Futterqualität moduliert die antioxidative Abwehr in Daphnia
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Futterqualität moduliert die antioxidative Abwehr in Daphnia
magna: Molekularbiologische Untersuchungen
DIPLOMARBEIT
ZUM ERWERB DES AKADEMISCHEN GRADES
DIPLOM-BIOLOGE
an der Humboldt Universität zu Berlin
Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät 1
Institut für Biologie
Süßwasser und Stressökologie
Arboretum, Späthstraße 80/81
12437 Berlin
vorgelegt von:
Steffen Herrmann
Berlin, im August 2009
Zusammenfassung I
Zusammenfassung
Viele biotische und abiotische Faktoren bestimmen die natürliche Fluktuation von Daphnia
spec. Populationen. Einige dieser Faktoren können als Stressoren wirken, wenn sie den
physiologischen Anforderungen der Organismen nicht entsprechen. Die Wasserqualität, zum
Beispiel der Huminstoffgehalt und die Qualität und Quantität der Nahrung sind entscheidende
Faktoren die leicht zu Stressoren werden können. Besonders wenn sie gemeinsam auftreten
besteht die Frage nach den zugrunde liegenden Wirkmechanismen der Stressantwort. In
diesem Zusammenhang wurde eine aquatische Schlüsselspezies Daphnia magna mit zwei,
qualitativ unterschiedlichen Diäten gefüttert (die kokkale Grünalge Pseudokirchneriella
subcapitata und die Hefe Saccharomyces cerevisiae) und gegen zwei naturnahe
Huminstoffkonzentrationen exponiert. Der Vergleich der Genexpressionslevel zweier
Stressindikatorgene (Katalase und Hsp60) normiert gegen die Futterqualität, gab Aufschluss
über die Aussagekraft der Genexpression, betreffend des oxidativen Status bei
Huminstoffexpositon. Dazu wurde die bisher unbekannte hsp60-DNA-Sequenz in D. magna
identifiziert und partiell sequenziert, und so ein weiteres Werkzeug für die Generierung von
Anhaltspunkten über den Stressstatus einer wichtigen Schlüsselspezies geschaffen. Die
Huminstoffexposition sowie die Futterqualität verursacht eine transkriptionell kontrollierte
Stressantwort der untersuchten Gene. Die Daten zeigen bei gleichzeitigem Wirken zweier
Stressoren nicht wie erwartet, in allen Fällen, synergetische Effekte. Interessanterweise
wurden gegensätzliche Expressionsmuster bei der Exposition mit einem Stressor, im
Vergleich zur Exposition gegen zwei Stressoren gemessen, dieses spricht für ein
antagonistisches Wirken auf die antioxidative Abwehr von D. magna.Inhaltsverzeichnis II
Inhaltsverzeichnis
ZUSAMMENFASSUNG .......................................................................................................................................I
INHALTSVERZEICHNIS.................................................................................................................................. II
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS....................................................................................................................... IV
1 EINLEITUNG ....................................................................................................................... 1
1.1 Oxidativer Stress: Ein Überblick................................................................................................................... 2
1.1.1 Toxizität von Sauerstoff und seinen reaktiven Formen .......................................................................... 3
1.1.2 Wichtige ROS ............................................................................................................................................. 5
SINGULET-SAUERSTOFF .............................................................................................................................. 5
HYPEROXID-ANION-RADIKAL ................................................................................................................... 5
WASSERSTOFFPEROXID .............................................................................................................................. 5
HYDROXYL-RADIKAL .................................................................................................................................. 6
1.1.3 Die Doppelrolle von ROS in biologischen Systemen ............................................................................... 6
1.1.4 Merkmale der antioxidativen Abwehr ..................................................................................................... 7
SUPEROXID DISMUTASE.............................................................................................................................. 8
KATALASE....................................................................................................................................................... 8
PEROXIDASE ................................................................................................................................................... 9
VITAMIN C....................................................................................................................................................... 9
TOCOPHEROL ................................................................................................................................................. 9
CAROTENOIDE ............................................................................................................................................. 10
1.1.5 Oxidativer Stress und Huminstoffe in aquatischen Systemen.............................................................. 10
1.2 Das Untersuchungsobjekt und Vorüberlegungen ...................................................................................... 11
1.2.1 Daphnia magna......................................................................................................................................... 11
1.2.2 Vorüberlegungen...................................................................................................................................... 13
1.3 Zielstellung..................................................................................................................................................... 14
2 MATERIAL UND METHODEN ...................................................................................... 15
2.1 Daphnia magna STRAUS............................................................................................................................. 15
2.2 Fütterungsszenarien...................................................................................................................................... 15
2.3 Expositonsszenarien...................................................................................................................................... 16
2.4 RNA-Isolierung ............................................................................................................................................. 17
2.5 cDNA-Synthese.............................................................................................................................................. 18
2.6 PCR ................................................................................................................................................................ 18
2.7 Verwendete Primer ....................................................................................................................................... 19Inhaltsverzeichnis III 2.8 Primer Design................................................................................................................................................ 20 2.9 qPCR .............................................................................................................................................................. 21 2.10 Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen................................................................................ 23 2.11 DNA-Gelelektrophorese ............................................................................................................................. 23 2.12 Bioinformatik .............................................................................................................................................. 24 2.13 Geräte........................................................................................................................................................... 25 2.14 Chemikalien................................................................................................................................................. 27 2.15 Medien.......................................................................................................................................................... 29 2.16 Lösungen und Puffer .................................................................................................................................. 29 3 ERGEBNISSE ..................................................................................................................... 30 3.1 Kontrolle der RNA-Isolierung und der cDNA-Synthese ........................................................................... 30 3.2 Partielle Sequenz eines hsp60-Gens aus Daphnia magna .......................................................................... 31 3.3 Genexpression der Katalase und des hsp60-Gens in Daphnia magna ...................................................... 33 3.3.1 Kontrolle der Genexpressionanalyse ...................................................................................................... 33 3.3.2 Genexpression, normiert gegen die mit Algen kultivierten D. magna ................................................. 35 3.3.3 Genexpression, normiert gegen die mit Hefen kultivierten D. magna................................................. 36 3.3.4 Genexpression, normiert gegen die mit Algen und Vitamin C kultivierten D. magna....................... 37 3.3.5 Genexpression, normiert gegen die mit Hefen und Vitamin C kultivierten D. magna ...................... 38 4 DISKUSSION ...................................................................................................................... 40 4.1 Vergleichende Betrachtung der Expressionsdaten..................................................................................... 40 4.2 Futterqualität und Huminstoffe als Stressoren .......................................................................................... 42 4.2.1 Futterqualität als Stressor ....................................................................................................................... 42 4.2.2 Huminstoffe als Stressor.......................................................................................................................... 43 4.3 Ausblick und Fazit ........................................................................................................................................ 44 5 LITERATURVERZEICHNIS ........................................................................................... 46 5.1 Abbildungsvezeichnis.................................................................................................................................... 56 6 DANKSAGUNG .................................................................................................................. 57 7 EIGENSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG.......................................................................... 58
Abkürzungsverzeichnis IV
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
A. dest. Aqua destilatum
et al. „et alii“ (und andere)
kb Kilobasen
Mio. Million
PCR Polymerase Chain Reaction
pH negativer dekadischer Logarithmus der
Wasserstoffionenkonzentration
ROS reactive oxygen species
rpm rounds per minute
Tab. Tabelle
UV Ultraviolett
vgl. vergleiche
xg relative ZentrifugalkraftEinleitung 1
1 Einleitung
„Du bist, was du isst.“ In dieser volkstümlichen Weisheit könnte mehr Wahrheit enthalten
sein, als man auf den ersten Blick annimmt. Die Qualität der Nahrung ist ausschlaggebend für
die Qualität des Lebens. Wobei Lebensqualität hier auch für biologische Fitness, einem
langen gesunden Leben mit vielen Nachkommen, steht. In Bezug auf den Menschen ist
hinlänglich bekannt, dass die „Futterqualität“ die Lebensspanne und die Gesundheit
beeinflusst. Die Menschheit des Atomzeitalters ernährt sich nach keinem bestimmten Muster.
