Deutscher Studienpreis | 1. Preis Natur- und Technikwissenschaften
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Deutscher Studienpreis | 1. Preis
Natur- und Technikwissenschaften
Entwicklung eines spektroskopischen Schnelltests zur
Detektion und quantitativen Charakterisierung von
Antibiotika-Resistenzen bei Sepsis-Pathogenen
Multiresistente Bakterien sind eine globale Bedrohung für Gesundheit
und Ernährung. Antibiotika werden wirkungslos. Mikrobiologische
Diagnostik ist unumgänglich, um eine gezielte Therapie bei
lebensbedrohlichen bakteriellen Infektionen einzuleiten. In dieser Arbeit
wurden innovative Strategien zur schnellen Resistenztestung entwickelt.
Mikrofluidik-Chips in Kombination mit Raman-Spektroskopie erlauben
phänotypische Charakter-isierung von Pathogenen. Schon nach 30 min
Exposition wurden erste Antibiotika-induzierte Effekte in den Spektren
nachgewiesen. Resistente Bakterien wurden nach 60 min zuverlässig
detektiert. Nach nur 90 min Interaktion wurde die minimale
Hemmkonzentration mit einem einfachen Ausleseverfahren bestimmt.
Ein drastischer Zeitgewinn im Vergleich zu klassischen Methoden,
welche 16 bis 20 Stunden benötigen. Flexibilität, Robustheit und
Automatisierbarkeit des photonischen Verfahrens lassen die klinische
Anwendbarkeit zu. Vorteile sind Kostensenkung und Ein-dämmung neuer
Resistenzen.
Johanna Kirchhoff promovierte an der Friedrich-Schiller-Universität Jena
im Fachgebiet Physikalische Chemie.
Der vorliegende Beitrag wurde beim Deutschen Studienpreis 2020 mit dem
1. Preis in der Sektion Natur- und Technikwissenschaften ausgezeichnet. Er
beruht auf der 2019 an der Friedrich-Schiller-Universität Jena eingereichten
Dissertation »Charakterisierung der Antibiotika-Empfindlichkeit von Sepsis-
Pathogenen mittels Raman-Spektroskopie« von Johanna Kirchhoff.
Entwicklung eines spektroskopi- reits erwähnt, der Patient auf der Inten-
schen Schnelltests zur Detektion sivstation bekommt, weil die lebensret-
und quantitativen Charakterisie- tende Therapie nicht warten darf, so-
rung von Antibiotika-Resistenzen fort ein stark dosiertes Breitbandantibi-
otikum oder eine Kombination aus
bei Sepsis-Pathogenen
mehreren Antibiotika. Ist es ein »lieber«
sensitiver Keim, ist solch eine Therapie
Hintergrund
völlig übertrieben.
»Mit Kanonen auf Spatzen schießen«,
In den letzten Jahren sind multiresis-
wie Prof. Michael Bauer (Klinikdirektor
tente Keime zu einem weltweiten Prob-
Intensivmedizin, Universitätsklinikum
lem herangewachsen. Wirkungsvolle
Jena) sagt. Geht man aber mit einer
Antibiotika verlieren ihre Wirksamkeit.
sanften Schmalband-Antibiose an den
Bei einer lebensbedrohlichen bakteriel-
lebensbedrohlichen Keim, gewöhnt
len Infektion, wie einer Sepsis, muss so-
sich dieser an die Behandlung und ent-
fort mit einer Antibiotika-Therapie be-
wickelt Resistenzen gegen solche Sub-
gonnen werden. Der lebensbedrohliche
stanzen. Das angewendete Antibioti-
Erreger muss beseitigt werden, um den
kum ist für diesen Erreger keine wirk-
Patienten zu retten. Jede Stunde zählt!
same Behandlungsoption mehr. »Use it
Ist der Erreger resistent, wirkt die empi-
and you lose it«, wie sich Prof. Mathias
rische Initialtherapie nicht.
