Grippe Impfstoffherstellung in Einweg-Bioreaktoren
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Genzel, Yvonne et al. | Grippe Impfstoffherstellung in Einweg-Bioreaktoren Tätigkeitsbericht 2007 Grippe Impfstoffherstellung in Einweg-Bioreaktoren Genzel, Yvonne; Reichl, Udo; Max-Planck-Institut für Dynamik komplexer technischer Systeme, Magdeburg Korrespondierender Autor Genzel, Yvonne E-Mail: genzel@mpi-magdeburg.mpg.de Zusammenfassung Die Angst vor einer möglichen Influenza-Pandemie hat dazu geführt, dass die Entwicklung von alternativen Produktionsmöglichkeiten gegenüber dem klassischen Prozess mit einer Vermehrung der Viren in bebrüteten Hühnereiern beschleunigt wurde. Die Arbeitsgruppe ,Upstream Processing‘ hat den Einsatz von neuen Einweg-Bioreaktoren für die Influenza- Impfstoffherstellung mit zwei verschie- denen Säugerzellen umfassend analysiert. Diese Bioreaktoren ermöglichen ein schnelles und einfaches Erweitern der Produktionskapazität im Falle einer Pandemie. Abstract Discussion on preparedness for a possible influenza pandemic is still ongoing. Authorities and public interest have now accelerated the development of alternative production systems to the classical egg-based production. New disposable bioreactors have been evaluated in the upstream processing group using different analytical tools comparing the influenza virus production with two different mammalian cells. These bioreactors show a potential for fast and simple up-scaling of production capacities in case of a pandemic. Grippe Impfstoffe, Politik & Pandemiepläne Das Thema Grippe, speziell Vogelgrippe, hat die Medien und Öffentlichkeit in den letzten Jahren immer wieder beschäftigt. Die Angst vor einer möglichen Pandemie flammt kurzzeitig auf, um dann wieder durch andere Themen in den Hintergrund gedrängt zu werden. Aber neben den saisonalen Influenza-Epidemien bleibt das Risiko einer Pandemie eine ständige Bedrohung und viele Wissen- schaftler in Forschung und Industrie sind bestrebt, adäquat für den Ernstfall vorbereitet zu sein. Daher sind in den letzten Jahren vor allem in den USA öffentliche Gelder vergeben worden, um alternative Produktionssysteme zu der klassischen Vermehrung der Viren in Hühnereiern zu fördern. Inzwischen haben die meisten Impfstoffhersteller eine zweite Produktionsschiene mit Säugerzellen entwickelt und neue Anlagen zur Produktion von Influenza-Impfstoffen in Bioreaktoren wurden in Betrieb ge- nommen. Analog zu dem klassischen Prozess mit Hühnereiern werden Grippeviren in Säugerzellen vermehrt, die freigesetzten Viren als Lebendimpfstoff (mit abgeschwächten Viren) oder als inaktivierte Viren aus der Kulturbrühe aufgereinigt und zum Endprodukt weiterverarbeitet. Die Entwicklung alter- nativer Methoden, wie die Produktion der Virushülle oder einzelner Virusproteine in Insektenzellen, Bakterien oder Hefen wird ebenfalls intensiv verfolgt. Daneben ist die Herstellung von antiviralen Medikamenten zur aktiven Bekämpfung einer Grippe, wie Tamiflu, auch weiterhin aktuell. So hofft man, nicht nur für einen kleinen Teil der Weltbevölkerung eine Abwehr gegen Influenzaviren zu haben. © 2007 Max-Planck-Gesellschaft www.mpg.de
Tätigkeitsbericht 2007 Genzel, Yvonne et al. | Grippe Impfstoffherstellung in Einweg-Bioreaktoren
Gegenüber anderen biotechnologischen Produkten gelten bei der Entwicklung von Herstellungs-
verfahren für Impfstoffe besondere Anforderungen:
– das Produkt ist für einen gesunden Patient bestimmt und Nebenwirkungen werden nicht akzeptiert
– gesunde Patienten sehen zunächst keine Notwendigkeit für eine Behandlung (Impfmüdigkeit)
– das Produkt ist ein Massenprodukt und muss billig, stabil (Lagerung) und einfach zu verabreichen
sein
– bei einem Impfstoff wie Influenza muss die Produktion sehr flexibel sein, da jedes Jahr andere Viren
mit leicht anderen Charakteristika hergestellt werden müssen
– im Falle einer Pandemie muss in kürzester Zeit sehr viel Produkt hergestellt werden.