Sie praktiziert eine omnivore Ernährung, die abhängig vom jeweiligen Kulturkreis und seiner
Wirtschaftskraft erheblich variiert und zudem von Modetrends und anderen Einflussfaktoren
überlagert wird. Dies wirft die Frage auf, inwiefern die heute angewandten Ernährungsweisen
dem genetisch vorgegebenen Bedarf an Nährstoffen bzw. Nahrungsinhaltsstoffen
entsprechen. Diese Frage ergibt sich auch aus der Tatsache, dass sich in Industrieländern
ernährungsabhängige Krankheiten epidemieartig ausbreiten. Vermutet wird, dass dies eine
Folge der nicht artgerechten Ernährung ist.
„Essen wir mehr, als wir denken?”, fragen Anthony J. Yun und Kollegen (2005) in ihrer
Medizinischen Hypothese: „Are we eating more than we think? Illegitimate signaling and
xenohormesis as participants in the pathogenesis of obesity.”, in dieser sie die Futterqualität
mit dem Stressstatus der Nahrung verknüpfen. Sie machen den chronischen Stress, von den
als Nahrung vorgesehenen Organismen aus der Intensivtierhaltung und der Agrarindustrie, für
das gehäufte Auftreten von Fettleibigkeit verantwortlich. Eine frühe Realisierung schlechter
werdenden Futters und eine damit einhergehende Umstellung der Energieres-
sourcenverwaltung beim Konsumenten wäre ein evolutionärer Vorteil. Jedoch scheint sich in
der heutigen Zeit der Überfluss des Angebots nicht in der molekularen Zusammensetzung der
Nahrung wiederzuspiegeln. Der durch die Produktionsbedingungen hervorgerufene Stress
wird in der Nahrungskette durchgereicht. Zum Beispiel werden durch oxidativen Stress Fette
verändert und diese könnten dann zu genetisch fehlinterpretierten Signalen werden (Yun et
al., 2005).
Ein möglicher Weg, diese Fragestellung zu lösen, besteht in der interdisziplinären Klärung
der Rolle der Ernährung und anderer Umweltbedingungen als Auslöser für oxidativen Stress.
Doch was ist oxidativer Stress und wo kommt er her?Einleitung 2
1.1 Oxidativer Stress: Ein Überblick
Als sich das Leben vor 3,8 Gigajahren zu entwickeln begann, war die Erdatmosphäre stark
reduzierend. Mikroorganismen waren die dominierenden Formen und im mittleren bis frühen
Archaikum entwickelten sie die Fähigkeit der oxigenen Photosynthese (Nisbet und Sleeo,
2001; Kasting und Siefert, 2002). Der Griff des Lebens nach dem Sauerstoffatom, als ein
zentrales Atom im Elektronenhaushalt, ist sofort einsichtig mit einem Blick auf seine
Elektronegativität und der Verteilung aller Elemente in der Erdkruste (Abb.1).
Abb. 1: Häufigkeit der Elemente in der Erdkruste (Cox, 1989)
Mit der Anhäufung von Kohlenstoffdioxid (CO2), Wasser (H2O) als Reduktionsmittel und
Sonnenstrahlen als Energiequelle verbreitete sich die oxigene Photosynthese durch serielle
Endosymbiose über viele Taxa (Falkowski et al., 2004). Als Ergebnis dessen entstand
molekularer Sauerstoff (O2) in signifikanten Mengen und akkumulierte in der oberen
Atmosphäre. Dadurch wurde am Ende des Archaikums ein stark selektiver Druck gegen
anaerobe Lebensformen ausgeübt. Die Evolution der aeroben Atmung mit ihrer größeren
Effektivität und der höheren Ausbeute an Energie, wird als äußerst wichtig für die
Entwicklung vielzelliger eukaryotischer Organismen angenommen.
Bis vor etwa 500 Mio. Jahren lebten Pflanzen und Tiere ausschließlich im aquatischen
Bereich. Zu dieser Zeit betrug der Sauerstoffgehalt in der Atmosphäre nur etwa 10 % derEinleitung 3
heutigen Werte. Im Verlauf der weiteren Erdgeschichte bis zur Gegenwart war er größeren
Schwankungen unterworfen und wuchs schließlich auf den aktuellen Level von etwa 20 %
der Gesamtatmosphäre an. Sauerstoff kann ultraviolette Strahlung (UV-Licht) absorbieren
und konvertiert zu chemisch instabilen radikalischen Verbindungen.
1.1.1 Toxizität von Sauerstoff und seinen reaktiven Formen
Molekularer atmosphärischer Sauerstoff ist in seinem Grundzustand wenig reaktiv. Die, im so
genannten Triplettzustand, getrennten Ladungen der beiden ungepaarten Elektronen
verhindern, dass Sauerstoff über eine hohe Reaktionsbereitschaft verfügt und verursachen
seine paramagnetischen und biradikalischen Eigenschaften. Die ungepaarten Elektronen
limitieren seine Interaktionsmöglichkeiten mit organischen Molekülen, da diese selten auch
ein Elektronenpaar mit gleichem Spin passend zu Sauerstoff aufweisen. Es sei denn, der
Sauerstoff wird „aktiviert“. Erst wenn es durch Zufuhr von Energie, wie UV-Licht, zur
Spinumkehr eines Elektrons kommt, entsteht die energetisch angeregte Form des molekularen
Sauerstoffs, der Singulett-Sauerstoff (1O2) (Cadenas, 1989; Fridovich, 1998; Halliwell und
Gutterigde, 1999). Auch ein Elektronentransfer monovalenter Natur überführt O2 in reaktivere
Formen wie Hyperoxid-Anionen (•O2-), Wasserstoffperoxid (H2O2), Hydroxyl-Radikale
(HO•) und Peroxylradikale (ROO•). Häufig werden alle diese reduzierten Produkte des
Sauerstoffs als freie Radikale bezeichnet. Jedoch sind Radikale Moleküle mit einem
ungepaarten Elektron. Daher bezeichne ich diese Zwischenprodukte, den aktivierten
Sauerstoff, im weiteren Verlauf als reaktive Sauerstoffsspezies (engl. reactive oxygen species,
ROS) und schließe H2O2 in diese Definition mit ein.