Pletz (Institutsdirektor Infektionsmedi-
zin, Universitätsklinikum Jena) zum
Ich bin kein Arzt, ich bin Mikrobiolo-
Antibiotika-Gebrauch äußerte. Ein Teu-
gin. Bei der infektiösen Probe des Pati-
felskreis, die Behandlung und die Resis-
enten beginnt mein Job: Es muss drin-
tenzentwicklung.
gend getestet werden, auf welches Anti-
Die Evolution der Bakterien, die Ent-
biotikum der Erreger reagiert. Es muss
wicklung von Resistenzen, können wir
ein Resistogramm des Erregers angelegt
nicht aufhalten. Aber wir können
werden. Der Erreger muss aber erst aus
schnellere Tests entwickeln. Schneller
der Patientenprobe isoliert werden und
Resistenzen detektieren. Schneller ein
dann identifiziert, dann dessen Antibi-
richtiges Antibiotikum definieren. Ge-
otika-Empfindlichkeiten charakteri-
zieltes Dosieren. Weniger Nebenwir-
siert. Darauf müssen Arzt und Patient
kungen. Besserer Therapierfolg. Resis-
in der Regel mehrere Tage warten, weil
tenzentwicklung eindämmen. Die Pati-
in der mikrobiologischen Routinediag-
enten könnten viel schneller mit einer
nostik zeitaufwendige kulturbasierte
zugeschnittenen, effektiven Antibio-
Methoden verwendet werden. Wie be-
tika-Therapie behandelt werden. Das ist
1Deutscher Studienpreis 2020 | 1. Preis Natur- und Technikwissenschaften Johanna Kirchhoff meine Motivation. Die Resistenztestung Diagnostik innerhalb weniger Stunden drastisch zu beschleunigen. Einen gewährleisten soll. Eine schnellere Me- schnelleren Resistenztest zu entwi- thode zur Empfindlichkeitstestung ist ckeln. Die Antibiotika-Empfindlichkei- von höchstem klinischem Interesse, um ten von Sepsis-Erregern in kürzester eine zielgerichtete und schonende Anti- Zeit zu ermitteln. biotika-Therapie bei lebensbedrohli- Dies kommt Menschen jeden Alters al- chen Infektionen schneller zu starten ler Bevölkerungsgruppen zugute, denn sowie die Entstehung von Resistenzen Sepsis kann jeden treffen und im Leben zu reduzieren. bedrohen. Es lassen sich Dauerschäden Zunächst wurden verschiedene Zeit- abmildern und in Anzahl senken, Kran- punkte zwischen 30 und 120 Minuten kenhausaufenthalte verkürzen und so- der Antibiotika-Pathogen-Interaktion mit auch Behandlungskosten einspa- getestet, um einen frühestmöglichen ren. Test-Zeitpunkt für spektrale, Antibio- Im Rahmen dieser Arbeit wurden die tika-induzierte Effekte aufzudecken. phänotypischen Reaktionen von Sepsis- Dabei konnten schon nach 30 min In- verursachenden Bakterien auf eine An- teraktionszeit Effekte in den Raman- tibiotikum-Behandlung mittels Raman- Spektren der Bakterien nachgewiesen Spektroskopie untersucht und hinsicht- werden. Die spektralen Unterschiede lich ihrer Antibiotika-Empfindlichkeit mit und ohne Antibiotika-Behandlung charakterisiert. Es wurden die Interak- wurden verwendet, um ein Klassifikati- tionen von bedeutenden Sepsis-Patho- onsmodell zu trainieren, welches eine genen verschiedener Gruppen mit kli- effektive Antibiotika-Behandlung an- nisch relevanten Antibiotika unter un- zeigt. Die Qualität und Robustheit des terschiedlichen Bedingungen sowie ei- statistischen Klassifikationsmodells zur nem variierenden Setup untersucht. Detektion der Interaktion konnte durch Die Untersuchungen wurden in der in- einen unabhängigen Testdatensatz, der terdisziplinären Forschungsgruppe von von einem anderen Experimentator er- Prof. Ute Neugebauer