Informationen über die jeweiligen Herstellungsprozesse und deren Weiterentwicklung wurden von
den Unternehmen in der Regel sehr vertraulich behandelt. Dies hat sich durch die öffentliche Diskus-
sion der Thematik „Bedrohung durch Infektionskrankheiten“ in den letzten Jahren zumindest zum
Teil geändert. Projekte, gefördert von der „Bill und Melinda Gates Foundation“ wie zum Beispiel
die „International Aids Vaccine Initiative“ (IAVI), haben Impfstoffhersteller und Forschungseinrich-
tungen zu gemeinsamen Projekten zum Wissensaustausch bewegt und man hat in den letzten Jahren
viele weitere interessante Entwicklungen sehen können (u.a. Public Private Partnerships). So wurden
neue Zelllinien entwickelt (Designerzellen) und neue Reaktoren und Aufreinigungsverfahren getestet
(Einweg-Bioreaktoren und Einweg-Aufreinigungseinheiten).
Welche Zellen produzieren unter welchen Bedingungen die meisten Viren?
Die Produktion von Grippeviren in bebrüteten Hühnereiern wurde vor vielen Jahren zugelassen und
hat sich auch als sicher erwiesen. Der Impfstoff enthält allerdings sehr geringe Restmengen von
Eierproteinen, die zu Allergien führen können. Bei der Produktion von Vogelgrippe-Viren stößt man
mit diesem Produktionssystem natürlich auch auf Grenzen. Will man nun andere tierische Zellen zur
Virusproduktion nutzen, so können diese nur unter bestimmten Bedingungen zugelassen werden. Die
Zellen müssen z.B. frei von adventiven Agenzien sein (also frei von bekannten biologisch kontami-
nierenden Agenzien wie Mykoplasmen, Viren, Bakteriophagen) und es muss gezeigt werden, dass von
dem hergestellten Impfstoff kein Risiko bezüglich Krebs oder Prionen hervorgeht.
So können CHO- oder BHK-Zellen nicht genutzt werden – beides Zellen, die häufig für die biotech-
nologische Herstellung rekombinanter Proteine oder monoklonaler Antikörper verwendet werden. Zu
den für die Produktion von Humanimpfstoffen zugelassenen Zelllinien gehören zum Beispiel MDCK-,
Vero- und Per.C6- Zellen. Dabei sind MDCK- und Vero-Zellen in der Regel adhärent, also auf Ober-
flächen wachsende Zellen von Hund bzw. grünen Meerkatzen, die ursprünglich aus Nierengewebe
gewonnen wurden. Die humane Zelllinie Per.C6 gehört zu den so genannten „Designerzellen“, wächst
in Suspension und wurde aus primären Retinoblasten durch Transfektion mit einem E1- Minigen
aus Adenovirus Typ 5 gewonnen.
Welche dieser Zellen nun die beste Zelle für die Etablierung eines bestimmten Impfstoffprozesses ist,
hängt von vielen verschiedenen Parametern ab. Wachstumsmedium und -bedingungen beeinflussen
die maximal mögliche Zellzahl und somit die Virusausbeute. Das Medium während der Virusvermeh-
rung sowie die Infektionsbedingungen beeinflussen dann die Produktivität der Zellen. Die Viren müs-
sen an die Zellen adaptiert werden und der richtige Infektionszeitpunkt sowie das optimale Impfver-
hältnis Virus pro Zelle ermittelt werden. Fehlende Nährstoffe im Medium oder während des Prozesses
akkumulierende, inhibitorische Substanzen haben ebenso einen großen Einfluss auf die Virusausbeute.
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Die Arbeitsgruppe ,Upstream Processing‘ der Fachgruppe Bioprozesstechnik am Max-Planck-Institut
für Dynamik komplexer technischer Systeme hat sich intensiv mit der Influenza- Impfstoffherstellung
in tierischen Zellen auseinander gesetzt und dazu auf verschiedenen Ebenen (extra- & intrazelluläre
Metabolite, Wirtszellproteinantwort, Zellphysiologie, …) Analytikmethoden etabliert. Dabei wurden
MDCK und Vero-Zellen unter verschiedenen prozessrelevanten Bedingungen verglichen. Durch die
umfassende Analytik konnten zahlreiche Parameter, die Zellwachstum und Virusausbeute entschei-
dend beeinflussen, identifiziert und hinsichtlich ihres Einflusses auf den Gesamtprozess genauer
charakterisiert werden [1-2]. Daten zum Verbrauch von Mediumsbestandteilen (Zucker, Aminosäuren,
Sauerstoff), Zellzyklus, Zellwachstum sowie Absterben und Infektionsgrad, Virusausbeute (aktiv und
inaktiv), programmierter Zelltod (Apoptose), Glykosylierungsmuster des Virusproteins Hämaglutinin
oder die Proteinantwort der Wirtszellen stehen nun zur Verfügung und werden zur Klärung von
Fragestellungen hinsichtlich Prozessentwurf und -optimierung weiter genutzt.