Abb. 2: Entstehung verschiedener ROS durch Energietransfer oder schrittweiser
monovalenter Reduktion des Triplettsauerstoffs (geändert nach Apel und Hirt, 2004).Einleitung 4 Alle Zellen produzieren ROS während der respiratorischen Vorgänge, die Entstehung von ROS ist hierbei positiv mit der O2-Konzentration korreliert (Jamieson et al., 1986). Der monovalente Elektronenübergang auf O2 führt über eine sequenzielle Reduktion letztendlich zu Wasser (H2O) (Klotz, 2002) (Abb.2). In heterotrophen Zellen entstehen ROS fast ausschließlich über diesen Weg. Eine Hauptaufgabe der antioxidativen Schutzmechanismen der Zelle ist das Abfangen des Singulett-Sauerstoffs an den Orten seiner Entstehung sowie eine Reduzierung des Fluxes anderer ROS. Wichtig dabei ist die Beschränkung der Diffusionswege der ROS, um die Produktion von HO• dem gefährlichsten, weil reaktivsten ROS, einzugrenzen (Cadenas, 1989; Fridovich, 1998; Halliwell und Gutterigde, 1999). Ist die Bildungsrate der ROS größer als die Schutzfunktion der antioxidativen Systeme der Zelle, so spricht man von oxidativem Stress (Sies, 1985). In Abbildung 3 ist ein Überblick der durch ROS bedingten Auswirkungen auf die Zelle gegeben. Abb. 3: Angriffspunkte von ROS an biologischem Material (Gey, 1986).
Einleitung 5
1.1.2 Wichtige ROS
SINGULET-SAUERSTOFF
In biologischen Systemen fällt 1O2 in verschiedenen photochemischen und chemischen
Reaktionswegen an. Der Energieübergang zu O2 zum Beispiel bei photosensitiven
Reaktionen erzeugt 1O2. Dieser hat eine Lebensdauer von zirka 3,7µsek in wässriger
Umgebung und diffundiert in dieser Zeit ungefähr 82nm. Daher sind die Auswirkungen des
1
O2 nur ortsspezifisch und lokal begrenzt (Cadenas, 1989; Fridovich, 1998; Halliwell und
Gutterigde, 1999).
HYPEROXID-ANION-RADIKAL
•
O2- kann in biologischen Systemen sowohl als Oxidationsmittel, wie auch als
Reduktionsmittel wirken und wird in den mitochondrialen und mikrosomalen oxidativen
Metabolismen generiert (Sies, 1986). Außerdem ist es eines der Hauptprodukte der
Photooxidation von gelöstem organischem Material in sonnendurchlichteten Wasserkörpern
(Zafiriou et al., 1998; Goldstone und Voelker, 2000).
Die Disproportionierung des Hyperoxid-Anions führt spontan zur Formierung von
Wasserstoffperoxid oder wird durch das antioxidative Enzym Superoxiddissmutase
katalysiert. Das Hyperoxid-Anion ist extrem reaktiv, aber in den aprotischen Innenräumen
biologischer Membranen stabil und in der Lage dort konzentrationsabhängig zu diffundieren
(Takahashi uns Asada, 1988; Shiraishi et al., 1994). Auch seine Lebensdauer von 50µsek und
einer mittleren Diffusionsdistanz von 320nm erklärt sein unabhängiges und signifikant hohes
Schädigungspotenial, trotz der Leistungen der Sod (Cadenas, 1989; Fridovich, 1986;
Fridovich, 1998; Halliwell und Gutterigde, 1999).
WASSERSTOFFPEROXID
H2O2 entsteht als Nebenprodukt der Atmungskette oder durch die Photolyse von Wasser. Es
ist ungeladen und kann leicht durch biologische Membranen diffundieren. Dadurch, dass
H2O2 nicht an den Ort seiner Entstehung gebunden ist, besteht für H2O2 die Möglichkeit in
viele Reaktionen einzugreifen. Zum Beispiel schädigt es DNA oder Enzyme der
Kohlenstofffixierung (Asada und Takahashi, 1987; Cadenas, 1989; Fridovich, 1998; Halliwell
und Gutterigde, 1999). H2O2 ist aber auch in wichtige zellbiologische Vorgänge, wie dieEinleitung 6
Apoptose, involviert (Halliwell und Gutterigde, 1999). Die so genannte Fenton-Reaktion des
Wasserstoffperoxids ist eine durch Eisensalze katalysierte Oxidation organischer Substrate in
saurem Medium. Die Fenton-Reaktion ist in biologischen Systemen eine wichtige Quelle der
reaktiven Sauerstoffspezies (Fenton, 1894).
HYDROXYL-RADIKAL
Das reaktivste der ROS ist in der Lage mit allen biologischen Molekülen zu reagieren. Es
tendiert dazu, radikalische Kettenreaktionen zu starten und kann Membranlipide, Proteine und
Nukleinsäuren oxidieren (Asada und Takahashi, 1987; Cadenas, 1989; Fridovich, 1998;
Halliwell und Gutterigde, 1999). Die Produktion von HO• wird in der Zelle über die
Verfügbarkeit des Eisen-Ions geregelt. Besonders bei der Reduzierung von Eisen(II) zu
Eisen(III) Verbindungen kann es zu einer anhaltenden Fenton Reaktion kommen und HO•
wird fortlaufend generiert (Cadenas, 1989; Fridovich, 1998; Halliwell und Gutterigde, 1999).
1.1.3 Die Doppelrolle von ROS in biologischen Systemen
Die unterschiedlichsten biochemischen Reaktionen sind an der Produktion reaktiver
Sauerstoffspezies beteiligt (Halliwell und Gutterigde, 1999). Die Gesamtheit der bei diesen
Vorgängen anfallenden ROS wird, unabhängig von ihrer Herkunft, Funktion oder
Lokalisation, als „oxidativer Stress“ bezeichnet. Dieser stark verallgemeinernde Begriff, wird
dem Stellenwert dieser Moleküle in der Zelle nicht gerecht. Einige ROS werden auch als
physiologisch bedeutsame Signalmoleküle diskutiert, besonders in so wichtigen
Funktionsbereichen wie der Regulation genetischer Programme. Auch das
Schädigungspotential der ROS wird zum Beispiel von Pflanzen, über eine induzierbare
Abwehrreaktion, den oxidativen Burst, vorteilhaft genutzt.
Der Schaden durch ROS an Biomolekülen ist bemerkenswert. Fette, Proteine und
Nukleinsäuren werden durch ROS angegriffen (siehe 1.1.1 Abb.3).
Der oxidative Schaden an Lipiden spiegelt sich hauptsächlich in der veränderten
Membranfluidität wieder (Halliwell und Gutterigde, 1999). Werden zum Beispiel Lipide in
Mitochondrien oxidiert, hat dies gravierende Effekte auf die Enzymaktivitäten der ATP-
Produktion und kann die Apoptose initiieren (Green, 1998).
Der oxidative Schaden an Proteinen manifestiert sich in ortsspezifischen
Aminosäureveränderungen. Diese Veränderungen können Fragmentierungen oder falscheEinleitung 7
Assemblierungen bewirken und führen häufig zur Degradierung der Proteine. Auch die
veränderten Ladungsverhältnisse wirken sich negativ auf die Funktion der Proteine aus
(Freeman und Crapo, 1982). Bei vielen Enzymen wird durch den Angriff der ROS auf das
aktive Zentrum die Enzymfunktion inaktiviert, ein Beispiel ist die Oxidation von Eisen-
Schwefel-Zentren durch •O2- (Freeman und Crapo, 1982; Hyslop et al., 1988). Eine große
Auswahl von Proteinen wird durch ROS geschädigt und die Akkumulation dieser wird als
Teil des Alterungsprozesses diskutiert (Dean et al., 1993; Stadtman, 1986).