am Center for stellt wurde, mit einer Vorhersage-Ge- Sepsis Control and Care am Universi- nauigkeit von über 90 % evaluiert wer- tätsklinikum Jena und von Prof. Jürgen den. Als Referenz zur spektroskopi- Popp am Leibniz-Institut für Photoni- schen Methode wurden Wachstumskur- sche Technologien (Leibniz-IPHT) ven mit und ohne Antibiotikum an- durchgeführt. hand der optischen Dichte aufgenom- Ziel der Arbeit war die Entwicklung ei- men. [JK1] nes Raman-spektroskopischen Verfah- Anschließend wurde der Fokus auf die rens zur unverzüglichen Bestimmung Detektion von Antibiotika-Resistenzen der Antibiotika-Empfindlichkeit von bei dem häufig multiresistenten gram- aus Patientenmaterial isolierten Bakte- negativen (MRGN) Bakterium E- rien. Diese Untersuchungen dienen als scherichia coli gerichtet. Für die Unter- Grundlage für einen neuen Schnelltest suchungen wurde ein Quadrupol-Die- zur Identifizierung und Empfindlich- lektrophorese-Chip (DEP) verwendet, keitstestung, der die mikrobiologische mit welchem lebende Bakterien im 2
Deutscher Studienpreis 2020 | 1. Preis Natur- und Technikwissenschaften Johanna Kirchhoff Urin isoliert werden können. Auf dem die anhand der optischen Dichte aufge- Chip werden die Bakterien einer Sus- nommen wurden. [JK2] pension mittels eines inhomogenen Um eine potentielle klinische An- elektrischen Feldes in einem kleinen wendbarkeit zu demonstrieren, wurde Bereich gesammelt und können direkt die Prozedur des Quadrupol-DEP-Chips Raman-spektroskopisch analysiert wer- in ein DEP-basiertes Mikrofluidik-Sys- den. Dadurch wird Vorbereitungs- und tem integriert, welches die Raman- Messzeit gespart. Damit sich die Test- spektroskopische Analyse von Bakte- kulturen im exponentiellen Wachstum rien in Suspension automatisiert er- befinden, wurden sie für 60 min vorkul- möglicht. Der integrierte DEP-basierte tiviert, dann erfolgte die Gabe von Anti- Mikrofluidik-Chip ist ein geschlossenes biotika, oder die Kultur blieb als Kon- Chip-System, welches den einfachen trolle unbehandelt. Proben für die Ra- und sicheren Umgang mit dem infekti- man-spektroskopische Analyse wurden ösen Probenmaterial gewährleistet und über einen Zeitraum von 2 h nach der sich einfach in ein Raman-Mikroskop Antibiotika-Gabe entnommen. Nach ei- integrieren lässt. Analog zu den Experi- ner minimalen Probenvorbereitung menten mit dem Quadrupol-DEP-Chip von etwa 10 min wurden die Bakterien wurden ein sensitiver und ein resisten- auf dem Chip gefangen und innerhalb ter E.- coli- Stamm nach einer 60-minü- von Sekunden Raman-spektroskopisch tigen Vorkultivierung mit Ciprofloxa- analysiert. Mit multivariaten statisti- cin behandelt, oder die Kulturen blie- schen Analysen wurden Markerbanden ben als Kontrolle unbehandelt. Über ei- in den Spektren identifiziert, die der nen Zeitraum von 120 min wurden die Differenzierung der Antibiotika-Emp- Bakteriensuspensionen über ein Sprit- findlichkeit und damit zur schnellen Er- zenpumpensystem in den Mikrofluidik- kennung von resistenten Stämmen die- Chip gegeben, wo die Bakterien auf- nen. So konnte mit dem kombinierten grund der dielektrophoretischen Kräfte DEP-Raman-Setup bei E. coli Resistenz in zehn mikroskopisch kleinen Berei- gegen das Antibiotikum Ciprofloxacin chen gesammelt werden. Die Raman- nach 60 min Interaktionszeit anhand ei- spektroskopische