity and a good correlation with virus
neutralization titers
Irsara et al. CCLM. DOI: 10.1515/cclm-2021-0214
12/2020: Verfügbarkeit des
1. internationalen WHO Standard
für COV AK
03/2021: Auftreten von Vakzin-induzierte immun-thrombotische
Thrombozytopenie nach Impfung

         Einführung einer VIPIT/VITT Diagnostik-Strategie im ZIMCL
Methode zum Nachweis von HIT-Antikörpern im ZIMCL seit langem
etabliert.
Nach Bekanntwerden der ersten Fälle von VIPIT (Nebenwirkung von
AstraZeneca Impfstoffen) umgehend Beginn des Nachweises der
auslösenden Antikörper gegen PF4 begonnen werden.

Derzeit an sieben Tagen in der Woche zeitnahe durchgeführt.
> schnelle Diagnostik und Erkennung dieser Fälle in Westösterreich
gewährleistet.
VITT (Vakzin-induzierte immun-thrombotische
thrombozytopenie)
                        Thrombosen an atypischen Stellen
                         (Sinusvenen, Mesenterialvenen)
                        Typischerweise bei jüngeren Frauen
                        Antikörper gegen PF4 (Thrombozyten)
                        Rasche Diagnose nötig

                        Therapie: hochdosierte i.v.
                         Immunglobuline (1g/kg Tag für 2 Tage)
Fazit: eine der größten
 Herausforderung an das ZIMCL und
und die medizinische Labordiagnostik
                   … to be continued

     © Zentrallinstitut für Med. Chem. Labordiagnostik (ZIMCL)
                            Stand: 06/2021
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