Der oxidative Schaden an Nukleinsäuren ist nicht weniger pathologisch. Insbesondere an der
DNA sind die Schäden wie Einzelstrangbrüche, Deletionen und „cross-links“ mit Proteinen
katastrophal (Imlay und Linn, 1988; Imlay 2003). Die meisten dieser Schäden sind auf die
Fenton-Reaktion in Anwesenheit von Übergangsmetallen zurückzuführen (Imlay und Linn,
1988; Imlay 2003). Jede eukaryotische sowie auch jede prokaryotische Zelle besitzt DNA-
Reparatursysteme und die Balance zwischen Schädigung und Reparatur bestimmt das
Schicksal dieser Zellen (Beyer et al., 1991).
Während der Aufrechterhaltung dieser Balance ist einiges an Signalübertragung zu leisten
und an dieser Stelle treten auch ROS als Second Messenger in Erscheinung (Schreck und
Baeuerle, 1991). Die Regulierung und die Produktion von ROS spielt eine große Rolle bei der
Expression von verschiedenen Transkriptionsfaktoren, Hitzeschock induzierten Faktoren und
von Zell-Zyklus-Genen (Zheng, 1998; Martindale und Holbrook, 2002). Sowohl die Apoptose
als auch die Nekrose können durch oxidativen Stress eingeleitet werden. Bei einem höheren
Stress wird die Nekrose initiiert und bei einem geringeren Stress wird erst der Zellzyklus
unterbrochen und anschließend die Apoptose eingeleitet (Halliwell und Gutterigde, 1999;
Martindale und Holbrook, 2002; Johnson et al., 1996). Dies zeigt die potentielle Eignung
reaktiver Sauerstoffspezies als zelluläre Botenstoffe und illustriert wie entscheidend das
zelluläre Gleichgewicht beeinträchtigt werden kann. Die daraus folgende Disregulierung
ganzer Gengruppen könnte von zentraler Bedeutung für die molekularen Mechanismen der
unterschiedlichsten Krankheiten sein. Besprochen werden solche Zusammenhänge unter
anderem für die Karzinogenese und den Alterungsprozess (Halliwell und Gutterigde, 1999;
Droge, 2002).
1.1.4 Merkmale der antioxidativen Abwehr
Antioxidantien gleichen sich in ihren Wirkungsmechanismen, sie reagieren mit den
oxidierenden Stoffen und machen diese dabei unschädlich. Durch die Reaktion verbrauchenEinleitung 8
sich die Antioxidantien und müssen nachgeliefert oder regeneriert werden. Es unterscheiden
sich die enzymatische und die nicht enzymatische antioxidative Abwehr. Zur enzymatischen
Abwehr gehören Enzyme wie die Superoxid Dismutase (Sod) (EC 1.15.1.1), die Katalase
(Kat) (EC 1.11.1.6) und die Peroxidasen (EC 1.11.1.7).
SUPEROXID DISMUTASE
Die Sod wurde von McCord und Fridovich als erste beschrieben (McCord und Fridovich,
1969). Es gibt verschiedene Formen des Metalloproteins mit verschiedenen Ausprägungen
des aktiven Zentrums wie das, Mn, Fe oder Cu/Zn. Zentrum. Die Cu/Zn Sod kommt im
Zytosol von Eukaryoten vor, wurde aber auch in Chloroplasten, Bakterien, Peroxisomen und
als extrazelluläres Enzym gefunden (Halliwell und Gutterigde, 1999; Sandalio und del Rio,
1988). Alle eukaryotischen Formen der Sod sind kernkodiert und werden an ihren
Bestimmungsort über eine aminoterminale Zielsequenz dirigiert (Bannister et al., 1987). Als
ein effizienter Katalysator ist die Sod mit einer Konzentration von 10-5 M und einer
Umsatzrate von 2 x 109 mol l-1 s-1 in der Lage die Konzentration des •O2- auf konstante 10-10
M zu beschränken (Asada und Takahashi, 1987; Cadenas, 1989; Fridovich, 1998; Halliwell
und Gutterigde, 1999; Jamieson et al., 1986).
KATALASE
Die Katalase ist ein Häm enthaltendes, in Eukaryoten kernkodiertes Enzym, das die Reaktion
von H2O2 zu H2O und O2 katalysiert. Durch einen hohen Km für H2O2 ist die Katalase sehr
effizient im Abbauen hoher H2O2-Konzentrationen (Asada und Takahashi, 1987; Cadenas,
1989; Fridovich, 1998; Halliwell und Gutterigde, 1999; Jamieson et al., 1986). Die Katalase
ist in allen aeroben Organismen vertreten und befindet sich vor allem in den Peroxisomen.
Man unterscheidet monofunktionale Katalasen von bifunktionalen Katalase-Peroxidasen die
zur Katalaseaktivität auch noch Peroxidaseaktivität besitzen. Monofunktionale Katalasen
kommen in Prokaryoten, Eukaryoten und Archaen vor. Bifunktionale Katalsen kommen
dagegen nur in Prokaryoten und Archaen (Brown-Peterson und Salin, 1995; Fraaije et al.,
1996; Terzenbach und Blaut, 1998) vor. In Pflanzen sind verschiedene Isoformen
monofunktionaler Katalasen gefunden worden, während aus Tieren bisher nur eine Form
isoliert wurde (Scandalios et al., 1997; Guan und Scandalios, 1996).Einleitung 9
PEROXIDASE
Peroxidasen katalysieren wie Katalasen, die Reduktion von H2O2 zu H2O, aber brauchen
dafür eine Elektronenquelle die oxidiert wird. Die Ascorbatperoxidase (EC 1.11.1.11), zum
Beispiel ist ein Häm-enthaltendes Enzym mit einer Masse von 30kD und einem signifikant
niedrigeren Km für H2O2 als der Km, der Katalase. Die Ascorbatperoxidase verbraucht als
Elektronendonor Ascorbat (Asada und Takahasi, 1987). Peroxidasen (EC 1.11.1.7) sind in
Bakterien, Pilzen, Pflanzen und Vertebraten weit verbreitet.
Zur nichtenzymatischen Abwehr gehören Stoffe wie Vitamin C, Tocopherol (Vitamin E) und
Karotinoide.
VITAMIN C
L-Ascorbinsäure ist ein essenszielles Vitamin das alle Pflanzen und Tiere, außer dem
Menschen, selbst de novo synthetisieren können. Tiere können Vitamin C auch mit der
Nahrung aufnehmen und so ihren antioxidativen Stoffwechsel unterstützen. Vitamin C ist ein
Reduktionsmittel für viele ROS und vermindert so die durch ROS verursachten Schäden. Es
reagiert nicht nur mit H2O2 sondern auch mit •O2- und HO• (Asada und Takahashi, 1987;
Cadenas, 1989; Fridovich, 1998; Halliwell und Gutterigde, 1999; Jamieson et al., 1986).
Außerdem, durch die Überführung des α-Tocopherol in seinen reduzierten Grundzustand und
als Substrat für die Ascorbatperoxidase, hemmt Vitamin C die reaktiven Sauerstoffspezies
auch noch auf indirektem Weg.