Analyse erfolgt eben- nes robusten Klassifikationsmodells falls innerhalb von Sekunden. Die verlässlich detektiert werden. Beobach- spektralen Daten der Bakterien des Mik- tete spektrale Effekte korrelieren mit rofluidik-Chips wurden in das statisti- dem Wirkmechanismus des Fluorchi- sche Klassifikationsmodell projiziert, nolonsCiprofloxacin, welches die DNA- welches mit den Daten des sensitiven Synthese hemmt. Die Spektren der un- Stammes anhand des Quadrupol-DEP- behandelten Kontrollen und der behan- Chips erstellt wurde. Bei beiden Setups delten resistenten E. coli reflektieren mit den verschiedenen Chips zeigte die die typischen Wachstumsphasen einer Analyse der Spektren die gleichen Ef- Bakterienkultur. Als Referenz für die fekte, welche die Wirkung des Antibio- Ciprofloxacin-induzierte Wachstums- tikums widerspiegeln. Durch die An- hemmung dienten Wachstumskurven, wendung des Mikrofluidik-Chips konn- 3
Deutscher Studienpreis 2020 | 1. Preis Natur- und Technikwissenschaften Johanna Kirchhoff ten, innerhalb von insgesamt 3,5 h Ana- finiert und optimiert, dass die Ergeb- lysezeit und mit minimalem manuel- nisse mit den standardisierten phänoty- lem Aufwand, Ciprofloxacin-resistente pischen Tests korrelieren, wobei eine E. coli mit einer statistischen Sensitivi- maximale Zeitersparnis zu den her- tät von über 90 % detektiert werden. kömmlichen Tests angestrebt wurde. Diese Ergebnisse besagen, dass sich die Eine Hauptkomponentenanalyse wurde Prozedur und das Klassifikationsmodell verwendet, um die spektralen Unter- zur Detektion von Resistenzen zwi- schiede der Reaktion auf die unter- schen verschiedenen Geräten übertra- schiedlichen Ciprofloxacin-Konzentra- gen lässt und bedienerunabhängig ist, tionen zu beschreiben. Zwei spektrale was wichtige Aspekte für eine potenti- Markerbanden, die der Differenzierung elle Anwendung in der klinischen Diag- einer sensitiven (Wachstumshemmung) nostik sind. [JK2] beziehungsweise resistenten Reaktion Basierend auf den erzielten Ergebnis- (Wachstum) dienen, wurden definiert. sen wurde in dieser Arbeit ein schnelles Das Intensitätsverhältnis dieser Marker- und einfaches spektroskopisches Ver- banden reflektiert deutlich den kon- fahren zur Bestimmung der minimalen zentrationsabhängigen Effekt von Hemmkonzentration (MHK) entwickelt Ciprofloxacin auf das Wachstum von E. und exemplarisch für E. coli und Cipro- coli nach 90 min Interaktion. In einem floxacin demonstriert. Zur Zeiterspar- Balkendiagramm, welches das Intensi- nis wurde auf die 60-minütige Vorkulti- tätsverhältnis der Markerbanden dar- vierung verzichtet. Die Bedingungen stellt, können subinhibitorische und in- für den Test wurden anhand von Labor- hibitorische Konzentrationen unter- stämmen mit bekannter MHK festge- schieden werden, und die MHK kann legt. Die Bakterien wurden direkt aus einfach unter dem so definierten der stationären Phase entnommen und Schwellenwert von 1 abgelesen werden. in frisches Nährmedium mit klinisch- Die Validierung der 90-min-MHK-Me- relevanten Ciprofloxacin-Konzentratio- thode erfolgte mit Ciprofloxacin-sensi- nen gegeben. Nach 90 min Kultivierung tiven und resistenten klinischen E.-coli- wurden die E.