Bei optimaler Prozessführung scheinen sich die Ausbeuten der verschiedenen Zellen letztendlich nicht
so sehr zu unterscheiden. Wichtiger ist es eher, nun mehrere Möglichkeiten zur Virusproduktion zu
besitzen, Vor- und Nachteile der jeweiligen Systeme besser zu verstehen und im Falle einer Pandemie
flexibel auf diese zurückgreifen zu können.
Einweg-Bioreaktoren – neue Möglichkeiten für schnelles und einfaches Produzieren?
Vor einigen Jahren wurde die bestehende Bioreaktortechnik überdacht. Anstelle von Edelstahl- oder
Glas-Rührkesseln als Standardreaktor wurden Kultivierungsbeutel aus Polyethylen, ähnlich zu Blut-
transfusionsbeuteln, vorgestellt. Diese werden auf einer beheizbaren Platte hin- und herbewegt, bei
Bedarf begast und nach einmaligem Gebrauch entsorgt [3], siehe Abbildung 1.
Abb. 1: Einweg-Bioreaktor der Firma Wave Biotech mit 2 Kultivierungsbeuteln (je 1 L Arbeitsvolu-
men): Die Metallschale ist temperierbar und bewegt sich vor und zurück, sodass sich die Flüssigkeit
in den Beuteln mit einer Wellenbewegung hin- und herbewegt. Zu- und Abluftfilter sowie die Möglich-
keit Proben zu nehmen sind im zertifizierten sterilen Beutel integriert.
Urheber: Max-Planck-Institut für Dynamik komplexer technischer Systeme/Genzel
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Zunächst war eine Anwendung in der Gentherapie angedacht, wobei zu behandelndes Patientenmate-
rial in jeweils einen eigenen sterilen, zertifizierten Beutel überführt und anschließend wieder zurück in
den Patienten gebracht werden sollte. Interessant könnten diese Reaktorsysteme auch für die Produk-
tion von teuren Produkten aus der Zellkultur zum Beispiel mit kleinem Produktvolumen und häufig
wechselnder Produktpalette sein. Denn dabei könnten lange Standzeiten durch Reinigung und Sterili-
sation und die bei Edelstahl-Rührkesseln notwendige, aber aufwendige Zulassungsprozedur umgangen
werden.
Heute haben sich diese Reaktoren in vielen biotechnologischen und pharmazeutischen Prozessen
durchgesetzt und werden in Maßstäben von 0,5 bis 500 L Arbeitsvolumen genutzt. Der Gedanke des
Einweg-Bioreaktors wurde zudem weiterentwickelt und so sind nun weitere Reaktortypen bis hin
zum Einweg-Rührkessel auf dem Markt. Die Medienvorlagebehälter sind inzwischen ebenso meist
Einwegbeutel und auch in der Aufarbeitung (zum Beispiel bei Klärung und Konzentrierung, aber auch
beim Einsatz chromatographischer Verfahren) werden mehr und mehr Einwegsysteme entwickelt.
Der Grundgedanke dabei ist die zukünftige Entwicklung kompletter „plug-and-play“ Einweg-Produk-
tionsanlagen. Noch ist man hinsichtlich des Maßstabs möglicher Prozesse begrenzt und bestehende
Edelstahl-Anlagen werden sicher nicht ersetzt. Auch ist das zur Herstellung der Beutel verwendete
Polyethylen nicht so innert wie Edelstahl. Damit könnten bei langen Prozesszeiten bei ungeeigneten
Flüssigkeiten bzw. Medien Plastikbestandteile oder Weichmacher in das Produkt gelangen bzw. Me-
diumsbestandteile oder Produkte unspezifisch an die Beuteloberfläche binden und so nicht zur Verfü-
gung stehen.
Die Arbeitsgruppe ,Upstream Processing‘ hat nun diesen neuen Reaktortypen für die Produktion von
Grippeviren genutzt und mittels der bestehenden umfassenden Analytik der Arbeitsgruppe einen Ver-
gleich zum klassischen Rührkessel durchgeführt [4].