TOCOPHEROL
Vitamin E (Tocopherole) sind phenolische, fettlösliche Antioxidantien die in Pflanzen und
Tieren gefunden werden (Asada und Takahashi, 1987; Cadenas, 1989; Fridovich, 1998;
Halliwell und Gutterigde, 1999; Jamieson et al., 1986). Pflanzen können z.B: α- Tocopherol
de novo synthetisieren, dagegen müssen Tiere es über die Nahrung aufnehmen. Es ist
hydrophob und ist daher zwischen den Lipiddoppelschichten von Membranen zu finden. Weil
es durch viskose Fette diffundieren kann schützt es in diesen Bereichen vor Lipidperoxidation
(Yamamoto et al., 2001).Einleitung 10
CAROTENOIDE
Carotenoide sind, fettlösliche Antioxidantien die es in Pflanzen und Tieren gibt (Asada und
Takahashi, 1987; Cadenas, 1989; Fridovich, 1998; Halliwell und Gutterigde, 1999; Jamieson
et al., 1986). Tiere müssen Carotenoide über die Nahrung aufnehmen. Pflanzen hingegen
können Carotenoide de novo synthetisieren. In photosynthetisch aktiven Organismen wirken
einige Carotenoide als akzessorische Pigmente in den Lichtsammelkomplexen und andere
sind speziell zur Reduzierung der anfallenden ROS bei Überanregung der
Lichtsammelkomplexe bestimmt (Asada und Takahashi, 1987; Cadenas, 1989; Fridovich,
1998; Halliwell und Gutterigde, 1999; Jamieson et al., 1986; Yamamoto et al., 2001).
1.1.5 Oxidativer Stress und Huminstoffe in aquatischen Systemen
Die Konsequenzen von oxidativem Stress in aquatischen Systemen sind bisher wenig
untersucht in Relation zum Organismus selbst und dem Ökosystem. Der im Zuge der
fortschreitenden weltweiten Industrialisierung zunehmende anthropogene Schadstoffeintrag in
die aquatische Umwelt stellt für ihre Lebensgemeinschaften ein hohes Gefährdungspotential
dar. Als Eintragsquellen der Schadstoffe in aquatische Ökosysteme gelten vor allem Fabriken,
Schiffshavarien, Verklappung und die atmosphärische Deposition (Emissionen). Neben den
anthropogenen Schadstoffen, wie chlorierte Kohlenwasserstoffe, polyzyklische aromatische
Kohlenwasserstoffe und Schwermetallen (Haarich und Harms, 1997; Menzel et al., 2007) sind
auch natürliche Stoffe wie Huminstoffe Quellen für Stress (Steinberg et al., 2003, 2006;
Timofeyev et al. 2006). Viele biotische und abiotische Faktoren bestimmen den Stresslevel
der aquatischen Bizönosen. Besonders das Zooplankton als Primärkonsument ist abhängig
von klimatischen Parametern wie Temperatur und Licht (Geller, 1975), Wasserqualität,
Predationsrisiko (Vanni, 1986; Pauwels et al., 2005) und der Qualität wie auch Quantität des
Futterangebots (Krause-Dellin und Steinberg, 1986). In nährstoffarmen Süßwassersystemen
ist der Anteil an gelösten organischen Kohlenstoff (engl: dissolved organic matter, DOM)
eine Zehnerpotenz höher als aller organischer Kohlenstoff in allen dort lebenden Organismen
und besteht zum größten Teil aus gelösten Huminstoffen (Wetzel, 2001; Thurman, 1985). Die
Photochemie von lichtabsorbierenden gelösten Huminstoffen ist ein wichtiger Teil des
globalen Kohlenstoffzyklus. Jedes Jahr werden rund 34 x 1012 Mol terrigenen, organischen
Kohlenstoff (0,4 Terragramm Kohlenstoff) in die Ozeane eingetragen, wovon große Teile
photochemisch umgesetzt werden (Goldstone und Voelker, 2000). Ein Ergebnis der
Absorption von Photonen in DOM, ist eine direkte Produktion von radikalischenEinleitung 11
Verbindungen aus DOM. Bei der indirekten Produktion von ROS aus Licht, Wasser und den
DOM-Radikalen entstehen Intermediate wie 1
O2, •O2- und H2O2 (Goldstone et al., 2002).
H2O2 hat von diesen Intermediaten die längste Lebenszeit im Wasser und da es leicht durch
biologische Membranen gelangen kann, erhöht es den oxidativen Stress des Phyto- und
Zooplanktons (Asada, 1987; Cadenas, 1989; Fridovich, 1998; Halliwell und Gutterigde, 1999;
Mopper und Kieber, 2000).
1.2 Das Untersuchungsobjekt und Vorüberlegungen
1.2.1 Daphnia magna
Als eine Schlüsselspezies aquatischer Ökosysteme sind Daphnien repräsentativ für die
Untersuchung allgemeiner ökologischer Prozesse und besitzen die praktischen Vorteile eines
Modellorganismus. Weltweit gib es über 200 Arten von Daphnia (Colbourne, 1997). Sie
weisen schnelle Lebenszyklen auf, sind aufgrund ihrer geringen Größe einfach und Platz
sparend zu halten (Lass und Spaak, 2003). Ihre periodische, parthenogenetische
Fortpflanzung ermöglicht die Kultivierung klonaler Abstammungslinien. Daphnia magna, der
große Wasserfloh ist mit einer Größe von 0,7 mm bis 6 mm mit bloßem Auge zu erkennen
und dadurch gut handhabbar.
Taxonomisch gehört Daphnia magna in den Stamm Arthropoda (Gliederfüßer) und ordnet
sich in den, aus molekularbiologischer Sicht als eine monophyletische Gruppe verstandenen,
Unterstamm Crustaceae (Krebstiere; Brünnich 1772) wie folgt ein (Brands, 2000).