- coli-Suspensionen auf Isolaten, die aus Blut von Sepsis-Patien- den Quadrupol-DEP-Chip gegeben und ten stammen. Alle resistenten Stämme Raman-spektroskopisch analysiert. Her- wurden mit dem Raman-spektroskopi- kömmliche standardisierte Tests zur Be- schen 90-min-MHK-Test detektiert. Als stimmung der MHK werden nach 16 bis Referenz wurden herkömmliche Tests 20 h ausgewertet, während die Raman- zur MHK-Bestimmung (Mikrodilutions- Spektren nahezu in Echtzeit aufgenom- test, Lebendzellzahlbestimmung) ver- men und sofort analysiert werden. Die wendet. Die Raman-spektroskopischen gesamte Prozedur der Raman-spektro- MHK-Werte, die innerhalb von 2 h er- skopischen MHK-Bestimmung kann in- mittelt wurden, sind in guter Überein- nerhalb von 2 h ausgeführt werden. Die stimmung mit den ermittelten MHK- Testparameter für die spektroskopische Werten der Referenztests, die am Empfindlichkeitstestung wurden so de- nächsten Tag ausgewertet werden. [JK3] 4
Deutscher Studienpreis 2020 | 1. Preis Natur- und Technikwissenschaften
Johanna Kirchhoff
Zusammenfassend lässt sich sagen, Referenzen aus der kumulativen Dis-
dass die im Rahmen dieser Arbeit erziel- sertation:
ten Ergebnisse die Grundlage für einen
optisch-spektroskopischen Schnelltest [JK1] Cora Assmann*, Johanna Kirch-
zur Detektion von Antibiotika-Resisten- hoff*, Claudia Beleites, Jessica Hey, So-
zen bilden und das Potential der Ra- phia Kostudis, Wolfgang Pfister, Peter
man-Spektroskopie als schnelle und Schlattmann, Jürgen Popp, Ute Neuge-
verlässliche mikrobiologische Analyse- bauer (2015). Identification of vanco-
mycin interaction with Enterococcus
methode zeigen. Die markierungsfreie
faecaliswithin 30 min of interaction
biophotonische Methode charakteri-
time using Raman spectroscopy. Ana-
siert die phänotypische Antwort der
lytical and Bioanalytical Chemistry,
Mikroorganismen, wodurch auch unbe- 407(27), 8343-8352. doi:10.1007/s00216-
kannte Bakterien und neue antimikro- 015-8912-y
bielle Wirkstoffe getestet werden kön-
nen. Der Innovationsgehalt besteht vor (*geteilteErstautorenschaft)
allem in einer drastischen Verkürzung
[JK2] Ulrich-Christian Schröder*, Jo-
der Diagnosezeit einschließlich einer
hanna Kirchhoff*, Robert Nißler, Uwe
schnellen quantitativen Resistenzbe-
Hübner, Günther Mayer, Uwe Glaser,
stimmung (MHK). Thomas Henkel, Wolfgang Pfister,
In an diese Arbeit anschließende Pro- Wolfgang Fritzsche, Jürgen Popp, Ute
jekte wird das spektroskopische Verfah- Neugebauer (2017). On-chip spectro-
ren auf weitere Antibiotika und weitere scopic assessment of microbial suscep-
pathogene Bakterien erweitert. Die tibility to antibiotics within 3.5 hours.
DEP-basierten Chips werden hinsicht- Journal of Biophotonics.
lich einer schnellen, automatisierten di- doi:10.1002/jbio.201600316
agnostischen Methode weiterentwi- (*geteilte Erstautorenschaft)
ckelt und optimiert. Ziel hierbei ist die
Translation der Technologie zu einer [JK3] Johanna Kirchhoff, Uwe Glaser,
patientennahen, flexiblen, universell Jürgen Bohnert, Jürgen Popp, Ute Neu-
einsetzbaren und anwenderfreundli- gebauer (2018). Simple Ciprofloxacin
chen Labordiagnostik. Als Produkt Resistance Test and Determination of
kann sie miniaturisiert zu einem kom- Minimal Inhibitory Concentration
pakten, mobilen Diagnosegerät interna- within 2 h Using Raman Spectroscopy.
tionale Märkte erschließen. Analytical Chemistry, 90(3): p. 1811-
1818. doi:10.1021/acs.anal-
chem.7b03800
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