Es konnte gezeigt werden, dass der Einweg-Bioreaktor in seiner simpelsten Konstellation ohne pH-
oder Sauerstoffregelung als „plug-and-play“ System zur Herstellung von Impfstoffen nutzbar ist.
Zudem wurde die Möglichkeit gezeigt, adhärente Zellen auf Mikrocarriern in diesem Reaktorsystem
zu kultivieren. Es wurden zunächst Mikrocarrierkonzentrationen von 2 und 4 g/L genutzt und dabei
sogar höhere Zellzahlen als im Rührkessel erreicht (350 MDCK Zellen/Mikrocarrier gegenüber 250
MDCK Zellen/Mikrocarrier). Für die wichtigsten Metabolite (Glukose/Laktat, Glutamin/Ammonium,
Glutamat) wurden ähnliche Verläufe gefunden wie im geregelten Rührkessel (Abb. 2A). Insbesondere
wurden in beiden Reaktorsystemen vergleichbare Virusausbeuten erreicht (Abb. 2B). Letztendlich
konnte der Prozess sowohl in serum-haltigem als auch in serum-freiem Medium erfolgreich durchge-
führt werden, für MDCK als auch für Vero-Zellen in 1 und 10 L Arbeitsvolumen.
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Abb. 2: Vergleich des Zellwachstums (0–96 h) und der Influenzaproduktion (96–168 h)
(A/Equi2/Newmarket 1/93 H3N8) in MDCK- Zellen im klassischen Rührkessel (5L STR, ▲) und im
Einweg-Bioreaktor (1L Wave, ■):
A. Glucose Konzentration (lila) und Laktat Konzentration (grün);
B. Glutamat Konzentration (blau) und Virus Titer (rosa). (Fehlerbalken geben die relative Standard-
abweichung der Messmethode an.)
Urheber: Max-Planck-Institut für Dynamik komplexer technischer Systeme/Genzel
Für einen anderen Impfstoffprozess (Nerz Enteritis Virus) konnte in Zusammenarbeit mit IDT
Biologika GmbH gezeigt werden, dass durch die Nutzung dieser Einwegreaktoren die Ausbeute des
bestehenden Prozesses verbessert und – durch Wegfall der bisherigen zeit- und personalintensiven
Herstellung in Rollerflaschen – erheblich vereinfacht werden kann [5]. Welche Scherkräfte bei der
Wellenbewegung des Mediums in diesen Einwegreaktoren auf die Zellen wirken und warum mehr
Zellen auf einem Mikrocarrier Platz haben als im Rührkessel wird momentan in Kooperation mit dem
Lehrstuhl für Strömungsmechanik und Strömungstechnik der Otto-von-Guerricke Universität
Magdeburg mittels Modelle für die Flüssigkeitsdynamik – „computational fluid dynamics“ (CFD) –
untersucht.
Zusammengefasst bleibt festzustellen, dass Einweg-Bioreaktorsysteme in ihrer einfachsten Konstella-
tion (ohne pH- und Sauerstoffregelung) eine Influenza-Impfstoffherstellung in einem Maßstab bis
zu 500 L pro Reaktor ermöglichen. Dies könnte im Falle einer Pandemie mit einem schnellen Bedarf
an großen Produktionskapazitäten eine interessante Option auch für die Länder sein, die bisher
keinen Impfstoff produzieren.
Literaturhinweise
[1] Genzel, Y. and U. Reichl:
Vaccine production - state of the art and future needs in upstream processing
Methods in Biotechnology : Animal Cell Biotechnology – Methods and Protocols 24, 457–473
(2007)
[2] Genzel, Y., M. Fischer, U. Reichl:
Serum-free influenza virus production avoiding washing steps and medium exchange in
large-scale microcarrier culture
Vaccine 24 (16), 3261–3272 (2006)
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[3] Genzel, Y., C. Dietzsch, U. Reichl:
Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation
Cytotechnology 30, 149–58 (1999).
[4] Genzel, Y., R.M. Olmer, B. Schäfer and U. Reichl:
Wave microcarrier cultivation of MDCK cells for influenza virus production in serum containing
and serum-free media
Vaccine 24, 6074–6087 (2006).
[5] Hundt, B., C. Best, N. Schlawin, H. Kastner, Y. Genzel and U. Reichl:
Establishment of a Mink Enteritis Vaccine Production Process in Stirred-Tank Reactor and
Wave Bioreactor Microcarrier Culture in 1–10 L scale
Vaccine 25, 3987–3995 (2007).
www.mpg.de © 2007 Max-Planck-GesellschaftSie können auch lesen