Klasse Branchiopoda (Latreille, 1817)
Unterklasse Phyllopoda (Blattfußkrebse; Preuss, 1951)
Ordnung Cladocera (Wasserflöhe; Latreille, 1829)
Unterordnung Anomopoda (Ungleichfüßer; Stebbing, 1902)
Familie Daphni(i)dae (Wasserflöhe im eigentlichen Sinne;
Straus, 1820)
Gattung Daphnia (Wasserfloh; O.F. Müller, 1785)
Daphnia magna STRAUS, spielen eine große Rolle im Nahrungsnetz. Dort werden sie ihrer
Schlüsselrolle, durch ubiquitäre Verbreitung und als filtrierende Zooplankter die dieEinleitung 12 Nahrungsgrundlage für höher gestellte trophische Ebenen bilden, gerecht (Wesenberg-Lund, 1939; Lampert, 1987). Extreme Temperaturen, Futtermangel und Überbevölkerung führen bei D. magna zu einer Änderung der Fortpflanzungsstrategie, bei der aus asexuellen Eiern dann auch Männchen gebildet werden (siehe Abb.4b). Durch die Männchen können die, unter diesen Bedingungen entstandenen haploiden Dauereier befruchtet werden. Das so durch Modifizierung des Carapax (siehe Abb.4a) entstandene Ephippium, ist aufgrund seiner festen Hülle in der Lage mehrere Monate bis Jahre zu überdauern (von Clifford, 1935; Innes, 1997). a) b) Abb. 4: a) Morphologie von Daphnia magna (geändert nach Paul, 2005) b) Reproduktionszyklus Daphnia magn, oben: Parthenogenese, unten: Heterogonie (Limburg, 2000) Die im Verhältnis zum Körper sehr großen sekundären Antennen (siehe Abb.4a) ermöglichen die für Wasserflöhe typische zuckende Schwimmbewegung. Daphnien filtrieren Partikel, mit Hilfe eines von Thoracopoden und Carapax gebildeten Filterapparats (Freyer, 1991), passiv aus dem Wasser und können so nur nach Größe und nicht nach Qualität differenzieren. Die untere Grenze der Größenklasse der Partikel wird durch die Maschenweite der Thoracopoden und die obere Größenklasse der Partikel wird durch die Öffnung des Carapax bestimmt (Gliwicz und Siedlar, 1980). Die Mitglieder des Pico- bis Mikro-planktons, Algen und Bakterien stellen die Hauptnahrungsquelle der Daphnien dar (Lampert, 1987). Bei Schwankungen des Nahrungsangebots ist eine kurzfristige Anpassung der Nahrungsaufnahme durch Modulierung der Schlagfrequenz der Thoracopoden möglich (Gliwicz und Siedlar, 1980). Die Ernährung hat eine große Bedeutung für den oxidativen Status des Organismus. Je nach Zusammensetzung, Qualität und Schadstoffbelastung kann sie einerseits selbst zur Belastung des Organismus werden oder andererseits zur Unterstützung der antioxidativen Kapazität beitragen. Somit ist eine ungeeignete Ernährung ein wichtiger Stressfaktor. Die
Einleitung 13
Qualität der Nahrung von Daphnia magna steht in Beziehung zu ihrem Gehalt an
mineralischem Phosphor, mehrfach ungesättigten Fettsäuren und Vitamin C (Koch et al.,
2009). Die Grünalge Pseudokirchneriella subcapitata, mit ihrem hohen Vitamin C Gehalt
eignet sich daher als Futter guter Qualität. Im Gegensatz dazu gilt die Hefe Saccharomyces
cerevisiae als Futter schlechter Qualität da sie wenig mehrfach ungesättigte Fettsäuren enthält
und kein Vitamin C synthetisieren kann (Amako et al., 2006).
1.2.2 Vorüberlegungen
Der Hauptteil der Gene aller Organismen unterliegt einer zelltyp-, entwicklungs- und
signalabhängigen differentiellen Expression. Diese dynamische Expression von Genen ist
eine fundamentale Voraussetzung für viele grundlegende Prozesse in einer Zelle. Bei der
Zellteilung, der Differenzierung, der Zellalterung und dem Zelltod werden unterschiedliche
Proteine in genau definierten Abfolgen benötigt, was durch gezielte Regulation der
entsprechenden Gene erreicht wird. Auch um auf Einflüsse von Außen, wie Stress zu
reagieren, sind Zellen auf eine dynamische Regulation der Genexpression angewiesen.
Beispielsweise unterliegen viele antioxidative Enzyme einem 24-stündigen lichtabhängigen
Expressionszyklus mit einem Maximum zur strahlungsreichen Mittagszeit (Hollnagel et al.,
1996; Butow et al., 1997).
Um die Frage nach den Auswirkungen von verschiedenen, oft gleichzeitig auftretenden,
umweltbedingten Stressfaktoren auf die antioxidative Abwehr zu untersuchen, soll Daphnia
magna mit zwei verschiedenen Futterqualitäten und zwei naturnahen
Huminstoffkonzentrationen (Thurman et al., 1985; Wetzel, 2001) kultiviert werden. Die
Kultivierung sollte über mehrere Generationen erfolgen, um maternalen Effekten und
kurzfristigen Anpassungen der Versuchtiere vorzubeugen. Ein 24h-Licht Regime sollte
tageszeitlich bedingten Schwankungen der Expression der Zielgene vorbeugen Außerdem soll
eine Versuchsreihe mit Vitamin C Zusatz angesetzt werden, um zum Beispiel mögliche
Mangelerscheinungen in den mit S. cerevisiae gefütterten D. magna auszugleichen und somit
eine mögliche Rolle von Vitamin C auf die Expressionslevel der Zielgene zu zeigen. Das
erste Zielgen, die Katalase ist eines der wichtigsten antioxidativen Enzyme und somit gut
geeignet, das ihr m-RNA-Expressionlevel, Aussagen über den oxidativen Status eines
Organismus zulässt. Bei der Funktionsananalyse von Genen und der Erforschung
ökologischer Zusammenhänge, ist das Vorliegen und Entschlüsseln genetischer Information
ausschlaggebend. Daher wurde das bisher in D. magna nicht identifizierte aber imEinleitung 14
Zusammenhang mit oxidativen Stress und der Katalase stehende (Cabiscol et al., 2002;
Campanella et al., 2008; Pauwels et al., 2007) hsp60-Gen identifiziert und im gleichen
Kontext als zweites Zielgen auf sein m-RNA-Expressionlevel untersucht.
Hitzeschockproteine mit einem Gewicht von 60kd sind Chaperonine in Mytochondrien die z.
B.: die Katalase in der Rinderleber vor Missfaltung schützen (Hook und Harding, 1997) und
haben daher möglicherweise auch in D. magna einen ähnlichen Stellenwert. Für ein
vollständigeres Bild sollen, in zwei parallel durchgeführten Diplomarbeiten, die ökologischen
Aspekte wie Fertilität und Lebensspanne (Bouchnak, 2009) sowie die antioxidative
Gesamtkapazität (TOSC engl.: total oxidant scavenging capacity), der Gehalt an Vitamin C,
L-Prolin und des Hsp60-Proteins (Ouerghemmi, 2009) untersucht werden.
1.3 Zielstellung
Um sowohl generelle als auch spezifische Wirkmechanismen aufzuzeigen, die mit oxidativem
Stress und seiner Wirkung im Ökosystem in Verbindung stehen, wurden im Rahmen dieser
Diplomarbeit aquatische Schlüsselorganismen der ersten trophischen Ordnung analysiert. Die
meisten, ähnlichen Arbeiten konzentrieren sich auf die Auswirkungen nur eines Stressfaktors,
jedoch sind die Organismen in natürlichen Umgebungen häufig mehreren simultan wirkenden
Stressoren ausgesetzt. Dabei stellen sich die Fragen, wirken diese Faktoren synergisch oder
antagonistisch und durch welche potentiellen Mechanismen kommen diese Wirkungen in
lebenden Systemen zum tragen. Zur Klärung dieser und weiterer Fragen, wurden
molekularbiologische Aspekte der antioxidativen Abwehr von D. magna, auf ihre
Aussagekraft über den oxidativen Status, untersucht. Wobei die Effekte, verschiedener
Futterqualitäten und verschiedener Huminstoffkonzentrationen, auf die Expressionslevel der
Katalase und des hsp60-Gens im Vordergrund stehen. Dazu wurde die Aufdeckung der
hsp60-DNA-Sequenz in D. magna angestrebt, um ein weiteres Werkzeug für die Generierung
von Anhaltspunkten über den Stressstatus einer wichtigen Schlüsselspezies zu schaffen.
Weiterhin wurde die Frage formuliert, besteht ein Zusammenhang zwischen der Katalase-
Expression und der hsp60-Expression bei oxidativen Stress. Dabei sollten die Huminstoffe
und eine qualitativ schlechte Nahrung (z.B.: Hefe) als Stressoren im Fokus stehen. Es wurde
die Hypothese aufgestellt: das, der durch schlechte Nahrung, ohnehin schon ungünstige
oxidative Status, der Organismen, sich durch den zweiten Stressor Huminstoff noch weiter
verschlechtern würde. Darüber hinaus wurde getestet, ob der Zusatz des Antioxidants Vitamin
C wie angenommen, zu einer Verbesserung des oxidativen Status in allen Fällen beiträgt.Material und Methoden 15
2 Material und Methoden
2.1 Daphnia magna STRAUS
Der getestete D. magna Klon wurde im Jahr 2000 vom Umweltbundesamt in Berlin bezogen.
Im Vorfeld der Experimente wurden D. magna, aller Fütterungs- und Expositions- Szenarien,
für mindestens 5 Generationen vor dem Beginn der Probennahme für die Messungen,
kultiviert. Alle Tiere des Versuchs stammen von einem Exemplar ab und hatten somit
synchrone Reproduktionszykluszeiten. Daraus folgt, dass alle Messreihen mit gleich alten D.
magna erfolgten.
2.2 Fütterungsszenarien
Die Tiere wurden in dem künstlichen Medium ADaM (Aachener Daphnien Medium) nach
Klüttgen et al. (1994) kultiviert. In den vorliegenden Versuchen wurde eine Zehn mal höhere
Natriumhydrogencarbonatkonzentration verwendet, um die pH-Wert Änderung, in den
Testreihen mit Vitamin C Zusatz abzupuffern. Die Hälterung erfolgte, in 1l Bechergläsern mit
maximal 50 adulten Tieren pro Liter Medium, bei 21±1°C, unter Permanentlicht. Der
Medienwechsel erfolgte alle 2 Tage und wurde über eine 1l fassende Fotoschale realisiert, aus
der die umzusetzenden Tiere in frisches Medium mit einer abgeschnittenen 10ml
Plastikpiepette (Elkay Eireann) überführt wurden. Jeweils 10 adulte Tiere, jeder
Testgeneration und jeder Futterkondition, wurden nach dem Schlupf ihres ersten Geleges in
doppelt destilliertem H2O (ddH2O)(Millipore) gewaschen, sofort in flüssigen Stickstoff
eingefrorenen und bei -80°C gelagert.
Es wurden zwei grundsätzliche Diäten gefüttert. Erstens, als Futter guter Qualität (Muñoz-
Mejía und Martínez-Jerónimo, 2007), die Alge Pseudokirchneriella subcapitata (Koršikov)
Hindák. Der verwendete P. subcapitata Stamm NIVA-CHL 1 wurde aus der
Stammsammlung für Algen von der Universität Göttingen Deutschland bezogen. Die Algen
wurden axenisch, unter Permanentlicht mit 40 µmol Photonen pro m-2 sec-1, bei 21±1°C in
FW04-Medium (Nicklisch et al., 2008) bis zur späten exponentiellen Wachstumsphase
angezogen. Diese Batchkulturen wurden während der Anzucht in 500ml Erlenmeyerkolben
mit gereinigter Luft begast. Nach der Ernte wurden die Algen bei 4°C gelagert. Die FütterungMaterial und Methoden 16
der Wasserflöhe erfolgte alle 2 Tage ad libitum und orientierte sich an der Menge, der nach
einem Tag sedimentierten Algen in den D. magna-Versuchsgefäßen.
Zweitens, als nicht optimale Nahrung für D. magna (siehe 1.2.1), wurde kommerzielle
Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae (UNIFERM) verfüttert. Die Hefe wurde im
Kühlschrank gelagert und vor der Fütterung in ADaM gelöst, so dass eine Endkonzentration
von 50mg/l Hefe in der Daphnien-Kultur erzielt wurde. Dieser Wert orientiert sich an der
Menge der sedimentierten S. cerevisiae Zellen nach 24h in den D. magna-Versuchsgefäßen.
2.3 Expositonsszenarien
Die für die Exposition vorgesehenen Wasserflöhe, beider Fütterungsszenarien, waren
während ihrer gesamten Lebensspanne jeweils, entweder Huminstoff oder Vitamin C oder
Huminstoff und Vitamin C, ausgesetzt. Beide Zusätze wurden in ADaM gelöst und immer
frisch alle zwei Tage während des Medienwechsels hinzu gegeben. Für die Experimente
wurde der Huminstoff HuminFeed® (Humintech) verwendet. Die Verwendung von
HuminFeed® soll keine Werbung für dieses Produckt sein. HuminFeed® ist ein Leonardit und
enthält 43% organischem Kohlenstoff. Es besteht zu 82% aus Huminstoffen (Humin- und
Fulvo-Säuren 70%-80%) und zu 18% aus niedermolekularen Komponenten (Natrium 12%)
(Meinelt et al., 2007; www.humintech.com, Stand Juni, 2009). Es wurden zwei HF-
Konzentrationen getestet, 1g/l HF und 25g/l HF. Die verwendeten HF-Konzentrationen
entsprechen 0,036mmol/l und 0,89mmol/l gelösten organischen Kohlenstoffs (DOC) und
wurden ähnlich den DOC-Konzentrationen von natürlichen Süßwasserhabitaten gewählt.
Für die Vitamin C beinhaltenden Versuchansätze wurde L-Ascorbinsäure (Sigma Aldrich), zu
einer Endkonzentration von 2mg/l, eingewogen.
Die Zusammensetzung der Expositionszenarien der gesamten Testreihe ist in Tabelle 1
aufgelistet.Material und Methoden 17
Tab. 1 Auflistung der Testszenarien. P.s. = Pseudokirchneriella subcapitata, S.c. =
Saccharomyces cerevisiae, HF1 = 1g/l HuminFeed®, HF2 = 25g/l HuminFeed®, VC = 2mg/l
Vitamin C
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
P.s. + + + + + +
S.c. + + + + + +
HF1 + + + +
HF2 + + + +
VC + + + + + +
2.4 RNA-Isolierung
Die gefrorenen Wasserflöhe, wurden in ein mit 300µl Trizol und mit 1/5 Volumen (Vol.)
Glasmurmeln (0,5 mm Durchmesser) gefülltes Reaktionsgefäß (Nunc Safe Flow Speedmill
Reaktionsgefäß) gegeben. Dieses wurde dann in einer Schüttel-Mühle (Speedmill aj
cybertron), viermal eine Minute lang geschüttelt. Dabei wurden die Reaktionsgefäße
zwischen den Schüttelgängen eine Minute auf Eis gekühlt. Das so entstandene Homogenat
wurde in einem neuen Reaktionsgefäß mit 200µl Chloroform versetzt und 10sek lang
geschüttelt. Anschließend wurde es in einer Zentrifuge (Megafuge 1.0R Heraeus Instruments)
für 2min mit einer Geschwindigkeit von 13000rpm zentrifugiert. Die so entstandene wässrige
Phase wurde mit einer Pipette (Eppendorf) in ein neues Reaktionsgefäß transferiert und mit
gleichem Volumen Chloroform versetzt, 10sek lang geschüttelt und anschließend für 2min
mit 13000rpm zentrifugiert. Die entstandene obere wässrige Schicht wurde mit einer Pipette
in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit 0,8 Vol. 2-propanol versetzt. Anschließend
wurde das Gemisch über Nacht bei einer Temperatur von 4°C inkubiert. Nach der
Inkubationszeit wurde die Probe für 30min bei 15000rpm und 4°C zentrifugiert. Zunächst
wurde der Überstand abgenommen, verworfen und 200µl 70% Ethanol hinzugegeben. Darauf
folgte eine zweiminütige Zentrifugation bei 15000rpm und einer Temperatur von 4°C. Der
Überstand wurde komplett abpipettiert und das Pellet an der Luft getrocknet. Dieser Vorgang
wurde mit einer Vakuumzentrifuge (SpeedVac. 5000) beschleunigt. Das getrocknete Pellet
wurde in 200µl ddH2O resuspendiert.
Für eine saubere, DNA freie RNA wurde die Suspension mit einem kommerziellen RNA-
Isolierungssystem (High Pure RNA Isolation Kit, Katalognummer: 11828665001, VersionMaterial und Methoden 18
Dezember 2005, Arbeitsanweisung 2.2 von Roche) aufgearbeitet. Der erste Schritt in der
Arbeitsanweisung 2.2 wurde weggelassen, stattdessen wurden die kompletten 200µl RNA-
Suspension der Trizolisolierung eingesetzt um die Konzentration des firmeneigenen
Bindepuffers zu gewährleisten. Es wurde mit 50µl RNAase freien ddH2O eluiert und die
RNA bei -80°C gelagert. Die Reinheit der RNA und die Ausbeute wurden photometrisch über
den Quotienten der Absorption bei 260nm und 280nm bestimmt. Um die Integrität der RNA
zu zeigen wurde eine Gelelktrophorese durchgeführt.
2.5 cDNA-Synthese
Aus der RNA-Lösung wurden 2µl entnommen und mit 8µl ddH2O verdünnt, so dass in diesen
10µl RNA-Lösung zirka 1µg-5µg RNA enthalten waren. Die Konzentration wurde in einem
Photometer (Spec.Gene) überprüft. Die 10µl RNA-Lösung wurden dann mit 0,8µl Oligo dt
Primer-Lösung (Promega #C1101; 0,5µg/µl) vermischt, geschüttelt und für 5min bei 70°C
inkubiert. Anschließend wurden die Proben sofort in Eis abgekühlt. Für jede Probe wurden
3,0µl fünffach konzentrierten RT-Puffer (Promega), 0,8µl dNTPs (10mM), 0,4µl Revertase
(M-MLV Revertase Promega #M1701; 200u/µl) in einem so genannten Master-Mix
vorbereitet und 4,2µl des Master-Mix zu jeder einzelnen RNA-Probe hinzugegeben.
Diese Proben wurden anschließend für 90min auf 42°C inkubiert und danach für 4min auf
90°C erwärmt um die Reaktion zu stoppen. Nach dem Stoppvorgang wurden die Proben bei
Raumtemperatur abgekühlt und danach auf Eis gelegt. Im weiteren Verfahren wurde auf Eis
gearbeitet. Die so hergestellten 15µl cDNA-Lösung wurden noch 1:10 verdünnt, um adäquate
Mengen cDNA in den folgenden PCR´s einsetzen zu können. Die Lagerung erfolgte bei -
80°C.
2.6 PCR
Es wurden für alle verwendeten Gene PCR´s zur Kontrolle der Amplikons durchgeführt um in
den folgenden qPCR´s zu gewährleisten, dass die richtigen DNA-Fragmente. detektiert
werden. Es wurden Oligonukleotidprimer (siehe Tab.1) verwendet, welche komplementär zu
den Enden der zu amplifizierenden DNA-Vorlage sind. Durch die thermostabile Taq-
Polymerase und die Anwesenheit von Desoxynucleosid-triphosphaten (dNTPs) wurden dieMaterial und Methoden 19
Primer an der denaturierten einzelsträngigen DNA-Vorlage verlängert. Folgender Ansatz
bildete die Grundlage der erfolgten PCR- Variationen.
Hot Star Taq – PCR-Ansatz (Fa. Quiagen):
10 x Polymerasepuffer 2 µl
dNTPs (10 mM) 0,3 µl
Vorwärtsprimer 0,2 µl
Rückwärtsprimer 0,2 µl
Template DNA 1 µl
Taq-Polymerase (5 U/µl) 0,1 µl
ddH2O 16,2 µl
Die Ansätze wurden in einem Thermocycler (Techne Touchgene Gradient) temperiert. Die
entsprechenden Primer sind der Tabelle 1 zu entnehmen.
2.7 Verwendete Primer
Die entsprechenden PCR wurden mit den in Tabelle 2 aufgelisteten Primern durchgeführt.
Alle Primer wurden von der Firma Invitrogen hergestellt.
Tab. 2 Primerdetails (Y=C+T; M=A+C; D=A+T+G; R=A+G; N=A+C+T+G; W=A+T;
K=T+G; V=A+C+G; S=C+G; I=Desoxyinosin)
Primer- Sequenz Annealing- Fragmet- Herkunft
bezeichnung temperatur größe
(5’-3’) (°C) (bp)
Selbst-
FACTIN DM182.2 CCA AAC GTG GTA TTT TGA CTC 55,5
konstruiert
232
(siehe
RACTIN DM414.2 CTG GAT GGT AAC GTA CAT GG 59,3
Abschnitt 2.8)
Selbst-
HSP60DEGENV AAR GAY GGI GTS ACY GTI GC 58,12 konstruiert
155 (siehe
HSP60DEGENR CKY TCR AAC TTC ATI CCY TC 55,3 Abschnitt 2.8)
Selbst-
HSP60ORIGINALV ACC TGG TGA TGG AAC AAC TG 55 konstruiert
202 (siehe
HSP60ORIGINALR TGA GAT AGT GGC AAC CTG AG 55 Abschnitt 2.8)
A. Jarosch,
KAT6JV TTT CTC TTC GCC CAG AGA CC 59,3 (2006)
481
KAT6JR GGC ACG AGG CAC AAG AGT AG 59,3Material und Methoden 20
Die primerspezifischen Annealing-Temperaturen wurden jeweils 1-2°C unter den
primereigenen Schmelztemperaturen gewählt. Die Schmelztemperatur (Ts) berechnet sich wie
folgt:
Ts= 69,3°C+0,41(G+C)-650/n. (1)
Wobei in Gleichung 1, n gleich der Länge des Primers in Basen ist und G+C gleich dem
prozentualen Anteil an Guanin und Cytosin im Primer ist.
2.8 Primer Design
Zur Durchführung der PCR wurden die β-Aktin Primer von der für Daphnia magna bekanten
Sequenz (NCBI AJ292554 mRNA CDS) abgeleitet. Für das hsp60 wurden durch ein
Alignment bekannter Hsp60-Protein-Sequenzen und hsp60-DNA-Sequenzen von Arabidopsis
thaliana (NM_179872), Caenorhabditis elegans (NM_065028), Danio rerio (NM_181330),
Drosophila melanogaster (NM_078560), Homo sapiens (NM_002156), Mus musculus
(NM_010477) und Saccharomyces pombe (NM_001018294) degenerierte Primer in
konservierten Bereichen dieser Sequenzen konstruiert.
Nach der partiellen Sequenzierung des hsp60-Gens wurden anhand dieser Sequenz die
„Original“ hsp60-Primer (Tab.1.) für die RT-PCR entwickelt.Sie können auch lesen
